Rongeurs
Role de la nutrition dans les réponses immunitaires anti-tumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour savoir si l'alimentation modifie l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses, 1 602 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous la peau des cellules tumorales alors qu'elles sont éveillées, développent une tumeur mesurée régulièrement, puis trois injections intrapéritonéales de traitement. Le porteur écrit que les groupes comptent dix-huit souris "sans recours à un test statistique pour définir ce nombre", en se fondant sur son expérience antérieure. Il indique que l'hypothèse testée, le rôle de nutriments végétaux dans la réponse immunitaire anti-tumorale, a d'abord été formulée en culture cellulaire, et affirme que le recours à la souris reste "indispensable" pour envisager une application clinique.
Objectifs
Ces dernières années, l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur, a ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques. Cependant, seule une partie des patients répondent au traitement par immunothérapie, et de nombreux paramètres peuvent impacter l’efficacité du traitement. En particulier, les aliments peuvent avoir un impact important, en fournissant des nutriments qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire et en modifiant les bactéries de la flore intestinale. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’effet de la nutrition dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester des traitements permettant d’augmenter l’efficacité de l’immunothérapie via des interventions nutritionnelles.
Bénéfices attendus
Des études suggèrent que des modifications de l’alimentation pourraient apporter un bénéfice aux patients traités par immunothérapie. Cependant, l'effet sur les cellules immunitaires des tumeurs des produits dérivés de la nourriture demeure mal connu. Ce projet permettra donc d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour mieux comprendre l’interaction entre nourriture et cellules immunitaires, et plus particulièrement dans les réponses immunitaires anti-tumorales au cours des immunothérapies. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des immunothérapies par point de contrôle immunitaire.
Procédures
Les expériences visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience, durée du geste inférieur à 20 sec). Les animaux seront ensuite traités à 3 reprises à raison d’1 fois par jour (administration des traitements par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles, durée du geste inférieur à 10 sec), tous les 2-3 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. Nos résultats précédents montrent que le régime spécial utilisé n’affecte pas l’état général des animaux et ne modifie pas leur poids.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que des nutriments présents dans certains végétaux jouent un rôle dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo. Le projet doit étudier l’influence de ces nutriments sur la croissance tumorale et les réponses immunitaires anti-tumorales dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent être représentatifs, sans recours à un test statistique pour définir ce nombre. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Nous limiterons le nombre de souris utilisées en restreignant le nombre de lignées tumorales étudiées et en étudiant un seul type de thérapie pour l’analyse des mécanismes moléculaires. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, y compris le week-end lorsque cela est nécessaire. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux sont mis à mort dès l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Hébergement de rongeurs génétiquement altérés présentant une altération de la réponse immunitaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées pour 2 700 d'entre elles dans des projets sur le cancer ou le système nerveux central, tuées pour les 620 autres, 3 320 souris génétiquement modifiées sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans intervention prévue. Le projet porte sur leur hébergement en cages ventilées et matériels stérilisés, l'immunodéficience de ces lignées les rendant vulnérables aux infections. Parmi elles, 320 souris "sentinelles" servent de détecteurs du statut sanitaire de l'animalerie, précisément parce que leur déficit immunitaire prononcé les rend très sensibles aux agents infectieux, et sont tuées entre quatre et cinq mois après lecture des contrôles. Les 300 reproductrices sont tuées à six mois, et le porteur présente l'ensemble du dispositif comme un objectif de raffinement destiné à empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable".
Objectifs
Le projet est porté par une plateforme qui élève des souris génétiquement modifiées au service de laboratoires qui les utilisent dans différents projets autorisés. Les animaux en élevage sont particulièrement fragiles ; différentes mesures sont mises en place pour les protéger en particulier des infections. Parmi ces mesures, en accord avec le vétérinaire référent de notre structure, nous utilisons des souris "sentinelles" du statut sanitaire, qui, du fait de leur déficit immunitaire prononcé, ont une grande sensibilité aux agents infectieux. De plus, parmi les souris élevées, certaines ont un déficit immunitaire modéré ; ces souris sont utilisées dans des projets d'études des cancers ou de maladies du système nerveux central qui nécessitent d'avoir recours à des greffes de cellules dites "étrangères". Les souris avec une immunodéficience modérée ne rejettent pas les cellules étrangères greffées. Le projet consiste à mettre en place des conditions environnementales adaptées pour héberger des souris présentant une immunodéficience et empêcher que l'immunodéficience ne conduisent à un état de mal-être. L'objectif du projet est donc d'empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable" dans le respect des 3R.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : la réduction du nombre d'animaux élevés par maitrise du statut sanitaire et le raffinement des conditions d'hébergement permettant de minimiser au maximum les situations de mal être des souris hébergées.
Procédures
Aucune intervention prévue sur les animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable prévus sur les animaux dans les conditions d’hébergement mises en place dans le projet.
Devenir
La plupart des animaux (2700) seront réutilisés dans des projets scientifiques en cancérologie ou étudiant des maladies du système nerveux central. Les animaux reproducteurs seront mis à mort après 6 mois d'âge (300). Les animaux sentinelles pour la gestion sanitaire de l'animalerie seront mis à mort après obtention des résultats des contrôles sanitaires soit entre 4 et 5 mois d'âge (320).
Remplacement
Les animaux hébergés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe à ce jour aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Les animaux sentinelles étaient initialement utilisés dans l'ensemble de l'animalerie pour surveiller le statut sanitaire ; nous les utilisons maintenant uniquement dans la zone d'élevage où les animaux sont particulièrement fragiles. Pour les élevages, l'utilisation d'animaux sentinelles est considérée comme le moyen le plus efficace de repérer des agents infectieux.
Réduction
La mise en œuvre de conditions d'hébergement limitant la contamination des souris immunodéficientes par des micro-organismes permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en limitant les infections qui pourraient avoir un impact sur la viabilité de ces souris. De plus, pour les lignées en élevage sur site, la stratégie d’accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter également la production d'animaux surnuméraires. L'utilisation des animaux sentinelles permet de contrôler la qualité du statut sanitaire et la bonne santé de l'ensemble des animaux dans la zone d'élevage ; les animaux sentinelles contribuent ainsi à une meilleure maitrise du nombre d'animaux élevés sur site.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'hébergement passe par un hébergement en cage ventilée avec filtration de l'air sur filtre à haute efficacité de filtration pour exclure toute contamination dans l'air entrant et sortant cage à cage ; l'air de la zone d'élevage étant lui-même filtré et renouvelé à haute fréquence. Cette approche est couplée à une décontamination/stérilisation de l'ensemble des matériels pouvant être au contact des animaux (matériels d'hébergement, aliments, litière, matériel d'enrichissement, eau de boisson...etc): décontamination thermique,chimique, par irradiation aux rayons gamma ou par ultrafiltration avec stérilisation aux ultra-violets pour l'eau d'abreuvement. Enfin, le port d'équipements de protection individuelle pour les manipulateurs permet également de renforcer la barrière sanitaire mise en oeuvre pour éviter une contamination de l'animalerie et l'apparition de situations de mal-être chez les souris immunodéficientes en particulier. Le suivi des animaux est réalisé quotidiennement par des personnels expérimentés formé à l’utilisation d’un outil développé par le centre national 3R en Angleterre : l’échelle de la grimace de la souris qui permet d’identifier la douleur de façon précoce. Cette échelle est basée sur l’observation fine des yeux, du nez, des joues, des oreilles et des moustaches avec 3 niveaux d’expression. Les expressions faciales s’intensifient en réponse à une douleur, et peuvent être utilisées comme un élément de l’évaluation clinique. Des critères stricts et précoces de prise en charge de la douleur ont été définis.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisés dans notre l'animalerie. Pour les animaux élevés sur site, ils sont transférés aux laboratoires pour une inclusion dans les projets de recherche à l'âge adulte soit entre 2 et 3 mois. Pour les animaux non élevés sur site, les animaux arrivent en provenance d'élevages agréés juste après leur sevrage. Pour les animaux sentinelles, ils sont remplacés à l'âge de 5 mois par des animaux dits "naifs". Le délai de 4 mois au sein de notre animalerie est un compromis pour repérer rapidement des contaminations récentes tout en utilisant un minimum d'animaux.
Etude du recrutement des monocytes et leur différentiation en macrophages dans le tissu adipeux brun.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées quotidiennement et, pour une partie d'entre elles, exposées à 4 degrés pendant une semaine, 1 944 souris sont toutes tuées pour prélever leur tissu adipeux brun, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 1 296 d'entre elles et modéré pour 648. Le porteur indique qu'une exposition prolongée au froid risque de provoquer une hypothermie pouvant aller jusqu'à la perte du réflexe de redressement, la prostration ou la léthargie, et qu'un gavage mal placé peut entraîner une détresse respiratoire. Il écrit par ailleurs que les souris de ce projet "ne présentent pas de phénotype dommageable", alors que 1 296 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère. L'objet du projet est de comprendre le rôle des monocytes dans la graisse brune, avec l'espoir déclaré d'identifier des cibles contre l'obésité et le diabète.
Objectifs
Il existe deux types de graisse corporelle (tissu adipeux) chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc stocke les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun, au contraire, est spécialisé dans la dépense énergétique : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. Ce phénomène permet ainsi de maintenir la température corporelle lors de l’exposition au froid mais aussi de réguler la quantité de graisses et de sucre dans l’organisme. L’activation du tissu adipeux brun a donc émergé comme une stratégie thérapeutique pour lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète. En plus des cellules adipeuses, le tissu adipeux contient aussi de nombreuses cellules immunitaires, dont certaines s’appellent monocytes. Ce projet a pour objectif de comprendre le rôle des monocytes présents dans les tissus adipeux et dans la régulation de son activité métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment les macrophages du tissu adipeux brun régulent le métabolisme énergétique. Chez l'homme l'activité du tissu adipeux brun est corrélée à un indice de masse corporelle (IMC) bas. Stimuler l'expansion et l'activité du tissu aidpeux brun pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour brûler les graisses et le sucre et lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète.
Procédures
Au cours de ce projet les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : des gavages quotidiens pendant 4 jours (la durée de cet acte est de 20 secondes), une injection intrapéritonéale unique (environ 10secondes), 1 ou 2 prélèvements de sang espacés d’une semaine (moins d'une minute par prélèvement).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux seront soumis à des contentions afin de réaliser : une injection intrapéritonéale (moins d'une minute pour réaliser ce geste), ce qui pourrait développer une inflammation au niveau du site d'injection, des gavages au cours desquels une introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons pourrait se produire entrainant une détresse respiratoire. De plus ceratins animaux seront hébergés dans une enceinte climatique dédiée à l'hébergement des souris et soumis à une exposition au froid (4°C, pendant une semaine maximum). Une longue exposition au froid risque d'entrainer une hypothermie. Une hypothermie sévère peut s’accompagner d’une perte du réflexe de redressement, d’une prostration ou d’une léthargie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l’analyser in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre la diversité, l’origine et les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons pour les élevages des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Les animaux seront hébergés dans une pièce ou une enceinte climatique à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage contiendra une tige en papier, un igloo et une brique de peuplier.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Dans l’ensemble des procédures nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 semaines au minimum afin de leur laisser le temps d’atteindre leur maturité et leur maturité du système immunitaire
Développement d’une thérapie combinatoire basée sur l’injection d’exosome et d’IL-2 dans un modèle murin de brûlure radiologique musculo-cutanée
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester un traitement des brûlures par irradiation, 3 108 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 2 528 d'entre elles et léger pour 580, toutes tuées à l'issue. Leur membre inférieur est irradié pendant vingt-cinq minutes sous anesthésie, ce qui provoque une lésion du muscle et de la peau, puis elles reçoivent jusqu'à sept injections et subissent jusqu'à onze analyses fonctionnelles du muscle de trente minutes chacune. Le porteur indique que certaines souris pourront avoir des difficultés à se déplacer et présenter un dos rond, une piloérection ou un amaigrissement. Sur le raffinement, il annonce un suivi quotidien et une mise à mort anticipée en cas de signes de souffrance, sans décrire d'analgésie ni de soin de la lésion.
Objectifs
Le but du projet est de proposer un traitement des brûlures radiologiques par des approches de médecine alternative basée sur l’injection des vésicules issues de cellules souches mésenchymateuses améliorant la création de nouveaux vaisseaux et cicatrisation cutanée et d’une protéine pour favoriser la régénération musculaire afin d’obtenir un effet combiné des deux produits.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est de contribuer à la proposition d’une nouvelle approche thérapeutique innovante, qui pourrait permettre la prise en charge d’un grand nombre de patients avec une amélioration de leur qualité de vie.
Procédures
Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie avant euthanasie : environ 30 secondes Irradiation du membre inférieur sous anesthésie (1 fois) : 25 min Injection intra-musculaire sous anesthésie (max 4 injections i.m.) : environ 1 min par injection Injection i.p. sous anesthésie (max 3 injections i.p.) : environ 1 min par injection Analyse musculaire fonctionnelle (11 fois au max) : sous anesthésie, environ 30 min par test
Impact sur les animaux
Après irradiation, un animal va développer une lésion musculo-cutanée localisée au site d’irradiation. Il est possible que certains animaux aient des difficultés à se déplacer et aient une apparence extérieure modifiée telle que piloérection, dos rond ou amaigri Après injection musculaire, l’animal peut présenter transitoirement une patte gonflée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements pour les analyses nécessaires.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent d’évaluer le réseau vasculaire ni la régénération musculaire. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les conditions d’expérimentation animal présentent une certaine variabilité de réponse. De plus, le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticien déterminent qu’un nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque condition expérimentale est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Un suivi des animaux quotidien sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. Si un animal présente des signes de souffrance son euthanasie anticipée sera réalisée.
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.
Etudes de toxicologie rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 20000
40 000 animaux non-humains, 20 000 souris et 20 000 rats, vont être utilisés et tous tués pour analyse histopathologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament, un vaccin ou un produit chimique par voie orale ou par injection, chaque jour ou chaque semaine, sur des études pouvant durer un, trois ou douze mois, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine, des prises de sang en tube de contention sur animal vigile, une mise à jeun et jusqu'à seize heures en cage à diurèse. Le porteur retient comme effets attendus l'inconfort, le stress, la douleur transitoire et la perte de poids, et parle de "sacrifices" pour désigner les mises à mort intermédiaires. Il indique que ces essais répondent à une exigence réglementaire et affirme qu'il n'existe pas encore de méthode in vitro pour certains effets, en raison de la complexité des organismes vivants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent lors de plusieurs phases du développement (précocément pour les études préliminaires, en prérequis avant tout essai clinique chez l’Homme pour les études subchroniques, ou dans les dernières étapes du développement d’un médicament avant sa mise sur le marché pour les études chroniques). Ces études permettent l’évaluation du risque pour l’Homme ou l’animal, en fournissant des informations sur les organes cibles et sur les effets toxiques majeurs, en déterminant notamment une dose sans effet adverse intégrée dans les critères de marge de sécurité pour l’utilisation ou l’exposition humaine ou pour un usage vétérinaire.
Bénéfices attendus
Le nombre minimal d’animaux par groupe et ou/sexe suit les recommandations des lignes directrices dans le but de garantir suffisamment d’animaux pour permettre la détection des signes de toxicité au début des premiers essais chez l’Homme ou l’animal). Ces effectifs minimums sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques [tests de normalité variance , comparaison de moyennes par exemple] afin d'interpréter les résultats. L'ensemble des études du projet vise à identifier la tolérance locale des produits, une toxicité d'organe, un potentiel clastogène et aneugène d'une substance, un profil métabolique et pharmacocinétique, et/ou des seuils de toxicité (dose maximale tolérée, dose sans effet...) permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique), la sécurité d’utilisateurs (industrie chimique) ou le bénéfice pour l’animal (industrie vétérinaire).
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3, ou 12 mois pour les études règlementaires]. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.
Devenir
Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments/produits chimiques selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène...) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout isolement d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.
Choix des espèces
Au-delà des aspects pratiques (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent cité car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou connue pour plus de sensibilité à certaines molécules) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’Homme (exemple paramètres immunologiques), le Hamster pour son métabolisme, le cobaye pour la voie dermale ou pour paramètres immunologiques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.
Thérapie cellulaire dans la gestion du diabète et de ses complications
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 232
Rendus diabétiques par une injection unique puis greffés d'îlots pancréatiques sous anesthésie, 232 souris et 232 rats sont tous tués pour des prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ une heure suivie d'une semaine d'isolement, des tests de tolérance au glucose avec jusqu'à dix prélèvements sanguins sur trois à six heures, des prises de sang jusqu'à trois fois par semaine pendant six mois, et une évaluation de la neuropathie par stimulation tactile et thermique des pattes. Alors que la gravité déclarée est sévère, le porteur ne décrit que des "effets indésirables légers", perte de poids, épisodes d'hypoglycémie, jeûne de seize heures et stress lié aux administrations. Il affirme que les modèles animaux "restent indispensables" pour valider la tolérance et l'efficacité du dispositif chez l'humain.
Objectifs
Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires, (4) à un stress lié à l'administration de substance. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).
Devenir
Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.
Etude systémique entre les os et les reins, par analyses morphologiques et fonctionnelles, après une exposition chronique à faible dose d’uranium chez des souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de l'uranium dans leur eau de boisson pendant six mois, passent jusqu'à seize heures seules en cage à métabolisme pour le recueil des urines et des fèces, et subissent des échographies doppler de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever le sang, les reins et les os. Le projet dispose déjà de sphéroïdes, d'organoïdes rénaux et de modèles osseux biomimétiques, et le porteur indique que les souris servent d'abord à évaluer la robustesse de ces modèles sans animaux, puis à observer la relation entre os et rein qu'il juge irréalisable in vitro. Il présente la mutualisation des prélèvements entre partenaires du projet comme sa mesure de réduction.
Objectifs
L’uranium est un métal lourd radioactif naturellement présent dans l’environnement. Du fait de cette présence naturelle mais également de ses propriétés de radioéléments il est utilisé par l’Homme pour diverses applications civiles et militaires. La population générale peut y être exposée par ingestion d’eau de boisson et/ou d’aliments contaminés. Diverses études épidémiologiques et expérimentales ont auparavant montré qu’une exposition environnementale, ou professionnelle à l’uranium peut induire des effets délétères sur les reins et les os connues comme étant les organes cibles de la toxicité aiguë de ce radioélément. Cependant d’importantes lacunes subsistent sur la compréhension des mécanismes à l’origine de cette toxicité ; de plus l’impact de cette toxicité sur la relation qui existe entre ces deux organes est très peu documenté - notamment dans le cadre d’une exposition chronique à faible dose qui correspond au risque d’exposition professionnelle ou de la population générale. Le présent projet permettra de comprendre les réponses biologiques et biochimiques existantes après une exposition chronique à de faible dose d’uranium au niveau des reins et des os ainsi qu’entre ces deux organes qui possèdent une relation physiologique importante. Le projet s’appuiera sur un modèle in vivo de souris non modifiées génétiquement qui a déjà prouvé être un modèle pertinent lors de précédentes études de toxicologie rénale. De plus, afin de limiter l’utilisation d’organismes vivants, le projet s’appuiera également sur différents modèles cellulaires 3D innovants (osseux et rénaux). Ils permettront d’évaluer en amont les mécanismes toxicologiques mis en jeu au cours d’une exposition chronique à faibles doses d’uranium. Les mécanismes et les voies cellulaires altérées au cours des études de toxicologie cellulaire seront par la suite analysés plus finement à l’aide du modèle in vivo dont il est fait mention. L’étude de ces réponses et de ces interactions physiologiques sera effectuée en collaboration avec des spécialistes du tissu osseux ainsi que des spécialistes des interactions protéines-ligands.
Bénéfices attendus
A court terme ce projet a pour objectif de mieux comprendre le comportement et le devenir de l’uranium (séparation en différence espèce chimique, interaction, distribution spatiale) dans les compartiments intra et extra-cellulaires des différents modèles osseux et rénaux chez l’animal, d’identifier les voies de signalisations cellulaires impactées, et différents biomarqueurs au sein et entre ces deux organes après une exposition chronique à faible dose. A plus long terme, ce projet a pour objectif de permettre une meilleure compréhension et une meilleure prise en charge des risques pour les populations et la santé humaine à la suite d’une contamination interne aux radionucléides.
Procédures
L’exposition par eau de boisson sera faite avec une surveillance du poids des biberons et du poids des animaux ; il n’est pas attendu de nuisance importante par rapport à l’exposition en cohérence avec les précédentes études publiées ; l’exposition interne à l’uranium doit conduire à une irradiation dans le domaine des faibles doses. Les animaux seront hébergés pendant un maximum de 16 heures individuellement en cage à métabolisme à 2 mois et/ou, 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Les analyses échographiques sont non-invasives et effectuées sous anesthésie : l’échographie aura lieu sous anesthésie légère pendant 30 à 45 minutes sous monitoring cardiaque et respiratoire. Elles seront réalisées avant l’exposition et à 2 mois et/ou 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Un prélèvement de sang est réalisé sur animal anesthésié juste avant son euthanasie de l’animal (2 min).
Impact sur les animaux
L’étude est susceptible de provoquer un léger stress chez les animaux qui seront amenés à être manipulé notamment lors du passage en cage spécifique pour la collecte d’urines et de fèces ; ainsi que pour le suivi par échographie doppler qui nécessitera une anesthésie préalable.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés avant d’être mis à mort à la fin de l’exposition pour prélèvement terminaux (sang, reins, os) qui seront par la suite utilisés à des fins histologiques (marquages des tissus pour localisation de biomarqueurs cibles au sein des tissus), ainsi qu’en biochimie et biologie moléculaire (expression de gènes cibles, quantification de protéines et de marqueurs d’atteintes toxicologiques/pathologiques).
Remplacement
Le projet comprend l’utilisation de modèles cellulaires innovants dont des sphéroïdes et organoïdes rénaux ainsi que des modèles osseux biomimétiques qui permettront d’évaluer une réponse toxicologique et de mettre en avant des voies de signalisation propres à l’organe d’intérêt du modèle utilisé (reins ou os). L’utilisation d’animaux au sein de ce projet permettra dans un premier temps d’évaluer la robustesse du développement de nos nouveaux modèles 3D (application des principes de remplacement) ; mais également d’analyser les réponses biologiques et biochimiques à l’uranium au niveau systémique et donc d’intégrer les relations hormonales existantes entre les os et le rein ce qui n’est pas réalisable à l’heure actuelle avec des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide de calcul statistique afin d’aboutir à un effectif minimal qui permettra un traitement des données statistiques à la suite de la procédure expérimentale. Les souris euthanasiées permettront de fournir des échantillons biologiques de façon mutualisées (os, reins, fluides biologiques etc) pour tous les partenaires impliqués dans le projet et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés si les études in vivo avaient été divisés entre les partenaires du projet.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe maximum de 5, avec un enrichissement supplémentaire (ouates, maisons…) comme mesure de raffinement. L’isolement pourra être fait uniquement en cas d’agression entre congénères. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Les points d’arrêt définis dans le projet seront appliqués à tous les animaux de l’étude présentant des signes comportementaux ou cliniques d’atteinte et conduiront à la mise à mort anticipée de l’animal (application du principe de raffinement).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est un modèle bien décrit dans la littérature. De plus les précédentes études sur la physiopathologie rénale effectuées au laboratoire après exposition interne à l’uranium ont permis à l’équipe porteuse des procédures d’expérimentation animale d’acquérir une expertise sur ce modèle de souris. Les animaux seront des adultes de 6-8 semaines au moment du début de l’exposition chronique. A cet âge, la physiologie rénale et osseuse est mature. Les animaux seront hébergés et mis en groupe à l’âge de 5 semaines afin de limiter les agressions entre congénères.
Impact de mutations humaines du gène GRID1 associées à une déficience intellectuelle sur les propriétés anatomiques et fonctionnelles du cerveau de souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour reproduire des mutations humaines du gène GRID1 liées à une déficience intellectuelle, 324 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 300 d'entre elles, les 24 autres étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux de trente à quarante-cinq minutes, un prélèvement de liquide céphalorachidien, un prélèvement sanguin et une amputation de deux millimètres de queue pour génotypage, toutes étant tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit une perte de poids et une douleur de vingt-quatre à quarante-huit heures après chirurgie, ainsi qu'un risque de détresse respiratoire ou d'arrêt cardiaque sous anesthésie, et qualifie ces chirurgies d'"indispensables" à son projet. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour éviter, écrit-il, la souffrance qu'entraînerait leur réveil après la ponction de liquide céphalorachidien.
Objectifs
Les protéines impliquées dans la communication entre les neurones jouent un rôle important dans le fonctionnement du cerveau, et des mutations humaines de ces protéines sont associées à la schizophrénie et à l'autisme. Il a récemment été identifié des mutations de ces protéines liés à une déficience intellectuelle avec paraplégie spastique, avec ou sans glaucome. L'expression de ces mutants dans des cultures neuronales de souris entraîne une altération de la physiologie du neurone et des connexions entre neurones. Il a également été généré une lignée de souris mutantes comportant une de ces mutations. Ce projet vise à : i) caractériser les altérations de ces souris mutantes aux niveaux neurophysiologiques, neurochimiques, anatomiques et génomiques afin de les comparer aux altérations observées par nos collaborateurs chez les patients humains, ii) caractériser l’impact de l’expression à l’âge adulte des récepteurs mutants susmentionnées sur les propriétés anatomiques et électrophysiologiques des neurones de souris sauvages pour en distinguer les effets aigus des effets neurodeveloppementaux. Ce projet permettra de caractériser les signatures pathologiques et les processus physiopathologiques liés aux mutations humaines de ces récepteurs.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des pathologies liées aux variants des récepteurs du glutamate chez l’humain (schizophrénie, autisme, déficience intellectuelle, paraplégie spastique) et à identifier des cibles pour de futures thérapies visant à les soigner.
Procédures
Les animaux subiront une des trois interventions suivantes : 1) Prélèvement sanguin sur animaux adultes de 2 mois sous anesthésie générale gazeuse et sous anesthésie locale. Cette procédure dure 5-10 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 2) Prélèvement de liquide céphalorachidien sur animaux adultes de 2 mois sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 3) Injections intracérébrales de vecteurs viraux sur animaux de 4-6 semaines sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4-6 semaines après l’injection, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire (15 min).4) Prélèvement caudal (2mm de long) à des fins de genotypage durée : 15min
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent d’exprimer les récepteurs d’intérêt à l’âge adulte dans des régions cérébrales spécifiques afin d’en distinguer les effets aigus et locaux des effets neurodeveloppementaux ou indirects. Durant les phases d’anesthésie, les animaux pourraient subir un stress thermique, une détresse respiratoire ou un arrêt cardiaque. Pour les besoins de genotypage, les souris subiront un prélèvement caudal qui pourrait causer un stress ou une douleur de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques génomiques, anatomiques et fonctionnelles du tissu cérébral, soit afin de valider le protocole de prélèvement post-mortem du liquide céphalorachidien, soit encore afin d’éviter la souffrance au réveil après prélèvement du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale.
Remplacement
Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude de l’impact sur les structures et les fonctions cérébrales d’une mutation bi-allélique responsable de déficience intellectuelle et de paraplégie spastique chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été calculé considérant l’expérience des utilisateurs de l’équipe en chirurgie, électrophysiologie, histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire et des données de la littérature, et sur la base d’un seuil de significativité et d’un calcul de puissance. Compte tenu de l’expérience des utilisateurs de l’équipe et des taux de succès indiqués dans la littérature, le nombre d’animaux utilisés a été réduit aux besoins minimaux d’apprentissage et de test et à la détection d’une différence significative entre les souris sauvages et mutantes. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nbre total d'animaux:324
Raffinement
Les animaux sont hébergés en accord avec la directive 2010/63/EU . Ils sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. Ils sont visités chaque jour. Ils seront acclimatés 5 à 7 jours dans la zone d’hébergement et manipulés chaque jour pour réduire le stress le jour de la procédure. Pour les procédures avec chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les points limites seront : a) une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire, b) modification du comportement caractéristique d'une douleur, détresse ou souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté), c) perte de poids supérieure ou égale à 20 pour cent. Une pesée sera effectuée avant l’anesthésie puis quotidiennement pendant 3 jours après. Les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une dose létale d’euthanasiant. L’euthanasie des animaux par décapitation, exsanguination ou injection d’une dose létale d’euthanasiant sera effectuée par une personne experte.
Choix des espèces
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation du récepteur du glutamate liée à un syndrome associant pathologie nerveuse centrale et périphérique. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Des animaux adultes seront utilisés afin d’évaluer l’impact sur l’animal de la mutation du récepteur du glutamate et de comparer les altérations biochimiques et génomiques avec celles observées par nos collaborateurs sur des patients adultes porteurs de cette mutation et sur des neurones corticaux matures issus de cellules souches pluripotentes humaines portant la même mutation. Des animaux de 4 semaines seront utilisés afin de permettre l’expression des transgènes par les vecteurs viraux (4 à 6 semaines) avant de réaliser les expériences sur les animaux d’âge adulte.
Développement d’une méthode de quantification d’acides gras par spectrométrie de masse chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tués avant tout réveil après un prélèvement de liquide céphalorachidien sous anesthésie, 70 rats servent à mettre au point une méthode de dosage des acides gras par spectrométrie de masse. Le projet ne teste aucun traitement et ne porte sur aucune maladie, il cale une technique analytique sur des organes et des fluides prélevés après la mort, foie, colon, sang, cerveau, urines et fèces. Le porteur indique que la même méthode pourra ensuite être appliquée à des prélèvements humains, et retient comme seule nuisance déclarée le stress du transport vers la salle de chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne remplace "l'animal entier" et conclut que le recours aux rats est "indispensable".
Objectifs
Le projet présenté est un projet de développement technologique qui permet de quantifier des petites molécules dans n’importe quel type de prélèvement. L’objectif est de développer une méthode de quantification des acides gras (courte, moyenne et longues chaînes) dans plusieurs organes ou tissus du rat afin de réaliser une cartographie de ces derniers et permettre de visualiser les échanges en acides gras entre ces tissus. La méthode sera utilisée pour la différentiation de rats sains et pathologiques ou la recherche de biomarqueurs. Les acides gras sont impliqués dans de nombreux métabolismes mais aussi dans de nombreuses pathologies : (i) inflammatoires, particulièrement du système digestif ; (ii) des maladies neurodégénératives, telle que Alzheimer ; (iii) des troubles du spectre de l’autisme. La principale source d’acides gras est l’alimentation. Du système digestif, les acides gras passent par la veine cave pour être distribués aux différents compartiments biologiques tels que le foie, le sang, les muscles, le cerveau. Les acides gras à courte chaîne réagissent avec des récepteurs et sont impliqués dans la communication entre intestin (microbiote intestinal) et cerveau. Les acides gras sont déjà très étudiés mais les études se cantonnent à quelques tissus. La plus-value de ce projet est d’apporter une méthode de quantification des acides gras dans les fèces, l’urine, le foie, le colon, le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR) et le cerveau avec une unique gamme de calibration, permettant des analyses sur différents tissus au cours d’un même examen. La méthode d’extraction des acides gras sera optimisée et spécifique à chaque tissu. L’objet de ce document est de formaliser le prélèvement des différents tissus.
Bénéfices attendus
L’objectif est de visualiser et quantifier les acides gras dans l’ensemble du corps, de leurs productions jusqu’à leurs transformations. Une fois cette méthodologie testée sur des rats, elle pourra être appliquée dans des modèles animaux pour mieux comprendre le rôle des acides gras dans la physiopathologie de maladies notamment cérébrales. La même méthodologie pourra aussi être appliquée sur des prélèvements humains pour explorer le rôle potentiel d’acides gras en tant que biomarqueurs de maladies (diagnostic, évolution, effets de thérapeutiques…).
Procédures
Prélèvement du Liquide céphalo rachidien sous anesthésie gazeuse : 1 fois pendant 3 min.
Impact sur les animaux
Nous ne pouvons pas exclure que les animaux présentent un stress lors du transport vers la salle de chirurgie et du temps de latence avant induction de l’anesthésie, même si l’habituation est censée minimiser tout stress dans ce contexte.
Devenir
Tous les animaux seront euthaniasiés à l'issue du projet. Les organes seront prélevés afin de réaliser des études in-vitro.
Remplacement
Chez l’humain, aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, et ne permet d’étudier la biodistribution des acides gras dans tous les organes d'un individu. De plus, les échantillons humains disponibles de manière non-invasive sont limités aux fèces, à l’urine et de manière invasive au sérum et au LCR. Dans ce contexte, le recours à l'animal est indispensable.
Réduction
L’objectif de ce travail est notamment de pouvoir comparer les quantités des différents métabolites dans les matrices explorées, ainsi que la comparaison des concentrations de chaque métabolite en fonction du sexe par matrice. Les données seront donc analysées par des stastitiques . La mise au point de la quantification sur les différentes matrices nécessite de travailler sur des pools d’animaux pour appliquer différentes méthodes sur un même échantillon. Selon les quantités nécessaires dépendant de chaque matrice, un groupe additionnel de n=10 animaux par sexe sera utilisé. L’effectif global pour ce projet est de n=35 par groupe soit 70 animaux.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle de chirurgie pour diminuer le stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison et/ ou tube en plastique). Les rats seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort. L’induction d’anesthésie et le maintien sera réalisée en gazeux. L’animal sera maintenu sur un tapis chauffant durant toute l’expérimentation. Il recevra une préparation avant le prélèvement: rasage des poils, désinfection et nettoyage de la peau et protection oculaire. Nous assurons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle.
Choix des espèces
L’objectif est de développer une méthode de quantification des acides gras afin de réaliser une cartographie et visualiser leurs évolutions pour être utilisé dans la recherche de biomarqueurs. Le rat est une espèce globalement très utilisée en recherche fondamentale et a effectivement déjà été utilisé dans ce contexte. Le choix du rat vs la souris est aussi motivé par leur différence de taille et l’accessibilité à des quantités d’échantillons par animal plus importante. Le rat est l’espèce la plus adaptée pour cette étude. Nous utiliserons des rats adultes pour réaliser les différentes dissections et prélever les fluides biologiques pour avoir suffisamment de données avant le dosage des acides gras.
Caractérisation in vivo de plusieurs clones de la lignée de cancer colorectal CT26
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rasées puis injectées sous la peau avec des cellules de cancer colorectal, 140 souris développent une tumeur et sont toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont contenues trois fois par semaine pour la mesure de la tumeur au pied à coulisse et anesthésiées une fois par semaine pour une imagerie par bioluminescence, soit quatre séances d'anesthésie par animal. Le projet vise à caractériser une lignée cellulaire "maison" destinée à servir de ressource aux équipes de l'établissement, sans évaluer de traitement. Le porteur affirme qu'aucun point limite ne sera atteint, ni sur la taille de la tumeur ni sur une nécrose de la peau, parce qu'il maîtrise le modèle et arrêtera les analyses avant ce stade.
Objectifs
L'immunothérapie ou les agents bispécifiques sont les voies les plus prometteuses de la recherche sur le cancer. Ces thérapies innovantes visent à réactiver le système immunitaire pour qu'il lutte contre les cellules tumorales qui, autrement, développent des stratégies d'évasion pour échapper à son contrôle. Les molécules ciblées dans ces stratégies pourraient être des molécules de point de contrôle inhibant les fonctions effectrices des cellules immunitaires. Déjà utilisés en clinique, le mode d'action précis de ces traitements innovants et leur effet sur le micro-environnement tumoral restent largement inconnus ou sont parcellaires, les modalités d'analyse développées étant limitées à l'expertise du laboratoire menant l'étude. Ce manque de caractérisation approfondie des modèles précliniques constitue un obstacle majeur à l'élaboration de stratégies expérimentales optimales pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle classe de produits thérapeutiques. Parallèlement, il n'existe actuellement aucun modèle de tumeur syngénique qui permettrait de surveiller efficacement la croissance tumorale et d'étudier le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Ce promet va nous permettre de générer un ensemble de données de ressources qui répondrait à ce défi en concevant un nouveau modèle de tumeur syngénique de "nouvelle génération" de cancer colorectal, la lignée CT26 permettant le suivi in vivo de la croissance tumorale par bioluminescence et couplé à la caractérisation phénotypique et fonctionnelle approfondie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) au cours de la progression tumorale et du microbiome.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est de caractériser in vivo une nouvelle lignée CT26 maison qui sera une ressource pour les membres scientifiques. Cette lignée à double rapporteur permettra un suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale par bioluminescence et introduira de l'ovalbumine (OVA) dans la tumeur qui permettra d'étudier le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral utilisé et nous pouvons nous assurer de la bonne mise en place de modèles tumoraux. Cette approche est rare et pourtant elle apporte un énorme bénéfice dans l'analyse longitudinale des projets de recherche fondamentale et appliquée dans le domaine de l'oncologie.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir des meilleurs résultats en imagerie et éviter l’auto fluorescence des poils, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. Les animaux seront ensuite soumis à une injection de cellules unique le jour même au niveau du flanc gauche avec maintien en contention de la souris, cela peut durer 2 minutes par souris. Tous les animaux seront soumis à une contention 3 fois par semaine pour la mesure de tumeur par calliper et pour l'imagerie par Bioluminescence une fois par semaine. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale (durée 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette procédure, nous allons injecter par voie sous-cutanées des cellules tumorales à des souris. L'injection dure quelques secondes et peut entrainer un stress léger de courte durée pour l’animal. Nous n’attendons pas d’effet additionnel lié aux injections des cellules tumorales. Les effets indésirables liés à la présence de tumeurs ou métastases peut provoquer un léger inconfort en fonction de la taille de la tumeur comme une gêne dans le déplacement. Si un problème de respiration suite à des métastases pulmonaires est observé. L’animal sera ainsi surveillé de très près. Notre bonne maitrise du modèle tumoral nous assure de l'absence d'atteinte de points limites liés à la taille de la tumeur, métastases ou à une éventuelle nécrose de la surface de la peau, car nous effectuerons les analyses avant cette période de la croissance tumorale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélévements sanguins et de la tumeur pour le suivi de marqueurs sériques et la caractérisation histologiques.
Remplacement
Ce projet vise à développer un nouveau modèle tumoral qui va nous permettre d'utiliser nos compétences en imagerie pour la recherche en oncologie et à la fois de caractériser le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Après avoir valider nos modèles tumoraux in vitro, nous avons besoin de valider que ses cellules injectées dans un organisme vivant peuvent formés une tumeur solide sur lequel on peut effectuer des traitements et suivre ainsi le volume de la tumeur. Seul le modèle animal vivant permet cet usage et la souris est le modèle de référence pour les recherches en oncologie.
Réduction
Nous prévoyons dans ce protocole d'injecter 20 animaux par clone de cellules et par concentration et 20 animaux pour la lignée contrôles pour un total de 140 animaux afin de permettre de bien caractériser le suivie de la tumorale. Sachant que statistiquement prêt de 5% des animaux peuvent ne pas avoir des tumeurs ou avoir des poussées tardives. Le but du projet vise à réduire le nombre d'animaux employés en recherche préclinique en oncologie plus tard. En effet, l'approche longitudinale remplace les mises à morts à des stades étagés et permet donc une réduction globale dans ces projets
Raffinement
Les animaux seront injectés par voie sous-cutanée, soit un geste de quelques secondes. Ils seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine pour s'assurer de leur bien-être. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral injecté et nous connaissons notamment sa croissance et les éventuelles conséquences sur la santé de l'animal. Nous pouvons affirmer qu'aucun point limite ne sera atteint pour ces animaux en lien avec le modèle tumoral, que ce soit en lien avec la taille de la tumeur ou son état (nécrose par exemple).
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en recherche préclinique en oncologie pour le développement des nouveaux modèles et tester des nouvelles cibles thérapeutiques Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines lors de l'injection, cela correspond à l'âge auquel nous avons généré le plus grand nombre de données sur ce modèle.
Étude de la dysfonction coronaire microvasculaire et de sa prévention par échographie chez le petit animal (½)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation qui les rend diabétiques et obèses, elles reçoivent un gavage quotidien six jours sur sept pendant douze semaines et subissent quatre échographies cardiaques de trente minutes sous anesthésie, avec épilation à la crème et injection intrapéritonéale d'un vasodilatateur. Le porteur affirme que ce protocole d'imagerie n'entraînera "pas de douleur, souffrance ou angoisse", et ne retient comme nuisances que le stress du transport pédestre entre bâtiments et celui du réveil d'anesthésie. Il justifie la mise à mort par la "nécessité" d'objectiver l'atteinte des microvaisseaux coronaires après la mort, pour un médicament déjà largement prescrit en clinique.
Objectifs
Les maladies des artères coronaires sont responsables d’une augmentation de la mortalité cardiovasculaire. L’objectif de cette étude est d’étudier la possibilité de la prévention de ces maladies en utilisant un traitement contre l’insuffisance cardiaque (Entresto) dont les effets coronaires sont inconnus à ce jour, dans un modèle de souris obèse diabétique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra l’évaluation de la capacité de l’Entresto à prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire.
Procédures
Les animaux prendront part à plusieurs imageries échographiques cardiaques réalisées à 8, 12, 16 et 20 semaines d’âge. Elles se feront sous anesthésie volatile et dureront 30 min maximum pour chaque souris. Durant les acquisitions les souris seront épilées au niveau de la zone d’intérêt avec une crème épilatoire pour peaux sensibles, elles seront sur un lit thermostaté pour compenser la chute de température corporelle liée à l’anesthésie et recevront un gel ophtalmique pour prévenir toute sécheresse oculaire. Les échographies auront lieu dans un autre établissement utilisateur que l’hébergement, Le transport des animaux vigiles prendra environ 10 min et se fera par voie pédestre dans des conditions de raffinement maîtrisées en utilisant des cages isolées des stimuli extérieurs. A partir de l’âge de 8 semaines et immédiatement après la 1ère échographie, une solution d’Entresto diluée dans du liquide physiologique sera administrée quotidiennement par gavage aux animaux du groupe traité jusqu’au terme du protocole, c’est-à-dire pendant 12 semaines, soit jusqu’à 20 semaines d’âge. Le volume administré quotidiennement per os sera de l’ordre de 300 µL. Les animaux des groupes diabétiques et contrôles non traités se verront administrer un volume similaire de liquide physiologique. Une trêve dominicale sera observée pour tous les animaux (traitement 6 jours / 7 pendant 12 semaines), compatible avec la pharmacocinétique de l’entresto décrite chez le rongeur. Un prélèvement sanguin caudal sera effectué sur les animaux vigiles à 8 et 20 semaines pour dosage plasmatique d'un marqueur d’efficacité du traitement.
Impact sur les animaux
L’imagerie échographique cardiaque implique l’administration intrapéritonéale d’un agent vasodilatateur qui sera réalisée sous anesthésie volatile afin de limiter le stress aux animaux. Le transport et le changement d’animalerie peuvent aussi induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport, pédestre, sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que les deux prélèvements caudaux peuvent également causer un stress léger. En revanche, aucun effet indésirable n’est attendu comme conséquence de l’administration de l’Entresto, qui est largement utilisé en clinique.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la nécessité d’objectiver la dysfonction coronaire microvasculaire par des études immunohistochimiqes post-mortem.
Remplacement
Les atteintes des microvaisseaux coronaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. De plus, l’évaluation de l’effet de l’Entresto sur la microcirculation coronaire doit être effectuée in vivo pour que l’on puisse envisager une extrapolation des résultats à la situation clinique.
Réduction
L’utilisation de 24 animaux au total se répartissant en 8 animaux / groupe est un minimum pour l’analyse fiable des résultats. Nous fondons ce dimensionnement sur une étude préalable ayant mis en évidence une dysfonction coronaire microvasculaire par réduction significative de la réserve coronaire in vivo chez des rats obèses avec des effectifs similaires. Nous comptons également sur l’absence de mortalité observée précédemment au décours de ce protocole expérimental pour limiter au maximum la taille initiale des groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites stricts et spécifiques au modèle animal et aux actes réalisés sont mis en place, via une grille de scoring, afin d’évaluer une potentielle souffrance. Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson en raison de la polydipsie des animaux diabétiques sera réalisée, et la fréquence de change des cages sera augmentée si nécessaire. Les sessions d’imagerie échographique cardiaque se dérouleront sous anesthésie volatile, avec une anesthésie d’environ 30min. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et les fréquences respiratoire et cardiaque seront monitorées en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie échographique cardiaque n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse.
Choix des espèces
La lignée de souris choisie possède une mutation génétique qui la rend diabétique. Le modèle est très largement utilisé pour l’étude de maladies métaboliques car il reflète bien la maladie humaine , tout en étant moins sévère que d’autres modèles. Ce modèle constitue donc un outil largement utilisé pour l’étude de la maladie coronaire microvasculaire et de sa prévention. Les animaux seront accueillis à 7 semaines d’âge, à un stade de développement précoce de la maladie diabétique entraînée par la mutation dont ils sont porteurs. Le choix de ce stade précoce est guidé par la volonté d’étudier le potentiel de l’Entresto à prévenir la maladie coronaire microvasculaire.
impact d’une exposition alimentaire à des pesticides seuls ou en cocktail sur l’homéostasie métabolique dans des conditions d’alimentation standard et déséquilibrée
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour mesurer l'effet de pesticides alimentaires sur le métabolisme, 256 souris sont utilisées pendant vingt-six semaines dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les organes. Nourries avec un régime riche en graisse contenant des pesticides seuls ou en mélange, elles développent une obésité, un diabète et une accumulation de graisse dans le foie. Le porteur décrit ces perturbations comme survenant "sans souffrance visible des animaux", et retient parmi les nuisances le stress de contention, les piqûres, les gavages et l'isolement de vingt-quatre heures en cage à urines. Le lien entre pesticides et troubles métaboliques a déjà été rapporté chez l'humain par la cohorte NutriNet-Santé, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit le dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux.
Objectifs
L’incidence des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2 et stéatose hépatique) a augmenté ces 30 dernières années et constitue un enjeu majeur de santé publique. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation riche en lipides), de nombreuses études appuient l’hypothèse que l’exposition à des contaminants environnementaux, tels que les pesticides, est un facteur de risque au développement de ces pathologies. Dans ce projet nous travaillerons sur un modèle murin d’exposition alimentaire aux pesticides pour mimer l’exposition des consommateurs. Les animaux seront exposés à des pesticides seuls ou en mélange à des doses non toxiques telles qu’elles sont définies par les agences réglementaires, dans des conditions d’alimentation équilibrée ou déséquilibrée (riche en graisse). Nous suivrons les marqueurs caractéristiques des pathologies hépatiques non alcooliques, du diabète et de l'obésité tout au long de l’expérience qui durera 26 semaines.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire aux pesticides seuls ou en cocktail dans un contexte d’alimentation équilibrée ou d’alimentation déséquilibrée source de troubles métaboliques. Ce projet apportera des arguments en faveur ou non du lien entre exposition aux pesticides et le risque de développer des pathologies métaboliques rapporté dans des études récentes réalisées dans la cohorte Française Nutrinet santé.
Procédures
Les animaux seront nourris avec un régime contrôle ou un régime riche en graisse contenant les pesticides. Au cours des 26 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests pour évaluer la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour ces tests, le glucose et l’insuline seront administrés après 6h de jeûne. Les gestes de contention et de gavage dureront moins de 30 secondes par animal. Pour les mesures de taux de glucose sanguin (glycémie), le prélèvement d’une seule goutte de sang sera réalisé à la queue. Ces tests seront réalisés en alternance et espacés au minimum d'une semaine, et réalisé seulement 2 fois au cours des 26 semaines. Des prélèvements intermédiaires de sang qui prennent environ 15 secondes, pourront aussi être réalisés. Les animaux seront placés individuellement pendant 24h dans des cages adaptées à la récolte des urines. Avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la joue.
Impact sur les animaux
Le régime utilisé dans cette expérience est riche en graisse. Il induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées comme un diabète, une accumulation de graisse dans le foie, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le prélèvement sanguin et l’administration de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, à la piqûre, bien que légère, au gavage, bien que très rapide, ainsi qu’une légère douleur (piqûre). L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine peut entraîner un stress de l’animal.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires). En effet, la stéatose hépatique non alcoolique est caractérisée par une accumulation de lipides dans le foie qui viennent majoritairement du tissu adipeux ; de plus le microbiote intestinal joue un rôle prépondérant dans son développement et sa progression.
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur des études similaires précédentes et en respectant la règle des 3R. Le nombre idéal d’animaux par groupe est donc de 16, et avec un total de 256 animaux.
Raffinement
Comme il est convenu réglementairement, les animaux seront hébergés dans des cages de 4 à 5 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. En ce qui concerne les cages à métabolisme, les souris disposeront également d'un abri en inox. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme respiratoire) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal, une absence totale et pérenne des 5 signes indiqués, ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition de la MASLD. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques.