Rongeurs

Réutilisés pour 2 000 d'entre eux dans d'autres projets, tués pour les autres afin de prélever leurs organes, 3 000 souris et 3 000 rats sont soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des substances jusqu'à trois fois par jour pendant cinq jours, subissent l'insertion d'une bille dans la partie terminale du colon, une privation de nourriture jusqu'à vingt-quatre heures sur grille et un hébergement individuel sur sol grillagé pour que soient comptés et pesés leurs excréments. Une partie reçoit une substance qui provoque artificiellement une diarrhée ou une constipation, afin de tester si un candidat médicament la corrige. Le porteur qualifie ces atteintes de gêne ou d'inconfort, et affirme que les modèles animaux "restent plus adaptés" que les tests in vitro pour évaluer la motilité intestinale humaine.

Objectifs

Les troubles gastrointestinaux constituent un large éventail de pathologies qui affectent l’appareil digestif depuis la cavité buccale jusqu’au rectum affectant plus de 40 % de personnes dans le monde. La diarrhée et la constipation sont les principaux symptômes des troubles de la motilité intestinale. Ils sont associés à un certain nombre de maladies chroniques (tel le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l’intestin) ou à la médication. La constipation est définie par une diminution de la fréquence des selles associée à une difficulté pour les évacuer et se caractérise par un ralentissement du transit et une déshydratation des selles. A l’inverse, la diarrhée est une émission de selles fréquentes, abondantes et de consistance très molle à liquide. Ces troubles sont associés à une morbidité accrue, à un inconfort, à la perte de productivité au travail et à la consommation de ressources médicales. Le présent projet consiste à évaluer d’une part l’effet des substances sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces) et d’autre part le potentiel effet à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives lors de l’évaluation clinique de nouveaux candidats médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament.

Bénéfices attendus

Ces études ont pour objectifs d’évaluer l’efficacité de potentiel nouveaux candidats médicaments à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives et d’autre part évaluer leurs potentiels effets indésirables sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces).

Procédures

Les substances d'essais sont administrées par bolus durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées ( 3 fois par jours au maximum) pendant plusieurs jours (maximum 5 jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont mis à jeun sur grille pour une période n’excédant pas 24h (test compris). L’effet des substances sur le transit du colon est évalué soit après insertion d’une bille dans la partie distale du colon (durée de quelques minutes) ou après évaluation du nombre et de la consistance des fèces récupérées aprés hébergement inviduel des animaux sur sol grillagé (6 h maximum). Dans certains cas, les animaux peuvent recevoir une substance réactive ralentissant artificiellement le transit clonique (administration unique , durant quelques secondes). L’effet reverse des substances sur la diarrhée ou la constipation est évaluée après administration unique ou répétée (2 fois par jours au maximum / durée de quelque seconde) d’une substance réactive induisant la diarrhée ou constipation. Pour les modèles de constipation la prise de poids et la consommation d'eau et de nourriture sont monitorées au cours de l'étude nécessitant un hébergement individuel des animaux pendant au maximum 24h. Enfin, des prélèvements de sang (8 maximum) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes.

Impact sur les animaux

Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire : un stress lié à la privation de nourriture temporaire (pour une durée n’excédant 24 h),à un hébergement individuel (pour une durée n’excédant 24 h), à une gêne ou un inconfort lié à l’induction des modèles symptomatiques de diarrhée ou de constipation, ou à une incommodité lors de l’insertion de la bille dans la partie distale du colon. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, des points limites clairement établis permettraient de sortir l'animal de l'étude.

Devenir

Dans le cas où des prélèvements terminaux d'organes (estomac, intestin...) sont obligatoires, les animaux ne pourront pas être maintenus en vie à la fin de l'étude et seront donc euthanasiés. Dans le cas contraire, (i.e; prélèvements terminaux d'organes non nécessaires pour atteindre les objetifs de l'étude) les animaux seront réutilisés dans un autre projet pour évaluer l'impact de la substance sur le transit intestinal par exemple.

Remplacement

De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne représentent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central et le système endocrinien. Ainsi, les modèles animaux, restent plus adaptés pour évaluer l'effet global des médicaments sur la motilité intestinale pour le développement de nouvelle thérapie et pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) présentent une motilité intestinale similaire à celle de l'Homme et réagissent de la même manière aux substances dont les effets prokinetique ou ralentisseur du transit sont connus. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage, car les substances testées dans ce projet sont principalement destinées pour l'Homme adulte).

Pour étudier le rôle d'une cytokine dans le vitiligo, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements. Elles reçoivent sous la peau du flanc des cellules de mélanome qui déclenchent une réaction auto-immune, puis des injections d'anticorps neutralisants, une résection chirurgicale de la greffe au douzième jour, et des séances répétées d'anesthésie gazeuse pour être pesées, mesurées et photographiées pendant plusieurs mois. Le porteur écrit que le protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris, chiffre supérieur aux 400 déclarées dans les gravités attendues. Sur le remplacement, il indique que les cibles ont été identifiées par des travaux in vitro et in silico, et affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend "nécessaire" le recours aux expériences in vivo.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.

Réutilisés ensuite dans d'autres projets, 90 souris, 90 rats et six macaques subissent des IRM répétées sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut passer jusqu'à 120 examens de deux heures sur cinq ans, avec prises de sang et administrations de molécules le jour de l'examen. Le porteur reconnaît que le stress de la contention et les anesthésies répétées entraînent une perte de poids, et que la stimulation des pattes des rongeurs provoque des douleurs les jours suivants. Quand les rongeurs deviennent trop lourds pour le scanner, il annonce leur transfert vers des projets de formation, ce qui prolonge leur utilisation dans un autre cadre.

Objectifs

Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire (RMN) à travers le développement et la validation d’outils dédiés à la résonance magnétique nucléaire à haut champ, notamment les antennes radiofréquences servant à l’excitation des spins nucléaires et la détection des signaux RMN, et les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux non-proton observables in vivo. Nous mènerons d’une part des expériences chez le rongeur (rat et souris) et le primate non humain sain anesthésié pour développer et valider nos nouveaux outils d’imagerie cérébrale. Nous attendons de ces expériences qu’elles nous permettent d’acquérir des données de référence qui seront comparées aux données de la littérature afin d’apporter la « preuve de concept » que nos outils sont performants et précis. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal sain.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour préfigurer les études de recherche biomédicale et de neurosciences à venir chez le rongeur, le primate non-humain et ultimement chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique.

Procédures

Des prélèvements sanguins (de quelques secondes) seront éventuellement réalisées chez l’animal anesthésié (juste avant, juste après ou pendant l’examen IRM) pour la détermination de certains paramètres physiologiques). Des molécules à dose thérapeutique seront administrés occasionnellement (réalisée typiquement en quelques minutes) le jour de l’examen IRM. Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM sur 5 ans pour les macaques et moins d’une dizaine pour les rongeurs. Un nombre maximal de 5 expériences de stimulations somato-sensorielle (quelques minutes) seront menées par animal durant certains examens IRM.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie répétée peuvent être délétères entrainant typiquement une perte de poids. A noter également que la stimulation somato-sensorielle des pattes chez le rongeur implique le plus souvent des douleurs les jours suivants nécessitant un traitement analgésique.

Devenir

Pour les rongeurs, les dispositifs expérimentaux présupposent un poids maximum au-delà desquels les souris ou les rats (ne peuvent plus être positionnés correctement et de façon stable dans le scanner IRM préclinique. Dans ce cas de figure, nous chercherons à transférer les animaux vers d’autres projets de formation en particulier. Après avis favorable du vétérinaire, les PNH pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.

Remplacement

Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de souris, de rat ou de macaque adulte. Toutefois, la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau ne peut être appréciée à l’aide d’objets-test aussi évolués soient-ils. Le passage par l’expérimentation animale (rongeur ou primate) est donc une nécessité.

Réduction

Nous comptons utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaires à la mise au point et à l’affinement de nos méthodes. Aucun test statistique précis n’est envisagé à ce stade mais les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Pour chaque espèce, les effectifs suffisant pour acquérir des données de références ont été évalué sur la base de nos études précédentes. Chaque animal sera réexaminé à plusieurs reprises avec un intervalle minimum de 15 jours (soit un nombre maximum de 120 examens par animal sur une période de 5 ans). Concernant la détection des variations locales de signal liée à l’activation cérébrale, nous considérons empiriquement que les effectifs prévus seront suffisants pour atteindre une significativité statistique. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de primate nécessaires en recherche biomédicale.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continus afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveiller de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Un contrôle minutieux des points-limites est également mené tout le long du projet afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux . Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces ubiquitaires en recherche biomédicale. L’organisation, la physiologie et le métabolisme du cerveau des rongeurs sont bien connues dans le monde scientifique. Par ailleurs, de très nombreux modèles de souris transgéniques permettent aujourd’hui de valider la pertinence de nos biomarqueurs vers une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques en jeu chez la maladie humaine. Chacune de ces deux espèces de rongeur propose des challenges techniques spécifiques en terme de dimensionnement des dispositifs expérimentaux mais aussi en terme de quantité ou de stabilité des signaux RMN. Ainsi certaines méthodes ne seront pas réalisables pratiquement chez l’une ou l’autre espèce. Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'homme notamment en termes de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (conceptions des équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour les rats, les individus devront être pesés de 200 à 450g. Pour les souris, leur poids devra être compris entre 20 et 40g. Des groupes homogènes en âge seront constitués. Pour le macaque, dans le souci de réduire, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.

255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une molécule par gavage chaque jour de la gestation, jusqu'à 21 fois, le porteur reconnaissant que la répétition accentue la douleur liée à la canule. Leur descendance subit trois tests de mémoire, une électrorétinographie sous anesthésie de 30 à 45 minutes, une IRM et un prélèvement de sang, les mères étant tuées au sevrage des petits. Le porteur espère déplacer "de quelques dizaines de points" le quotient intellectuel de personnes trisomiques, promesse adossée à un modèle murin dont le taux de transmission de la trisomie atteint à peine 30 %.

Objectifs

La trisomie 21 (T21), est due à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental qui touche environ 1 nouveau-né pour 2000 naissances. Elle représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. Plusieurs traitements visant à améliorer le retard mental ont déjà été investigués. Parmi ceux-ci, on trouve une molécule qui a montré des effets bénéfiques dans des modèles animaux mais aussi chez l’Homme à l’âge adulte. Pour autant, peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications importantes se mettent en place très tôt au cours du développement dans la T21. Pour palier a ce manque, une molécule sera administré aux souris femelles gestantes. Suite à ce traitement au cours de la gestation, 4 domaines seront évalués. 1) Le domaine de la mémoire à l’origine du retard mental. 2) Le domaine ophtalmologique qui servira à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces défauts chez les patients. 3) Le domaine de du cerveau pour évaluer par Imagerie par Résonance Magnétique son fonctionnement avec ou sans le traitement. 4) Le domaine de fonctionnement du foie qui comporte des défauts chez les porteurs de T21. Ici nous voulons tester l’hypothèse que ces problèmes commence au cours de la gestation. Ce projet sera réalisé sur 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer, de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée. Cela constituerait un progrès très important pour leur qualité de vie et celle de leur entourage. Peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications structurales de l’hippocampe et du cervelet se mettent en place très tôt au cours du développement embryonnaire dans la T21 et donc au cours de la période gestationnelle. Dans 2 études précédentes, nous avons montré que le traitement in utero chez la souris avec des inhibiteurs ciblant l’activité d'une proteine cible, améliore les déficits observés en lien avec la T21 chez plusieurs modèles murins. Ceci montre que le traitement au cours de la gestation entraîne des modifications qui perdurent sur le long terme. Nous attendons pour cette étude, les mêmes effets bénéfiques mais en utilisant une molécule de dernière génération, soluble, permettant une administration per os, indispensable pour une transposition chez l’Homme. Nous espérons que ce traitement sera suffisant pour permettre de ne plus avoir besoin de traitement chronique chez l’adulte. Une amélioration significative des performances cognitives est attendue, notamment pour la mémoire de travail et la mémoire explicite dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ce test. L’imagerie rétinienne révélera si le traitement a un impact sur les phénotypes rétiniens, ça n’a jamais été investigué. De plus, les potentielles améliorations seront également caractérisées par de l’imagerie fonctionnelle. L’étude des marqueurs sanguins permettra de savoir si le défaut du métabolisme hépatique à une origine développementale. D’une façon plus générale, pour une recherche fondamentale, les résultats obtenus devraient également permettre d’approfondir les connaissances sur le rôle de cette protéine cible au cours du développement et son impact sur les défauts cognitifs des patients.

Procédures

Les femelles gestantes seront traitées avec la molécule par gavage tous les jours pendant la durée de la gestation. Le traitement sera administré 1 fois par jour, tous les jours durant la gestation (21 jours maximum) per os par gavage. Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement qui permettent d'évaluer leur mémoire. Ces tests se déroulerons sur 4 jours, avec 1 session unique par jour. Chaque session dure de 8 à 15min suivant le test. Les souris recevront 3 anesthesies, -1 gazeuse pendant toute la durée de l’imagerie ophtalmique, 15 minutes maximum. -1 anesthésie gaseuse complementée par une analgesie pour l'imagerie par resonnance magnétique (IRM) - 1 anesthesie pour effectuer une fixation du cerveau ou une anesthésie de quelques minutes par inhalation pour un prelevement sanguin. La production des animaux traités in utero ainsi que les tests de comportement et les analyses ophtalmologiques seront fait dans l'EU235. L'IRM, les prelevements de sang et les fixations des cerveaux au PFA seront fait dans l'EU466.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules par voie orale. Cette douleur sera accentuée à cause de la répétition des gavages, au maximum 21 fois, soit 1 gavage par jour de gestation. L’électrorétinographie implique une anesthésie longue (30-45 minutes) obtenue par injection d'anesthesique. L'IRM se fait sous une anesthésie gazeuse avec analgésie, necessitant une injection. Le prélèvement de sang se fait sous anesthésie gazeuse, pouvant induire une angoisse chez l'animal. Les test de comportement nécessite de placer les souris dans des sytèmes quelles ne connaissent pas, ce qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis a mort. Des organes seront prelevés pour études.

Remplacement

La compréhension des mécanismes ainsi que les origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines.

Réduction

Le taux de transmission de la trisomie dans ce modèles souris et d’à peine 30%. 1 portée compte en moyenne 6 petits dont 2 trisomiques. Pour assurer la production des animaux, il faut accoupler 40 animaux femelles au total pour le traitement au cours de la gestation. Il faut multiplier ce chiffre par 2 pour avoir des mâles et des femelles, car l’analyse IRM montre des différences significatives en fonction du sexe. En effet, il nous intéresse de connaître la différence d’action que peut avoir la molécule inhibitrice sur des souris de sexes différents. Les effets du genre sur l’action de la molécule pourront ainsi être étudiés. La taille des groupes a été déterminée grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testeront 4 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Dans notre étude précédente, l’administration répétée pendant 19J par gavage chez l’adulte de cette molécule n’a pas montré d’effets délétères chez les animaux traités. Un suivi des femelles sera cependant réalisé sur la totalité de l’expérience, notamment durant la période gestationnelle où aura lieu le traitement. Un arbre décisionnel basé sur le reflet de la douleur chez la souris sera utilisé pour ne pas prolonger des souffrances éventuellement constatées. Les conditions d’élevage seront améliorées pour les femelles gestantes pour leur permettant de faire un nid plus complexe et ainsi de mieux gérer leur exposition à la lumière et aux menaces perçues. De plus, un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience. Les animaux seront ensuite sevrés de leur mère à 4 semaines et hébergés par groupe de 4 ou 5 pour leur assurer une vie sociale. Lors des tests ophtalmiques, du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout dessèchement cornéen. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil. Durant l’examen d’IRM une anesthésie est utilisée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. La température et la respiration des animaux sont en permanence surveillées par un système de monitorage et les animaux sont maintenus à une température optimale grâce au système de chauffe berceau de l’IRM. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l’acquisition en cours est immédiatement interrompue et l’animal est sorti de l’IRM. Il est alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu’à son réveil, sous surveillance. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées et sera pris en charge par un transporteur. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d’utiliser des transgéniques est liée à l’absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Les femelles qui seront traitées durant leur gestation, utilisées pour générer les groupes d’animaux, seront accouplées à partir de 8 semaines, dès la maturation sexuelle atteinte. Les animaux issus de ces croisements, seront utilisés dès le début de la gestation. Le but de l’expérience étant de réduire les deficits qui ont lieu in utero, pendant la gestation chez les souris trisomiques. Après la naissance, les animaux sont sevrés à 4 semaines. Les femelles porteuses seront mises à mort à ce stade. Les nouveaux nés seront gardés jusqu’à 3 mois, âge adulte, auquel ils seront évalués dans différents paradigmes. C’est aussi l’âge où le développement cérébral est complet et où le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présentes.

1 704 rats vont être utilisés, tous tués pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois irradiations de l'abdomen espacées de 48 heures, vivent seuls pendant cinq à seize semaines et subissent un prélèvement de sang dans l'artère mésentérique avant la mise à mort. Le porteur indique que l'irradiation peut toucher l'intestin grêle et provoquer des signes cliniques irréversibles, amaigrissement et gonflement de l'abdomen, et que le régime cétogène testé entraîne une forte perte de poids puis de fortes carences. L'hébergement individuel imposé à des animaux sociaux pendant plusieurs mois figure parmi les procédures, quand la rubrique raffinement met en avant un tunnel et une étagère.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le bénéfice thérapeutique de différents régimes alimentaires sur la toxicité digestive radio-induite. Plus précisément, ce projet visera à démontrer, via l’utilisation de régimes alimentaires renforçant ou fragilisant l’homéostasie au sein de l’écosystème colique, qu’après irradiation, la dégradation des relations de symbiose entre le système immunitaire de l’hôte et le microbiote, joue un rôle important dans les lésions digestives et notamment dans celles de l’épithélium colique. Ce travail revêt un intérêt majeur pour réduire la prévalence de patients souffrant de « Pelvic Radiation Disease » (PRD) ou améliorer leur prise en charge. La PRD est une maladie de certains patients bénéficiant d’une radiothérapie pelvienne et souffrent de complications gastrointestinales.

Bénéfices attendus

Le projet de recherche scientifique vise à apporter des bénéfices dans le domaine de la prévention et du traitement des lésions radio-induites du côlon dans un contexte de complications gastrointestinales après une radiothérapie pelvienne. Cela passe en premier lieu par une meilleur compréhension de la dynamique précoce des lésions radio-induites. Le projet permettra d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux lésions radio-induites de l’épithélium colique. Cela inclut l'identification des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement initial des lésions, et son évolution, ici interactions entre microbiote et système inflammatoire de l’hôte au sein de l’écosystème colique. Cette étude pourrait permettre d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques personnalisées basées sur l’alimentation (facilement applicable en clinique, prescrit par un nutritionniste), qui en renforçant de façon préventive l’intégrité de la barrière épithéliale colique permettraient de réduire la toxicité digestive au cours de la radiothérapie pelvienne, d’augmenter la tolérance au traitement antitumoral et ainsi d’optimiser son efficacité tout en préservant la qualité de vie des patients. D’un point de vue fondamental, la partie mécanistique de cette étude viserait à proposer une signature du microbiote, comme prédictifs des lésions radio-induites du côlon (i.e., « biomarqueur »), mais aussi de nouvelles cibles thérapeutiques sur la base d’une modulation des interactions hôte/microbiote et enfin pourrait appuyer le passage de l’étude expérimentale vers un transfert clinique éventuel.

Procédures

- Hébergement individuel pendant toute la durée de l’étude (min 5 semaines, i.e., pour la majorité des protocoles et max 12 à 16 semaines (dépendant de la longueur du régime alimentaire) pour 3 expériences potentielles et impliquant 432 rats maximum au total - Irradiations locales au niveau de l'abdomen sous anesthésie gazeuse (maximum 6 minutes), 3 fois avec un intervalle de 48 heures entre chaque séance. - Prélèvement de fèces de façon hebdomadaire pendant tout le temps de l’expérimentation. Ce prélèvement sera effectué au moment de la pesée de l’animal (réduction de la fréquence de manipulation des animaux et de leur stress). - Prélèvement de sang à partir de l'artère mésentérique avant l'euthanasie, d'environ 2 minutes, sous analgésique et anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les deux modèles d’irradiation localisée du côlon, chez le rat, utilisés dans ce projet sont déjà utilisés dans le laboratoire. Ce modèle d’irradiation du côlon peut toucher une petite zone de l’intestin grêle, qui est mobile, entraînant des signes cliniques spécifiques irréversibles : amaigrissement de l’animal accompagné d’un gonflement au niveau de l’abdomen. Les régimes alimentaires pourraient favoriser des modifications de la masse graisseuse des animaux entraînant une variation de leur métabolisme. Le régime alimentaire dit « occidental » sera celui qui pourrait le plus induire d’effets néfastes (prise de poids, réduction de la mobilité, troubles métaboliques). Une attention particulière sera également portée à la suite du régime cétogène et notamment durant les 3 premières semaines de prise (perte de poids importante pendant cette période et période latence de l’efficacité de ce régime sur la santé). A long terme ce régime nécessitera des compléments alimentaires car il induit de fortes carences. Il est possible que les animaux sous ces deux régimes alimentaires présentent des signes cliniques et comportementaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.

Remplacement

Dans le but d’évaluer les bénéfices thérapeutiques de certains régimes alimentaires sur la sphère digestive après exposition aux rayonnements et particulièrement pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo. Il n'existe pas de test in vitro substitutif permettant de répondre aux questions soulevées dans ce projet. Le bénéfice thérapeutique d’un traitement passe par une action multiple au sein de l’organe d’intérêt, en agissant sur différents systèmes de cet organe, ici écosystème colique i.e., microbiote et hôte (système immunitaire, la barrière épithéliale mais aussi le micro-environnement, le système nerveux…). Seul un modèle animal intégré permet de façon pertinente de tester une telle efficacité, ici celle de différents régimes alimentaires sur la fonction de barrière du côlon.

Réduction

Pour atteindre la pertinence statistique, les groupes sont classiquement constitués de 8 à 12 individus selon le paramètre analysé. Pour certaines parties de l’étude, 2 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de reproduire un effet observé (2x6 animaux par expérience et par groupe). A minima, une analyse statistique sera réalisée afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement pendant toute la durée des expérimentations. Le bien-être de l’animal sera évalué quotidiennement par le suivi de son comportement et de son aspect physique (aspect du poil, prise alimentaire, présence de fèces dans la cage, perte de mobilité…). Les animaux seront pesés toutes les semaines. De plus, des dispositifs d'enrichissement (tunnel rouge et cage haute avec étagère) seront mis en place dans les cages pour créer un environnement stimulant pour les animaux. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et euthanasié si son état est jugé irréversible.

Choix des espèces

Le modèle rat est approprié dans notre étude et a été validé au laboratoire dans le cadre de l’étude des complications gastro-intestinales radio-induites. Nous utilisons au laboratoire, le modèle d’irradiation localisée au niveau colorectal sur une fenêtre de 2cm/3cm La taille du rat permet aisément la réalisation d’irradiations fractionnées. Les lésions obtenues au cours du temps sont histologiquement proches de celles qui ont pu être observées chez des patients ayant bénéficié d’une radiothérapie pour le traitement de tumeurs abdomino-pelvienne. D’autre part, nous avons choisi le rat qui possède l’intégralité de son patrimoine immunitaire nécessaire à la réparation tissulaire. De plus, le rat est un modèle clé en recherche préclinique, en particulier dans la recherche pharmacologique et toxicologique mais aussi dans le cas plus précis de cette étude pour l’étude des variations fonctionnelles du microbiote, en raison de sa similitude avec l'être humain (par rapport à la souris). Les animaux seront reçus à l’âge de 13 semaines, ceci correspondant au stade adulte qui a été choisi afin d’éviter une potentielle hétérogénéité liée à l’âge. Ils seront irradiés à l’âge de 17 semaines minimum soit 4 semaines minimum après leur arrivée et leur accessibilité aux différents régimes alimentaires testés et ce, afin de permettre la modification et la stabilisation du microbiote à la suite du changement alimentaire.

Soumis à une restriction alimentaire pendant 120 jours, puis à des chocs électriques ou à des injections provoquant des troubles digestifs, 288 rats sont tués à l'issue pour analyse du cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingt-seize d'entre eux reçoivent une récompense associée à un stimulus électrique pendant six semaines, les 192 autres une injection de chlorure de lithium censée rendre cette récompense écœurante. Le porteur qualifie ces atteintes de légères et transitoires, stress et sensation désagréable de moins d'une seconde, contractions abdominales de quelques dizaines de secondes. L'objectif annoncé reste de savoir si des rats devenus habitués deviennent aussi compulsifs, transposition aux addictions comportementales humaines qui reste une hypothèse de travail.

Objectifs

Les addictions comportementales (avec ou sans consommation de produit) représentent un coût élevé d’un point de vue médical, social et économique pour nos sociétés. La compréhension des mécanismes cognitifs et comportementaux impliqués dans ces désordres pourrait aider à une meilleure prise en charge de ces pathologies. Les habitudes de consommation peuvent participer au maintien de l’addiction et contribuer à la difficulté à changer son comportement de consommation, lorsque celui-ci n’est plus adapté. Dans un contexte d’addiction, il a été suggéré que le développement d’habitudes peut conduire à une consommation compulsive, c’est-à-dire, une consommation de produits malgré les conséquences négatives. Cependant le lien entre habitude et compulsion n’a pas été clairement établie. Ce projet a pour but principal de déterminer si des rats ayant une tendance à développer un comportement habituel sont également plus vulnérable à développer un comportement compulsif. Ce projet comprend deux procédures qui utilisent deux méthodes différentes pour évaluer les comportements habituels et compulsifs : la première procédure associe une récompense a une conséquence négative, la deuxième, rend la récompense aversive. Ces deux procédures seront complémentaires car elles évaluent deux composantes différentes d’un comportement compulsif : la persistance du comportement malgré les conséquences négatives ou la persistance à consommer malgré le dégout.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’étudier le lien entre habitudes de consommation et compulsion afin de pouvoir déterminer dans quelle mesure de mauvaises habitudes peuvent conduire aux comportements inadaptés caractéristiques des addictions comportementales. A terme, ces connaissances nous permettrons de développer des stratégies thérapeutiques ciblées sur les habitudes de consommation pour aider les patients à regagner le contrôle sur leur comportement. Par exemple, si ce projet permet de démontrer un lien entre habitudes de consommation et compulsion, des thérapies cognitives et comportementales peuvent consister à casser les habitudes pour prévenir le développement d’un comportement compulsif.

Procédures

Toutes interventions se feront sur animaux vigiles. Tous les rats (288) seront sous alimentation restreinte pendant 120 jours maximum et seront pesés 5 fois par semaine. Tous auront accès à des récompenses appétentes après avoir exécutés et appris des tâches simples. Les sessions d'apprentissage et de détection des habitudes s'étaleront sur 8 semaines à raison de 5 séances par semaine, 1 séance par jour, 1 h par séance. Pour 96 rats, les séances d'apprentissage seront suivies de séances de détection de l'habitude en absence de récompense (2 séances, 1 séance par jour, 1h par séance) puis de séances où la récompense sera associée à un stimulus électrique en basse tension d'une durée maximale d'1 seconde. Les séances avec le stimulus éléctrique basse tension auront lieu pendant 6 semaines, 1 séance par semaine, 1h par séance (soit 6 séances de 1h). Les 192 rats restants auront des séances d'apprentissage selon les modalités décrites ci-dessus. Puis les animaux suivront à 3 séances de 10 min en présence de la récompense suivi d'un stimulus aversif (injection intrapéritonéale d'une solution provoquant des troubles gastro-intestinaux pendant quelques dizaines de secondes) à raison d'une séance par jour pendant 3 jours consécutifs. Ces mêmes animaux suivront ensuite 10 séances d'accès à la récompense réparties sur 2 semaines, à raison de 1 séance par jour, 1 h par séance. Toutes les séances indiquées ont lieu dans des cages spécifiques dites opérantes.

Impact sur les animaux

- Stimulus électriques : légers stress et sensation désagréable transitoire pendant moins d’une seconde. - Injection intra-péritonéale de chlorure de lithium : induit des contractions abdominales transitoires pendant quelques dizaines de secondes. - Léger stress transitoire due à la contention de l’animal lors des injections intrapéritonéale (douleur légère à l’injection pendant moins de 10 secondes). - Léger stress due à la restriction alimentaire pendant toute la durée de l’expérience pour maintien du poids constant.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier. Les connaissances acquises dans ce projet devraient permettre dans le futur d’apporter des connaissances pour développer des algorithmes permettant de modéliser le comportement. Ces algorithmes pourraient à terme constituer des outils de remplacement.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles. Sur la base d’études scientifiques publiées, nous nous attendons à observer de la variabilité inter-individuelle dans l’émergence de comportement compulsif. Le nombre d'animaux par lot a été calculé en tenant compte de cette variabilité et afin d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique. Ainsi, 32 animaux par lot seront nécessaires à notre étude avec 9 lots au total soit 288 animaux maximum.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 5 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, ainsi que les récompenses sucrées, de façon spontanée. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus, qui s’approche de celle rencontrée chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.