Rongeurs

Tous tués au terme de l'étude pour analyse de leur œil, 104 rats aveugles et immunodéprimés reçoivent une greffe de cellules rétiniennes humaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sept anesthésies en trois mois pour la chirurgie intraoculaire, l'imagerie et l'enregistrement de l'activité électrique de la rétine. Le porteur signale des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires possibles après injection, une perte de poils liée à la lignée qui s'accumule sous les paupières, et une mise à mort immédiate en cas d'inflammation ou d'infection de l'œil. Il retient un taux d'échec de 20 à 30 % lié à la chirurgie, au rejet de greffe ou à l'opacification du cristallin, chiffre intégré au calcul des effectifs.

Objectifs

Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire visant à remplacer l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dysfonctionnel ou perdu constitue une piste déjà très avancée avec l’incroyable potentiel thérapeutique des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS). le projet consiste à greffer des cellules de patients RP modifiées génétiquement pour corriger la mutation à l'origine de la pathologie. Ainsi, cela permettra de démontrer que les cellules de patients sont devenues fonctionnelles.

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à partir de cellules souches pluripotentes humaines différenciées en cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) pour préserver la vision dans ces maladies.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette opération consistera en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) de trois types de cellules de la rétine différentes assemblée en un feuillet de cellules. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Cette opération sera rapide et durera 15 à 20 minutes. Elle ne sera réalisée qu’une seule fois par rat. Tous les animaux seront examinés par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (15 minutes par rat) et feront également l'objet d’un examen de l'activité électrique de la rétine (30 minutes par rat) qui permettra l’étude de la fonction de ce tissu. Ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront également évalués avec un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière. Ce test de la fonction visuelle est rapide (5 à 10 minutes environ). Tous ces examens seront réalisés une fois par mois (pendant 3 mois). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'oeil.

Impact sur les animaux

-Anesthésies : 7 fois par animal au cours de l’étude qui dure 3 mois (risque cardio-respiratoire et d’hypothermie) -Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. -Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). -Le phénotype nude entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d'évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n'est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d'un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul oeil ; l’oeil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..)) lors de nos précédentes études aux approches similaires. Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés aux petits effectifs. Au total, 104 animaux sont prévus pour cette étude.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l'accès à l'eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d'analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’ inflammation ou d’infection de l’œil entraînera l’euthanasie.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques permettent une comparaison des résultats avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront opérés à 4 ou 5 semaines (début de la dégénérescence des photorécepteurs). L'ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation : à 2, 3 et 4 mois, le stade le plus tardif prévu par l’étude.

1 680 souris et 3 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'étude histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à deux chirurgies cérébrales, des administrations répétées de nanoparticules et, en option, cinq à six heures d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie. Le porteur décrit une récupération difficile après chirurgie, mobilité réduite, attitude de repli et poil terne, et affirme par ailleurs que le modèle de maladie neurodégénérative "n'entraîne pas de symptôme marqué". La description des procédures tient en quatre lignes pour 4 800 animaux, et les tests comportementaux annoncés au titre de la réduction ne sont jamais précisés.

Objectifs

Actuellement, Les maladies neurodégénératives ne possèdent pas de traitement curatif, mais seulement des traitements symptomatiques ayant un effet limité, accompagné d’effets indésirables. Le but de ce projet est de développer un outil thérapeutique visant à restaurer la voie de « nettoyage » des neurones en permettant ainsi l’élimination de protéines qui s’agrègent et tuent les neurones. Les lysosomes sont des organites cellulaires impliqués dans la survie des cellules, en dégradant certaines molécules anormales qui s’accumulent provoquant ainsi des pathologies neurodégénératives. Or chez les patients atteints de certaines formes de ces pathologies, la fonction lysosomale est perturbée et ne permet donc plus le nettoyage cellulaire dans les neurones, entrainant leur mort. La stratégie de ce projet est donc de développer et tester via différents modes d’administration des nanoparticules contenant des molécules permettant de refonctionnaliser la voie de « nettoyage » des neurones dans différents modèles animaux de la Maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Les synucléinopathies comme la maladie de Parkinson touchent plus de 100.000 personnes en France, dont 80% sont âgées de plus de 65 ans, au cours des années à venir nous allons observer une augmentation importante du nombre de cas en raison du vieillissement de la population et de l'amélioration de l'espérance de vie. De ce fait la découverte d’un traitement curatif utilisant des nanoparticules est un des grands axes de notre recherche. Ce projet s’inscrit dans une optique à long terme avec à terme une application clinique du composé utilisé.

Procédures

Chirurgie : au maximum deux chirurgie de 30 minutes. Traitements avec les différents modes d'administration. Récolte d'urine excrétée. Enregistrements électrophysiologiques (optionnels) durée 5 à 6h sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Effets liés à la chirurgie, mais bien encadrés au niveau analgésie et avec un suivi postopératoire sur 3 jours minimum. Effets liés à la chirurgie pour les enregistrements électrophysiologiques (optionnels). Le modèle neurodégénératif chez la souris ou le rat n'entraine pas de symptome marqué, en effet les désordres sont plutôt visibles à l'échelle moléculaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau.

Remplacement

Dans le respect du R de remplacer, dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement spatiotemporel des synucléinopathies dans des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé par une approche statistique afin d'obtenir des résultats significatifs en réalisant une cohorte par groupe. Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Les organes étudiés en fin de procédure représenteront une banque de tissus utilisable pour d'autres analyses ultérieures au sein de notre Institut (cerveau en général et pour ce projet particulièrement reins, foie).

Raffinement

Acclimatation : une période de deux semaines d'acclimatation permet aux animaux de se familiariser avec leur nouvel environnement. Les animaux sont hébergés dans des cages transparentes placées sur portoirs ventilés et maintenues à 21°C et 55% d’humidité. L'enrichissement de leur milieu est représenté par des maisons en papier mâché que les animaux peuvent utiliser pour se cacher ou ronger. Des batonnets de bois sont aussi intégrés dans les cages pour permettre aux animaux de ronger. Anesthésie et analgésie : la douleur et l’inconfort générés par la chirurgie et les méthodes d’administration sont maitrisés par un recours à l’anesthésie (gazeuse) et l’utilisation d’analgésiques. Des points limites adaptés pour les deux espèces sont uivis : une mobilité réduite voir difficile suite à la chirurgie, une attitude de repli, une allure du poil terne et mal nettoyé (difficulté à récupérer le poids initial) dans les jours suivant la chirurgie. Un suivi post-opératoire est dans tous les cas réalisé grâce à une fiche de scorage qui évalue la perte de poids, la mobilité, les interactions avec les congénères, aspect du poil. Les animaux sont pesés de manière hebdomadaire pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus du rat largement transférables à l'homme. De plus, ces espèces permettent d’utiliser des animaux modifiés génétiquement. Les animaux sont utilisés à l'age adulte, de jeune adulte afin d'induire les modèles jusqu'a un age avancé afin de tester l'effet curatif des traitements.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis allaitantes reçoivent des nanoparticules directement dans la trachée, une fois par semaine pendant six semaines, et leur descendance subit des mesures de fonction pulmonaire d'une heure à plusieurs stades de sa vie. Le porteur reconnaît que ces expositions répétées pourraient perturber le comportement maternel et provoquer des anomalies de développement chez les souriceaux. Il affirme dans le même temps que les femelles "tolèrent" l'exposition sans nuisance particulière, et présente le projet comme une contribution à l'évaluation des risques pour les femmes enceintes et allaitantes.

Objectifs

Les nanotechnologies sont en plein essor depuis le début du XXIème siècle. Les propriétés exceptionnelles des nanoparticules, acquises par leur taille nanométrique, les rendent intéressantes dans de nombreux secteurs industriels (agroalimentaire, cosmétique, pharmaceutique etc.). Cependant, leur utilisation exponentielle suscite des inquiétudes quant à leurs potentiels effets sur la sante de l’Homme et sur l’environnement. En effet, en raison de leur présence dans de nombreux produits du quotidien (produits cosmétiques, alimentation, produits d’entretien, expositions professionnelles etc.), nous y sommes régulièrement exposés, que ce soit par voie cutanée, orale ou pulmonaire. Des analyses toxicologiques sont donc nécessaires pour connaitre les risques liés à leur utilisation, notamment dans le cadre d’expositions pendant la période périnatale, lorsque l’organisme en développement est particulièrement sensible aux agressions environnementales. Des études récentes réalisées chez la souris ont montré que des nanoparticules administrées à des femelles gestantes ou lactantes peuvent atteindre le fœtus, traversant la barrière placentaire via la circulation sanguine, ou le souriceau après passage dans le lait maternel. Les conséquences de ces expositions périnatales jusqu’à l’âge adulte sont encore peu étudiées, il apparait cependant qu’elles peuvent provoquer des défauts dans divers organes (reins, foie, organes sexuels) chez la descendance. Une étude a montré qu’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la gestation (voie pulmonaire) provoque des anomalies de développement pulmonaire chez la descendance. Ce présent projet s’inscrit dans leur continuité. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition maternelle aux nanoparticules pendant la période de lactation sur le développement et la fonction pulmonaires de la descendance et d’évaluer les potentiels effets combinés d’une exposition pendant la gestation et la lactation, à l’aide d’approches in vivo et in vitro complémentaires. Dans un premier temps, nous effectuerons des tests qui nous permettront de mettre au point un protocole d'exposition optimal, permettant une exposition post natale la plus précoce possible, avec un minimum de dommages pour la descendance. Les résultats obtenus permettront de contribuer à l’évaluation des risques liés à ce type d’exposition chez les femmes enceintes, allaitantes et leurs enfants.

Bénéfices attendus

Bien que l’impact d’une exposition directe aux nanoparticules sur le site d’exposition (poumons, système digestif) ait été bien décrit ces dernières années, les conséquences d’expositions maternelles aux nanoparticules sont relativement peu étudiées et se concentrent sur le développement prénatal de la descendance. Les analyses des conséquences à l’âge adulte d’expositions périnatales à ces nanoparticules sont rares, notamment dans le cas particulier du développement pulmonaire. Ce projet nous permettra donc d’en apprendre davantage sur la toxicité des nanoparticules chez la souris, dans un modèle in vivo permettant d’étudier la transmission de ces particules de la mère à la descendance (circulation sanguine, lait maternel) et ses conséquences sur le développement pulmonaire des souriceaux dans des conditions physiologiques. Ce projet aura pour bénéfice de contribuer à l’évaluation des risques liés à des expositions périnatales aux nanoparticules pour les femmes enceintes, allaitantes ainsi que leurs enfants.

Procédures

Les femelles gestantes et lactantes seront soumises à des expositions pulmonaires nanoparticules (administration par voie pulmonaire via la trachée) aux sous anesthésie de manière hebdomadaire pendant 6 semaines (geste technique réalisé en quelques minutes, réveil et récupération rapides pour l’animal). La descendance sera soumise à des mesures longitudinales non invasive de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leurs vies.

Impact sur les animaux

Les souris femelles tolèrent l’exposition aux nanoparticules pendant la gestation sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. La mesure de la fonction pulmonaire, non invasive, n’induit pas d’effets indésirables. Dans le cadre de ce projet, les expositions comprendront la période de gestation ainsi que celle de lactation. L’exposition des femelles chaque semaine pendant la gestation puis la lactation pourrait induire un stress conduisant à des troubles du comportement maternel. Des anomalies de développement pourraient apparaitre chez la descendance, une attention particulière sera portée à leur croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux nanoparticules (prélèvement d'organes).

Remplacement

Notre étude porte sur l’impact d’une exposition maternelle aux nanoparticules sur le développement pulmonaire de la descendance. Ces nanoparticules peuvent passer des poumons de la mère à son système sanguin, s’accumuler dans ses organes et enfin atteindre la descendance, en traversant le placenta ou en passant dans le lait maternel ingéré par les nouveau-nés. Cette transmission résulte d'une complexité impossible à modéliser de manière bio-informatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.

Réduction

Nous avons optimisé les protocoles afin d’étudier le phénotype pulmonaire à la fois des mâles et des femelles. Nous réalisons un maximum d’analyses sur le même animal afin d’utiliser tous les animaux générés dans nos procédures et d’en minimiser le nombre, tout en gardant la puissance statistique nécessaire pour mettre en évidence des variations biologiques Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous n’effectuerons que les seules expériences indispensables, et nous efforcerons de réutiliser les animaux lorsque cela est possible, notamment le contingent de mâles d’accouplement nécessaires pour générer des femelles gestantes.

Raffinement

Pour les besoins de notre étude, nous travaillerons avec les femelles gestantes et lactantes particulièrement sensibles au stress. Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser ce stress, notamment en rangeant ces cages aux endroits de plus faible passage dans le box d’hébergement, et en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. Au cours de l’expérimentation, toutes les étapes de la procédure seront réalisées en limitant au maximum la souffrance et l’angoisse animale. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi dans notre projet car la souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, le projet nécessite un modèle mammifère permettant la transmission des nanoparticules de la mère à la descendance par la circulation sanguine et le lait maternel. Or, les quelques études décrivant cette transmission ont été réalisées dans le modèle murin. Le but du projet est de caractériser les effets d’une exposition périnatale aux nanoparticules sur le développement et la fonction pulmonaire jusqu’à l’âge adulte, les poumons se développant chez la souris en pré et post-natal. Le phénotype pulmonaire de la descendance sera analysé à 2 stades : 1) au stade juvénile (jeune non sevré) afin de visualiser les effets d’une exposition post-natale pendant la période de lactation et 2) à l’âge adulte afin d’en évaluer les conséquences à long terme.

273 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur ovarienne humaine leur est greffé sous la peau, puis celles qui développent une tumeur subissent une ponction intracardiaque avant la mise à mort et le prélèvement de la tumeur. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, provoquer une perte de poids ou une gêne au déplacement, la mise à mort intervenant quand elle dépasse 12 mm. Il affirme le recours à la souris "indispensable" faute de modèle alternatif, tout en annonçant que les tumeurs entretenues sur ces souris serviront ensuite à démontrer l'intérêt des organoïdes tumoraux.

Objectifs

Les cancers de l’ovaire restant particulièrement meurtriers du fait de leur capacité à développer une résistance aux chimiothérapies conventionnelles (association carboplatine/paclitaxel), le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles de surmonter la chimiorésistance constitue un enjeu majeur pour l’amélioration de leur prise en charge. Il est donc indispensable de s’appuyer sur des modèles expérimentaux qui représentent de façon pertinente la pathologie afin d’identifier et valider de nouvelles cibles thérapeutiques, évaluer de nouveaux médicaments et leurs biomarqueurs associés, ainsi qu’étudier les mécanismes de résistance. Il existe donc un réel besoin de s’appuyer sur des modèles expérimentaux capable de refléter au mieux la situation chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire. Il est maintenant largement reconnu que les tumeurs dérivées de patients ou patient-derived tumor xenografts (PDXs) sont très proches de la tumeur du patient et constituent les modèles de référence dans l’industrie pharmaceutique. Ces modèles sont obtenus en implantant des morceaux de tumeurs de patients chez des souris avec un système immunitaire déficient pour permettre la croissance de la tumeur, puis la tumeur est maintenue in vivo par passage successifs de souris en souris. L’objectif de ce projet est de finaliser l’établissement d’un panel de modèles de PDX (22 sont déjà établis et 13 sont en cours d’établissement) afin de pouvoir disposer d’une cohorte représentative de l’hétérogénéité intra- et intertumorale de la maladie.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet en premier lieu qu’il permette de mettre en place un panel de PDX de cancer de l’ovaire qui puisse être utilisé pour les différents projets de recherche du laboratoire. Ces modèles seront utilisés pour tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques identifiées par le laboratoire, permettre l’évaluation de leur biodistribution et de leur toxicité, et identifier/valider des biomarqueurs (dans le sang ou dans la tumeur). Ces modèles seront aussi pour démonter l’intérêt de nouveaux modèles alternatifs tels que les organoïdes tumoraux.

Procédures

Un petit fragment tumoral de cancer de l’ovaire sera implanté en sous-cutané sur un nombre maximal de 273 souris immunodéprimées sous anesthésie générale et après administration d’un dérivé morphinique (analgésie). La plaie est refermée ensuite à l’aide de 3 agrafes. Cette procédure est très rapide (5 minutes maximum). Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels à la suite de l’implantation de fragment tumoraux humains sont : le développement d’un abcès (assez rare en raison de la localisation de tumeur d’origine et de l’expertise du laboratoire dans la réalisation de la chirurgie), la cachexie (perte de poids liée à la tumeur qui est limitée puisque les souris seront euthanasiées dès lors que la tumeur atteindra un diamètre de 12 mm x 12 mm), la formation de métastases (peu fréquentes dans le cadre d’implantations sous-cutanées), ou l’ulcération de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie jusqu’au développement d’une tumeur atteignant la taille éthique. En cas d’absence de pousse tumorale après 12 mois, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Le recours au modèle animal est indispensable dans le cadre de notre étude puisqu’à l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’évaluation de la toxicité, de la biodistribution et de l’efficacité de traitements anticancéreux innovants.

Réduction

Afin d’éviter d’avoir à maintenir les tumeurs sur les souris, des fragments de tumeurs prélevées après euthanasie des animaux seront congelés au fur et à mesure pour permettre de futures réimplantations. Un test de décongélation sera réalisé 2 mois après congélation de fragments tumoraux afin de valider la bonne cryopréservation de ces échantillons. Par ailleurs, à plus long terme, ces modèles pourront être utilisés pour démontrer la pertinence de modèles aternatifs tels que les organoïdes tumoraux, des microtumeurs cultivées dans des boites, étant donné que plusieurs modèles de PDXs et organoïdes tumoraux ont été établis à partir de la même tumeur de patiente. De plus, les molécules à tester pourront être présélectionnés en premier lieu sur les organoïdes tumoraux appariés avant de passer chez l’animal pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une animalerie nude dédiée à raison de 3 souris par cage. Les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Les souris peuvent s’accrocher à la grille de nourriture, aux tétines de biberons, à des balançoires et grimper sur un rebord dans la cage. Les animaux sont hébergés dans des cages avec de la litière en copeaux de peuplier à laquelle y est ajoutée différents matériaux pour permettre aux animaux de confectionner un nid. Des batonnets à ronger et des tunnels en cartons sont également mis à disposition des animaux. Les conditions de cet hébergement répondent aux normes de la directive européenne 2010-63. La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement (7J/7) et 2 fois par jour pendant la période critique : 2 jours suite à l’implantation afin de vérifier le comportement de l’animal. Concernant la procédure chirurgicale (implantation de fragments tumoraux), les souris seront injectées avec un analgésique (dérivé de la morphine) afin de réduire la douleur péri- et post-opératoire. Une anesthésie générale est ensuite réalisée lors de l’implantation sur une table chauffante. Le réveil des souris s’effectue sous lampe rouge afin d’éviter la baisse de température de l’animal. Pour les animaux développant une tumeur, une ponction intracardiaque sous analgésie morphinique et anesthésie profonde sera réalisée préalablement à la collecte de la tumeur et à l’euthanasie de l’animal. Une inspection détaillée et quotidienne de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal. Une souffrance visible liée au développement tumoral (poids tumoral supérieur à 10% du poids de la souris, diamètre supérieur à 12 mm, ulcération de la tumeur ou gêne au déplacement/motricité) est considérée comme point limite. De même, une détresse caractérisée par une perte de poids supérieure à 15% ou une prostration de l’animal sont considérées comme des points limites.

Choix des espèces

L’implantation de cellules tumorales d’origine humaine n’est possible que chez des animaux immunodéprimés ; les souris immunodéprimées sont fréquemment utilisées dans ce type d’étude. Nous avons préalablement comparé différentes souches de souris et constaté que les souris nude de 4 semaines permettait une prise tumorale optimale (en termes de délai de prise tumorale et d’homogénéité entre les animaux).

Tous tués à l'issue, 185 rats reçoivent par gavage de la quétiapine à la moitié de la dose létale 50, seule ou associée à des opioïdes et des benzodiazépines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit s'attendre "possiblement au décès" en raison de la dose choisie, et décrit une sédation pouvant aller jusqu'au coma, avec hypothermie et dépression respiratoire. Chaque rat subit une chirurgie de vingt minutes à une heure, certains jusqu'à vingt prélèvements sanguins sur animal vigile, et ceux porteurs de sondes de télémétrie sont hébergés seuls jusqu'à la fin. L'objectif déclaré est de comprendre la toxicité d'un médicament de plus en plus impliqué dans des surdoses humaines.

Objectifs

La quétiapine est un antipsychotique de plus en plus prescrit dans la prise en charge de la dépression chez les patients bipolaires et dans la prise en charge de la schizophrénie ainsi que chez les patients présentant des troubles anxieux généralisés. En raison de la fragilité de ces patients et l’accès encore peu restreint en comparaison à d’autres médicaments tels que les opioïdes, le quétiapine est de plus en plus mésusée et se retrouvent impliqués dans un nombre d’overdoses grandissant au cours des 4 dernières années en particulier en Europe. Bien que la quétiapine ne soit décrite comme agissant directement sur les récepteurs aux opioïdes, la prise massive de quétiapine semble induire une dépression respiratoire en plus d’un effet cardiovasculaire qui peut aller jusqu’à entrainer le décès du patient, et pour laquelle le mécanisme d’action reste à ce jour inconnu. Ainsi, les effets neurorespiratoires délétères constatés en clinique en cas de surdosage à la quétiapine seule ou lors de poly-intoxications, nous ont conduits à concevoir ce travail expérimental chez le rat, avec pour objectifs de caractériser selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique, les effets toxiques (neuro-respiratoires et cardiovasculaires) induits par l’administration par voie orale de quétiapine seule à forte dose, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central, notamment les opioïdes et les benzodiazépines que l’on retrouvent fréquemment détectés dans les prélèvements sanguins post-mortem des intoxications attribuées à la quétiapine.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité en particulier d’ordre neurorespiratoires et cardiovasculaires induits par l’administration de la quétiapine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre ce neuroleptique et les psychotropes étudiés que l’on retrouve de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients dépressifs, plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi permettre l'optimisation ou le développement de nouvelles thérapeutiques au-delà du simple traitement symptomatologique pour la prise en charge des patients intoxiqués.

Procédures

Pour la caractérisation de la fonction ventilatoire, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (20 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage). Pour l'étude cinétique et métabolique, les animaux subiront tous une procédure chirurgicale (30 mins) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage) + prélèvements de sang sur animaux vigiles (20 prélèvements ; 1 prélèvement : 30 secondes). Pour l'évaluation de la fonction respiratoire périphérique ou la fonction cardiaque, tous les animaux subiront une procédure chirurgicale (45 mins à 1h) + gavages de molécules (30 secondes – 1 minute par gavage).

Impact sur les animaux

On s’attend surtout à des effets indésirables de type sédation pouvant aller d’une réduction de l’activité locomotrice jusqu’au coma en particulier dans le cas des associations médicamenteuses avec hypothermie et dépression respiratoire. De par le choix de la dose (50% de la dose létale 50), on s’attend possiblement au décès. La présence de ces effets, leur durée ainsi que leur intensité varient en fonction des molécules et des associations qui seront administrées. De plus, un stress lié au gavage, aux anesthésies et aux injections pourrait être perçu par l’animal lors des procédures expérimentales. Un risque de fausse route suite au gavage est à prendre en compte. En outre, lors de la quantification de la réponse ventilatoire, les rats seront isolés seuls dans le système dédié pendant 6 heures. De plus, après la chirurgie d’implantation des sondes de télémétrie pour les mesures de la fonction diaphragmatique et cardiaque, les rats seront hébergés en cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation ce qui pourra également induire un stress.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite (atteinte du volume sanguin de prélèvement maximal autorisé) qui requiert la mise à mort des animaux.

Remplacement

L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique du système respiratoire et cardiovasculaire intégrée sur animal entier ainsi que la caractérisation du comportement pharmacocinétique de la quétiapine dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.

Réduction

D'après nos expériences précédentes avec des modèles animaux similaires, il a été déterminé que l'utilisation d'un groupe de 8 animaux est suffisante pour conduire une analyse statistique fiable. Ce nombre de 8 rats par groupe a été prédéfinie par une approche statistique adéquate. De plus, il est prévu d'utiliser le même animal pour les mesures des gaz du sang artériel, les mesures de lactatémie, ainsi que l’étude pharmacocinétique, ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux nécessaires grâce à une technique de dosage par microprélèvements. Enfin, si aucun effet ventilatoire significatif n’est perçu à la suite des associations médicamenteuses, celles-ci ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des antalgiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées . Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.

Choix des espèces

Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est un modèle très pertinent notamment du fait de sa physiologie respiratoire et cardiovasculaire très proche de la physiologie humaine. En plus de sa taille importante qui permet une facilité et une répétabilité des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera la translation des données pharmacocinétiques à l’Homme. Pour les études télémétriques (pléthysmographie, éléctromyographie et électrocardiographie), la pose des sondes est plus aisée et donc plus reproductible. Des rats jeunes adultes âgés de 6 à 8 semaines ayant un poids de 250 à 350 g seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec ce que l'on retrouve dans la littérature scientifique, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances en particulier dans un contexte de pathologie psychiatrique sous-jacente.

Implantées de cellules de glioblastome dans le crâne, 864 souris immunodéficientes reçoivent ensuite deux à trois injections de lymphocytes T humains, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyser leur cerveau. Deux des trois voies d'injection testées passent par une nouvelle chirurgie intracrânienne de vingt-cinq minutes. Le porteur attend des douleurs post-opératoires, une cicatrisation difficile, une perte de masse musculaire, un comportement qu'il qualifie de névrotique, de l'agressivité, de la prostration et un penchement de la tête. Après une première phase sur 324 souris, la voie retenue sera appliquée à 540 souris supplémentaires.

Objectifs

Les glioblastomes sont les tumeurs du cerveau les plus fréquentes, affectant 3 personnes sur 100 000. Elles sont caractérisées par leur grande agressivité, et leur résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique conduit à une survie inférieure à 15 mois chez la moitié des patients atteints. La mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques est donc primordiale. Les immunothérapies, basées sur l’exploitation du système immunitaire du patient, sont extrêmement prometteuses dans le traitement des glioblastomes, et contribuent au développement actuel de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous nous intéressons a une sous-population spécifique de cellules immunitaires, appelés lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs, qui a déjà montré son potentiel pour le traitement de différents cancers, mais n’a pas été exploitée jusqu’ à présent pour le traitement des glioblastomes. Nous avons effectué de nombreuses expériences préliminaires in-vitro montrant que ces lymphocytes T sont capables d’éliminer des cellules cancéreuses provenant de tumeurs cérébrales de patients. Néanmoins, pour compléter ces études in-vitro, il nous faut valider et approfondir les résultats, notamment en déterminant si les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs sont capables d’infiltrer et d’éliminer durablement les tumeurs de cerveau dans un organisme vivant (in-vivo), et ce en utilisant des modèles animaux. L’objectif de cette étude est donc de mettre en évidence les propriétés anti-glioblastome de ces lymphocytes T γδ in-vivo, pour permettre ensuite leur utilisation en essais cliniques.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d’améliorer la connaissance fondamentale des propriétés anti-tumorales de cette sous-population de cellules immunitaires, les lymphocytes T γδ Vδ2 négatifs. Il nous permettra notamment de mieux comprendre comment ces cellules peuvent atteindre la tumeur, la reconnaitre spécifiquement, et l’éliminer. D’autre part, ce projet constituera la première évaluation de l’efficacité de cette thérapie cellulaire chez des organismes vivants. Cette évaluation préliminaire est nécessaire avant tout développement d’essai clinique chez les patients atteints de glioblastome. Ainsi, si les résultats obtenus dans ce modèle sont satisfaisants, on s’attend à des bénéfices sur le long terme en essais cliniques et plus généralement pour la prise en charge des patients atteints de glioblastomes. Améliorer la survie de ces patients est actuellement un enjeu de santé public majeur.

Procédures

La totalité des animaux de ce projet (864 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale unique d’implantation intracrânienne de cellules de glioblastome. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de dix minutes par souris. Suite à cette chirurgie, la taille des tumeurs sera suivie par une méthode d’imagerie non invasive, qui dure 20 minutes environ, et sera réalisée 2 fois par semaine, entre le jour 0 et le jour 28 d’expérimentation (post-implantation). Suite à l’implantation de cellules de glioblastome, les animaux seront injectés 2 à 3 fois par la thérapie cellulaire de lymphocytes T (aux jours 7 puis 14 puis après implantation). Cette injection sera faite selon trois procédures différentes. Les deux premières seront des procédures chirurgicales d’implantation intracrânienne de lymphocytes T, soit au niveau de la tumeur, soit au niveau du ventricule, réalisées sous anesthésie générale plus locale, sur une durée de 25 minutes par souris. La troisième procédure d’injection sera intraveineuse. Ces trois méthodes d’injection de lymphocytes T concerneront chacune 108 souris dans un premier temps (324 souris au total). Puis, dans un second temps, la méthode associée au meilleur bénéfice pour les souris sera sélectionnée, et concernera alors 540 souris supplémentaires.

Impact sur les animaux

Suite à l'implantation dans le cerveau des souris de cellules de glioblastome puis de lymphocytes T, les effets indésirables suivants peuvent être attendus : des douleurs post-opératoires, des points sautés suite à la chirurgie, une cicatrisation difficile, un comportement anormal (dont agressivité, perte de masse musculaire, comportement névrotique, prostration), ou encore un penchement de la tête. Par ailleurs, sur la durée totale des expérimentations, une perte de poids des animaux peut être attendue.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, toutes les souris concernées par ce projet (864 animaux) devront être euthanasiées pour permettre l'analyse de leur cerveau et ainsi l'étude des lymphocytes T injectés et du bénéfice apporté par cette thérapie sur la progression de la tumeur et la survie des souris.

Remplacement

La capacité des lymphocytes T utilisés ici à éliminer des cellules tumorales de glioblastomes issues de différents patients a déjà été démontrée in vitro, posant ainsi de solides bases pour cette étude in vivo. L’utilisation de ce modèle animal répondra uniquement aux questions ne pouvant être élucidées in vitro, notamment en déterminant si les lymphocytes T peuvent migrer jusqu’à la tumeur, l’infiltrer, éliminer les cellules tumorales et améliorer significativement la survie des souris.

Réduction

Grâce à des analyses bioinformatiques et statistiques, nous utiliserons le minimum nécessaire d’animaux pour être statistiquement significatifs et scientifiquement irréprochables. Par ailleurs, un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera effectué par imagerie, ce qui permettra de réduire le nombre de souris par groupe expérimental. Enfin, nous utiliserons toutes les femelles et tous les mâles issus de croisements, ce qui réduit de 50% l’utilisation des animaux.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, et éliminer ou réduire toute douleur, souffrance, angoisse, ou tout dommage durable susceptible d’être infligé aux animaux, leur bien-être sera pris en compte quotidiennement de leur naissance à leur mort et évalué par le personnel zootechnique expérimenté. Notamment, afin de réduire les douleurs liées aux chirurgies d'implantation de tumeurs et aux procédures de transfert de lymphocytes T, des protocoles analgésiques et antalgiques seront mis en place. Un suivi quotidien des animaux permettra aussi de prévenir leur affaiblissement et de prendre une décision rapide quant à leur sacrifice. Enfin, le suivi non invasif de la croissance des tumeurs par imagerie participera à maximiser le bien-être animal.

Choix des espèces

Un modèle de souris (Mus musculus) immunodéficientes est utilisé. Leur système immunitaire ne possède pas de lymphocytes. Ce modèle présente un double intérêt pour ce projet : -Les tumeurs de glioblastomes issues de patients s’y développent de manière très reproductible, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Ce modèle est très pertinent d’un point de vue préclinique, car les tumeurs y reconstituent les caractéristiques complexes observées chez les patients humains. - Ce modèle immunodéficient permet le transfert de lymphocytes T humains sans que ceux-ci ne soient rejetés par le système immunitaire de la souris receveuse. Nous utiliserons des souris âgées de 7 à 9 semaines, qui permettent une croissance tumorale optimale en s’affranchissant de l’affaiblissement d’individus plus âgés.