Rongeurs

100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter un dispositif de mesure, puis des tests d'équilibre, de motricité et des mesures auditives et vestibulaires dont le nystagmus post-rotatoire. Ces procédures ne visent pas à produire des connaissances mais à maintenir les compétences techniques du personnel, dont la validité expire tous les six mois dans l'établissement. Le porteur décrit le remplacement comme "difficilement applicable" puisque l'objectif est l'entraînement au geste lui-même.

Objectifs

La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Ce projet est dédié au maintien des compétences des personnels maîtrisant les gestes techniques impliqués dans ces 2 procédures. Ceux-ci ayant une durée de validité de 6 mois dans notre établissement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux spécifiquement pour ce maintien de compétence. Ainsi, la bonne formation du personnel permet 1) d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués, et 2) d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Cette demande d’autorisation de projet a un double objectif : 1. Former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permettra une montée en compétence des expérimentateurs et donc in fine une diminution probable des mauvaises manipulations pouvant conduire à des mises à morts inutiles ou à des reproductions d’expérimentation. 2. Raffiner les procédures expérimentales, notamment évaluer la possibilité de réaliser diverses procédures fonctionnelles et comportementales sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures afin 1) d’améliorer la santé et le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal pratiqués et 2) d’optimiser les procédures expérimentales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Procédures

Procédure 1 : Mesure de l'activité cérébrale et analyse comportementale de la fonction motrice chez le rat. La procédure comporte une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispostif de mesure de l’activité du cerveau. Ensuite, des tests de comportement (30min au total) sont effectués pour évaluer la motricité et l’équilibre de l’animal. Procédure 2 : Mesure du nystagmus post-rotatoire et évaluation des fonctions vestibulaire et auditive. La procédure inclut une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispositif de fixation pour réaliser le test du nystagmus post-rotatoire (10min). Ensuite, des tests de comportement (10min au total) sont effectués pour évaluer l’équilibre de l’animal. Enfin, des mesures auditives sous anesthésie médicamenteuse sont pratiquées (20 secondes de mesure ; 1h pour le reveil de l’animal dans une armoire chauffante).

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux chirurgies crâniennes.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet sont mis à mort à la fin de la procédure les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale. Les mesures fonctionnelles, comportementales et de mises à mort n’offrent pas cette possibilité.

Réduction

Ce projet vise à former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permet une montée en compétence des expérimentateurs et donc une diminution probable des mauvaises manipulations. Une approche de formation « centralisée » sera mise en œuvre afin que plusieurs personnes puissent assister simultanément aux procédures. L’utilisation de chaque animal est optimisée autant que possible pour réaliser à la fois des explorations fonctionnelles et comportementales : - Les animaux dont l'activité cérébrale est mesurée sont également utilisés pour les tests comportementaux et mis à mort pour l’analyse histologique. - Les animaux dédiés à la mesure du nystagmus post-rotatoire sont également utilisés pour les tests comportementaux, la mesure des produits de distorsion acoustiques, les dosages sanguins et mis à mort pour l’analyse histologique. Ceci permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures.

Raffinement

- Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Après chaque procédure invasive, un suivi renforcé des animaux sera réalisé afin d’identifier toute forme de souffrance ou d’atteinte de point limite ; - Les animaux seront hébergés à plusieurs par cage à chaque fois que cela est possible ; - Un enrichissement varié (tunnel, éléments de nidification, briquettes en bois) leur sera apporté ; des friandises issues de fournisseurs d'aliments pour animaux de laboratoire leur seront données après la réalisation des gestes ; - Si possible, les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins une semaine avant le début des tests.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur le rat Long Evans. Le rat est un des modèles recommandés dans les lignes directives de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques, domaine d’expertise du laboratoire. La souche Long Evans a été choisie car il est possède une oreille interne plus proche de l’Homme que celle des rats Albinos. Les procédures sont réalisées sur des rats adultes afin que la croissance du crâne soit terminée, et permettre ainsi les chirurgies crâniennes.

844 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 Gy puis greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes, pour développer une maladie du greffon contre l'hôte et chercher des cibles contre la leucémie. Le porteur décrit une perte de poids, un pelage terne et des atteintes cutanées, les souris atteignant 20 % de perte de poids ou un score clinique de 5 étant mises à mort. Les retombées annoncées pour les patients restent générales, et les souris qui n'atteignent pas les points limites sont tuées deux à trois mois après l'irradiation faute d'évolution attendue.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles dans le traitement des rechutes de leucémie aigue myéloblastique ainsi que dans la maladie du greffon contre l'hôte (maladie induite par la greffe de cellules souches hématopoïétiques lors de traitement des hémopathie malignes). Tout d'abord dans la mise en place du modèle murin de leucémie aigue myéloblastique. Ensuite dans l'identification de nouvelles cibles avec des outils technologiques innovants. Par la suite, nous tenterons de traiter les animaux avec des traitements visant les nouvelles cibles identifiées.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider une ou plusieurs molécules thérapeutiques qui auront été identifiés via différents processus autant chez la souris que chez l'homme.

Procédures

Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Le temps total d'irradiation est de 10 minutes par souris. L'irradiation s'effectue dans une pièce adjacente à l'animalerie. Les animaux sont installés par 11 dans une cage à irradiation avec couvercle filtant. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seule ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses (+ ou - cellules leucémiques) pour un total de 100µl par souris. Le temps d'injection des cellules en comptant l'anesthésie est d'environ 1 minute par animal. Dans un second temps, les souris seront traitées selon le schéma adapté à la molécule avec des injections de 100µL de solution diluée dans une solution saline administrée par voie intrapéritonéale. Le temps d'injection des traitements est d'environ 30 secondes par animal. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois par expérience. Le temps de prélèvement est d'environ 1 minute par animal. Le volume maximale prélevé sera de 100µL. Le nombre d'intervention par souris est de minimum 2 à maximum 6.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pelage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi t. Ce score a été évalué par nos pairs spécialistes de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale. Concernant les souris simplement irradiées qui servent de validation de l'expérience, elles meurent d'aplasie. Elles auront de l'anémie et de la perte de poids. Lorsque le poids de ses souris atteint moins 20% du poids initial, ces souris seront mises à mort.

Devenir

Les animaux dont la perte de poids aura atteint 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront mis à mort ainsi que les animaux qui n'auront pas atteint les points limites deux à trois mois après l'irradiation. Pour les procédures 1, 2 et 3, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus. Pour la procédure 4, les animaux n'ayant pas atteints les points limites à la fin des 3 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.

Remplacement

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de molécules thérapeutiques sur le développement de la maladie du greffon contre l’hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l’utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l’hypothèse émise. Toutefois, toutes les expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo seront réalisées sur des cellules in vitro.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupées le plus possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience. Le nombre d'animaux pour chaque procédure a été calculé par une approche statistique à l'aide du document « Estimation du nombre d’animaux nécessaires » de Hugues Jacobs.

Raffinement

Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 4 ou une perte de poids de 20% seront mises à mort. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établir le score clinique associé à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute souffrance. L'enrichissement et l'hébergement des animaux dépend entièrement des conditions imposées par l'animalerie. Ce qui consiste à déposer 3 enrichissements différents dans les cages comme les Nestlets, un smart home, ainsi que des Bed-r’nest. Le nettoyage des cages a lieu une fois toutes les deux semaines par les zootechniciens, mais les souris étant contrôlées tous les 2 jours par l'expérimentateur, les cages souillées sont changées rapidement.Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront mis à mort quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane et un anesthésique local type collyre d'oxybuprocaïne sera utilisé.

Choix des espèces

La maladie du greffon contre l'hôte a été étudiée depuis des décennies dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, ils possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doses d'irradiations auxquelles ils seront soumis.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal boit de l'eau contenant des ions perchlorates pendant quatre mois, avant l'induction d'une colite par instillation intra-colique, provoquant perte de poids et d'appétit sur deux jours. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré car il fausserait les résultats, et que les animaux souffrant trop seront isolés ou tués. Il présente cette étude comme "exploratoire", préalable à un projet "plus complet" sur le lien entre pollution et maladie de Crohn.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. La France est un pays fortement agricole et un des plus utilisateur de pesticides en Europe. Un cluster de sur-prévalence de la MC est notamment situé dans le nord de la France, région très sujette aux épandages massifs de produits phytopharmaceutiques (PP). Depuis quelques années une nouvelle préoccupation autour des effets santé des ions perchlorates est en train de naître. Ces ions sont des contaminants de l'eau de boisson et sont notamment issus de l'ionisation en milieu aqueux des perchlorates d'ammonium et de potassium issus principalement de la dégradation d'anciennes mines et munitions issus de la guerre mais peuvent provenir également de rejets industriels. Ce projet vise la réalisation d’une étude exploratoire sur l’effet pro-inflammatoire des ions perchlorates sur la muqueuse digestive. L’objectif de cette étude exploratoire est de pouvoir répondre à cette demande avant de redéposer un projet plus complet.

Bénéfices attendus

Nous n'avons pour le moment que peu d'information concernant un potentiel effet pro-inflammatoire au niveau intestinal des ions perchlorates chez l'Homme ou dans un modèle expérimental. L’hypothèse testée trouve son origine dans la corrélation spatiale très significative entre pollution des sols et des nappes phréatiques par les perchlorates et prévalence de la maladie de Crohn, qui est maximale en région Hauts de France. D’autre part, le registre EPIMAD sur les maladies inflammatoires du tube digestif apporte un certain nombre d’arguments épidémiologiques compatibles avec cette hypothèse. Grâce à ces expériences, nous pourrons obtenir des données essentielles et importantes concernant un potentiel effet pro-oxydant et pro-inflammatoire des ions perchlorates sur le système digestif. D'autre part, le développement d'une colite expérimentale chez des animaux traités ou non par les ions perchlorates apportera des données supplémentaires et capitales sur la capacité de ces ions à modifier le profil inflammatoire colique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des ions perchlorates de sodium dans l'eau de boisson pendant 4 mois consécutilfs. Ce mode d'administration ne génère aucune perturbation dans le bien-être des animaux. Après les 4 mois d'administration des ions perchlorates, nous induirons une colite expérimentale chez certains groupes d'animaux comme décrit dans le protocole expérimental. Ce modèle de colite est un modèle inflammatoire d'intensité modérée d'une durée de 3 jours limitant au maximum les potentiels effets délétères chez les animaux. Ce modèle est parfaitement maîtrisé par l'expérimentateur. Une perte de poids et d'appétit est observée au cours des deux premiers jours de colite. A l'issue des 3 jours de colite, les animaux sont mis à mort pour prélèvements tissulaires comme décrits précédemment.

Impact sur les animaux

Les ions perchlorates à la dose utilisée ne doivent induire aucun effet particulier sur l'état général des animaux sur une durée de 16 semaines. La procédure est qualifiée de légère. Le modèle de colite expérimentale est un modèle de colite très modérée. La procédure est qualifiée de modérée. Les modèles de colite expérimentale sont parfaitement maîtrisés par le responsable de projet et ce modèle a déjà été pratiqué dans un précédent projet et hormis une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids modérée les 2 premiers jours de la colite, aucune autre altération du comportement des animaux n'a été observée. L'administration du TNBS se fait par l'intermédiaire d'un capillaire en plastique inséré dans le colon à 5 cm de l'anus. Cette administration ne dure qu'environ 2 min et se fera sous anesthésie. Les animaux seront ensuite replacés dans leur cage respective et surveillés régulièrement pendant les heures suivant la procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la période d'administration des ions perchlorates et l'induction de la colite expérimentale pour les prélèvements de sang et d'organes ainsi que l'analyse ultérieure des marqueurs d'intérêt.

Remplacement

Le recours au modèle animal rat est justifié par l’absence de méthodes alternatives pour les études physiologiques et comportementales telle que des modèles in vitro. De plus, nous étudions des paramètres liés à la survenue de l'inflammation intestinale ainsi que son intensité chez de jeunes animaux soumis ou non à un polluant environnemental administré par voie orale (eau de boisson), impossible à modéliser autrement que par une étude chez l'animal de laboratoire. De plus, les interactions entre différentes fonctions physiologiques et organes (système digestif, microbiote, foie...) est impossible à reproduire par un modèle in vitro. Nous savons également que l’inflammation colique peut produire une élévation de la température corporelle qu’un organisme vivant peut compenser par la mise en place de mécanismes d'adaptation par le biais de certaines fonctions telle que le sommeil ou la prise alimentaire, contrairement à des cellules en culture. De plus le modèle d’induction de la colite expérimentale chez le rat est bien décrit dans la littérature et maîtrisé par l’expérimentateur du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet (n=96; n=12/groupe expérimental) a été estimé sur la base de nos précédentes expériences sur le même modèle ou des modèles différents utilisés les années précédentes. Nous avons décidé de ne pas travailler sur des femelles gestantes comme ce fut le cas dans nos précédents projets et explorer ensuite les effets sur la descendance mâle et femelle. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons commander spécifiquement des animaux mâles et femelles juste sevrés de façon à limiter le nombre total d'animaux impliqués. En fonction des résultats que nous obtiendrons dans cette étude préliminaire, nous déposerons un projet plus complet et de plus grande envergure. De ce fait, 12 animaux mâles et femelles par groupe expérimental seront indispensables pour s'affranchir de la variabilité des réponses et pour obtenir des données exploitables tant sur l'aspect variabilité physiologique qu'analyse statistique.

Raffinement

Dans la mesure où nous travaillons sur un modèle expérimental de colite, nous ne pouvons utiliser d'antalgique, cela aurai pour conséquence de modifier les réponses physiologiques rendant nos résultats inexploitables. Les animaux seront suivi quotidiennement avec une grille d'évaluation de la douleur qui sera scrupuleusement respectée. De par l'expérience que vous avons de ce modèle inflammatoire, nous savons que la dose induira une colite très modérée n'entrainant aucun décès prématuré d'animaux et que très peu d'effets visibles chez le rat, excepté une perte d'appétit et quelques selles molles sur les 2 premiers jours expérimentaux après induction de la colite. Dans le cas où nous observerons des signes de douleur trop importants, l'animal sera isolé de ses congénères, voire mis à mort. En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe (nombre en fonction du poids conformément à la règlementation en vigueur) tout au long du projet. Un enrichissement sera apporté par des tunnels en carton et des frisettes de papier.

Choix des espèces

Le modèle d’étude sera le rat pour les raisons suivantes : - il est un bon indicateur des effets éventuellement observés chez l’Homme de par la similitude des réponses physiologiques et comportementales mises en jeu lors de l’exposition à différents types de polluants environnementaux, - il s’agit d’un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation intestinale comme référencé dans la littérature - l’hébergement au sein de l'animalerie est adapté depuis plusieurs années pour cette espèce. Notre hypothèse de travail est que l’exposition aux ions perchlorates pendant des phases critiques du développement (enfance et adolescence) pourrait favoriser la survenue des MICI. Nous avons sélectionné un stade de développement en adéquation. Les animaux mâles et femelles commandés seront des animaux juste sevrés de façon à pouvoir débuter l'administration orale des ions perchlorates vers l'âge de 5 semaines de vie maximum et pour une durée de 16 semaines consécutives. A l'âge d'environ 21 semaines, les animaux subiront une anesthésie pour l'induction de la colite expérimentale. Nous souhaitons travailler pendant la phase aiguë inflammatoire et devront mettre à mort les animaux 3 jours après l'induction de la colite.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à des fins d'enseignement universitaire. Chaque animal est infesté chirurgicalement par le ver Taenia crassiceps, gardé 70 jours, puis soumis à des tests comportementaux (open field, planche à trous, boîte claire-obscure, néophobie, rotarod) avant la mise à mort et le prélèvement des parasites. Le porteur décrit un projet pédagogique servant de "fil rouge" sur trois années de licence pour 200 à 250 étudiants. Il affirme qu'une partie des résultats repose sur une "approche pédagogique alternative" par analyse bibliographique.

Objectifs

Taenia crassiceps est un parasite à cycle complexe qui possède comme hôte définitif un canidé sauvage ou domestique et comme hôte intermédiaire un rongeur. Chez l’hôte intermédiaire la souris, le parasite réalise une multiplication asexuée intense. L’augmentation de la charge parasitaire est associée à une modification des taux d’hormones sexuelles chez les souris. Les souris femelles voient leur taux d’œstrogène augmenter très significativement. Les souris mâles arrêtent de produire de la testostérone et produisent des œstrogènes ce qui conduit à une féminisation des mâles hormonalement parlant. Ces changements hormonaux s’accompagnent de modifications profondes de la réponse immunitaire et des comportements des souris parasitées. L’objectif de ce projet est donc de pouvoir étudier l’ensemble de ces modifications et du fonctionnement de cette interaction hôte parasite au travers de plusieurs enseignements réalisés en Licence de biologie en Licence 1ère année sera étudiée la multiplication asexuée par bourgeonnement du parasite, en licence 2ème année seront quantifiés les taux d’hormones sexuelles dans le sang de souris mâles et femelles, en licence 3ème année sera étudiée la réponse immunitaire des souris saines et infectées par le parasite ceci par l’intermédiaire de numérations lymphocytaires sur frottis sanguins et les comportements des souris saines et parasitées seront analysés en focalisant sur des comportements de stress et de mesure de la capacité physique des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet pédagogique permet aux étudiants d’aborder dans un modèle d’interaction hôte parasite de nombreux concepts écologiques, physiologiques, endocrinologiques et moléculaires. L’idée de ce projet est un fil rouge que les étudiants analysent tout au long de leurs trois années de licence et qui leur permet de comprendre comment un parasite peut prendre le contrôle de son hôte à son profit, ceci leur permet de développer des analyses intégratives des molécules aux populations pour comprendre comment cette prise de contrôle s’opère. Ceci est déterminant pour les apprentissages que l’équipe pédagogique souhaite que les étudiants maîtrisent en fin de Licence afin de les former au mieux pour leur poursuite d’étude en Master.

Procédures

Infestations expérimentales de souris par les larves du cestode Taenia crassiceps par chirurgie. Une seule intervention chirurgicale est pratiquée chez les animaux, l'acte chirurgical dure environ 8 minutes / animal. Les animaux sont ensuite gardés à l'animalerie 70 jours avant euthanasie et prélèvement de sang et des parasites. Les animaux sont soumis à des tests comportementaux réalisés par les étudiants sur souris saines et infectées (openfield, planche à trous, boite claire/obscure, néophobie, rotary road), pour chaque souris, chaque test comportemental est réalisé pendant 60 secondes d'observation.

Impact sur les animaux

Les nuisances qui peuvent être attendues sur les animaux sont liées à la chirurgie pratiquée pour l’infestation. L’infestation est réalisée par une incision extrêmement réduite (3 mm), un seul point de suture est réalisé pour refermer l’incision. De plus, la gestion de la douleur post-opératoire est assurée par une injection sous-cutanée de Buprénorphine toutes les 12h pendant 24h. Le développement des larves dans la cavité péritonéale ne provoque pas de nuisances sur les tissus des rongeurs. Les larves du parasite sont libres dans la cavité péritonéale et ces larves se nourrissent par osmotrophie trans-tégumentaire sans aucun effet direct sur les tissus de leur hôte. A 70 jours, la charge parasitaire est faible chez les animaux et ces derniers sont euthanasiés avant que le parasite n’induise de potentielles souffrances chez l’animal.

Devenir

Le but du projet est de produire des parasites de l'espèce Taenia crassiceps et de récupéré du sang chez la souris souris, ainsi que d'étudier les comportements des animaux. A la fin du projet, les animaux sont euthanasiés afin de récupérer les parasites et le matériel biologique afin d'assurer l'ensemble des approches pédagogiques envisagées.

Remplacement

IImpossible, on ne peut pas réaliser le cycle du parasite in vitro. Il n'existe pas non plus de culture cellulaire permettant de mener des approche similaires in-vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte intermédiaire pour être maintenu et la souris est connue pour être l’hôte intermédiaire privilégié pour cette espèce de cestode. La technique d’infestation chirurgicale permet de maintenir en laboratoire le parasite par transfert des parasites de souris à souris et donc en ne manipulant exclusivement que le stade larvaire du parasite, sans ne jamais passer par le stade adulte. Dans la stratégie 3R , le nombre d'animaux utilisé est le plus faible possible car nous veillons à ce que ce soit les mêmes animaux qui soient utilisés pour les tests comportementaux et pour ensuite la récupération des échantillons biologiques utilisés par les étudiants. Pour limiter également l'utilisation des animaux, une partie des analyses et des résultats exploités par les étudiants sont acquis à partir d'une approche pédagogique alternative reposant sur l'analyses bibliographiques de la litérature scientifique existante sur le sujet des modifications physiologiques et comportementales induites par les parasites chez leurs hôtes.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet a été pensé pour réduire au maximum les animaux utilisés tout en maintenant un travail statistiquement et scientifiquement robuste de la part des étudiants. Un total de 360 souris sera utilisé dans ce projet et cela permet de travailler avec les étudiants de 3 années de Licence dans 4 matières d’enseignement ce qui représente un contingent total d’environ 200 à 250 étudiants selon les années. La souris permet de produire des parasites et le matériel biologique nécessaire à l’ensemble des approches proposées sans ressentir de souffrance ou mortalité précoce. Le nombre d’animaux est basé sur 6 lots de 6 souris mâles ou femelles saines et parasitées. 6 lots car les étudiants en TP sont répartis en 6 groupes de 3 étudiants (trinômes) qui pourront chacun travailler avec 6 souris par conditions expérimentales afin d’avoir un nombre suffisant de réplicas biologiques pour mener des approches statistiques robustes. Pour les tests comportementaux les mêmes lots de souris sont utilisés. Le sang récupéré chez les souris à 70 jours d’infection est suffisant pour faire travailler l’ensemble des autres groupes d’étudiants de licence 1ère, 2ème et 3ème année toujours dans ce même objectif de réduire le nombre de souris qui sont utilisées. Ainsi le besoin annuel en animaux s’élève à 72 souris par an.

Raffinement

Nous avons fixé le nombre optimal de parasites qui sont utilisés lors de l’infestation afin d'assurer la production optimale de cestodes et d’induire les modifications physiologiques et comportementales sans engendrer de mortalité chez la souris. Le temps de développement au sein de l’animal a également été optimisé pour récolter les parasites et les échantillons biologiques avant que la pathologie induite par le parasite soit dommageable pour la souris hôte. Nous avons donc établi i) la meilleure espèce hôte, ii) la meilleure dose de parasite et iii) le temps de développement optimal pour minimiser le nombre d’animaux à utiliser et éviter la souffrance. Pendant le développement du parasite chez l’animal, une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu. La mortalité ne survient jamais suite à l’infestation. L’infestation par chirurgie pour le transfert des larves du cestode peut être une source d’inconfort pour l’animal, mais des soins post-opératoires sont prévus afin de palier à ces potentielles souffrances, le protocole a été pensé pour éviter tout signe de souffrance. Cependant, durant cette période de développement parasitaire, tout rongeur retrouvé en souffrance, score de 3 dans les points limites (voir annexe 1), est euthanasié par un personnel habilité. L’euthanasie peut également être effectuée par le RBEA. Les points limites sont : la pâleur de l’animal, la perte de contacts sociaux, le dos vouté, le poil hérissé, les yeux mi-clos, diminution ou arrêt de l’alimentation, l’immobilité ou le museau gonflé ; le pointage pour chacun de ces points limites est de 1 ou 2. Chaque animal ayant un score égal ou supérieur à 3 est euthanasié au CO2. Aucune médication n’est donnée car l’infestation par le parasite n’est pas réversible ; aucune médication ne peut être donnée car elle interfère avec le développement du parasite. Le point d’arrêt a été fixé à 70 jours post-infestation. Avant chaque séance de travaux pratiques l'enseignant responsable et le technicien animalier (titulaires du niveau 1 et chirurgie) informent les étudiants sur la réglementation et l'éthique sur l'utilisation des animaux en science. Les bonnes pratiques en terme de manipulation des animaux leur sont présentées afin d'éviter tout stress pour les animaux en particulier dans les tests comportementaux pratiqués par les étudiants.

Choix des espèces

La souris a été choisie car c’est l’hôte intermédiaire le plus souvent retrouvé en milieu naturel pour ce cestode parasite Taenia crassiceps. La souris apparaît donc comme le modèle principal pour maintenir les larves du cestode Taenia crassiceps en laboratoire. La souris permet de produire les parasites et le matériel biologique parfaitement adaptés aux tests envisagés en minimisant la souffrance et en utilisant le moins d’animaux possible. Animaux adultes. Les animaux infestés sont âgés de 8 à 9 semaines.

96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un anticancéreux, le bortézomib, pour induire une neuropathie, puis subit des tests hebdomadaires de sensibilité tactile et thermique évaluant l'allodynie, pour en étudier le mécanisme membranaire. Le porteur décrit l'induction de la neuropathie comme une nuisance modérée "indispensable" à l'étude et signale une possible baisse de poids. Il reconnaît que des animaux plus âgés seraient plus proches de la clinique humaine mais les écarte pour leur "coût" financier et éthique.

Objectifs

L’objectif principal de projet est d’étudier le mécanisme toxique des neuropathies induites par un anticancéreux utilisé en clinique, le bortézomib et de connaître l’implication d’une altération de la membrane cellulaire (impliquant aussi bien une modification de la composition en lipides qu’en protéines) dans ce mécanisme. Parmi les objectifs secondaires, nous souhaiterions (1) mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et (2) tenter de découvrir les facteurs prédisposant à cette pathologie expliquant pourquoi certains malades sont spécifiquement atteints.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles thérapeutiques pour prendre en charge ces neuropathies pour lesquelles à ce jour la prise en charge reste très limitée en clinique. Le mécanisme sous-jacent reste encore mal élucidé et l’implication d’un remodelage membranaire potentiellement responsable des neuropathies doit être élucidé.

Procédures

Ce projet reposera sur un modèle de neuropathie chimio-induite (CIPN) chez le rat. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires afin d’établir l’apparition de la neuropathie et jusqu’à une semaine après la fin des injections : - évaluation de la sensibilité tactile : durée du test pour un animal de 60 minutes (max). Le test en lui-même est beaucoup plus court, mais cette durée correspond à la durée maximale de mobilisation d’un animal – évaluation de la sensibilité thermique : durée du test pour un animal 5 minutes (max).

Impact sur les animaux

L’induction de la CIPN chez l’animal sera une nuisance modérée à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. L’induction du modèle se faisant progressivement sur une semaine, nous pouvons redouter des symptômes notables associés à une altération de son bien-être sur les quelques jours qui suivent cette induction. Les administrations répétées d’anticancéreux peuvent notamment être responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. A noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre la CIPN nécessitent un bon état général des animaux. Un phénotypage des animaux au cours de l’induction de la neuropathie reposera sur l’évaluation de l’allodynie tactile et de l’allodynie au froid, tests n’excédant pas 60 minutes et 5 minutes respectivement.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue des expérimentations, après une sédation profonde et rapide. Car l’objectif sera de prélever des échantillons tissulaires du système nerveux central et périphérique afin d’étudier des anomalies retrouvées au niveau des membranes cellulaires aussi bien au niveau de la composition lipidique que protéiques (expression et localisation) pouvant expliquer l’apparition des neuropathies.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Néanmoins, des travaux in vitro sont réalisées en parallèle sur une lignée cellulaire. Bien que ces travaux aident à compléter les connaissances sur le mécanisme lié à cette pathologie (notamment au travers de l’étude du stress oxydant), ils ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie induite par les anticancéreux. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer ces troubles neurotoxiques générés par les anticancéreux au travers de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Mais le plus souvent, nous devons fractionner les études en nombre d'animaux plus petits (pour des raisons de faisabilité des tests comportementaux) et avec une approche par bloc de traitement. Cette méthodologie peut permettre de réduire les effectifs d'animaux si par exemple avec n=6 ou 8, les résultats attendus sont significatifs.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maîtrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg) et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux. Une grille de score a été construite afin d’identifier une altération trop importante de l’état de l’animal menant à l’euthanasie de l’animal en cas d’obtention d’un score supérieur à 15 (grille en annexe).

Choix des espèces

Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies chimio-induites (CIPN). D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie. Les animaux auront 5 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 6 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important (financier et éthique) et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

1 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections de tamoxifène, d'autres sont rendues obèses par un régime gras pendant quatre mois, avec des phases d'hébergement individuel, pour étudier l'inflammation cérébrale déclenchée par un repas gras. Le porteur qualifie l'obésité induite et l'isolement de nuisances sans "signes comportementaux" d'inconfort, en s'appuyant sur ses publications passées. Il affirme que la satiété et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (postprandial inflammatory response, ou PIR) systémique est maintenant bien documentée mais ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas. La PIR est exacerbée lorsque le repas est riche en graisses. Notre équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules inflammatoires spécifiques (les cellules microgliales) chez l’individu sain en réponse à un repas gras. La PIR cérébrale n’est pas déclenchée par un repas équilibré standard. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas gras. Elle se produit dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire, du poids corporel et du métabolisme énergétique. Nous avons déjà identifié des effets bénéfiques de la PIR en montrant qu’elle contrôlait la prise alimentaire en favorisant la satiété et en limitant les apports caloriques futurs après consommation d’un repas hyperlipidique hypercalorique. Toutefois, les bases moléculaires de ce phénomène biologique sont encore totalement inconnues. Pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la PIR cérébrale et en comprendre les déterminants, nous allons étudier des souris transgéniques particulières permettant de recueillir des informations biologiques nouvelles, avec une très grande précision, au sein des cellules microgliales spécifiquement. Les animaux seront étudiés dans différentes phases prandiales : avant ou après un repas, et en fonction de la nature des repas consommés (standard ou gras), et en fonction de leur état métabolique (sain ou obèse). Après étude du comportement alimentaire, des analyses de biologie moléculaire seront faites post-mortem sur des biopsies cérébrales. Au total, 1850 souris seront utilisées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur processus cérébraux impliqués dans le contrôle de la satiété. Ainsi ce projet qui apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

L’obtention de souris mutantes A nécessite un traitement au tamoxifène durant 5 jours par une injection péritonéale quotidienne à l’âge de 5 semaines. La procédure 1 implique une mise en cage individuelle pendant 3 jours au maximum, afin de mesurer la prise alimentaire de chaque individu, ce qui peut engendrer stress et inconfort. Des contentions seront réalisées pendant les expériences afin de mesurer le poids corporel et en fin d’expérience afin d’anesthésier les animaux avant mise à mort. Une injection intrapéritonéale d’anesthésique durant 5 secondes sera réalisée avant la mise à mort sous sédation.

Impact sur les animaux

Le traitement par le tamoxifène des souris mutantes A peut induire des signes d’inconfort et de mal-être. Obésité nutritionnelle induite Les principales nuisances sont liées à la production de lots d’animaux obèses, dont l’obésité sera induite par exposition à un régime gras hypercalorique pendant 4 mois. Nous utilisons ce modèle depuis plus de 15 ans. Cela provoque une obésité associée chez certains individus à une résistance à l’insuline. Une accumulation de graisses ectopique peut être observée au niveau des muscles ou du foie. En revanche, il n’y a pas de signes particuliers comportementaux suggérant un inconfort, une douleur ou un mal-être. Hébergement individuel pendant 3 jours Pour assurer contrôler les prises alimentaires individuelles lors de ces études, les animaux seront placés en cage individuelle. Cette condition de vie imposée est brève et ne produit aucune gêne ni aucun changement hormonal visible, comme nous l’avons attesté et publié , mais reste un acte pouvant affecter le bien-être des souris. Contention et injection intrapéritonéale En fin d’expérience, la contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent d’anesthésique avant la mise à mort représentent des nuisances potentielles. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal , l'ensemble de la manipulation durera 5 minutes.

Devenir

Les 1850 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses de biologie moléculaire.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

La procédure décrite a été optimisée, standardisée et validée précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits.

Raffinement

Depuis la naissance des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront élevés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Pendant les expériences, la surveillance quotidienne du bien-être animal sera assurée de manière visuelle, à travers les cages transparentes. De plus, lors des changements de conditions nutritionnelles à l’échelle d’un repas (induction des états prandiaux contrôlés sur 3 heures), une observation directe des animaux sera faite. L’induction des états prandiaux se fait en cohérence avec la physiologie des animaux (introduction des repas à l’extinction des lumières, en début de phase active).

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes, âgées de 9 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.