Rongeurs
Rôle de la clusterine dans une modèle murin de syndrome hémolytique urémique
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une toxine bactérienne reproduisant le syndrome hémolytique urémique, ainsi que des prises de sang répétées, pour tester une molécule censée améliorer la survie. Le porteur décrit une asthénie, une diarrhée et des tremblements marquant le point limite, et s'appuie sur l'article 14 de la directive pour réaliser certaines injections sans anesthésie. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable", cette pathologie systémique ne pouvant s'étudier sur un modèle uniquement cellulaire.
Objectifs
Le syndrome hémolytique urémique (SHU) est une maladie infectieuse grave le plus souvent d’origine alimentaire. Elle est une forme de microangiopathies thrombotiques (MAT), un ensemble de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. Chez l’enfant, ce syndrome est le plus souvent causé par une infection due à une bactérie appartenant à la famille des Escherichia coli (E. coli) producteurs de toxines, appelées les Shiga-toxines (STx1 et 2). Ces toxines entraînent l’inflammation et la mort cellulaire massive. Le traitement de première intention repose sur les échanges plasmatiques. Actuellement, il n’existe pas d’options thérapeutiques ayant fait leurs preuves pour le traitement d’un SHU autres que des soins supports. La mise au point d’une véritable thérapie afin de traiter le SHU est nécessaire et primordiale afin de diminuer la mortalité et la morbidité. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires : le déficit en CLU était associé à une mortalité accrue et la supplémentation en CLU a amélioré la survie des souris. L’objectif de ce projet est de déterminer l’implication de la CLU dans la physiopathologie du SHU et son rôle protecteur potentiel afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.
Bénéfices attendus
Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance renale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.
Procédures
1/ L’Injection intra péritonéale est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 2/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 244 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 3/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée dans les 3 procédures du projet. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner 182 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire. 3/ L’Injection intra veineuse est utilisée dans 2 procédures du projet. Elle concerne 116 animaux, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal ; selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE le recours à l’anesthésie n’est donc pas obligatoire.
Impact sur les animaux
L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. A une dose plus importante de Stx-2, le poil pourra présenter un aspect piqué et à très forte dose, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie, selon l’article 14 de la directive 2010/63/UE.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procedure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.
Réduction
Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (244) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront agées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.
Rétablissement de l’expression d’un gène chez la souris par thérapie génique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par voie intraveineuse un vecteur de thérapie génique, une prise de sang et un jeûne de seize heures, avant le prélèvement de leur foie auquel elles ne peuvent pas survivre. Le projet vise à faire exprimer une protéine modifiée pour la rendre reconnaissable par un anticorps du commerce et faciliter son étude. Le porteur situe les bénéfices dans la biologie fondamentale et affirme que le foie ne peut être reproduit fidèlement en culture cellulaire.
Objectifs
L'utilisation d'anticorps pour purifier une protéine d'un fluide biologique est une stratégie bien connue et qui a fait ses preuves. Cependant, pour certaines protéines, il s'avère impossible d'obtenir un anticorps spécifique. Il est donc ici envisagé d'utiliser des souris transgéniques n'exprimant pas une protéine d'intérêt, et de réintroduire par thérapie génique la même protéine très légèrement modifiée afin qu'elle soit reconnue par un anticorps du commerce. Les souris obtenues exprimeront alors une protéine modifiée, ce qui rendra son étude possible. L'étude de protéines purifiées permet des avancées significatives dans le domaine de la biologie fondamentale, mais aussi des médecines humaine et vétérinaire. Il sera par exemple possible d'isoler la protéine d'intérêt afin de caractériser les autres molécules avec lesquelles elle entre en interaction.
Bénéfices attendus
La purification spécifique d'une protéine permettra son étude approfondie (liaison à l’ADN, interaction protéine-protéine, identification de ligands). Les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront une contribution aux domaines de la médecine, de la pharmacologie et de la nutrition.
Procédures
Les animaux recevont une injection intraveineuse sous anesthésie locale (2 minutes de contention dans un dispositif prévu à cet effet), et il sera pratiqué une prise de sang (30 secondes de contention manuelle), ainsi qu'une mise à jeun de 16h, dont seulement 4h pendant la période nocturne.
Impact sur les animaux
L'injection au niveau de la veine de la queue du virus pour la thérapie génique demande une contention de l’animal stressante, et l’injection engendre éventuellement une inflammation temporaire. La mise à jeun peut entrainer une légère hypoglycémie, mais qui ne devrait pas chuter en-dessous d'un seuil mettant en péril la santé de l'animal.
Devenir
Comme les animaux ne peuvent pas survivre au prélèvement de leur foie, tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
L’utilisation de l’animal entier est envisagée car le foie est un environnement complexe, qui ne peut pas être mimé avec fidélité en culture cellulaire. Cet organe est constitué d’une grande diversité de cellules et est affecté par des signaux hormonaux et nutritionnels provenant de tout l’organisme. Cependant, la phase animale n’est engagée que si des tests préliminaires sur des cellules en culture des différents transgènes utilisés sont concluants (gène rapporteur, reconnaissance par un anticorps du commerce). Ces tests ont déjà été fait sur des lignées cellulaires du commerce puis sur des cellules isolées d’un animal, et sont concluants.
Réduction
L’utilisation de lignées de grande proximité génétique permet de limiter le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en fonction de l'amplitude de réponse à la transgénèse, les tests de puissance statistique pourront être refaits avec de nouvelles données, et le nombre d'individus par lot révisé au cours du projet
Raffinement
Le milieu d’élevage des souris est enrichi d’un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Pour limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Nous procèderons également à une surveillance accrue des souris (toutes les 2 heures le premier jour puis 2 fois par jour pendant 1 semaine) après l'injection à la veine de la queue et après le prélèvement sanguin à la joue. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue avant l'injection. Une méthode d'évaluation du stress et de la douleur est prévue. Pour être la moins pénible, la période de jeûne est planifiée ainsi : 12h pendant toute la période de jour durant laquelle les souris dorment et ne mangent que 10% de leur bol alimentaire quotidien, et 4h en période de nuit. Ce jeûne permet d’arriver au pic d’activité de la protéine d'intérêt, tout en évitant une période de privation de nourriture trop longue.
Choix des espèces
Les modèles d’invalidation de gène que nous utilisons ne sont disponible que chez la souris. Les animaux qui sont utilisés sont de jeunes adultes, dont le foie est arrivé à maturité. Comme l'étude porte sur le métabolisme et que la race de souris utilisée développe des troubles métaboliques spontanément avec l'âge, les animaux trop vieux sont à éviter.
Etude du rôle des récepteurs nicotiniques dans un ensemble de processus cognitifs altérés au cours de plusieurs pathologies neuropsychiatriques et identifications des circuits neuronaux mis en jeu
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1866 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ils subissent pendant des mois des tests comportementaux quotidiens, une restriction alimentaire, des tests d'anxiété et de locomotion, une chirurgie intracérébrale et des séances de contention forcée, pour étudier le rôle de récepteurs nicotiniques dans des troubles neuropsychiatriques. Le porteur qualifie les dommages de minimes en indiquant que les modèles employés n'induisent pas d'altération majeure de la santé. Il affirme que ces fonctions cognitives et émotionnelles ne peuvent s'étudier que sur des animaux au système nerveux entier et fonctionnel.
Objectifs
Un rôle important de certains récepteurs cellulaires a été mis en évidence par de nombreuses études dans un ensemble de pathologies neurologiques, neurodéveloppementales et psychiatriques, notamment dans les troubles cognitifs associés. L’objectif global du projet est de préciser ce rôle et d’identifier ses mécanismes sous-jacents qui ne sont pas encore élucidés, dans l’espoir d’ouvrir de nouvelles voies de recherche thérapeutique. Plus précisément les objectifs sont i) de mieux caractériser le rôle de deux sous-unités majeures d’un récepteur dans les processus cognitifs altérés au cours de différentes pathologies neuropsychiatriques, ii) de tester l’impact de molécules pharmacologiques agissant sur ces récepteurs sur certains de ces processus, et iii) d’identifier les circuits cérébraux impliqués dans leurs mécanismes d’action, en utilisant des modèles précliniques présentant une forte valeur translationnelle.
Bénéfices attendus
Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une meilleure compréhension des rôles de certains récepteurs aux neurotransmetteurs, exprimés dans différentes régions du cerveau, dans les fonctions cognitives impactées au cours de ces pathologies. De plus, ce projet devrait permettre d’identifier une étiologie commune potentielle à différents troubles neuropsychiatriques, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique. Grâce à l’implémentation de tests précliniques à forte valeur translationnelle, ce projet pourra ouvrir à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur des composés ciblant certains sous-types de récepteurs nicotiniques, tels que des modulateurs allostériques de ces récepteurs qui sont actuellement en voie de développement. Ce projet générera également des bases solides pour de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux quotidiens d’1h maximum par jour, pendant des mois, élaborés pour générer le moins de stress possible aux animaux. Ils seront également soumis, seulement une fois et pour 30 minutes maximum, à des tests d’anxiété et de locomotion, susceptibles d’entraîner un stress passager. Les animaux ne seront pas soumis à plus d’un test de comportement par jour. Les animaux seront soumis à une très légère restriction de nourriture pendant toute la durée de l’expérience mais ils auront accès à une récompense sucrée presque chaque jour, et l’eau sera laissée à volonté. En outre, certains animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale au cours de laquelle une infusion ou implantation intracérébrale sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales, ou infusions intracérébrales (qui dureront 3 minutes tout compris et auxquelles ils auront été progressivement habitués), de composés pharmacologiques, répétées maximum 9 fois par animal, avec au moins 3 jours d’écart entre chaque injection ou infusion. Enfin, certains animaux seront exposés à un stress de contention pendant 30 minutes pour un maximum de trois fois par animal avec une semaine d’écart entre chaque exposition.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests cognitifs. Les différents modèles et protocoles qui seront employés pour induire l’expression ectopique de gènes d’intérêt ou des symptômes de type neuropsychiatriques ont déjà été testés et validés, et n’ont pas été associés à des altérations majeures de la santé physique ou émotionnelle des animaux. Ils ont été choisis sur cette base. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à une privation alimentaire légère, à un stress induit volontairement sur un temps court, ou à une chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo
Remplacement
Pour identifier les mécanismes cérébraux mis en jeu et les effets de composés thérapeutiques sur les processus cognitifs associés à des pathologies neuropsychiatriques, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au fonctionnement exécutif au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents
Réduction
La méthodologie statistique a été discutée en amont de la soumission de ce projet avec un biostatisticien. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 15 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de rats sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront systématiquement prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des vérifications et mesures de marqueurs neurophysiologiques. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Nous enrichirons le milieu avec des blocs de bois, et des tunnels en carton si un animal doit être isolé, et nous nous rapprocherons du comité responsable du bien-être animal pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués au moins 30 min avant la chirurgie. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du comité responsable du bien-être animal. Au moins une fois par jour les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites. Des points limites sont identifiés et leur atteinte conduira à la mise à mort de l’animal. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression faciale très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, et, pour les chirurgies, signes de douleur malgré l’analgésie, poils hérissés, animal prostré, hypothermie.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre ce projet). Le rat est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier des fonctions cognitives complexes et particulièrement pour des tests cognitifs basés sur la technologie dite ‘touchscreen’ et l'auto-administration de drogue sur une longue période qui présentent une forte valeur translationnelle. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte pour la grande majorité (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement. Un groupe d’animaux sera utilisé ponctuellement dès une semaine après la naissance pour recevoir des injections d’un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau (une injection aux jours 7, 9 et 11), puis laissés sans manipulation jusqu’à l’âge adulte. Un groupe d’animaux sera exposé in utero à un composé pharmacologique dans le but de modeler le développement du cerveau à travers une injection réalisée chez la mère vers le milieu de la gestation.
Elevage de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
6000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour gérer un élevage de souris génétiquement altérées. Chaque animal subit sous anesthésie un prélèvement au bout de la queue ou de l'oreille pour son génotypage. Le porteur indique que les souris au génotype voulu sont versées en continu dans d'autres projets et que celles au génotype non requis sont mises à mort ou réutilisées. Il présente cet élevage comme une "réduction" du nombre d'animaux, tout en programmant le génotypage de 6000 individus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est la caractérisation génétique des rongeurs (souris) dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés. L'élevage est réalisé par une plateforme au service des activités de recherche utilisant des animaux à des fins scientifiques comme modèle expérimental dans le domaine des neurosciences, de la physiologie, la compréhension de la réponse immunitaire dans certaines pathologies humaines ou encore dans les mécanismes liés au développement de cancers. Certains de ces projets sont amenés à utiliser des animaux génétiquement altérés (génétiquement modifiées ou avec des mutations spontanées) en l'absence de solutions alternatives disponibles n'utilisant pas d'animaux. L'élevage des animaux génétiquement modifiés nécessite la détermination de la constitution génétique (appelé génotype) de chaque individu par une amplification précise et localisée des séquences d’ADN modifiées à partir des cellules de tissu facilement accessible et avec une approche la moins invasive possible. Cette caractérisation précoce au moment du servage ou plus tardive des animaux nés sur site, est indispensable et contribue au respect de la règle des 3R, notamment en termes de réduction.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet repose sur la réduction du nombre d'animaux utilisées. La mise en place d'une procédure de caractérisation génétique fiable et reproductible permet: d'utiliser des individus avec un génotype défini et requis dans les projets scientifiques, de maitriser la production du nombre d'individus au strict minimum et la qualité génétique des animaux élevés sur site.
Procédures
un prélèvement tissulaire (extrémité de la queue ou pavillon de l'oreille de 2mm) sous anesthésie générale pour 6000 souris; durée inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse associé à une douleur légère et transitoire liée à la biopsie.
Devenir
Les individus avec le génotype requis seront en utlisation continue dans les projets scientifiques nécessitant l'utilisation des lignées concernées. Les individus ne possédant pas le génotype requis seront mis à mort ou seront réutilisés dans des projets ne nécessitant pas de génotype particulier.
Remplacement
Les animaux élevés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Il n'existe pas non plus de technique in vitro ou in silico pour déterminer le génotype d'un animal sans prélèvement de son ADN contenu dans ses propres cellules. L'ADN est spécifique à chaque individu.
Réduction
La stratégie d'accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter la production d'animaux au strict minimum. Cette stratégie participe fortement à la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Selon les lignées et les projets, un certain nombre d’animaux n'ont pas le patrimoine génétique requis. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype. La réutilisation participe à la réduction du nombre d'animaux utilisés globalement pour les projets scientifiques. De plus, le génotypage en amont des projets et non pas à la fin des projets scientifiques participe également à la réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une alternative non-invasive pour la récupération de cellules (prélèvement buccal) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables et reproductibles. Des techniques alternatives de biopsie non invasives n'ont pas permis à ce jour d'obtenir des résultats satisfaisants. Le prélèvement de tissu pour déterminer le génotype des souris est réalisé systématiquement sous anesthésie gazeuse. Pour les jeunes individus, ce prélèvement sera réalisé à l’extrémité de la queue précocement, à l’âge de 21 jusqu'à 30 jours au moment du sevrage, avant l’ossification complète de la queue ce qui permet de limiter la nuisance de ce geste. Chez l’adulte, un prélèvement d’un morceau du pavillon de l’oreille en dehors de la zone cartilagineuse sera privilégié. La taille de la biopsie est réduite à son minimum. Les animaux sont hébergés en groupe social, en cage ventilée enrichie avec du matériel permettant de répondre à leurs besoins (nidification, se cacher, ronger) avec accès à l’eau et à l’alimentation ad libitum.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisées dans l'animalerie. Ils font appel à des souris génétiquement modifiées. Pour les individus nécessitant une biopsie de l'extrémité de la queue pour génotypage, ils sont âgés de 21 à 30 jours maximum. Pour les individus nécessitant un prélèvement d'un morceau du pavillon de l'oreille, ils sont agés de plus de 6 semaines.
Etude, en fonction du sexe, des effets d’une inflammation excessive sur la contraction et la consommation d’oxygène musculaires de rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
60 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie de dix minutes pour déclencher un sepsis, puis est tué pour prélever ses tissus, l'étude visant à comparer la réponse des mâles et des femelles. Le porteur situe les bénéfices à long terme, pour l'amélioration de l'état des patients en réanimation. Il affirme que le sepsis met en jeu des régulations globales qui ne peuvent être étudiées ni sur cellules ni sur organes isolés.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome d’inflammation généralisée grave secondaire à une infection. Son incidence le classe en première position dans les causes de mortalité survenant dans les unités de soins hospitaliers. Il est en effet caractérisé par une réaction inflammatoire disproportionnée amenant à une dégradation structurale et fonctionnelle de plusieurs organes pouvant amener à la mort. Cette réponse inflammatoire systémique est également source de stress oxydant. Selon le sexe, il s’avère que la réponse au sepsis est différente. Cette étude a pour objectifs : 1) de comprendre la différence mâle et femelle sur un modèle de rat septique 2) contribuer à l’amélioration de l’état des patients hommes et femmes atteints de sepsis.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet à long terme permettront de comprendre la différence de réponse entre les femmes et les hommes face au sepsis et ainsi de contribuer à l’amélioration de l’état des patients atteints de sepsis, état pathologique qui représente la première cause de mortalité dans les unités de réanimation médicale et de soins hospitaliers.
Procédures
L'animal sera contentionné pour induire l’anesthésie générale par injection (10 secondes pour une injection). Puis, l'animal aura une chirurgie d'une durée de 10 min maximum pour déclencher le sepsis. Pour le maintien de l’anesthésie/analgésie, au maximum 5 injections seront réalisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sont un stress de courte durée (1 minute) engendré par la contention de l'animal pour induire l’anesthésie générale par injection d’un mélange anesthésique/analgésique (10 secondes pour une injection, douleur légère). Pour le maintien de l’anesthésie, 5 injections (au maximum, 5 fois 10 secondes, douleur légère) d’un mélange anesthésique/analgésique (toutes les heures environ) seront réalisées. Les animaux auront 6 injections d'anesthésique/analgésique au maximum. Parmi les nuisances peu susceptibles d'arriver mais qui doivent être envisagées, on peut noter l'hémorragie, l'hyperventilation anormale ou la détresse respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser les prélèvements tissulaires.
Remplacement
Il s’agit d’une étude sur les effets physiologiques au niveau de l’organisme pour laquelle le remplacement n’est pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe est limité au minimum permettant une étude statistique pour comparer les différences mâles /femelles.
Raffinement
Le raffinement est mis en place dans la pratique de l’antalgie et de l’anesthésie. Afin de prévenir tout risque de douleur, une injection analgésique par voie sous cutanée est réalisée 30 min avant l'anesthésie. Puis, l’animal est installé sur un tapis chauffant permettant le maintien de sa température corporelle à 37°C grâce à un monitoring par sonde rectale. Au cours de la procédure, le concepteur évalue la profondeur de l’anesthésie en pinçant les pattes arrières et réinjecte toutes les heures une dose d'analgésique/anesthésique. Une fiche de suivi de l’anesthésie a été mise en place.
Choix des espèces
Le sepsis est une pathologie complexe mettant en jeu des régulations physiologiques globales qui ne peuvent être uniquement étudiées sur des organes isolés ou a fortiori sur des cellules. De plus, les mécanismes physiologiques du sepsis chez le rat sont très proches de ce qui se déroule chez l’Homme. Les expérimentations seront menées sur le rat, qui représente pour ce type d’étude l’espèce de référence dans la littérature. De plus, cela permettra la comparaison avec des résultats déjà obtenus au laboratoire. La procédure sera réalisée sur des rats âgés de 8 semaines pour obtenir des résultats sur des animaux adultes mais pas trop âgés. Nos précédents résultats sont également basés sur cet âge, ce qui nous permettra de réaliser des comparaisons avec la littérature et nos précédents résultats.
Etude de la toxicité neurorespiratoire d’un traitement antalgique seul ou en association chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
168 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'une sonde de télémétrie, des gavages et des injections, une partie recevant de la morphine pendant neuf jours, pour étudier la toxicité respiratoire de la gabapentine seule ou associée à des dépresseurs du système nerveux. Le porteur indique que ces molécules peuvent provoquer une sédation allant jusqu'au coma, une hypothermie et une dépression respiratoire. Il justifie l'étude par l'usage détourné croissant de la gabapentine et affirme que la fonction respiratoire intégrée ne peut être évaluée in vitro.
Objectifs
Notre objectif global est de mieux comprendre les besoins non satisfaits des personnes atteintes de cancer et souffrant de douleurs chroniques neuropathiques, ainsi que les mécanismes de toxicité liés à la surconsommation ou à l’association des traitements habituellement utilisés (dont les gabapentinoïdes). Du fait de l’augmentation du taux de prescription de la gabapentine, notamment pour les douleurs neuropathiques, et de son usage illicite dans le monde et surtout aux Etats-Unis, ainsi que la tendance émergente de son association aux dépresseurs du système nerveux central, les inquiétudes sont de plus en plus grandes vis-à-vis de sa toxicité et de ses mécanismes. Même à doses thérapeutiques, les effets respiratoires de ces composés associés représentent un risque important pour les utilisateurs pouvant même aller jusqu’à engager leur pronostic vital. Les objectifs de notre étude sont ainsi de caractériser par une approche préclinique chez le rat, les effets neuro-respiratoires induits par l’administration de gabapentine seule, ou en association avec les dépresseurs du système nerveux central selon une approche pharmacocinétique/pharmacodynamique. Et dans un second temps, d’évaluer le potentiel de la gabapentine vis-à-vis d’une levée de la tolérance respiratoire suite à une administration prolongée d’opioïdes. La tolérance respiratoire est un processus d’adaptation de l’organisme caractérisé par une diminution des effets respiratoires produits par la même dose d’opioïde après un usage prolongé. La levée de tolérance respiratoire induit par la gabapentine pourrait donc expliquer la toxicité de ce traitement.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de caractériser les mécanismes de toxicité et les effets neuro-respiratoires induits par l’administration de la gabapentine seule ou en association avec d’autres dépresseurs du système nerveux central, et ainsi de mieux comprendre les mécanismes pharmacocinétiques et pharmacodynamiques des interactions entre les gabapentinoïdes et les psychotropes étudiés que l’on retrouvent de plus en plus fréquemment dans les intoxications, en particulier chez les patients souffrants de douleurs chroniques neuropathiques et plus à risque de surconsommation médicamenteuse, et ainsi alerter, prévenir et proposer des stratégies de prise en charge de ces effets toxiques ayant des conséquences potentiellement fatales.
Procédures
Pour les animaux inclus dans l'une des 4 procédures: Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie (2 injections de chacune 5-10 secondes) + chirurgie (20 à 30 mins) + administration par gavage de molécule (1 gavage; 30 secondes – 1 minute) et 1 injection sous-cutanée de substances (1 injection : 5 -10 secondes). De plus, pour les animaux de la procédure 2 : prélèvements de sang (23 prélèvements ; 1 prélèvement durant 30 secondes). Les animaux de la procédure 4 seront soumis en plus à : Injections intrapéritonéales de morphine (2 injections/jour pour 9 jours, soit 18 injections durant chacune entre 5-10 secondes)
Impact sur les animaux
On s’attend à la suite de l’administration des différentes molécules à des effets indésirables pouvant aller d’une légère sédation jusqu’à un coma, une hypothermie et une dépression respiratoire. Les injections et les prélèvements sanguins induisent une douleur légère. Un stress lié au gavage avec risque de fausse route, quoi que rare, est à prendre en compte. De plus, suite à la chirurgie permettant l’implantation la sonde de télémétrie pour la procédure d’électromyographie, les rats seront hébergés en cage individuelle jusqu’à récupération post-chirurgicale complète pouvant être à l’origine d’un certain stress.
Devenir
La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage de télémétrie ou de l'atteinte d'un point limite requérant la mise à mort des animaux.
Remplacement
L’ensemble des procédures ne sont pas remplaçables par des expériences in silico ou in vitro, en raison d’une approche physiopathologique de la fonction respiratoire intégrée sur animal entier ainsi que de la pharmacocinétique dont les différentes phases ne peuvent être évaluées dans leur intégralité que par l’utilisation d’animaux.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux (6 animaux/groupe) a été prédéterminés à l’aide de tests de puissance afin de permettre l’analyse des résultats entre les différents groupes expérimentaux en utilisant un test non paramétriques pour s’assurer de leur validité et l’atteinte du seuil de significativité fixé à 5%. De plus, à l’aide d’une technique de dosage sur microprélèvements, les prélèvements sanguins pour la mesure des gaz du sang artériel et la pharmacocinétique s’effectueront sur le même animal. Enfin, en cas de l’absence d’effets ventilatoires significatifs suite à l’administration concomitante de certains traitements en pléthysmographie corps-entier, ces associations médicamenteuses ne seront pas étudiées en gaz du sang, ni en électromyographie, dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant des bâtonnets et des bandelettes de papier kraft à titre d’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Enfin, l’étude pharmacocinétique sera réalisée à l’aide de microprélèvements dans le but de réduire au maximum le volume sanguin à prélever.
Choix des espèces
Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est le modèle de référence dans le domaine de la toxicité respiratoire, notamment du fait de sa physiologie respiratoire qui est très proche de la physiologie humaine. De plus, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera les études pharmacocinétiques. Des rats âgés de 6 à 9 semaines seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec les expériences déjà faites au sein du laboratoire et les articles publiés dans la littérature, la population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substances.
Efficacités de produits rodenticides à action anticoagulante dans le cadre d’autorisations de mise sur le marché
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 200
200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont isolés quatre jours puis reçoivent un appât anticoagulant, avant une surveillance quotidienne sur 28 jours et une mise à mort dès les premiers signes d'empoisonnement. Le porteur décrit des hémorragies, un état de faiblesse et une anémie conduisant à la mort, et empoisonne ainsi des rongeurs pour homologuer des produits destinés à tuer des rongeurs. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, la réglementation imposant de tester l'appétence et la mortalité sur les espèces cibles.
Objectifs
La lutte contre les rongeurs est un enjeu de santé publique et un enjeu économique majeur pour l’industrie agro-alimentaire. En plus des mesures classiques d’hygiène et de conception des bâtiments, la politique de lutte contre les rongeurs fait appel à des appâts anticoagulants. Ces appâts sont consommés par les rongeurs et ils ont un effet biocide. L’utilisation de ces biocides est considérée comme étant la méthode chimique létale la plus efficace. Tous les anticoagulants ont le même mécanisme d’action, ils inhibent les facteurs de la coagulation sanguine, dits « vitamine K1 dépendants », conduisant à un trouble de la coagulation. Ce trouble de la coagulation engendre de la mortalité dans la population de rongeurs diminuant ainsi les problèmatiques liées à une surpopulation. La toxicité de ces anticoagulants est connue et souvent déjà bien évaluée in vitro et in vivo. Cependant, la réglementation exige de nouveaux tests in vivo si la composition d’un traitement évolue (e.g. : concentration, appétence augmenté, passage d'une formulation liquide à une formulation solide). En effet, le changement de composition peut entrainer une modification du comportement des rongeurs face à l’appât. Selon la réglementation, ces produits modifiés doivent être obligatoirement testés conformément à des recommandations précises avant de pouvoir être mis sur le marché. L’entreprise à l’origine de cette DAP est prestataire pour d’autres entreprises. Ces entreprises lui délèguent les tests nécessaires à l’homologation de leurs produits anticoagulants rodenticides ou le cas échéant la ré-homologation imposée par la législation après 5 ans d'utilisation commerciale. Les procédures réalisées dans ce projet permettent de tester l’appétence et l’efficacité d’un rodenticide sur rat et/ou souris (mesure de la consommation et de ses effets). Les résultats de ces procédures permettrons de jugué quant à l'homologation du produit ou non. Cette demande d’autorisation de projet, encadre différents produits et formulations de produits provenant de différents délégataires. Les principes actifs de ces produits sont tous des anticoagulants perturbant le métabolisme de la vitamine K. Les résultats des procédures alimentent un dossier réglementaire très strict permettant de réaliser des demandes d’autorisation de mise sur le marché. Ces autorisations sont obligatoires et positivement bien encadrées.
Bénéfices attendus
La gestion problématique des déchets de consommations et des poubelles a intensifié un fait ayant toujours existé, la présence de rats et de souris en contact direct avec l’être humain. Comme pour beaucoup d’espèces vivantes, une prolifération intense engendre des conséquences négatives. Dans notre cas, la prolifération de rats et de souris peut avoir des conséquences sanitaires (droit de retrait pour le rammassage des containers poubelle, leptospirose, transmission de diverses bactéries et helminthes), cela peut entrainer des dégâts sur les ressources alimentaires (10% à 15% des pertes mondiales :consommés/contaminés/jetés) et les rongeurs sont à l'origine de dégâts matériels conséquent (en France : coût annuel des dégâts = environ 38 millions d'euros, galeries, accès aux bâtiment, sites de passage souillés, câbles rongés, accidents liés au dysfonctionnement). De plus les proliférations de rongeurs ont un impact très négatif sur l'image des sites infestés et une répercution économique et sociale importante sur ces sites (fermetures d'écoles, industrie agroalimentaire fermé par le autorités sanitaires, restaurant, boulangeries). Quant aux particuliers concernés par ces infestations la répercussion psychologique n'est pas négligeable. Le développement de produits rodenticides plus performants est un élément important de la lutte contre la prolifération des rongeurs. L'utilisation d'anticoagulants est le moyen chimique le plus efficace pour diminuer la pression parasitaire. Ces anticoagulant doivent être homologués, aussi la réalisation de tests réglementaires est indispensable à la mise sur le marché de ces produits. De plus, les rodonticides ne présentant pas les résultats attendus par la réglementation ne seront pas autorisés. Donc ce projet permet d’empêcher la mise sur le marché de produits inefficaces. Or l'utilisation de produits inefficaces peut être à l’origine de résistances pour la cible (rongeurs) mais demeurer mortel pour des espèces non-ciblées (eg.chien). Aussi Il est très important de tester ces produits afin d'écarter les produits inefficaces. En résumé, il y a des avantages économique, écologique, sociale et sanitaire à la mise sur le marché de produits efficaces, or cette mise sur le marché nécessite la réalisation des tests décrits dans ce projet comme préconisé par la loi et la réglementation.
Procédures
Les animaux seront maintenus en cage individuelle (isolement) durant 4 jours. Les cages des animaux isolés sont à proximité de cages contenant des congénères afin de conserver un contact visuel, sonore et olfactif. Les cages individuelles contiennent un enrichissement supplémentaire (abris et du coton). Durant 4 jours, un produit anticoagulant est proposé à la consommation en libre choix en regard d’une alimentation habituelle. Quotidiennement durant 28 jours, les animaux sont sortis de leur cages et doucement manipuler durant moins de 10 minutes afin d’observer leur orifices (nez, yeux, bouche oreille, anus appareil génital) et d’être pesé. Lorsque les animaux présentent les signes cliniques d’une intoxication aux anticoagulants, alors afin de limiter la souffrance des animaux, ils sont mis à mort.
Impact sur les animaux
Au regard de leur nature sociale, l’isolement des individus (rats et souris) durant 4 jours est une source de mal-être chez le rat et la souris. C'est à pondéré avec un maintien des individus à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Nous n'attendrons pas d'observer d'intoxications graves dues aux anticoagulants. En effet ceux-ci entrainent des hémorragies, occasionnant différents maux et troubles significativement négatifs : hémorragies interne et externe entrainant un état de faiblesse et d'apathie, sans douleurs mais susceptible de provoquer un mal-être et dont l'issue est une anémie aigüe entrainant la mort. Aussi, il est inconcevable d'attendre la mort par intoxication aux anticoagulants. Aussi, une observation régulière des animaux permettra de déceler les animaux commençant à présenter des signes négatifs d’intoxication (prostration, pelage, léthargie, décoloration des extrémités ou saignements); ces points limites permettront d’effectuer une mise à mort très en amont de la mort liée à l’anticoagulant. La sortie, l'auscultation et la pesé régulière des animaux peut être une source d'angoisse surtout si cela se cumule avec un mal-être/souffrance existante aussi une période d'habituation permettra de diminuer les contraintes liées à ces manipulations.
Devenir
Attendre une intoxication létale aux anticoagulants est inenvisageable. Sont mis à mort les animaux montrant des signes précoces d’un empoisonnement aux anticoagulants. La mise à mort permet d’éviter des souffrances inutiles à l’animal. Si l'animal ne présente pas de signes cliniques permettant de juguer quant à son empoisonnement, il est néanmoins victime d'une fragilité au niveau de la coagulation pouvant perdurer plusieurs mois. Cette fragilité de coagulation pourrait se révéler cliniquement en dehors du temps d'observation prévu par la procédure et engendrer des souffrances importantes si une mise à mort n'est pas réalisée à temps. Ce risque de fragilité de coagulation est trop important pour envisager une réutilisation des animaux. Aussi, les animaux ayant reçu l’anticoagulant sont euthanasiés à la fin des procédures.
Remplacement
Il n'y a pas de stratégie de remplacement possible. En effet, la réglementation impose de tester l'attractivité alimentaire du traitement (consommation) et les effets du traitement (mortalité). Ces critères ne peuvent être observés que sur animaux vivants, le comportement de consommation en particulier ne peut être simulé. De plus, la réglementation impose que ces produits soient testés sur les espèces cibles, c’est à dire rats et souris. il y a donc une obligation réglementaire empêchant ce remplacement par d'autre espèces animales.
Réduction
Dans le cadre d’une Autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit produit biocide de type anticoagulant, les essais règlementaires soumis au législateur doivent être mis en place selon des recommandations strictes. Pour chaque formulation à l’étude, il est recommandé de tester à minima 10 animaux par espèce ciblée. Pour chaque formulation et selon la revendication du produit, des tests pourront être conduit sur les 2 espèces ou sur une espèce. Ainsi, si un produit à l’étude cible les rats et les souris alors 20 animaux sont utilisés dans la procédure (10 rats et 10 souris). La loi exige de tester un minimum de 10 animaux; nous souhaitons utiliser le moins d'animaux possible, aussi nous ne testerons que le minimum d’individus préconisé soit 10 animaux par procédure. Un test statistique sera réalisé afin de vérifier si la consommation et la mortalité sont identiques entre les 2 sexes, le cas échéant ces taux seront calculés en prenant en compte la population entière. Le nombre d’animaux définit suffira à déterminer la tendance statistique nécessaire pour voir si le produit testé est suffisamment consommé (≥20% de la ration alimentaire) et s’il permet une mortalité efficace (≥90% des animaux testés). Afin de ne pas inclure inutilement des animaux dans les procédures, nous ne testons pas d'animaux témoin. Nous nous basons sur une survie théorique de 100% des individus témoin en nous basant sur les périodes d'acclimatation et d'habituation qui précédent le test. Afin d'éviter un biais de placement pour la mesure de la consommation, l'emplacement du produit est inversé quotidiennement avec l'emplacement de l'aliment de laboratoire habituel (aliment extrudé ou biberon d'eau).
Raffinement
Phase d'Acclimatation : durée = 7 jours minimum , acclimatation le cas échéant à la salle, à l’aliment, aux procédures d’hébergement, aux congénères. Phase d'Habituation : Durée = 7 jours. Afin d’individualiser les animaux, un signe distinctif est réalisé au marqueur indélébile sur leur queue. Afin d’habituer les animaux aux manipulations et au manipulateur, celui-ci réalise différentes actions sur les animaux. Quotidiennement, le manipulateur consigne pour chaque animal : l’état du pelage, des yeux et des oreilles et le comportement de l’animal. Pour chaque animal, le manipulateur saisit délicatement l'animal, le sort de la cage, réalise une brève observation et le pèse. Lors de la brève observation, le manipulateur vérifie l’état des différents orifices (bouches, oreilles, nez, anus, appareil génitale). La masse des animaux et la masse d’aliment non-consommé est consignée quotidiennement, puis une masse déterminée d’aliment est mise à disposition. Ainsi, le manipulateur prend connaissance du comportement "normal" de chaque animal et pourra le comparer à celui de l'animal sous anticoagulant. De plus, l'animal habitué réagira moins aux manipulations lorsqu'il sera sous anticoagulant, ce qui évitera l'accumulation de contraintes. Phase d’isolement : durée = 4 jours . Lors de l’hébergement individuel, l’environnement est enrichi (cachette + coton). Les animaux sont placés dans des cages transparentes à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Après ces 4 jours d'isolement, les rongeurs femelles sont regroupés. Les mâles non-agressifs seront regroupés suivant leur affinité et groupe de départ. Sinon, ils seront maintenus isolés. Phase d’observation de la mortalité (J+2 à J+21) : Signes précoces d’intoxication ou de morbidité = mise à mort. Afin d’éviter des souffrances inutiles aux animaux, l'observations des points limites en regard d'un score au delà duquel les animaux sont mis à morts est mis en place. Les cages et éléments d’élevage sont adaptés à l’espèce et au nombre d’animaux. Si une baisse de poids supérieure à 10% est observé, alors de l’aliment humidifié et de l’eau gélifiée seront fournis à l’animal. À la suite de chaque réalisation de procédure, une analyse rétrospective sera réalisée pour le comité éthique afin d'améliorer d'un point de vue "éthique animal" la procédure (affinement des points limites, des observations ...).
Choix des espèces
Les produits sont destinés à limiter la surpopulation indésirable de rongeurs en agriculture, en industrie ou en milieu urbain. La réglementation exige l’utilisation des espèces cibles comme modèle expérimental. L’utilisation de rongeurs est appropriée puisque les produits testés ont pour destination une utilisation sur rats et souris. Bien que les traitements anticoagulants ciblent les rongeurs « sauvages », nous utilisons des souches de laboratoire. En effet, en plus de la contrainte d’obtention, d’habituation et du risque sanitaire, la récupération d’individus sauvages est en soit une source de stress et de mal-être chez l’animal. Une souche de laboratoire « non résistante » nous permet de réaliser plus efficacement l’observation des points limites. Les souches testées sont quasiment identiques aux souches sauvages. Nous utiliserons des adultes afin de conserver une certaine homogénéité dans la consommation interindividuelle de produit à l’étude. Ainsi, nous conservons une relative maitrise de l'intensité et du délais avant apparition des effets toxiques. Ainsi, nous pouvons anticiper de manière plus fine et donc mieux gérer la souffrance et détresse. Dans un objectif de réutilisation, les animaux utilisés seront idéalement d’anciens reproducteurs issus des laboratoires d’élevage. Nous utiliserons des animaux âgés de plus de 6 mois et de moins de 1,5 an, cela correspondant à la fourchette d'âge observée dans la nature, de plus les individus sont de masses relativement homogènes et donc plus facilement comparables.
Étude du rôle des composants de la lame basale lors du processus de régénération musculaire après lésion induite au sein du Tibialis Anterior chez des souris jeunes et âgées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
108 souris, jeunes et âgées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le muscle de leur patte est lésé par injection de venin de cobra afin d'étudier le rôle de deux protéines dans la régénération musculaire. Le porteur affirme que les injections ne provoquent pas d'effets indésirables et que les souris reprennent leur activité dès le réveil. Il indique léser les deux pattes de chaque animal pour diviser par deux le nombre de souris, et conclut que des lignées cellulaires ou modèles 3D ne reproduisent pas le muscle en régénération.
Objectifs
Des souris saines seront utilisées pour ce projet. Des études préliminaires dans le laboratoire ont montré la diminution avec l'age de protéine présente au sein du muscle et qui pourrait impacté le bon fonctionnement de la régénération musculaire. Le processus de lésion et régénération musculaire sera induit par une injection de toxine (venin de cobra). La toxine déclenche le processus de régénération musculaire sans affecter le comportement de l'animal. Cette technique permet une lésion de l'ensemble du muscle injecté de façon reproductible. L'injection de toxine sera utilisée pour suivre les différentes étapes de la régénération musculaire et voir l'effet de nos deux protéines d'intérêt sur le processus de régénération musculaire. Pour ce faire, nous allons effectuer l'extinction de ces protéines au sein des muscles de souris jeunes puis nous allons ajouter ces protéines au sein de muscles de souris agées afin d'observer si cela améliore leur régénération musculaire.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats du projet permettront de mettre en évidence le rôle de deux protéines d'interêt dans le processus de régnération musculaire dans la muscle squelettique, et cela dans le muscle jeune et plus agé. En plus d'augmenter les connaissances des mécanismes fondamentaux qui régulent la fonction des cellules qui participent à la réparation du muscle squelettique, les résultats de cette étude pourraient permettre la conception de nouvelles stratégies de médecine régénérative par la mise en évidence de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Trois injections intramusculaires dans le muscle releveur de la patte seront réalisées. Elles durent moins de 5 secondes et seront faites sur animaux anesthésiés. Deux injection d’analgésique (anti-douleur) sera également réalisée avant et après la lésion musculaire.
Impact sur les animaux
Les injections de la protéine d'intérêt n'ont pas été rapportées comme provoquant des effets indésirables chez l'animal aux doses utilisées. L'utilisation d'anesthésiques au cours des procédures de lésion musculaire et d'injection de la protéine garantit l'absence de stress chez l'animal et n'est utilisé que pendant un court temps, non nuisible pour l'animal. De plus, l'injection d'analgésique avant et après l'injection permet de réduire au maximum la douleur chez l'animal et donc le stress. Les expériences précédemment menées avec cette procédure confirment que les souris reprennent leurs activités dès le réveil et qu'elles ne montrent pas de signes de douleurs pendant les jours suivants.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les muscles seront prélevés.
Remplacement
Les paramètres d'auto-renouvellement des cellules souches musculaires et leur potentiel de fusion avec les fibres musculaires sont essentiels pour comprendre la physiopathologie musculaire. Notre projet s'intéresse aux interactions entre les différents types cellulaires au sein du muscle en régénération, et nécessite donc des modèles murins. Ces résultats ne peuvent pas être obtenus par l'usage de lignées cellulaires, ni de modèle 3D qui ne reproduisent pas fidèlement la diversité et l'organisation des types cellulaires au sein du muscle en régénération.
Réduction
L'injection de cardiotoxine dans les deux pattes présente une nuisance supplémentaire pour les animaux mais reste tolérable et tout sera mis en œuvre pour limiter la souffrance des animaux. Cette double injection nous permettra de diviser par deux le nombre de souris nécessaire en utilisant chaque souris pour deux analyses différentes. Les expériences seront effectuées sur un lot expérimental réduit de 6 souris afin de garder suffisamment d’individus pour effectuer des analyses statistiques robustes et fiables tout en réduisant le nombre d’animaux au strict minimum. Nous utiliserons comme test statistique le test de Student pour comparer la moyenne des différentes conditions biologiques expérimentales entre elles (groupe contrôle versus traité)
Raffinement
1)L es animaux suivront une période d'acclimatation d'au moins une semaine à leur arrivée au sein de l'animalerie. 2) En plus de la surveillance quotidienne des animaux par le personnel animalier, les animaux seront observés par nos soins 2 fois par semaine. Cela va permettre de contrôler leur posture, leur mobilité, leur comportement et leur niveau d'interaction sociale, tout changement pourrait refléter une souffrance, douleur ou stress même minime chez l'animal. Les douleurs dues à la lésion musculaire et le mécanisme de régénération se mettant en place dans les premières 24h, l’animal sera particulièrement surveillé pendant cette période. L'animal sera mis à mort en cas de douleurs trop importantes pour éviter toute souffrance inutile. 3) Les animaux seront également pesés 4 jours avant l’injection de cardiotoxine puis 4 jours après afin de vérifier qu'il n'y a pas de perte de poids anormale. 4) La procédure est peu invasive (injection intramusculaire simple sans chirurgie) pour permettre d'induire le processus de régénération musculaire et l'injection des molécules. 5) Des anesthésiques (isoflurane 3-4%) et analgésiques seront utilisés au cours de la procédure afin de prévenir au maximum le stress des animaux. L'analgésique sera utilisé avant et après l'induction de la lésion musculaire et l'anesthésique au cours de l'induction de la lésion musculaire ainsi que durant les injections des molécules d'intérêt. 6) Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante.
Choix des espèces
Le tissu musculaire de la souris est extrêmement proche du tissu musculaire de l'Homme, aussi bien dans sa composition cellulaire que dans son fonctionnement. La souris représente donc un modèle de choix pour l'analyse exploratoire des gènes impliqués dans la régulation du muscle. Afin d'observer si nos protéines ont un rôle dans le processus de régénération musculaire physiologique, des souris agées de 8 à 12 semaines seront utilisées afin de découvrir le rôle de nos deux protéines d'intérêt. Dans un second temps, afin d'observer si nos protéines peuvent avoir un effet sur la régénération musculaire dans un contexte de vieillissement, des experiences sur souris agées de 24 mois seront effectuées. Seules des souris mâles seront utilisées pour cette étude comme les hormones femelles peuvent impactées le processus de régénération musculaire, et que les mâles sont principalement touchés par les maladie du muscle comme la dystrophie.
Etude de la biocompatibilité d’un dispositif médical (DM) sur la santé humaine par l’utilisation d’un modèle de rat.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1085 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère, la majorité en gravité sévère. Ils subissent des tests réglementaires de toxicité d'un dispositif médical par gavage, application cutanée, injection ou instillation nasale. Le porteur indique que ces tests peuvent provoquer des signes de toxicité générale allant jusqu'à la mort, ainsi que des lésions cutanées pouvant aller jusqu'à l'escarre et la destruction de la peau. Il affirme que les méthodes in vitro susceptibles de remplacer ces essais ne sont "pas encore validées" et que ces tests sont imposés par la réglementation européenne.
Objectifs
Les professionnels de santé utilisent aujourd’hui des dispositifs médicaux (implants, prothèses, instruments…) que nous appelons « DM ». Le but du projet est d’évaluer la biocompatibilité de ces dispositifs. Autrement dit nous devons déterminer si les dispositifs, qui vont avoir un contact direct avec les tissus et fluides interne, sont compatibles avec le corps humain. Pour cela les DM doivent faire l’objet de tests réglementaires de toxicité évaluant en particulier les risques de toxicité systémique aigüe et de tolerance locale. Parmi les paramètres à étudier pour évaluer la biocompatibilité d’un DM, il faut évaluer sa toxicité systémique ainsi que sa tolérance locale. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit, nous réaliserons des tests de toxicité systémique aigüe sur le modèle du rat (par voie orale, voie cutanée, voie intraveineuse et/ou intrapéritonéale) et un test de tolérance locale sur la muqueuse nasale du rat. Pour la toxicité systémique, le produit à tester ou son extrait est administrée par voie idoine chez le rat afin de déterminer la toxicité du produit, par les différents signes cliniques observés et les potentielles mortalités. Pour la tolérance locale, le produit à tester ou son extrait est administré par instillation nasale chez le rat afin de vérifier, par l’observation de réactions locales, si une réaction d’irritation se produit.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’obtenir des données expérimentales utilisées pour conclure sur la sécurité biologique d’un DM, sa biocompatibilité. Ce projet fait donc partie intégrante de l’évaluation biologique des DM, une exigence essentielle en matière de sécurité requise par le Règlement Européen et exigée par les organismes notifiés afin d'accorder ou non la mise sur le marché. Le but est d’obtenir une autorisation de mise sur le marché de DM sans risque pour la santé de l’homme.
Procédures
-TAOiso : traitement unique par gavage (1 minutes). Pesée à J0, J2, J7 et J14. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes). - TADiso : traitement unique local par patchage (24h) / dépatchage (1minute) (mise d’un pansement puis retrait). Pesée à J0, J2, J7 et J14. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes). - TAI : traitement unique par injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 minute). Pesée de J0 à J3. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes). - MN : instillations intranasales (3 minutes) (fréquences et nombre de jours de traitement dépendant du protocole). Pesée à en début, milieu et fin d’étude. Observations cliniques quotidiennes. Injection intrapéritonéale pour l'euthanasie (15 secondes).
Impact sur les animaux
Toxicité systémique : Les réactions attendues sont des signes cliniques généraux relevant d’une toxicité systémique (sur l’activité spontanée des animaux, le réflexe de Preyer, la respiration, la température corporelle, le réflexe de retournement, le tonus musculaire, la ptose palpébrale, l’aspect de la pupille, l’aspect du poil, il peut aussi y avoir des convulsions, tremblements, salivation, larmoiement), pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal. S’il y a atteinte des points limites alors l’animal peut être euthanasié pour raison éthique avant la fin de l’étude. Pour le test TADiso, en plus des effets systémiques, des réactions locales limitées à la zone de traitement peuvent être attendues (sécheresse cutanée, perte de souplesse de la peau, érythème pouvant aller jusqu’à la formation d’escharre et/ou de croûte, desctruction de l’épidermes et du derme, œdème) Pour le test MN un phénomène d’irritation peut apparaître (érythème, œdème, secheresse). Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement.
Devenir
Les tests de toxicité systémique aigüe par voie orale et par voie cutanée ont pour but d’évaluer la toxicité d’un dispositif médical qui sera observé lors de l’autopsie générale. Cette autopsie permettra également l’observation du site de traitement (estomac ou peau selon la voie d’administration). Les tests de toxicité systémique aigüe par voie intraveineuse et/ou intrapéritonéale ont pour but d’évaluer la toxicité d’un dispositif médical qui sera observé lors de l’autopsie générale. Les tests de toxicité systémique par voie nasale ont pour but d’évaluer la toxicité d’un dispositif médical qui sera observé lors de l’autopsie générale. Lors de cette autopsie les muqueuses nasales seront prélevées afin de réaliser une analyse histologique de ces tissues.
Remplacement
Les tests de toxicité systémique aigüe sur le modèle du rat (par voie orale, voie cutanée, voie intraveineuse et/ou intrapéritonéale) sont menés après avoir rassemblé toutes les informations disponibles sur la substance d’essai (identité et structure chimique, propriétés physico-chimiques, résultats obtenus dans tous les autres essais de toxicité in vitro et in vivo, données toxicologiques de substance structurellement apparentées et l’usage escompté). Les tests de toxicité systémique aigüe doivent être effectués sur le modèle du rat car les modèles in-vitro pouvant les remplacer n’ont pas encore été validés à l’heure actuelle. Le test de tolérance locale sur la muqueuse nasale ne doit pas être effectué sur un produit irritant pour la peau, les yeux, les muqueuses ou ayant un pH ≤ 2 ou ≥ 12.5 (le pH étant une échelle permettant de savoir si une solution est acide, neutre ou basique). Par ailleurs les tests d’irritations ne doivent être envisagés seulement si les données de sécurité ne peuvent être obtenues par d’autres moyens. Il n’existe pas de modèle in-vitro validé pour l’irritation nasale.
Réduction
- TAOiso : ces tests sont réalisés sur un seul sexe (normalement des femelles). Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin négatif tous les six mois et non à chaque essai. - TADiso : Les produits chimiques d’essai ne doivent pas être administrés à des doses connues pour provoquer une douleur importante ou une détresse par un mécanisme potentiellement corrosif ou fortement irritant. Le test est réalisé sur un seul sexe (normalement des femelles). Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un test témoin négatif tous les six mois et non à chaque essai. - TAI : ces tests sont réalisés sur un seul sexe. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ces tests, nous réalisons un groupe contrôle commun aux différentes études se déroulant en même temps. - MN : Lorsque plusieurs DM sont testés dans un même temps, le lot contrôle sera communs aux différentes études.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages communes par 3 ou 5, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont transparentes et contiennent de la litière constituée de particules de bois résineux déshydratée puis tamisée et un tunnel en carton comme enrichissement. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et la litière souillée est remplacée par de la litière propre 2 fois par semaine. Des points limites (basés sur l’état général de l’animal) sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.
Choix des espèces
Le rat, reste le modèle de choix utilisé pour les tests de toxicité. L’espèce et le stade de développement des animaux à utilisé est imposé par les normes ISO correspondantes. Le choix d’une autre espèce doit être justifié. - TAOiso, TADiso, TAI, MN : rats jeunes adultes de 7 à 9 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.
Décryptage du rôle des récepteurs à un facteur de guidage axonal au cours du développement du système nerveux central.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1755 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le travail porte sur des embryons pour étudier le rôle de récepteurs d'un facteur de guidage neuronal, les femelles gestantes recevant une injection destinée à bloquer l'action d'hormones sexuelles et les animaux étant identifiés par prélèvement d'un fragment d'oreille. Le porteur affirme que ces souris génétiquement modifiées ne développeront pas de douleur, ce qui contraste avec la gravité modérée déclarée pour l'ensemble. Il conclut que la complexité du développement cérébral ne peut être reproduite in vitro et que la souris partage 98 % de son patrimoine génétique avec l'humain.
Objectifs
Dans le monde animal, la plupart des espèces possèdent un axe de symétrie avec des extrémités avant/arrière et des faces ventrale/dorsale. Le système nerveux central (SNC) de ces espèces est composé de 2 hémisphères qui sont reliés par des neurones particuliers, les neurones commissuraux. Ces neurones projettent leur fibre sur des neurones cibles situés du côté opposé. Au début du XXième siècle, S. Ramon y Cajal avait déjà décrit en détail ces connexions reliant les deux moitiés du cerveau, et observé que les fibres nerveuses croissent en direction d’une structure ventrale et médiane, la plaque du plancher. Des études biochimiques ont identifié la protéine responsable de cette croissance. Enfin, des études ultérieures identifièrent plusieurs récepteurs à ce facteur de guidage neuronal. Toutefois, ces études sont contradictoires et sont soumises à controverse. Ce projet vise à trancher définitivement quant aux rôles de ces différents récepteurs à l’aide de modèles murins permettant de « casser » spécifiquement des gènes avec un contrôle spatial (tissu spécifique) et temporel (au moment voulu).
Bénéfices attendus
Ce projet a un but exclusivement fondamental. Son objectif est de clarifier le rôle de différents récepteurs à un facteur de guidage neuronal pendant le développement du système nerveux central. Une meilleure compréhension des mécanismes développementaux impliqués dans la mise en place du système nerveux central pourrait faciliter la compréhension de troubles psychiatriques comme l’autisme ou l’épilepsie ou des problèmes moteurs (strabisme). En effet, ces pathologies sont associées à des défauts de connexions neuronales qui mettent en jeu les gènes étudiés dans ce projet.
Procédures
Tous les animaux seront marqués par la pose d'une bague auriculaire et un prélevement d'un bout d'oreille sera réalisé à l'aide d'un poinçon. Ce geste d'identifcation/genotypage est réalisé en moins de 10 secondes. Les femelles gestantes de la procédure 2 et 3 recevront une injection intrapéritonéale d’un produit dont l’activité prévient l’interaction entre des hormones sexuelles et leurs récepteurs.Il n’est pas connu de nuisances associées à ces injections et ce geste est bref (5 secondes). Pour les animaux de la procédure 1 seul un geste réalisé (identifaction/prélevement pour génotypage) et pour les animaux des procédure 2 et 3 un second geste est réalisé (injection intrapéritonnéale).
Impact sur les animaux
Les animaux génétiquement modifiés utilisé dans cette demande de projet ne développeront pas de problèmes pouvant être à l’origine de douleur. En effet, nous utilisons un système génétique permettant d’invalider spécifiquement les gènes étudiés dans un tissu et à un temps voulu. Ce modèle murin permet de définir la localisation où les gènes sont invalidés et le moment désiré. Il permet de contourner les problèmes associés à la perte total du gène
Devenir
Ils seront tous mis à mort pour analyse des tissus.
Remplacement
La compréhension du développement du système nerveux central ne peut être réalisée uniquement chez l’animal. En effet, l’organisation du tissu cérébral est hautement complexe et les mécanismes impliqués dans son développement font intervenir des interactions cellulaires et de la communication intercellulaire. Il est impossible de récapituler in vitro ces différentes caractéristiques.
Réduction
Une attention particulière sera accordée à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. L’analyse développementale est principalement basée sur une analyse en microscopie et ne fera pas intervenir de tests statistiques. Les tissus seront techniqués de manière à pouvoir analyser de nombreuses caractéristiques sur un individu. Les analyses ex vivo seront réalisées sur un nombre défini d’échantillons déterminé par l’utilisation d’un test de puissance statistique.
Raffinement
Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. Les animaux seront hébergés avec dômes et boules de coton dans les cages. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur habitué à réaliser ces gestes. Les modèles murins utilisés dans cette demande de projet permettent un contrôle spatial et temporel de l’invalidation des gènes. Grâce à ces modèles génétiques, nous restreignons l’effet de la perte de ces gènes aux structures étudiées. De plus, les embryons sont analysés avant que les structures responsables de la douleur soient mises en place.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle qui partage 98% de son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Nous travaillerons sur les embryons car c’est à ce moment-là que le système nerveux central se développe.
Etude de biodistribution d’un vecteur délivrant de l’ARN dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique d'un vecteur délivrant de l'ARN par différentes voies, un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis est tué pour prélever ses organes. Le porteur présente cette étude de biodistribution comme exigée par les autorités réglementaires en vue d'un usage futur chez l'humain. Il cite des modèles alternatifs comme les organoïdes ou les organes sur puce, mais conclut qu'aucun ne renseignerait sur la dissémination de l'ARN dans un "organisme complet".
Objectifs
La caractérisation du profil de biodistribution d'un produit après administration in vivo est un élément majeur du programme de développement préclinique. Les études de biodistribution, exigées par les autorités réglementaires, ont pour objectif de déterminer la dissémination du matériel biologique dans les tissus et les fluides ciblés et non-ciblés, ainsi que leur transmission dans les lignées germinales. Ce projet a pour objectif d’évaluer la biodistribution d’un vecteur non intégratif délivrant de l’ARN chez l’animal, nécessaire pour comprendre la pharmacologie du produit. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. Plusieurs voies d’injection vont être testées, avec un ensemble d’organes analysés post mortem, en relation avec la voie d’injection en question.
Bénéfices attendus
Cette étude de Biodistribution chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en déterminant comment il se répartit dans les différents organes et tissus de l’organisme; - de valider l’expression transitoire de l’ARN distribué sans évènement(s) d’intégration dans le génome; - d’évaluer son efficacité de dissémination pour optimiser les doses et les schémas posologiques pour maximiser son efficacité thérapeutique; - de conceptualiser la thérapie adaptée à l’utilisation du produit en termes de contenu du vecteur et de méthodes d’administration appropriées pour atteindre les cibles biologiques.
Procédures
Les animaux recevront 1 seule injection, soit par voie intraveineuse, ou intramusculaire, ou sous-cutanée, ou intradermique (durée 2-3 minutes). On réalisera un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) sous anesthésie gazeuse, avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans le cadre d’une étude de biodistribution, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. Dans cette étude, l’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN se fera par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. Ces injections peuvent entrainer un stress ou une douleur chez l'animal. Par ailleurs, ces souris subiront une anesthésie pouvant induire un stress lors de la contention.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses moléculaires et histologiques.
Remplacement
Le Remplacement du modèle animal pour une étude de biodistribution peut se faire selon : - L’utilisation de modèles alternatifs tels que la culture de cellules adaptées, les modèles bio-informatiques ou les organoïdes; - l’utilisation d’organes sur puce qui permettent de modéliser la biodistribution dans un environnement plus proche de la réalité. Cependant, aucun de ces outils ne pourra apporter de réponses précises sur la biodissémination des ARN dans un modèle d’organisme physiologique complet nécessaire à la validité scientifique requise. La fonctionnalité du vecteur de transfert d’ARN prévu pour cette étude est systématiquement validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont.
Réduction
La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe, en comparant les résultats des études moléculaires et histologiques entre animaux ayant eu le vecteur non-intégratif amenant un ARN et les controles ayant eu le véhicule. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d'animaux, les mêmes organes seront utilisés pour l'ensemble des analyses, moléculaires et histologiques, évitant ainsi de doubler le nombre de souris.
Raffinement
Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans les études de biodistribution pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 12 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.
Inhibition du Canal TRPC3 dans les muscles de rat DMD pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne par thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
105 rats porteurs de la mutation de la myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires d'un vecteur de thérapie génique, l'implantation chirurgicale d'une mini-pompe dans l'abdomen ou une injection intraveineuse, avant une exsanguination terminale sous anesthésie. Le porteur présente cette étude comme un essai pilote destiné à sélectionner l'approche la plus efficace avant une étude ultérieure à plus grand effectif. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit un transfert de gène dans un "organisme entier" et que l'animal est le "seul organisme vivant" permettant cette étude.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique affectant environ 1 garçon sur 5000 à la naissance. Elle est due à des mutations dans le gène DMD codant pour la protéine Dystrophine, essentielle au fonctionnement et au maintien de l’intégrité des fibres musculaires. L’absence de Dystrophine dans l’intégralité des muscles de l'organisme provoque leur dégénérescence progressive, une faiblesse musculaire, la perte de la marche avant 15 ans, l’apparition de déficiences respiratoire et cardiaque, et, finalement une mort prématurée. La thérapie génique est une des approches prometteuses pour le traitement de la DMD. L’efficacité thérapeutique passe par le transfert d’un gène thérapeutique dans les muscles, à l’aide d’un vecteur viral recombinant dérivé du virus adéno-associé (AAV). Le gène de la dystrophine étant trop grand pour être inséré dans un vecteur AAV, des transgènes miniaturisés de la Dystrophine, appelés microDystrophines (MD) ont été générés. Si les premiers résultats obtenus après injection de patients DMD à l’aide de vecteurs AAV-MD sont encourageants, nous savons déjà que la correction ne pourra qu'être partielles et il reste nécessaire de développer des produits de 2ème génération qui seront alternatifs ou complémentaires à la thérapie génique AAV-MD. L'objectif de notre projet est de tester une nouvelle approche thérapeutique basée sur le blocage de canaux calciques, présents à la surface des cellules musculaires, et dérégulés dans la DMD. L'utilisation de bloqueurs de canaux calciques spécifiquement dans les muscles cardiaques et squelettiques représente une stratégie complémentaire à la thérapie génique AAV-MD. Ce projet est une étude pilote dans laquelle nous souhaitons faire la preuve de concept que l’inhibition moléculaire d'un canal calcique (via l'utilisation de vecteurs AAV) peut être bénéfique pour traiter la DMD. Pour cela, nous traiterons des rats DMDmdx à l’aide de différentes stratégies.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats obtenus dans cette étude pilote nous permettront de (i) cumuler des 1ères données suite à un traitement combinatoire AAV-MD + inhibition d'un canal calcique via une approche pharmacologique, et (ii) sélectionner l’approche moléculaire la plus efficace pour inhiber l’activité d'un canal calcique à l'aide d'un vecteur AAV, et améliorer les lésions histologiques musculaires du rat DMDmdx. La construction la plus efficace sera ensuite évaluée pour son efficacité thérapeutique dans le même modèle animal du rat DMDmdx, mais avec un nombre d’animaux plus important par groupe expérimental afin d’assurer la robustesse des évaluations phénotypiques. Cette efficacité thérapeutique sera évaluée seule et en combinaison avec un traitement AAV-MD. Cette seconde étude fera l’objet d’une autre demande d’autorisation de projet. A long terme, les bénéfices attendus de ce projet pilote sont de développer un candidat présentent un fort potentiel thérapeutique pour le traitement de la Dystrophie Musculaire de Duchenne par thérapie génique AAV. En cas de succès, le produit final sera évalué dans une étude de toxicologie réglementaire afin de pouvoir prétendre ensuite réaliser un essai clinique chez des patients DMD.
Procédures
(i) Pour maximum 66 animaux: injection intramusculaire réalisée dans 2 muscles des pattes postérieures. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: environ 10min. (ii) Pour maximum 22 animaux: implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 20min. (iii) Pour maximum 12 animaux: injection intravaineuse dans une veine caudale sur animal vigile. Geste réalisé une fois par animal sous analgésie. Durée de l'intervention: maximum 5min. Puis, 2 semaines après, implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale. Geste réalisé une fois par animal sous anesthésie. Durée de l'intervention: maximum 20min. (iv) Pour tous les animaux (maximum 105): Exanguination terminale au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
(i) Injection intramusculaire réalisée dans 2 muscles des pattes postérieures: geste réalisé une fois par animal (sur une partie des animaux) sous anesthésie. Elle ne provoquera donc pas de stress ou de douleur aux animaux. Durée de l'intervention: environ 10 min. Les animaux seront surveillés après leur réveil par un examinateur. La récupération devrait être rapide. Par ailleurs, l’injection intramusculaire d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection intramusculaire d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (ii) Implantation mini-pompe osmotique dans la cavité péritonéale : cette procédure chirurgicale peu invasive sera réaliséz une fois par animal (sur une partie des animaux) sous anesthésie générale, et avec une analgésie adaptée. Malgré tout, les animaux pourraient ressenti une douleur modérée au niveau de la zone d’incision pendant la période de cicatrisation (maximum 7 à 10 jours). Durée de l'intervention: maximum 20 min. (iii) Injection intraveineuse réalisée dans une veine caudale: geste réalisé une fois par animal (sur une partie des animaux) sous contention, sans anesthésie, mais sous analgésie afin de limiter le stress de l'animal et la douleur provoquée par la ponction de l'aiguille. Durée de l'intervention: maximum 5 min. Par ailleurs, l’injection intraveineuse d’un vecteur viral chez le rongeur est connue pour ne provoquer aucun effet indésirable. Il a été en effet documenté dans de nombreuses études que l’injection systémique d'un tel vecteur chez le rongeur est très bien tolérée. (iv) Exanguination terminale au niveau de la veine cave : pas de stress ou de douleur pour les animaux, puisque cet examen sera réalisé sous anesthésie générale renforcée par une analgésie ce qui limitera une éventuelle douleur liée au geste invasif. Ce prélèvement se fera au moment de la mise à mort des animaux.
Devenir
A l'issue des procédures décrites dans ce projet, tous les animaux de cette étude seront euthanasiés afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses calcique, moléculaires, biochimiques et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l'animal.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier et sur le long terme (plusieurs semaines après injection). L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires et sur un tissu pathologique dans toute sa complexité. Ce projet, qui vise à faire la preuve de concept que l’inhibition d'un canal calcique peut en effet être bénéfique pour réduire les anomalies calciques et les lésions musculaires liées à la pathologie DMD ne peut donc pas être réalisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est basé sur notre expérience précédente de protocoles de thérapie génique lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles dans des groupes de cette taille, pour les analyses pilotes qui seront réalisées ici (analyses calciques, moléculaires, biochimiques et histologiques). Cela semble être un nombre minimal qui permette d’assurer la robustesse des résultats sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. D’autre part, par l’identification des constructions les plus efficaces, cette étude pilote permettre de réduire le nombre total d’animaux qui seront à inclure dans l’étude qui suivra et qui visera à évaluer l’efficacité thérapeutique de la meilleure construction, en combinaison ou non avec un AAV-MD. En effet, tester d’emblée ces 10 approches d’inhibition moléculaires calciques aurait demandé l’inclusion d’un nombre très important d’animaux, supérieur au nombre total qui sera inclus via ces 2 études.
Raffinement
Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu (mise à disposition de tunnels en cartons ou PVC, frisottis de papier, bûchettes de bois), un hébergement à deux animaux (par groupe expérimentaux), accès à l’eau et à l’alimentation à volonté. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) 3) l'instauration de points limites pertinents et la mise en place de mesures adaptées si nécessaire (anesthésies, traitements analgésiques ou autre, ou euthanasie si pas d'autre alternative) 4) Afin d'améliorer la réactivité du personnel animalier, une grille de scoring de la douleur sera mise en place dès que celle-ci s'avère nécessaire afin de pouvoir détecter précocement tout point limite et mettre en place les actions adéquates. 5) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire).
Choix des espèces
Le rat DMDmdx possède une mutation dans l’exon 23 du gène dmd codant pour la protéine Dystrophine. Dans ce modèle animal de la DMD, l’expression de la dystrophine est nulle et le phénotype sévère. Les modèles animaux atteints de DMD les plus classiquement utilisés : souris mdx et chien GRMD, présentent des limites pour les projets pré-cliniques. La souris mdx ne reproduit que partiellement les lésions tissulaires avec un phénotype peu marqué. Le chien GRMD présente des lésions tissulaires proches de celles des patients DMD et un phénotype sévère, mais reste un modèle "gros animal" lourd à manipuler. Le rat DMDmdx est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Les animaux seront injectés à l’âge de 1 mois pour les animaux traités avec les vecteurs AAV, et à l’âge de 1,5 mois pour les animaux traités avec le produit Pyr10. Le décalage de 15 jours entre ces 2 groupes est lié au fait qu’il faut au moins 15 jours pour obtenir une expression significative d’une protéine après injection d’un vecteur AAV, alors que le produit Pyr10 sera actif immédiatement. Les animaux seront ensuite mis à mort à l’âge de 3 mois. Dès l’âge de 1,5 mois, les rats DMDmdx présentent des anomalies calciques dans leurs muscles, avec une augmentation de ces défauts au cours du temps, et la mise en place de fibrose musculaire bien présente à 3 mois d’âge. L’âge de début des différents traitements et la durée de ceux-ci permettront donc d’évaluer les bénéfices sur la dystrophie musculaire des stratégies d’inhibition testées et de les comparer entre elles. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette myopathie est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation devient sévère (troubles locomoteurs, douleurs à la manipulation) pour la plupart des animaux au delà de 8-9 mois.