Rongeurs
Etude du role du collagène XVIII dans la formation/fonction des plaquettes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent des injections répétées, des prélèvements sanguins sous anesthésie et des modèles de thrombose induits sans réveil. L'objet est d'étudier le rôle du collagène XVIII dans la formation des plaquettes et dans une forme de cancer de la moelle osseuse. Le porteur affirme que la thrombose met en jeu des interactions à étudier sur l'animal vivant.
Objectifs
Le collagène XVIII est une protéine de la matrice extracellulaire, notamment présente au niveau des vaisseaux sanguins. Elle participe à l'organisation des tissus. Par l'un de ses domaines pouvant être libéré, appelé endostatine, elle régule également les phénomènes de développement des vaisseaux sanguins, pouvant être mis en oeuvre dans diverses pathologies telles que l'athérosclérose ou les cancers. Ayant observé de façon inattendue une très forte augmentation de l'expression de ce collagène dans un modèle de souris développant de la myélofibrose primaire, un cancer qui chez l'homme entraine une dégénerescence de la moelle osseuse avec insuffisance médullaire , nous cherchons à comprendre comment la surexpression de ce collagène freine ou au contraire contribue au développement de la maladie. En outre, étant présent dans les vaisseaux sanguins, nous chercherons également un rôle éventuel dans les processus d'arrêt des saignements ou à l'inverse dans le développement des thromboses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compréhension des rôles du collagène 18 dans la formation plaquettaires, dans l'initiation ou le développement des myélofibroses, ainsi que dans l'hémostase et la thrombose. Si le collagène 18 est impliqué dans ces processus, cela constituera de nouvelles pistes pour moduler,chez les différents patients, la formation ou la fonction des plaquettes.
Procédures
Pour les expérimentations nécessitant un traitement d'un mois, celui-ce sera administré sur souris vigile, par injection unique 2 fois par semaine pendant 4 semaines. Tous les prélèvements sanguins répétés seront effectués sur animal anesthésié, à J0, après 2 semaines et 4 semaines. Pour les expérimentations impliquant un traitement unique par chimiothérapie, le suivi de la numération sanguine sera effectué à J0, J5, J7, J8, J9, J12, J14. L'anesthésie et le prélèvement de sang dure entre 5 et 10 minutes pour chaque souris. Tous les modèles de thrombose seront mis en place sur animal anesthésié sans réveil.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont essentiellement le stress de la contention qui précède l'injection ou l'anesthésie, ainsi que la piqure d'anesthésie ou de traitement par elle-même. Ce stress est minimisé par le recours dans tous les cas à un professionnel expérimenté et diplômé. Le prélèvement sanguin caudal est susceptible d'entrainer un petit saignement, qui est stoppé par un point de compression de 1 à 2 minutes lorsque la souris est toujours sous anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements.
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique et hémostatique in vivo dans sa totalité, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. En particulier, la thrombose met en œuvre simultanément des interactions entre les plaquettes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Ces évènements sont intégrés et demandent à être étudiés sur l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Des études pilotes ont permis de déterminer le nombre minimum pour l’obtention de résultats statistiquement analysables. Un certain nombre de souris sont réutilisées au sein de ce même projet. De plus, une fois sacrifiées, les souris seront partagées afin d'utiliser différents organes pour d'autres expérimentations. Les lots sont optimisés afin d'utiliser mâles et femelles. Enfin, dès que possible, nous utilisons des cellules humaines pour nos expériences in vitro qui ne nécessitent pas l'environnement des tissus ou l'animal dans sa globalité.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupe de même sexe et sans défaire les groupes préformés pour éviter le développement de comportements agressifs. Des objets sont placés dans la cage pour enrichir le milieu et permettre une protection contre l'éventuelle agressivité des congénères. De la ouate est également disposée pour favoriser le comportement de fouissage et du coton cardé pour favoriser le maintien de la chaleur corporelle dans le nid. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront réduit au maximum, notamment par anesthésie pour toute procédure invasive. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé. Une grille de points limites a été établie pour la procédure expérimentale afin de soustraire l’animal aux procédures si nécessaire afin de limiter la souffrance.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris génétiquement modifiée n'exprimant plus le collagène 18 est un modèle unique et précieux pour étudier le rôle de cette protéine par comparaison avec les souris contrôles exprimant cette protéine. De plus, nous possédons une bonne connaissance de la physiologie de la souris et des similitudes avec l'homme, et nous disposons de nombreux modèles d’étude largement maitrisés chez la souris. Cette lignées de souris est donc parfaitement adaptée à cette étude et constitue un outil original et unique. L'absence de collagène 18 n’induit pas d’effet indésirable chez la souris au vu de leur comportement. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, soit entre 8 et 18 semaines et les mâles et femelle utilisés en quantité similaire, ce qui nous permettra à postériori de déterminer un éventuel effet différent selon le sexe.
Etude de la fonction des gènes de modification et d’aminoacylation des ARN de transfert (ARNt) dans le développement cortical
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
7 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une laparotomie, leur utérus étant transpercé par un capillaire de verre pour injecter le cerveau de chaque embryon, puis les nouveau-nés sont tués à sept jours pour prélever leur cerveau. L'objet est d'étudier des gènes de modification des ARN de transfert dans le développement du cortex. Le porteur affirme que la complexité du cortex ne peut pas être recréée in vitro et met en avant l'efficacité de la souris, qui porte environ huit embryons par portée.
Objectifs
Le cortex cérébral est la partie superficielle du cerveau qui permet à l’homme d'effectuer des tâches complexes. Il est composé de différents types de cellules cérébrales spécialisées dont les neurones. Au cours du développement du cerveau chez l'embryon, un seul groupe de cellules progénitrices génère tous les types de cellules du cerveau qui doivent se former au bon endroit et au bon moment pour avoir un cerveau fonctionnel. Les processus qui régulent la création des différentes cellules du cortex ne sont pas encore entièrement connus et des perturbations dans ces processus pendant le développement conduisent à des maladies rares appelées troubles du neurodéveloppement. Notre équipe souhaite comprendre les processus qui régulent le développement du cortex cérébral et la production des différents types de cellules du cortex. Parmi les processus impliqués, le décodage de l'information génétique des cellules en une succession d'acides aminés formant les protéines, apparait comme un élément clé et sa molécule adaptatrice responsable du décodage, l’ARN de transfert (ARNt) comme une molécule décisive. Pour être pleinement actifs, les ARNt doivent être modifiés puis chargés avec leurs acides aminés. Ces modifications sont effectuées par des molécules appelées enzymes. A ce jour, 84 gènes de modification et 20 gènes de chargement des ARNt ont été identifiés. L'objectif de ce projet est d’étudier l’implication des enzymes de modification et de chargement des ARNt dans le développement cortical et d’identifier quelles enzymes influencent la génération et la diversité des cellules du cortex. Pour ce faire, nous allons utiliser une nouvelle approche chez la souris qui permet d’inactiver une des enzymes de modification des ARNt dans chaque cellule progénitrice du cortex chez l’embryon au début du développement du cortex et d’analyser les effets 7 jours après la naissance lorsque le développement des neurones est terminé. L’intérêt de cette approche est que nous pourrons tester toutes les enzymes de modification des ARNt en même temps chez un même embryon et observer les effets sur les cellules individuellement. Pour chaque cellule, nous identifierons quelle enzyme de modification a été inactivée et les conséquences sur la cellule. Ainsi, nous pourrons déterminer quelles modifications de l'ARNt sont importantes pour la génération et le développement des cellules du cortex.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre le rôle des molécules adaptatrices de la traduction, les ARNt, et de leurs modifications et leur chargement dans le développement du cortex cérébral. Il permettra d’identifier les gènes de modification des ARNt importants pour le développement du cortex et dont l’inactivation pourrait conduire à des malformations du cerveau. L’identification des tels gènes permettra de proposer de nouveaux gènes candidats dans la recherche des causes génétiques chez les patients atteints de malformations du développement cortical. Enfin, la compréhension des mécanismes pathologiques responsables peut permettre d’envisager des pistes thérapeutiques.
Procédures
Les femelles gestantes vont subir une injection d’anti-douleur (environ 5 secondes), suivie d’une chirurgie abdominale (consistant en l'ouverture de l'abdomen : laparotomie) et leur utérus va être exposé et transpercé par un capillaire en verre très fin à plusieurs reprises (une fois pour chaque embryon pour une durée de 1 à 10 secondes par embryon). La durée totale de la chirurgie n'exèdera pas 45 minutes. Les femelles gestantes seront par la suite placées dans des cages isolées puis avec leur portée jusqu'à la mise à mort des souriceaux. Les embryons au stade embryonnaire E12.5 vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin (entre 1 et 10 secondes).
Impact sur les animaux
La barrière cutanée des femelles gestantes sera rompue en plusieurs endroits (site d'injection dans le dos entre les omoplates avec une aiguille très fine et cicatrice de la laparotomie sur le ventre), il en résulte une plus grande sensibilité aux éventuelles infections. Les femelles seront par la suite placées dans des cages isolées et de ce fait, privées de congénères. L'isolement sera uniquement physique (pas visuel, olfactif et auditif) car les souris verront, sentiront et entendront leurs congénères. Les embryons à 12.5 jours de gestations vont subir une injection dans le cerveau avec un capillaire en verre très fin. Depuis 8 ans que nous effectuons ce type d’injection dans le cerveau au laboratoire, nous n’avons pas observé de phénotypes dommageables chez les souris après la naissance ou à l’âge adulte.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin du projet. Les femelles gestantes sont herbergées jusqu’à la mise à mort des nouveau-nés. Les nouveaux-nés sont herbergés 7 jours, puis mis à mort pour collecter leur cerveau.
Remplacement
L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement du cortex cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. Le développement du cerveau est très bien caractérisé chez la souris, ce qui nous permet de déterminer efficacement les conséquences de l’inactivation de gènes sur le développement embryonnaire du cortex. Le projet vise à utiliser une approche groupée in vivo afin d’analyser les effets de la perturbation des différents gènes de modification et de chargement des ARNt simultanément sur le développement du cortex et sur la quantité et la diversité des neurones générés. Cette approche a déjà été utilisée chez la souris au cours du développement en 2020 par Jin et ses collaborateurs pour évaluer la fonction de 35 gènes candidats de troubles du spectre autistique et de retard du neurodéveloppement et elle a permis d’identifier des types cellulaires et des gènes communément affectés, justifiant la pertinence de cette approche et sa faisabilité dans le modèle murin.
Réduction
Les approches conventionnelles pour étudier les effets de l’inactivation d’une enzyme sur le développement du cerveau requiert de générer une lignée de souris pour chaque enzyme analysée, ce qui demande de produire un grand nombre d’animaux pour chaque enzyme. Nous avons choisi une stratégie qui nous permet d’utiliser une seule lignée de souris pour tester les effets de l’inactivation d’environ 30 enzymes simultanément dans un même embryon et donc de diminuer considérablement le nombre d’animaux manipulés. De plus, nous avons choisi de générer la lignée de souris utilisée sur un fond génétique présentant un faible taux de cannibalisme des nouveau-nés et un nombre important de nouveau-nés par portée permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux manipulés. Nos croisements de souris seront faits de manière à utiliser 100% des embryons générés pour les expériences. Nous avons prévu une phase de formation à l’injection dans le cerveau des embryons à 12.5 jours de gestation de 2 expérimentateurs sous la supervision de l’assistante ingénieure de l’équipe qui a acquis une très bonne maitrise de cette technique chirurgicale au long de ces 8 dernières années. L’objectif de cette formation est d’avoir un temps de chirurgie de moins de 30 minutes et un bon taux de survie des embryons afin de limiter le nombre de femelles gestantes manipulées. Pour cela, nous avons également investi dans un système de loupe équipé d’un écran afin de mieux visualiser les embryons et ainsi d’optimiser les conditions d’injections. De plus, nous utiliserons des nouveau-nés d’autres expérimentateurs de l’animalerie pour optimiser la collecte et la préparation des cellules au lieu d’élever des souris supplémentaires. Enfin, nous exploiterons les données publiées et l'analyse de puissance pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour notre étude et ses analyses statistiques. Les analyses statistiques sont effectuées par l’analyse différentielle au niveau des cellules individuelles. En optimisant le protocole au mieux de nos capacités, nous serons en mesure d'obtenir des cellules de haute qualité et en quantité suffisante pour chaque animal utilisé, augmentant ainsi la taille de notre échantillon pour les tests statistiques tout en maintenant un nombre d'animaux utilisés à un faible niveau.
Raffinement
Nous prendrons en compte avec la plus grande attention le bien-être des animaux utilisés pour ce projet. Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. L’élevage et la reproduction de nos animaux se font dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress pour l’animal. Des nids et des tunnels seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Tout inconfort de la souris détecté durant la gestation ou la mise bas sera traité en fonction des symptômes détectés. Au début de l’expérience, les femelles reçoivent une injection d'un anti-douleur 30 minutes avant l’anesthésie. Durant l’expérimentation, les femelles gestantes sont anesthésiées par voie gazeuse. Leurs yeux sont protégés de la déshydratation par du gel pour les yeux. Nous limitons le temps de manipulation à 45 minutes maximum sur l’animal anesthésié. Le réveil est immédiat une fois l’arrêt de l’anesthésie gazeuse. Un anti-inflammatoire est injecté à la fin de l’opération afin de prendre le relai de l’analgésie pendant 24h. L’animal se réveille dans une cage chauffée à 37°C et est surveillé régulièrement. Nous vérifions que les animaux mangent, s’abreuvent et se toilettent normalement. Les jours suivants, les animaux sont surveillés pour voir notamment si la plaie a besoin de soins et pour détecter d’éventuelles infections post-chirurgicales ou autres complications. L’objectif est de prévenir toute douleur ou détresse. En cas d’infections importantes ou de douleur manifeste, les femelles gestantes sont euthanasiés immédiatement et les embryons sont sortis de leur sac utérin et mis à mort.
Choix des espèces
L'approche utilisée a été mise au point chez la souris et dans le cerveau d'embryons de souris. Cet animal de petite taille avec environ 8 embryons par femelles gestantes rend cette méthode efficace. De plus, la technique utilisée nécessite l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà existantes. Enfin, les étapes du développement du cerveau sont très bien caractérisées chez la souris ce qui nous permet de voir les effets de l’inactivation des gènes analysés dans le développement cortical.
Caractérisation de la contribution des neurones nés dans l’hippocampe à l’âge adulte dans l’apprentissage et le maintien d’informations de nature sociale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'environ deux heures avec trépanation, des injections et des tests comportementaux de mémoire spatiale, de reconnaissance d'objets et de mémoire sociale. L'objectif est de décrire le rôle de neurones formés à l'âge adulte dans l'hippocampe, chez des souris saines et des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne permet d'aborder cette voie neuronale de façon intégrée.
Objectifs
Nous avons deux objectifs principaux. Tout d'abord, nous voulons étudier comment les nouveaux neurones dans une partie spécifique du cerveau, sont organisés chez des souris normales et des souris atteintes de la maladie d'Alzheimer. Nous souhaitons découvrir s'ils se connectent uniquement à cette région ou s'ils établissent des connexions à la fois avec cette région et avec une autre région du cerveau. Pour ce faire, nous allons marquer ces nouveaux neurones avec des molécules fluorescentes afin d’identifier l’endroit ou ils se connectent. Ensuite, notre deuxième objectif est d'étudier comment ces nouveaux neurones, qui se forment à l'âge adulte, influencent la mémoire. Pour ce faire, nous allons manipuler ces neurones de manière à les activer ou les désactiver chez des souris normales et des souris atteintes d'Alzheimer, puis nous allons tester leur mémoire. Juste avant les tests de mémoire, nous activerons ou désactiverons ces neurones en utilisant des substances chimiques que nous injecterons aux souris. Nous essayerons également d’augmenter le nombre de nouveaux neurones en plaçant les souris dans un environnement stimulant, à la fois sur le plan cognitif, social et physique puis, nous testerons la mémoire des souris.
Bénéfices attendus
Le premier objectif du projet nous permettra de déterminer si les neurones nouvellement formés envoient des informations au niveau de deux régions de l'hippocampe, ou si les nouveaux neurones se connectent de façon spécifique soit à la première région, soit à la deuxième. Si tel est le cas, cela serait la première démonstration de l’existence d'une voie nerveuse specifique qui se connecte à une région liée à la cognition sociale. Si, en revanche, les nouveaux neurones contactent les deux régions, cela suggérerait que les informations contextuelles, spatiales, et sociales, sont intégrées et codées conjointement au sein des nouveaux neurones. Le deuxième objectif du projet permettra de révéler la contribution des nouveaux neurones projetant à cette région dans la mémoire sociale, et de déterminer si des manipulations de ces nouveaux neurones et/ou des neurones qui contribuent à leur survie sont en mesure de restaurer les capacités de mémoire sociale de souris modèles de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
La chirurgie dure environ 2h par animal. Une seule intervention chirurgicale par animal sera réalisée. Les animaux recevront une injection en aigue (une seule injection qui durera environ 10 secondes) d’agent pharmacologique. Pour cela, la souris sera maintenue en contention durant 15 secondes. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux n’excédant pas 1h30. Ces tests comportemenaux auront pour objectif d'étudier la mémoire spatiale, la mémoire de reconnaissance d'objets et la mémoire de reconnaissance d'individus (mémoire sociale).
Impact sur les animaux
Pour la chirurgie, l'incision de la peau ainsi que la trépanation osseuse peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24heures. La contention de l’animal lors des injections peut induire un stress modéré durant une dizaine de minutes. Les injections peuvent induire une douleur modérée lors de l’injection durant les 20minutes qui suivent la manipulation de l’animal. Les test comportementaux n'induisent pas de nuisances.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvement des cerveaux et /tissus afin de réaliser des marquages immunohistochimiques sur coupes de tissus pour poursuivre les investigations anatomiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Les nouveaux neurones naissent dans le cerveau au niveau d'une zone appelé le gyrus denté et se connectent à différentes sous régions de l'hippocampe. Nous comptons explorer le rôle des nouveaux neurones qui se connectent à une sous région bien définie de l'hippocampe. Notre objectif est d'étudier l'impact de ces nouveaux neurones sur les capacités mnésiques des mammifères. De plus, nous nous intéressons à la mémoire sociale qui est altérée dans certaines maladies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. L’utilisation du modèle murin nous permet d’étudier les modulations de cette mémoire sociale chez des individus sains et présentant des troubles de mémoire sociale (souris modèles de la maladie d’Alzheimer). A ce jour, il n’existe pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de cette voie neuronale spécifique de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études comportementales et neurologiques visant à décrire les mécanismes mis en jeu dans les processus mnésiques.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante lors de la réalisation de tests statistiques, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis à partir de grilles de scoring. En cas de blessure ou de souffrance, les animaux recevront un traitement analgésique adapté. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos voûté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent. De plus, nous réaliserons plusieurs tests sur les mêmes animaux pour limiter leur nombre.
Choix des espèces
Nous comptons explorer la fonction biologique des nouveaux neurones formés à l’âge adulte. Nous proposons que ces nouveaux neurones ont un effet sur le comportement de l’animal (mémoire). Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder l’impact de ces nouveaux neurones sur le comportement de l’animal. Nous comptons également faire une description anatomique des voies de projections des nouveaux neurones. Il nous faudra donc prélever des tissus pour voir l’organisation cérébrale. De plus, la souris appartient à la classe des mammifères ce qui la rend proche de l’Humain. Son utilisation nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux sous-tendant les processus mnésiques chez les mammifères. D’autre part, nous utiliserons des souris modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce modèle nous permettra d’étudier les éventuels mécanismes à l’origine des troubles mnésiques dans un contexte pathologique. Les animaux que nous utiliserons seront âgés de 3 à 6 mois. En effet, la neurogénèse adulte diminue avec l’âge. Si nous voulons l’étudier nous devons nous placer à une fenêtre de temps ou elle est suffisamment abondante.
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 464 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime gras ou alcoolisé, des injections de CCl4 pour induire une fibrose du foie, des prélèvements sanguins et un gavage. Le porteur indique que la défaillance hépatique peut provoquer une perte de poids de plus de 20 %, seuil qui déclenche la mise à mort. Il affirme devoir étudier la protéine CD44 dans un "organisme entier", aucune approche in vitro ne tenant compte des interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines. Une mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. Comme conseillé dans la revue laboratory animals, le CCl4 sera administré par voie intra péritonéale (vs inhalation) avec alternance du point d’injection. Ce traitement est associé au développement de la fibrose hépatique sans perte de poids ni développement d’ascite ni trouble digestif attendus. Potentiellement, la conséquence la plus grave que les animaux pourraient subir serait une défaillance des fonctions du foie entrainant une difficulté pour s'alimenter et donc une perte de poids brutale de plus de 20% par rapport à la dernière pesée. Cependant, d'après nos expériences passées ainsi que celles de nos collaborateurs, ceci arrive rarement. Si une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente est observée mais sans signe de souffrance (dos voûté, poil non entretenu, indifférence au milieu extérieur…), l’animal sera surveillé et repesé tous les 2 jours. Les animaux auront à disposition dans la cage des croquettes ainsi qu'un boudin de réhydratation. Si aucune reprise de poids la semaine suivante, il sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la protéine CD44 dans les fonctions des cellules immunitaires impliquées dans divers aspects de la physiopathologie des NAFLD et ALD, notamment dans la stéatose, l'inflammation, les lésions hépatocellulaires, la fibrogénèse et l’hépatocarcinogénèse. Les études in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement nutritionnel et métabolique ou encore des interactions entre différents types cellulaires ou entre organes. Il nous est donc nécessaire d'étudier le rôle de cette protéine dans un organisme entier.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour les procédures 2, 3, 4 et 7(souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 5 (souris mâles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour la procédure 6 (souris mâles et femelles), l’isolation des cellules sera effectuée sur des souris adultes à partir de 7-8 semaines d’âge.
Etude de l’intérêt d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont gavés chaque jour pendant quinze jours et une partie est rendue allergique par trois injections intrapéritonéales, le déclenchement de l'allergie provoquant une baisse de température et des douleurs abdominales. L'objet est d'évaluer l'ajout d'une composante microbienne proche du lait maternel dans des formules infantiles, avec en vue le développement de produits laitiers fermentés pour les personnes allergiques. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reproduire le système immunitaire in vitro.
Objectifs
Les allergies touchent 30 à 40% de la population mondiale et parmi elles, les allergies alimentaires (AA) affectent plus de 6% de la population Européenne. Il n'existe pas à ce jour de stratégie préventive efficace et validée. Elles sont liées à un dysfonctionnement du système immunitaire (SI) et à une diminution de la diversité du microbiote intestinal chez les nouveau-nés. Ce point suggère l’intérêt des stratégies au début de la vie pour induire un microbiote intestinal optimal et ainsi prévenir les allergies. Des études ont suggéré que l’administration de probiotiques (1 à 4 souches) en périnatal avaient un effet bénéfique pour la prévention de l’eczéma. Le microbiote du lait maternel fournit un apport en bactéries dans le tube digestif du nouveau-né. Il est très divers, riche en candidats probiotiques potentiels et représente un intérêt santé certain pour le futur enfant. Il serait potentiellement protecteur des allergies mais les études restent controversées. Aujourd’hui, les formules infantiles n’intègrent pas (ou très peu), de composante microbienne par rapport au lait maternel. L’objectif du projet est d’évaluer l’intérêt d’une composante microbienne issue du lait maternel dans les formules infantiles en comparant l’effet de différentes formules chez des souriceaux sur la prévention de l’allergie alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces résultats permettront à terme le développement de produits laitiers fermentés (laits fermentés, fromages) ayant des propriétés modulatrices caractérisées particulièrement bénéfiques pour des populations à risque de pathologies chroniques telles que les allergies. Ces produits laitiers fermentés exploiteront les propriétés « 2-en-1 » des ferments laitiers pour une population cible : les allergiques.
Procédures
Les femelles reproductrices seront pesées tous les 2 jours après la fin de la reproduction pour déterminer la gestation. Gavages tous les jours pendant 15 jours chez la descendance. Lors de la récupération des fèces, les souris sont placées dans une cage individuelle le temps de récupérer un nombre suffisant de fèces pour les analyses. Chez la descendance, les groupes rendus allergiques alimentaires reçoivent 3 injections intrapéritonéales (aiguille 22G) et 1 gavage, espacés chacun d’une semaine.
Impact sur les animaux
Lors des gavages quotidiens, une gêne à l'oesophage peut être ressentie du fait du geste répété. Lors du déclenchement de l’allergie alimentaire (challenge), une baisse de température corporelle des animaux est généralement observée, ainsi que des douleurs abdominales.
Devenir
Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et physiologique.
Remplacement
Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interaction complexe comme ici avec l’étude des propriétés immunomodulatrices de probiotiques.
Réduction
Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques. De plus, 2 protocoles indépendants seront nécessaires pour valider les différentes études et leurs résultats ce qui fait un total de 20 souris par groupes
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. L'évaluation des points limites sera faite tous les jours lors de l'observation journalière des animaux et se base sur la présence de signes cliniques notables et sévères. En présence de 3 signes cliniques notables ou 1 seul signe clinique sévère, le responsable SBEA et le responsable de l’étude analyseront l’animal et prendrons la décision de laisser l’animal au sein du protocole en accord avec la cellule du bien-être animal ou de procéder à l’euthanasie. Les souris sont hébergées avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube, coton) pour limiter l’angoisse.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris femelles de souche Balb/C. Ces souris constituent un modèle de choix, reconnu, dans le cadre d’étude du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de ces souches et servent de modèle pour l'allergie alimentaire. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Des analyses immunologiques des différentes populations cellulaires (lymphocytes T et B) seront réalisées et l’utilisation de souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les femelles et males reproducteurs seront utilisés à 8 semaines de vie afin qu’ils soient matures sexuellement. Afin d’étudier s’il y a une action précoce d’une composante microbienne proche du lait maternel dans les formules infantiles pour la prévention des allergies alimentaires, nous utilisons des souriceaux en début de diversification alimentaire (sevrage) c’est-à-dire à 2 semaines de vie.
Thérapie pour les myopathies de type BIN1 & Dynamin 2 par ajout de tamoxifène dans l’alimentation.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
344 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des tests comportementaux répétés chaque semaine, des mesures de force musculaire sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour évaluer le tamoxifène comme traitement de myopathies congénitales. Le RNT ne précise pas lesquels de ces tests comportementaux sont pratiqués. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer la contractilité musculaire sur l'"organisme entier" et décrit une application clinique comme rapide.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un agent pharmacologique déjà utilisé en clinique dans d’autres maladies pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets d’une molécule pharmacologique déjà approuvée et utilisée en clinique dans d’autres pathologies pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pouvant avoir une application en clinique rapide.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 semaines ou 15 semaines. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile ou sous anesthésie légère pendant un maximum d’une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué sur animal sous anesthésie générale sur une durée maximale de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une perte de masse corporelle. Les animaux seront mis sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques qui pourra provoquer une douleur ou une inflammation au point d’injection. Lors du prélèvement de sang, l’animal pourra ressentir un stress lors de la manipulation et un inconfort au niveau du point de piqure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets d’un agent pharmacologique sur le muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets d’une molécule. L’évaluation des effets d’un agent pharmacologique in vivo est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire par groupe (i.e. 10 animaux par groupe), basé sur de précédentes études, a été déterminé à l’aide d’une analyse statistique mettant en évidence une différence phénotypique entre les animaux malades non traités et les animaux contrôles. Les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement en fin de traitement, ce qui permet non seulement de collecter les différents tissus sur ces mêmes animaux mais également de s’affranchir de générer une cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. Enfin, les groupes d’animaux ne recevant pas d’agent pharmacologique serviront de groupe contrôle pour les différentes doses d’agent pharmacologique testées. Ces points sont importants car ils sont à l’origine de la réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide système permettant la circulation d'eau chaude et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées.
Choix des espèces
Le modèle murin est privilégié car il s’agit de l’espèce la plus proche de l’Homme physiologiquement et structurellement pour laquelle les manipulations génétiques permettent de reproduire les caractéristiques principales de la maladie étudiée. Le traitement des souris mères débutera 14 jours après la naissance des animaux ce qui permet aux animaux nés de recevoir le traitement via le lait maternel dès les premiers jours de vie, et ainsi de traiter au plus tôt la maladie qui est présente dès la naissance. Les mâles et les femelles seront utilisées car la maladie se développent indépendamment du sexe. Les tests comportementaux seront réalisés une fois par semaine sur des animaux âgés de 3 semaines jusqu’à l’âge de 8 ou 15 semaines, i.e. à partir du sevrage et pendant toute la durée du traitement.
Evaluation de l’activité antitumorale des perturbateurs de la liaison cIAP1 – TRAF2 (cITIn)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, puis trois injections intrapéritonéales par semaine pendant trois semaines, de la chimiothérapie et des injections d'anticorps, pour tester six molécules censées bloquer la liaison cIAP1-TRAF2 dans les cancers. Une partie de ces souris immunodéficientes subit aussi une vaccination avec réinjection de cellules tumorales vivantes. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à un éventuel essai chez l'homme, tandis que le porteur affirme que l'analyse des tumeurs dans leur environnement rend l'usage des souris nécessaire.
Objectifs
La thérapie ciblée des cancers est une stratégie thérapeutique très prometteuse permettant de cibler spécifiquement les anomalies des cellules tumorales. En gagnant en spécificité par rapport aux traitements conventionnels, cette stratégie thérapeutique réduit considérablement les effets secondaires et améliore la qualité de vie des patients. La protéine cIAP1 est promotrice de tumeur et a été retrouvée surexprimée dans de nombreux échantillons tumoraux humains de différente origine. Elle constitue une cible thérapeutique pertinente. Il a été montré que l’association de la protéine cIAP1 avec son partenaire TRAF2 était absolument nécessaire à son activité oncogénique. Une recherche de perturbateurs de liaison cIAP1 – TRAF2 en vue d’une utilisation en thérapie anti-cancéreuse a été entreprise. Une première génération de molécules a été obtenue et une seconde génération est en cours d’élaboration. Le présent projet a pour but d’évaluer les propriétés antitumorales des molécules élaborées. Six molécules seront testées en monothérapie ou associées à de la chimiothérapie conventionnelle et/ou immunothérapie.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’une étude préclinique d’évaluation de nouvelles molécules à finalité thérapeutique anti-cancéreuse. L’objectif est de sélectionner au moins une molécule qui pourra ensuite faire d’objet d’une optimisation et d’une étude pharmacologique en vue d’essai thérapeutique chez l’homme.
Procédures
Dans la procédure 1, les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane et subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans du sérum physiologique. Dans la procédure 2, les souris porteuses de tumeurs recevront trois injections intra-péritonéales par semaine des molécules à tester ou de son contrôle, et ceci pendant 3 semaines. Une injection unique de chimiothérapie sera réalisée en intra-péritonéale. Dans la procédure 2 et 3, l’injection d’anticorps aura lieu 3 fois par semaine pendant 3 semaines à partir du 14ème jour post-injection des cellules tumorales, en même temps que les molécules à tester. Ces injections seront réalisées en intra-péritonéale. Dans l’expérience de vaccination de la procédure 3, des cellules tumorales mortes seront injectées en sous-cutanée dans le flanc de l’animal. Une semaine après la vaccination, des cellules tumorales vivantes seront injectées en sous-cutané (100 µL, 10 secondes) dans le flanc opposé et l’apparition d’une tumeur au deuxième point d’injection sera évaluée.
Impact sur les animaux
- Les molécules testées pourraient occasionner une réaction inflammatoire modérée au moment de l’injection. - Les souris sont immunodéficientes et donc plus sensibles aux infections - Le développement de grosses tumeurs pourrait gêner le mouvement de la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées selon les pratiques recommandées pour les souris par l’union Européenne
Remplacement
L’objectif du projet est de vérifier si les molécules en développement peuvent exercer une activité anti-tumorale en agissant directement sur les cellules tumorales ou/et en stimulant la réponse immunitaire anti-tumorale. Ceci nécessite l’utilisation d’animaux pour analyser les tumeurs dans leur environnement. Toutes les procédures chez l’animal seront précédées d’une validation in vitro de l’efficacité des molécules. La procédure 1 sera précédée par une validation in vitro de la capacité des molécules à inhiber la signalisation intracellulaire pro-tumorale et la croissance des cellules tumorales. Seules les molécules montrant une activité anti-proliférative seront évaluées chez l’animal. Nous avons actuellement 2 molécules remplissant ces critères. Au maximum les 6 molécules seront analysées. La molécule la plus efficace sera ensuite utilisée dans la seconde et troisième série d’expériences (procédure 2 et 3). La procédure 3 sera précédée par une analyse in vitro de la capacité des molécules ou de la combinaison molécule-chimiothérapie à induire une mort immunogène. Seules les combinaisons efficaces seront testées in vivo.
Réduction
La première série d’expériences (5 souris / groupe) permettra de définir les concentrations efficaces et de choisir les molécules utilisées dans la seconde série d’expérience. Pour les 2 molécules les plus efficaces, nous répèterons l’expériences 2 fois de manière indépendante. La répétition permettra d’ajuster les concentrations si besoin. Les prises tumorales et la réponse aux traitements peuvent varier d’un individu à l’autre, la seconde et troisième séries d’expériences seront réalisées sur des groupes de 5 souris. Nous répèterons les expériences 2 fois de manière indépendante afin d’avoir suffisamment de puissance pour des analyses statistiques.
Raffinement
Les injections sous-cutanées de cellules tumorales, intrapéritonéales ou intraveineuses des molécules ou agents thérapeutique seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés. Les souris auront une phase d’adaptation d’une semaine avant le début de l’expérimentation afin de les habituer à la manipulation et à la contention. Aucune douleur associée à ces gestes n’est attendue. Concernant les points limites adaptés les plus prédictifs, il s’agira des modifications de l’apparence physique, de la perte de poids, de l’apparition d’inflammation, du volume et de l’aspect des tumeurs, et des modifications du comportement L’arbre décisionnel ci-après sera suivi pour la prise en charge des animaux : 1. Si des changements de comportement ou d’apparence physique sont observées, une nourriture gélifiée pourra être rajoutées dans la cage et les animaux seront surveillés quotidiennement. 2. Si une légère inflammation au moment de l’injection des composés est observée, un anti-inflammatoire non stéroïdien pourra alors être administré de manière ponctuelle aux animaux. 3. Si des nécroses apparaissent sur les tumeurs, leur aspect et douleur seront évalués. En cas de nécrose non sèche, ou lorsque les nécroses sont sèches mais douloureuses à la palpation ou creuses, les souris seront mises à mort. Si les nécroses sont sèches, non douloureuses et sans déformation ni signe d’inflammation, les souris seront surveillées quotidiennement et pourront être prise en charge avec l’utilisation d’un produit cicatrisant (alu spray). Dans tous les cas, si les animaux présentent une perte de poids ou une taille de tumeur définie comme point limite, ou si l’aspect des tumeurs le nécessite (nécroses douloureuses ou creuses) ou d’autres signes mettant en évidence une souffrance telle qu’une inflammation persistante, les animaux seront euthanasiés selon les bonnes pratiques.
Choix des espèces
Les souris sont les modèles de choix utilisés pour une analyse de l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. Nous utiliserons des souris immunodéficientes nude (NMRI) pour la première série d’expérience permettant d’implanter des cellules exprimant cIAP1 ou un mutant invalidé de cIAP1. Lors de la seconde série d’expériences, nous utiliserons des souris immunocompétentes pour l’implantation de cellules cancéreuses d’origine murine et des souris immunodéficientes pour l’implantation des cellules cancéreuses humaines. Pour la troisième série d’expérience, des cellules cancéreuses coliques seront injectées à des souris immunocompétentes pour l’expérience de vaccination. Ensuite, l’analyse de la capacité des molécules ou des combinaisons de traitement à sensibiliser les tumeurs à une immunothérapie se fera sur des tumeurs faiblement immunogènes développées dans des souris immunocompétentes. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant (supérieur à 20g).
Comparaison de deux voies d’injection intraveineuse par fluorescence chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La moitié reçoit une injection dans la veine de la queue, l'autre une injection derrière l'œil, suivies de trois séances d'imagerie sous anesthésie, pour comparer deux techniques d'injection et deux traceurs fluorescents. Les souris sont ensuite tuées au CO2 pour analyser la distribution du produit. Le porteur affirme que la validation d'une injection systémique "ne peut être réalisée que sur un organisme entier".
Objectifs
L'administration de médicament chez la souris peut être réalisée par voie oral (dans l'eau de boisson ou par gavage) ou par injection (sous cutanée, intra péritonéale ou intraveineuse). La voie la plus directe et la plus utilisé en clinique est la voie intraveineuse, puisque le composé injecté passe dans tout le corps très rapidement. Pour l'intraveineuse, toujours chez la souris, il existe deux techniques couramment mises en œuvre qui sont l'injection dans la veine caudale (au niveau de la queue) sans anesthésie où les souris sont mises dans un système de contention indolore et rétro orbitale (derrière l'œil) où les souris seront anesthésie. La première permet des injections répétées et nécessite d'immobiliser la souris durant l'opération. Elle peut être compliquée à réaliser sur des animaux de petite taille ou ayant une peau foncée. Dans le cas de l'injection rétro orbitale, la souris est maintenue en contention légère après l'avoir anesthésié et injectée en passant à côté de l'œil. Cette injection ne doit pas être répétée sous peine de causer des lésions à l'animal. Dans notre institut, ces injections sont régulièrement mises en œuvre. Depuis quelques mois, nous sommes équipés d'un appareil de lecture de fluorescence/bioluminescence dans notre service. La lecture de fluorescence sur animal permet de suivre des composés fluorescents en temps réel dans l'animal. Lors d'expériences, nous avons constaté une fluorescence persistante au niveau de la queue lors d'injection en intraveineux caudale. Afin de garantir nos résultats scientifiques, nous devons connaitre précisément la quantité injectée à l'animal que ce soit de cellules ou de médicaments. Dans le cas d'injection en intraveineuse rétro orbitale, nous avons constaté sur un faible nombre d'animaux (1 sur 4 injectées) un échec de l'injection (le liquide ne s'est pas diffusé dans le sang mais est resté localisé au niveau de l'œil). L'objectif de ce projet est de quantifier pour 30 souris (15 souris pour chaque type d'injections) la perte éventuelle de liquide lors d'injection intra caudale et de quantifier le taux d'échec lors d'injection rétro orbitale. Par la même occasion, nous pourrons comparer la distribution de fluorescence entre ces deux techniques et comparer l'efficacité de deux fluorophores que nous utiliserons en parallèle comme traceurs.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une amélioration de nos techniques d'injection en intraveineuse et du choix des fluorophores dans nos futures études et ainsi l'amélioration continue de la qualité des résultats scientifiques.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir les résultats d'imagerie, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. La moitié des animaux seront soumis à une injection unique le jour même au niveau de la queue avec maintien en contention dans une boite prévue à cet effet durant une période de 3 à 5 minutes selon la difficulté de l'injection. L'autre moitié des animaux seront maintenu en contention et auront une injection unique en rétro orbital (moins d'une minute). Tous les animaux seront soumis à trois séances d'imagerie sous anesthésie générale (durée de 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par CO2.
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress léger (maximum 3 minutes) lié à la cage de contention et une douleur légère (moins d’une minute) liée à l’injection. Après injection, les souris subiront une anesthésie gazeuse ce qui représentera aussi un stress léger lié aux anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter des tissus qui seront analysés pour déterminer la distribution.
Remplacement
La validation d'une injection systémique ne peut être réalisée que sur un organisme entier. Nous ne disposons pas de méthode alternative.
Réduction
Ce projet a été mis en place en réduisant autant que possible la taille des groupes expérimentaux. Cependant, les éventuels problèmes d'injections (échec du manipulateur ou formulation du produit) ne permettent pas de descendre sous le nombre d'une quinzaine d'animaux par groupe. Afin de diminuer le nombre d'animaux, l'injection simultanée de deux fluorophores a été privilégié à des injections sur des animaux différents. Afin d'observer un échec d'injection en rétro orbitale ou calculer une éventuelle perte de produit injecté au niveau caudale demande un effectif important de 15 animaux par groupe. D'après nos observations lors d'une étude précédente sur un très faible effectif d'animaux (un échec d'injection sur 4 souris injectées), ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir une statistique fiable sur l'apparition de ce type d'événement.
Raffinement
Les animaux seront placés dans les conditions optimales d'hébergement. Les examens d'imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (5% à l'induction et 2% en entretien). Afin d'éviter l'hypothermie pendant l'anesthésie, l'appareil d'imagerie est équipé d'une plaque thermostatée. De plus, les animaux seront placés dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post examen d'imagerie. Des points limites généraux avec établissement d'une grille d'évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être animal tout le long de l'étude ont été établis pour surveiller l'état général de l'animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur.
Choix des espèces
La souris est le modèle principalement utilisé dans nos études. Ce modèle est le plus pertinent pour le test d'injection intraveineuse que nous effectuerons à l'avenir. Nous utiliserons des souris blanches de taille adulte entre 12 et 20 semaines d'âge. On sera dans des conditions optimales pour la taille de la queue des animaux adultes qui permettra une insertion d'une aiguille de 30 G (la mieux adapté pour les injections IV caudal) et pas trop âgées pour que la peau de la queue ne soit pas durcie.
Caractérisations et comparaisons de différents hydrogels prévascularisés chez la souris.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur pratique une implantation sous-cutanée puis une ouverture du crâne, avec des injections dont une en rétro-orbitaire et des séances de scanner, pour étudier la vascularisation dans la réparation d'os de la face. Il décrit des douleurs postopératoires modérées pendant 72 heures, avant la mise à mort pour l'imagerie et l'histologie. Il affirme utiliser des souris immunodéprimées porteuses de cellules humaines et qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" in vitro ou in silico.
Objectifs
L'os est un tissu dur vascularisé qui se renouvelle continuellement pour s'adapter aux exigences mécaniques et métaboliques du corps. Les maladies inflammatoires, infectieuses ou les traumatismes entraînent d'importants défauts osseux craniofaciaux, aux conséquences esthétiques et fonctionnelles. Des substituts osseux synthétiques ou biologiques ont été développés et sont actuellement utilisés pour traiter ces défauts avec des résultats encore inconstants et perfectibles. La vascularisation joue un rôle important dans la réparation osseuse. L’objectif de ce travail est d'arriver à caractériser et comprendre le rôle de la vascularisation puis d'en déterminer son rôle dans la réparation osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à proposer une solution optimisée et centrée sur le patient pour restaurer les défauts osseux orofaciaux et mieux comprendre le comportement des vaisseaux implantés essentiel à toute survie d'un tissu greffé. Il s’attaque à un problème de santé majeur par le biais d’une stratégie d’ingénierie tissulaire innovante combinant la science des matériaux, la bio-ingénierie et les études précliniques, avec des avantages prévisibles tant pour les patients que pour le système de santé et la société dans son ensemble.
Procédures
Procédure 1 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale d'implantation sous-cutanée (5min), des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (2 acquisitions, 10min) Procédure 2 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale de craniotomie (10min) et des injections (5 injections, durée totale de 25 min), des scanners (5 acquisitions, 25min)
Impact sur les animaux
A l'anesthésie, une dépression respiratoire peut très rarement être observées. Lors de la chirurgie, une complication hémorragique peut survenir. En post opératoires des douleurs modérées pendant 72h, hématomes, oedèmes et réouverture de la plaie par désunions des sutures peuvent être rarement observées. Concernant l'injection en rétro-orbitaire, un léger gonflement de l'oeil est rarement observé durant quelques minutes.
Devenir
Mise à mort pour permettre les analyses d'imagerie et d'histologie.
Remplacement
Ce projet s'intérêsse à la prévascularisation de greffon pour améliorer leur intégration in vivo et leur survie. Cela nécessite donc un modèle in vivo capable de supporter l’implantation de cellules humaines, comme la souris athymique nude. De plus, nous visons à transposer ce modèle de pré-vascularisation à la régéneration osseuse, qui présente une biologie complexe que l’on ne sait pas reproduire par ingénierie actuellement et dont la complexité ne peut être mimée in vitro ou in silico. Il n’existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été limité grâce à une approche statistique de manière à déterminer la taille des groupes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par quatre par cage et disposeront d’un espace suffisamment complexe pour leur permettre d’exprimer leur comportement normal (enrichissement). Les conditions d’élevage sont présentes pour le bien-être animal de façon à réduire le stress et l’anxiété dans un environnent enrichi au sein de groupes sociaux de plusieurs individus, avant et après les procédures. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l’utilisation d’anesthésie et d’analgésique adaptée durant les procédures avec une médication anti-douleur systématique en per et également post-opératoire, et l’établissement de points limites adéquats. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pendant 7 jours après la chirurgie puis 2 fois par semaine par l’expérimentateur dédié au projet. Si au cours de l’expérience une souris atteint un score de points limites de 3 dans une sous-catégorie ou si un indice total de 6 est atteint, l’animal sera alors mis à mort.
Choix des espèces
La souris est une espèce de laboratoire appropriée, dont la biologie (vasculaire et osseuse) est proche de celle de l’homme. De nombreux outils d’analyses d’imagerie et d’histologie sont donc disponibles et adaptés à ce modèle. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéprimées du fait de l’implantation de cellules humaines. Des souris de 8 semaines à 5 mois seront utilisées, les animaux étant alors de jeunes adultes et sont alors les plus à même de pouvoir procéder à une régénération tissulaire.
Modulation de l’activation lymphocytaire T par une enzyme immunosuppressive
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
126 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une irradiation, une injection de lymphocytes et une vaccination, puis des prélèvements de sang, pour étudier une enzyme qui freine la réponse immunitaire contre les cancers. Le porteur indique une perte de poids transitoire, puis les souris sont mises à mort au huitième jour pour prélever les organes lymphoïdes. Il affirme qu'il est "impossible" de modéliser in vitro l'activation d'un répertoire de lymphocytes du fait de leur rareté.
Objectifs
La molécule que nous étudions est une enzyme immunosuppressive, c’est-à-dire qu’elle freine la réponse immunitaire. La production de cette molécule au cours du cancer rend donc la réponse immunitaire moins efficace à éliminer les cellules cancéreuses, ce qui accélère la croissance des tumeurs de souris. Chez l’homme, la production de cette molécule dans les tumeurs réduit la survie. Nous savons déjà que sa production par des cellules immunitaires appelées « cellules présentatrices » limite l’activation des « lymphocytes T », qui sont les acteurs de la défense de l’organisme contre les infections et les cancers. La rencontre avec la cellule présentatrice est l’étape essentielle qui permet au lymphocyte de reconnaitre la cible à attaquer, sous forme d’un fragment moléculaire appelé antigène. Lors du développement d’un cancer, les lymphocytes T activés par la reconnaissance des antigènes des cellules cancéreuses ont pour fonction de les tuer. Nous cherchons à comprendre comment la molécule que nous étudions freine l’activation des lymphocytes T. Nous pensons que la force de l’interaction entre l’antigène et le lymphocyte joue un rôle important. En effet, dans le vaste répertoire de lymphocytes T d’un individu, certains lymphocytes T peuvent reconnaitre un antigène particulier, mais très peu ont la capacité de le reconnaitre fortement tandis que beaucoup plus le reconnaissent plus faiblement. Il est important de déterminer quel type d’interactions la molécule que nous étudions peut freiner, car les conséquences sur la qualité de la réponse immunitaire (et donc la capacité à éliminer les cellules cancéreuses) ne sont pas les mêmes. Ce projet est donc important pour comprendre le rôle de la molécule que nous étudions dans l’échappement des cellules du cancer à la réponse immunitaire. Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro les conditions d’activation d’un répertoire physiologique de lymphocytes T
Bénéfices attendus
Nous souhaitons démontrer que la molécule que nous étudions restreint le répertoire des lymphocytes T capables de répondre à une stimulation par une cellule présentatrice d’antigène. En présence de cette molécule (souris qui l’expriement), seuls les lymphocytes T reconnaissant fortement l’antigène sont probablement capables de s’activer et donc secondairement tuer des cellules malades, par exemple cancéreuses. Bien que cela puisse être suffisant pour faire cesser une infection aigue, au cours de laquelle la réponse est de brève durée, cela n’est pas souhaitable dans le cas du cancer. En effet, du fait de la grande rareté dans l’organisme des lymphocytes de forte affinité pour les antigènes du cancer, cette restriction est contre-productive au maintien à long terme d’une réponse anticancéreuse active. L’immunothérapie connait un développement fulgurant dans le traitement du cancer, car elle permet de réactiver la réponse du système immunitaire contre les antigènes du cancer. Néanmoins l’efficacité des immunothérapies actuelles reste limitée à certains types de cancer et un pourcentage restreint de patients. La molécule que nous étudions représente une cible potentielle pour de nouvelles stratégies d’immunothérapie. Afin de permettre le développement de traitements visant cette molécule, il est nécessaire de comprendre ses mécanismes d’action sur l’activation des lymphocytes T, acteurs clés de l’élimination des cellules tumorales.
Procédures
Irradiation en 1 séquence de 5,8 minutes. Le lendemain, injection d’une suspension lymphocytaire et vaccination (moins de 30 secondes chacun). Les animaux sont endormis à l’isoflurane lorsque les deux injections sont couplées. Trois jours après les deux injections, ponction de sang (animaux vigiles, anesthésie locale, moins de 20 secondes). Avant mise à mort (jour 8) : prélèvement de sang dans les mêmes conditions.
Impact sur les animaux
Concernant l’axe peur/détresse : il existe un stress lié aux manipulations. En effet, l’irradiation nécessite de regrouper les souris dans une boite pendant quelques minutes. Concernant l’axe de stress physique/thermique : pas de stress spécifique à l’expérimentation car l’irradiation est indolore. Concernant l’axe douleur, lésions et maladie : on s’attend à observer une perte de poids transitoire et modérée (
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélever les organes lymphoïdes utiles à l’analyse.
Remplacement
Du fait de la rareté de chaque lymphocyte T spécifique d’antigène dans la population lymphocytaire T totale d’un individu (1/100 000 à 1/1 000 000), il est impossible de modéliser correctement in vitro notre hypothèse. En effet, les outils de détection dont nous disposons ne permettent pas d’analyser de façon robuste un très faible nombre de cellules. De plus, les conditions expérimentales in vitro sont très éloignées de la physiologie.
Réduction
Pour chaque expérience, 3 tests indépendants devront être effectués pour assurer la validité des observations. Chaque test devra indépendamment permettre d’observer une différence statistiquement significative entre les lymphocytes des souris exprimant ou non notre molécule pour une même condition expérimentale. En effet, les résultats varieront très probablement trop d’une expérience à l’autre pour qu’ils puissent être accumulés dans une même analyse statistique. Du fait de la variabilité individuelle accentuée par les différentes étapes de la manipulation, il est souhaitable d’inclure plusieurs animaux par groupe de souris exprimant ou non notre molécule. Trois animaux par groupe seront inclus dans les expérimentations sans vaccination, et 5 animaux par groupe lorsqu’une étape de vaccination est ajoutée. Dans les expérimentations sans vaccination, deux types de transfert de lymphocytes T seront effectués (lymphocytes monoclonaux et polyclonaux). Il y aura donc 6 souris par expérience (3 souris exprimant notre molécule et 3 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes, effectuées avec deux types de transfert lymphocytaire, soit 36 animaux. Dans les expérimentations avec vaccination, trois conditions de transfert des lymphocytes T seront testées. Il y aura donc 10 souris par expérience (5 souris exprimant notre molécule et 5 souris ne l’exprimant pas) au cours de trois expériences indépendantes effectuées avec trois types de transfert lymphocytaire, soit 90 animaux. Au total pour les deux types d’expérimentation, il y aura donc 126 animaux.
Raffinement
L’hébergement se fait dans les conditions habituelles de l’animalerie locale : cinq souris sont hébergées par cage et le milieu est enrichi par des carrés de coton et fibres végétales permettant la formation de nids et des maisonnettes pouvant servir de refuge aux animaux. L’irradiation (une seule séquence de 5,8 minutes sur animaux vigils) est effectuée dans une boite de contention adaptée pouvant contenir 11 souris au maximum, isolées les unes des autres. Pour limiter le stress qui accompagne la manipulation au moment de l’irradiation, l’injection de lymphocytes sera réalisée le lendemain. Lorsque cette injection sera couplée à une vaccination, les souris seront endormies avec de l’isoflurane sur une plaque préchauffée à 37°C. Les prélèvements de sang seront précédés d’une anesthésie locale. Les animaux seront manipulés par du personnel expert de l’équipe de recherche. Les souris élevées dans notre animalerie seront transférées en zone d’expérimentation au minimum 48h avant d’être manipulées. Les souris achetées dans un élevage extérieur seront installées en zone d’expérimentation au minimum une semaine avant d’être manipulées.
Choix des espèces
Nous disposons de trois modèles de souris : 1. Transgéniques : tous les lymphocytes T de ces animaux reconnaissent le même antigène. Elles seront mises à mort sans manipulation et leurs lymphocytes T seront extraits de la rate afin de préparer une suspension injectable aux souris des deux modèles décrits ci-dessous. 2. Génétiquement déficientes pour la production de notre molécule. 3. Exprimant naturellement notre molécule. Souris âgées de plus de 6 semaines. Le travail s’intéresse à l’activation des lymphocytes T dans un organisme adulte
Traitement des thromboses par des particules nanométriques ciblantes délivrant des médicaments dans un modèle de thrombose veineuse chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
185 souris vont être utilisé·es dans une procédure unique menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur ouvre l'abdomen pour exposer le mésentère, provoque un caillot dans une veine à l'aide d'une solution chimique, puis injecte des nanoparticules censées mieux cibler le traitement d'un accident vasculaire cérébral. Après une imagerie de trente minutes, les souris sont euthanasiées sous anesthésie, au plus tard soixante minutes après le début de l'opération. Le porteur affirme qu'il "n'existe pas" de modèle non animal capable de simuler la distribution des nanoparticules dans la circulation.
Objectifs
Cette étude est un projet fondamental dans le domaine de la santé publique. L’accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause mondiale de mortalité. En particulier, 80% des cas d’AVC sont caractérisés par la formation d’un caillot (thrombose) dans une artère cérébrale provoquant une diminution voire une suppression du flux sanguin dans une région du cerveau. L’hétérogénéité des causes de ces thromboses, la complexité et la sensibilité du cerveau font encore de l’AVC une pathologie complexe à traiter et des règles standards de traitements sont difficiles à établir. La première action thérapeutique consiste à rétablir le flux sanguin le plus rapidement possible afin d’éviter des séquelles irréversibles. Le traitement de référence reste le même depuis les années 1980 ; l’injection d'un médicament qui entraine la destruction du caillot. Toutefois, les critères d’inclusion des patients restent très limités, notamment à cause des effets secondaires: saignements, toxicité cérébrale. Le but de ce projet est d'étudier des nanoparticules (particules de taille nanométrique) pour apporter des médicaments directement au caillot, et ainsi éviter ces effets secondaires et diminuer les doses employées. Les tests sur modèle animal permettraient de valider le ciblage, l'action thérapeutique améliorée et l'innocuité du traitement proposé en comparaison avec la ligne actuelle de traitement.
Bénéfices attendus
A travers ce projet, la pertinence d'un nouveau traitement pour les AVCs dus à des caillots sanguins pourra être évaluée, avec en particulier: la mise à disposition des médecins d'un traitement plus complet pour résorber les caillots à l'origine de l'accident, avec une minimisation des effets secondaires (saignement, toxicité cérébrale), une diminution des doses employées et donc une utilisation potentielle pour plus de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une unique procédure sans réveil. Après induction de l'analgésie puis de l'anesthésie, les animaux subiront une incision abdominale pour exposer le mésentère (tissu rattachant les intestins à la cavité abdominale). Après une injection visant à marquer les plaquettes et globules blancs, une veine sera mise au contact d'un papier avec une solution chimique pour créer un caillot, puis une seconde injection avec les traitement sera faite. Après un suivi par imagerie jusqu'à 30 min, les animaux seront euthanasiés (60 min maximum après début de la procédure).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont donc: - douleur liée à l'injection de l'analgésique et de l'anesthésique - douleur liée à l'opération si réveil de l'animal (évité par surveillance et maintien de l'anesthésie).
Devenir
Afin d'éviter toute souffrance inutile des animaux suite à cette procédure chirurgicale, et vu qu'un maintien en vie n'est pas nécessaire post-opération pour des observations dans ce protocole, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie à la fin de la procédure. Pour un nombre limité d'animaux, des prélèvements d'organes post-mortem permettront des analyses des tissus biologiques.
Remplacement
Des études préliminaires ont permis de cibler les médicaments et les doses à tester pour détruire des caillots sanguins. Cependant, Il n'existe actuellement pas de modèles non animaux permettant de simuler la distribution des nanoparticules dans le corps, ni de récapituler le circuit complexe de circulation dans lequel doivent évoluer les nanoparticules pour cibler le caillot. Ainsi, les modèles in vivo permettent donc de répondre à la question: les nanoparticules chargées peuvent-elles, dans la circulation sanguine, résorber un caillot de manière plus efficace que le traitement actuellement utilisé?
Réduction
Les études in vitro préliminaires ont permis de déterminer le meilleur candidat en termes de nanoparticules et de leur chargement respectif (concentration) des médicaments, afin de diminuer le nombre d'animaux nécessaires. Le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminé d’après une analyse statistique: un nombre de 15 animaux par groupe est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents.
Raffinement
Les animaux avant la procédure bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de bien-être. L'anesthésie se fera avec analgésie pour réduire la douleur durant la procédure, et suivis durant la procédure: en cas de signe de réveil, une re-injection d'agent anesthésiant permettra de garder l'animal anesthésié; et en cas d'incident chirurgical (saignements, etc.) l'animal sera sacrifié.
Choix des espèces
Les modèles de thrombose veineuses et artérielles sur la souris sont abondamment décrits dans la littérature, et en particulier celui-ci dans l'étude de médicaments pour les AVCs humains avec caillots sanguins. Des adultes (5-8 semaines) seront utilisés pour que les veines mésentériques puissent être facilement visualisées par macroscopie intravitale. Des stades plus âgés risqueraient de présenter des zones grasses autour des veines, ce qui gênerait l’imagerie.
Etude du rôle du gène p16 dans les cellules épithéliales pulmonaires lors d’un emphysème.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
576 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit un emphysème par une injection d'élastase dans la trachée, via une incision au cou refermée par suture, et active un modèle génétique par des injections de tamoxifène. Les souris sont ensuite mises à mort pour prélever et étudier leurs poumons. Il reconnaît disposer de modèles d'organoïdes humains, mais affirme qu'ils ne peuvent "pas se substituer complètement" au modèle murin.
Objectifs
L’emphysème est une maladie pulmonaire impliquant une destruction irréversible des alvéoles, sans médicament disponible actuellement. Dans les poumons de patients ayant un emphysème, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Ces cellules peuvent sécréter différents facteurs bloquant la prolifération et la différenciation des cellules voisines. Nos données préliminaires montrent que l'absence de p16 répare l'emphysème chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules souches épithéliales des alvéoles, ou pneumocytes 2 sont à l'origine de ce processus de régénération alvéolaire lorsque p16 est absent. Ainsi, l’objectif du projet est d'étudier si l'absence du gène p16 spécifiquement dans les pneumocytes 2 pourrait mener à une réparation des alvéoles pulmonaires. Pour se faire, nous allons utiliser des souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2. L’emphysème sera induit par une injection d’élastase dans la trachée, substance qui provoque une destruction alvéolaire partielle. L’emphysème sera évalué par des analyses sur coupes de poumon. Pour tenter de comprendre les mécanismes impliqués dans la réparation, nous étudierons la composition cellulaire des poumons de ces souris avec des analyses de l’expression génique de cellules individuelles. Pour étudier la capacité de ces cellules à former des alvéoles, nous utiliserons le modèle de formation d'organoïdes (structure d’auto-assemblage de cellules épithéliales et mésenchymales en 3 dimensions).
Bénéfices attendus
Nous anticipons : i) de montrer que les cellules responsables de la régénération dans le poumon emphysémateux en l'absence de p16, sont les pneumocytes 2, ii) d'identifier une ou plusieurs sous-populations de cellules épithéliales issues de la différenciation des pneumocytes 2, ayant des capacités régénératives modulées par la délétion de p16. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée.
Procédures
Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.
Impact sur les animaux
Un modèle de souris génétiquement modifiée sera utilisé pour induire l’absence de p16 dans les pneumocytes 2. Ce phénotype n'est pas dommageable pour les animaux. Pour activer ce modèle génétique, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen par voie intrapéritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l'injection (aiguille). Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. L'injection d’élastase se fait dans la trachée, à l’aide d’une aiguille. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.
Remplacement
La variabilité des caractéristiques des patients ayant de l'emphysème comme leur âge ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysémateuse ayant une déletion de p16 dans les pneumocytes 2 permettra d’étudier directement si les cellules responsables de la régénération sont les pneumocytes 2, dans l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. Actuellement, nous disposons de modèles d'organoïdes chez l'humain qui ne peuvent pas se substituer complètement aux modèles murins mais qui représentent des outils in vitro d’intérêt pour étudier la dysfontion des celules épithéliales chez les patients atteints d'emphysème pulmonaire. Les inconvénients majeurs de ces modèles sont la disponibilité des échantillons et la variablilité entre les patients (consommation de tabac, arrêt de la cigarette, sévérité de l'emphysème, âge, comorbidité, traitement,...).
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 576, correspondant au minimum pour obtenir des résultats significatifs. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 576 souris ayant une absence de p16 dans les pneumocytes 2 seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : i) le nombre d'alvéoles pulmonaires sera évalué à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l’élastase vs 20 souris au PBS (contrôle), ii) la composition cellulaire des poumons de ces souris sera analysée à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 8 souris seront injectées à l’élastase vs 8 souris au PBS (contrôle) iii) le modèle d’organoides alvéolaires permettra d'étudier les propriétés des pneumocytes 2 à former des alvéoles à 21, 90 et 150 jours : pour chaque temps 20 souris seront injectées à l'elastase et 20 souris a PBS (contrôle). Pour chaque expérience et pour chaque groupe de souris injectés soit à l'élastase, soit au PBS, la moitié des souris seront injectées au Tamoxifen permettant d'avoir des souris contrôles (ayant une expression de p16 dans les pneumocytes 2) et des souris présentant une absence p16 dans les pneumocytes 2. Chaque expérience sera réalisée de manière préventive (Tamoxifen administré 3 jours avant l'injection) et de manière curative (Tamoxifen administré à partir de 21 jours, lorsque l'emphysème est déjà constitué).
Raffinement
Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie. Il y aura une présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage, dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constitueront des critères d'arrêt et conduiront à la mise à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.