Rongeurs

320 rats vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À l'adolescence, ils subissent un stress chronique imprévisible pendant 21 jours, cinq tests comportementaux dont la nature n'est pas précisée et quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, pour modéliser des troubles psychotiques. Le porteur indique que ce stress ralentit la prise de poids, puis les rats sont mis à mort pour analyser leur cerveau. Il affirme qu'une approche comportementale n'est possible qu'à l'échelle de "l'organisme entier" et que le rat offre une meilleure "performance translationnelle".

Objectifs

Les troubles psychotiques sont fréquents. Ils apparaissent généralement à l’adolescence, une période de grands changements, tant sur le plan physiologique, psychologique, que social. Ces troubles ont des conséquences majeures sur la vie personnelle, sociale, et professionnelle des patients et de leur entourage en font un véritable enjeu médical et socioéconomique. Malheureusement l’étiologie de la maladie reste mal connue car plurifactorielle. Son développement résulterait d’une interaction entre gènes et environnement, suggérant qu’il existe une vulnérabilité génétique précipitée par des facteurs environnementaux comme le stress psychosocial. Des adolescents ou jeunes adultes présentant des symptômes atténués ou très transitoires de psychose ont été identifiés comme des individus à ultra-haut risque de psychose. Deux tiers des sujets à ultra-haut risque ne développeront pas de trouble psychotique et les thérapies cognitivo-comportementales pourraient favoriser cette résilience au stress. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la sensibilité ou la résilience au stress notamment pendant la période cruciale qu’est l’adolescence pourrait permettre de faire émerger de nouvelles cibles thérapeutiques. Ce projet, chez le Rat, vise à étudier les consequences comportementales pouvant s’apparenter aux les troubles psychotiques suite à stress chronique à l’adolescence afin d'identifier les mécanismes biologiques et moléculaires impliqués dans cette dernière et la résilience au stress et dans les effets bénéfiques de l’environnement enrichi (modèle de thérapies cognitivo-comportementales chez l’animal).

Bénéfices attendus

A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant la vulnérabilité au stress et l’effet des thérapies cognitivo-comportementales pourrait ouvrir la voie au développement de stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les stades précoces des troubles psychotiques.

Procédures

Les animaux pendant l'adolescence subiront sur une période de 21 jours un stress chronique un stress chronique imprédictible. Ils seront également évalués à 2 périodes de temps dans 5 comportementaux espacés de 24h au minimum et durant entre 5 minutes et 1h. Chez ses mêmes animaux 4 prélèvements sanguins seront effectués avec au minimum 3 semaines entre chaque prélèvement. Les prélèvements seront réalisés sur une période de 5 minutes sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le stress réalisé pendant l'adolescence va induire un ralentissement de la prise de poids. Les testscomportementaux utilisés peuvent engendrer un stress chez l'animal mais sont de courte durée. . Les prélèvements sanguins peuvent entrainner un stress et une douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau pour des analyses moléculaires

Remplacement

L’utilisation d’un modèle animal est une nécessité pour cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum nécessaire permettant une analyse statistique robuste des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes et une analyse de puissance statistique. De plus, certaines expériences présenteront un aspect longitudinal afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Les rats sont hébergés en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les soins sont toujours effectués par les mêmes expérimentateurs et animaliers afin de réduire le stress des animaux. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur sera soulagé avec des analgésiques. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale avec prise en charge de la douleur pour limiter le stress et la douleur associés à ce geste.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rongeur et plus particulièrement le Rat car il présente l’avantage, d’être proche physiologiquement de l’Homme, conférant ainsi aux résultats des recherches une meilleure performance translationnelle. D'ailleurs, le Rat, contrairement aux souris, est plus réceptif aux interactions sociales et présente dans le temps des performances cognitives plus stables. De plus, des résultats préliminaires issus de notre laboratoire ont pu montrer que certains stress pendant l'adolescence pouvaient avoir des répercutions à long terme qui pouvaient varier d'un individu à l'autre, comme chez l'Homme. Les animaux issus de femelles gestantes commandées seront utilisés à partir de 28 jours de vie (adolescence) jusqu'à l'âge adulte.

1 200 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur met au point une greffe de cellules de cancer du pancréas directement dans le pancréas, par chirurgie abdominale ou par injection échoguidée, avec suivi de la tumeur et prélèvements sanguins répétés. Les souris sont euthanasiées lorsque la tumeur approche 1 500 mm3 ou en fin d'étude, pour prélever sang, tumeur et organes. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de reconstituer in vitro les interactions de la tumeur avec son microenvironnement.

Objectifs

Le pancréas est un organe localisé à l’arrière de l’estomac. Il contient 2 types de cellules : les cellules exocrines dont la fonction est de libérer des enzymes et des sucs participant à la digestion et les cellules endocrines qui produisent des hormones notamment impliquées dans l’homéostasie glucidique. Avec 14000 nouveaux cas de cancers diagnostiqués par an, le cancer du pancréas est le 6e cancer le plus fréquent en France. Parmi les différents types de cancer du pancréas, l’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACP), qui se développe dans le compartiment exocrine, représente 90-95% des cancers pancréatiques. L’ACP est un cancer très agressif et létal, avec un pourcentage de survie des patients à 5 ans inférieur à 10% (et seuls 20% des patients souffrant d’ACP survivent plus d’un an). Les traitements classiques de l’ACP sont la chirurgie qui permet de retirer la partie tumorale tout en conservant la partie saine du pancréas, la chimiothérapie et l’irradiation, mais ces traitements ne permettent pas d’améliorer significativement les résultats cliniques. Ainsi, il est important de développer de nouveaux traitements pour ce cancer afin d’améliorer la survie et la qualité de vie des patients. Dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments, les composés, après avoir été sélectionnés grâce à des tests in vitro, sont évalués in vivo chez des souris porteuses de tumeurs pour déterminer leur efficacité anti-tumorale. Les modèles les plus couramment utilisés sont des modèles de greffes de cellules tumorales sous la peau des souris. Mais ils ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral qui peut constituer une barrière physique aux traitements. La greffe de cellules tumorales pancréatiques directement dans le pancréas, (greffe orthotopique pancréatique), permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée d’intérêt pour la recherche de nouveaux traitements. Ce projet vise à mettre au point des techniques de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique chez la souris via une méthode dite classique de chirurgie ainsi que par une méthode d’échoguidage non invasive – les deux techniques seront réalisées en différents sites du pancréas pour déterminer quelle approche permet de générer un modèle le plus ressemblant à la tumeur humaine. L’activité anti-tumorale de traitements candidats sera ensuite évaluée.

Bénéfices attendus

Actuellement, les études pharmacologiques dans le cadre de l’ACP sont effectuées sur des modèles de xénogreffes de cellules tumorales humaines sous la peau de souris (greffe ectopique ou hétérotopique). Mais ces modèles ne récapitulent pas toutes les caractéristiques spécifiques associées à l’ACP et notamment le microenvironnement tumoral. La greffe de cellules tumorales pancréatiques dans le pancréas de souris immunocompétentes permet de retrouver ce microenvironnement tumoral et est donc considérée plus pertinente pour l’évaluation de nouveaux traitements anti-tumoraux. Bien que l’approche de la greffe orthotopique au niveau de la queue du pancréas soit la plus décrite, nous allons mettre au point l’injection orthotopique dans la tête du pancréas. En effet, ce site d’injection, bien que moins simple d’un point de vue de l’approche chirurgicale, est plus relevant scientifiquement vis-à-vis de la pathologie humaine. De plus, la greffe orthotopique dans le pancréas nécessite un acte de chirurgie dont nous allons essayer de nous affranchir par la mise en place d’une approche d’implantation per cutanée échoguidée. L’utilisation de l’échographie pour évaluer la progression tumorale au cours des études permet de raffiner l’utilisation des animaux en les incluant progressivement dans l’étude. Ainsi les bénéfices de ce projet seraient de mettre au point un modèle plus prédictif de la pathologie humaine et ainsi de mieux prédire l’efficacité de candidats médicaments chez l’homme. Ce projet vise également à développer si possible ce modèle avec une méthode non chirurgicale moins invasive afin de favoriser le bien-être animal.

Procédures

- Puçage : afin d’identifier chaque animal, un dispositif sous cutané est implanté en vigile par trocart quelques jours avant l’étude (environ 10 secondes/souris) - Chirurgie pour l’implantation des cellules tumorales dans le pancréas : cette chirurgie durera 30 minutes maximum et sera réalisée une seule fois sur l’animal avec mise en œuvre des bonnes pratiques chirurgicales (asepsie, protocole analgésique pré-post opératoire, surveillance et réveil en enceinte chauffée). - Echoguidage sous anesthésie gazeuse pour l’implantation de cellules tumorales dans le pancréas : cette procédure sera réalisée une seule fois sur l’animal et durera 10-15minutes. - Mesure du volume tumoral par échographie sous anesthésie gazeuse. Réalisé une fois avant la greffe puis après rétablissement complet de l’animal suite de la chirurgie (7 à 10 jours), à raison de 1 mesure échographique par semaine. La durée d’une mesure est déterminée à environ 30 minutes par souris et la mesure se fera sur une durée maximale de 8 semaines - « Microsampling » : prélèvements de sang, en cinétique, à la veine marginale latérale du membre inférieur sur animal vigile, au maximum 1 fois par semaine, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de marqueurs caractéristiques de la cachexie) (environ 20 secondes/souris) - Prélèvement de sang en fin d’étude sur animal anesthésié et sans réveil consécutif par ponction cardiaque.

Impact sur les animaux

-Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de de la mesure de la composition corporelle -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors de l’administration des traitements en quotidien ou biquotidien ou triquotidien, avec une durée d’environ 30 secondes /souris/ administration) -Stress physique léger lié à la contention de l’animal lors des prélèvements sanguins par microsampling d’environ 20 secondes /souris -Douleur très légère lié à la piqûre lors des prélèvements sanguins par microsampling -Douleur légère due à la pathologie et possiblement associée à une perte de poids et/ou formation d’ascite et/ou cachexie -Douleur modérée liée à la chirurgie lors de la greffe orthotopique avec une petite ouverture de l’abdomen

Devenir

Lorsque le volume tumoral total est proche de 1500 mm3, ceci constitue un point limite et l’animal concerné est alors euthanasié. A la fin de chaque étude, tous les animaux sont euthanasiés pour réaliser des prélèvements de sang, de tumeur et d’autres organes. Ces prélèvements seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…) ou pour des analyses de biomarqueurs dans le cadre des études d’efficacités.

Remplacement

Ce projet a pour but de mettre au point un modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales d’origine pancréatique. L’implantation des cellules dans le pancréas permet ainsi à la tumeur de se développer dans le microenvironnement d’origine d’un cancer du pancréas, fournissant ainsi une récapitulation des nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Il est impossible à l’heure actuelle de reconstituer in vitro les interactions d’une tumeur avec le microenvironnement, et donc il n’y a pas de méthodes substitutives.

Réduction

- Un accompagnement par le service biostatistique sera réalisé pour estimer la variabilité de la pousse de la tumeur pour chaque lignée cellulaire étudiée dans le cadre de ce projet. Cette étape permettra d'établir le nombre d'animaux nécessaires par groupe pour les études futures d'efficacité de traitement et de pharmacodynamie en évaluant la capacité des designs de ces études à l’aide d’un test statistique. Un modèle statistique longitudinal sera utilisé pour évaluer l’efficacité des candidats médicaments. - Lorsque les souris seront euthanasiées, des prélèvements de tumeurs seront réalisés pour générer des échantillons qui pourront être utilisés pour des études ultérieures (détermination de l’expression de protéines ou de gène d’intérêt, par immunohistochimie, génomique ou protéomique…). Cette approche permet donc d’optimiser les études et de réduire le nombre d’animaux en évitant de refaire des études pour obtenir des échantillons. - Dans les phases d’entrainements, les premiers essais se feront sur des souris mortes issues d’autres projets afin de maitriser les voies d’abords et les volumes d’injections avant de valider le geste sur des souris dédiées au projet. De plus la mise au point des techniques et sélection de la plus pertinente se fera par un seul expérimentateur afin de réduire le nombre d’animaux - Afin d’inclure toutes les souris greffées dans les études, nous utiliserons l’échographie pour randomiser tous les animaux au fur et à mesure avec un volume tumoral similaire ainsi le taux d’inclusion sera maximisé. - Lors des études d’efficacité de candidats traitements, il sera possible d’effectuer des analyses de pharmacocinétique c’est-à-dire d’évaluer, en fonction du temps, le devenir d’un médicament dans l’organisme (via des prélèvements sanguins de faibles volumes et répétés maximum 6 points) évitant la réalisation d’une seconde étude dédiée.

Raffinement

- Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les animaux font l’objet d’une observation clinique tout au long de l’étude par les expérimentateurs et par les zootechniciens pour s’assurer de leur rétablissement, de leur bien-être et de l’absence de signe clinique. En cas de signe clinique, le vétérinaire est alerté et les recommandations de la SBEA et les points limites seront appliqués. - La procédure de greffe orthotopique est réalisée selon les bonnes pratiques de chirurgie, avec : - des espaces séparés pour la préparation des animaux et pour la chirurgie - une anesthésie et une analgésie adaptées à la chirurgie - une asepsie maintenue pendant toute la chirurgie - L’analgésie post-opératoire pourra être adaptée en termes de traitement administré et de durée en fonction des signes de douleurs observés et en concertation avec le vétérinaire. - Une seconde méthode de greffe orthotopique « non chirurgicale » par échoguidage percutané sera évaluée, ceci en vue de s’affranchir de douleurs opératoires et réduire les risques de pertes lors de la chirurgie. L’implantation cellulaire s’effectuera sous échographie par injection échoguidée en percutanée ne nécessitant pas de pré ou post médication. Le suivi de la croissance tumorale par échographie est une méthode non invasive pour l’animal et sans douleur. Cette mesure est réalisée sur des souris anesthésiées à l’isoflurane. Les tumeurs sont mesurées par échographie 1 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais aussi pour limiter la souffrance et appliquer les points limites. En cas de volume tumoral s’approchant des 1500 mm3 lors d’une lecture, les souris seront euthanasiées. - La cachexie, signe clinique associé à la progression tumorale du cancer du pancréas, sera suivie via l’établissement d’une grille de scoring. La prise alimentaire, l’activité générale, la mesure de la composition corporelle par scanner non invasif EchoMRI (pourcentage de masse grasse, masse maigre et eau totale), de paramètres métaboliques (albumine, triglycérides) et hématologiques seront monitorés tout au long de l’étude.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de la souris est largement décrite dans la littérature pour la recherche pré-clinique. De plus, la greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas chez la souris est couramment utilisée dans les études précliniques d’oncologie. Ainsi la souris est le modèle de choix. Les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 7 semaines. Il s’agit de l’âge d’utilisation classique des souris dans les protocoles d’efficacité et de pharmacodynamie en oncologie.

180 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit dix-sept interventions, dont trois injections d'une protéine avec adjuvant, sept anesthésies gazeuses, quatre prélèvements de sang et trois inhalations, pour tester un traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Les souris sont ensuite mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire. Le porteur affirme qu'un "modèle murin est nécessaire" et que les cultures in vitro ou les organoïdes ne reconstituent pas tous les acteurs du système immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Notre laboratoire a identifié la protéine (PAD4) responsable de la production des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde. Un nouveau traitement pour bloquer la réponse immunitaire contre la protéine PAD4 sera utile pour traiter la polyarthrite.

Bénéfices attendus

Développer un nouveau traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Cette maladie bénéficie de traitements qui traitent les conséquences de la maladie (l'inflammation) mais pas la cause principale qui est la production d'autoanticorps.

Procédures

17 interventions : 3 injections de la protéine ou de la solution saline pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute

Impact sur les animaux

3 injections de la protéine ou de la solution saline avec l’adjuvant complet et incomplet pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 4 prélèvements de sang de 10 secondes, 3 inhalations de la protéine ou de la solution saline pendant 1 minute.

Devenir

Les 180 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.

Remplacement

L’objectif de cette demande est de tester l’effet d’un traitement qui pourra être utilisé chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde pour bloquer la production des autoanticorps. Chez les patients, il est difficile d’analyser les autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Un modèle murin est nécessaire car il permet d’induire les autoanticorps afin de comprendre comment ils sont produits et de développer des traitements pour bloquer leur production. D’autres alternatives à l’expérimentation animale comme la culture de cellules in vitro ou des organoides ne permettent pas de reconstituer tous les acteurs du système immunitaire pour analyser les mécanismes de production des autoanticorps et tester les effets d’un traitement.

Réduction

Nous allons suivre pendant 50 jours l’effet de la protéine PAD4 sur des souris de deux fonds génétiques différents. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Le nombre total de souris sera 180.

Raffinement

Une anesthésie gazeuse à l’isoflurane sera réalisée pour chaque inhalation (3 par souris) et chaque prélèvement de sang dans la veine mandibulaire (4 prélèvements par souris) pour analyser leur sérologie. Les souris seront mises à mort pour analyser leur réponse lymphocytaire. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens deux fois par semaine. Les effets des procédures seront suivis selon une grille d’évaluation de la souffrance qui combine l’apparence générale, le comportement, la locomotion et les signes neurologiques des souris. Si une souffrance est observée, elle sera chiffrée par une grille de score. L’injection d’analgésiques sera faite si besoin. Chaque cage contenant au maximum 4 souris sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole.

Choix des espèces

Nous allons choisir les souris en fonction des facteurs de risque connus chez les patients atteints de la polyarthrite. Nous voulons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite touche l’homme ou la femme adulte, des femelles car la production d’autoanticorps est meilleure que chez les males, des souris qui ont certains gènes à risque de développer une arthrite. Nous allons tester des formes adultes de souris car la polyarthrite rhumatoïde touche l’homme ou la femme adulte. Nous allons utiliser des souris agées de 6 semaines.

3 570 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales dans la glande mammaire ou le poumon, puis des injections d'hormonothérapie, de facteurs de croissance ou de lymphocytes, pour étudier des cellules immunitaires qui favorisent les cancers. La croissance tumorale provoque une asthénie et les souris sont tuées par dislocation cervicale avant d'atteindre les points limites, pour prélever rate, tumeur, foie et poumons. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système in vitro ni non-vertébré ne peut mimer ces interactions immunitaires.

Objectifs

Le système immunitaire protège généralement contre l'apparition des cancers. Cependant, dans certains cas, les cancers peuvent échapper à protection par le système immunitaire. Des cellules immunitaires particulières, appelées « cellules myéloïdes suppressives (CMS) » contribuent à cet échappement. Ces cellules sont en partie responsables du manque d’efficacité des immunothérapies chez de nombreux patients. De nombreux sous-types de CMS ont été décrites, ce qui rend leur identification problématique. En dehors de leur capacité à bloquer le système immunitaire, les CMS participent à la mise en place de vaisseaux sanguins dans les tumeurs ou au processus métastatique. La notion que ces cellules pourraient s’associer avec les cellules tumorales circulantes (cellules tumorales présentes dans le sang, migrant depuis la tumeur primaire vers des sites distants métastatiques) est un concept récent sur lequel notre laboratoire travaille activement. Ce projet a pour objectifs de caractériser l’influence des CMS sur l’immunité anti-tumorale, la préparation des sites pré-métastatiques et la réponse aux thérapies en utilisant des modèles de cancer murins établis, représentatifs de cancers humains et avec lesquels notre équipe a précédemment publié. Les objectifs principaux sont les suivants : 1) Déterminer la cinétique d’apparition de différentes sous-types de CMS dans différents organes au cours du développement tumoral. En parallèle, une caractérisation précise d’amas cellulaires associant cellules tumorales et cellules immunitaires (dont ces CMS) dans le sang sera réalisée. 2) Déterminer l’influence de sous-types distincts de CMS sur l’apparition de micro-métastases dans des organes distaux ; 3) Evaluer si l’hormonothérapie, des facteurs de croissance ou des chimiothérapies utilisées dans le traitement de nombreux cancers modifient le nombre et les fonctions de ces cellules dans un modèle de cancer mammaire et pulmonaire ; 4) Evaluer le rôle de ces cellules dans la réponse aux immunothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait apporter des informations nouvelles concernant les multiples rôles des cellules myéloides suppressives dans les cancers. 1) Les données obtenues devraient d'abord permettre de mieux définir les fonctions protumorales de sous-populations différentes de cellules myéloides suppressives. 2) de nouveaux résultats devraient être générés concernant la capacité de ces cellules à préparer les organes situés à distance de la tumeur primaire à l'arrivée de cellules tumorales migrantes (métastatiques). 3) Enfin, ces travaux apporteront des informations essentielles sur l’impact de l’hormonothérapie et de facteurs de croissance (utilisés cliniquement pour prévenir les risques d'infection) sur les différentes sous-populations myéloïdes et le développement tumoral.

Procédures

Model de souris de cancer du sein : injection dans la glande mammaire de cellules tumorales (~10 secondes). Model de cancer du poumon : injection intrapulmonaires de cellules tumorales (~2min). Des injections intrahépatiques, intraspléniques et intrapulmonaires de cellules myéloïdes seront effectuées (

Impact sur les animaux

Les nuisances, stress et douleurs anticipés seront liés à la préhension et contention des animaux, aux injections (cellules tumorales ou thérapies) ainsi qu’à la croissance tumorale. La croissance tumorale s'accompagne d'une asthénie générales. Un handicap physique lié à la tumeur primaire n'est pas anticipé puis les souris seront euthanasiées avant qu'elles atteignent ce stade basé sur des points limites définis. Basé sur nos travaux précédents, les immunothérapies proposées sont bien tolérées et aboutissent dans certain cas à la régression des tumeurs et à la guérison des animaux.

Devenir

A l'issu de toutes les procédures, les animaux sont euthanasiés pour collecter les différents organes d'intérêt permettant une analyse du nombre, du phénotype et des fonctions de différentes populations de cellules immunitaires

Remplacement

L'utilisation de modèles de souris de cancers est indispensable à ces études et ne peut être remplacée par des approches alternatives: en effet, la simplicité des systèmes de culture in vitro n'est pas adaptée et ne permet pas la génération de résultats interprétables puisque ne prenant pas en compte les multiples interactions cellulaires et facteurs solubles jouant un rôle à distance dans l'organisme impliqués dans la régulation du système immunitaire. Il n'est pas possible de mimer in vitro les influences réciproque entre les très nombreuses populations de cellules présentes in vivo. De plus, ces systèmes in vitro ne permettent pas l'évaluation de l'influence du microenvironnement propre à chaque organe sur les cellules myéloïdes suppressives in vivo. Nous avons envisagé la possibilité d'utiliser des modèles d'insectes ou des systèmes non-vertébrés, mais ces organismes ne possèdent pas les cellules immunitaires retrouvées chez les mammifères, rendant impossible une extension des résultats à l'Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux sera restreint au minimum permettant de dresser des conclusions scientifiques basées sur une approche statistique. Par ailleurs lorsque possible les groupes contrôles seront communs à différentes expériences. Les animaux sont hébergés e à raison de 5 souris par cage. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu.

Raffinement

La procédure majeure commune à toutes les expériences proposése consiste en l’implantation orthotopique de cellules tumorales syngénéiques. Cette procédure est largement reconnue et adaptée à l’étude des cancers in vivo. Elle présente les avantages suivants : • une mise en œuvre aisée ne nécessitant pas d’acte chirurgical. • un suivi longitudinal simple donc sans manipulation engendrant une douleur ou un stress important de l’animal D’un point de vue éthique cette méthode permet de : • restreindre le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal. En effet il n'y aura pas besoin de mettre à mort des animaux pour obtenir le suivi de points intermédiaires dans l'évolution tumorale, tout sera fait sur les mêmes animaux qui iront jusqu'au point final avant d'être mis à mort. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. Les animaux seront anesthésiés comme indiqué lorsque requis, lors de procédures spécifiques.

Choix des espèces

Il n´existe pas de méthode alternative pour ce projet. Le suivi de la réponse immunitaire chez les patients ne donne qu'une réponse partielle (limité a des endpoints partiels, au niveau du compartiment sanguin). L'impact du microenvironnement tumoral sur le système immunitaire, et les modifications dynamiques de la fonction et du phénotype des cellules immunitaires étudiées sont impossibles éthiquement et techniquement à mettre en évidence chez l'homme. L'étude chez la souris (6-8 semaines) est la seule approche permettant une analyse spatio-temporelle de la régulation des réponses immunitaires antitumorales. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro (absence des complexes réseaux d'interraction cellulaire et cytokinique régulant l'immunité antitumorale) et sans l'utilisation de souris immunodéficientes. Des systèmes non-vertébrés ne sont en outre pas adaptés puisque ne possèdant pas de système immunitaire équivalent à celui des mammifères. La souris comme animal modèle est Sources: PubMed, CEVMA.

120 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur greffe des cellules tumorales dans le tronc cérébral au deuxième jour après la naissance, puis suit la croissance de la tumeur sous anesthésie trois fois par semaine et administre des agents anticancéreux, pour un cancer pédiatrique incurable. Les souris sont euthanasiées pour prélever et analyser les tumeurs cérébrales. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité de la tumeur in vivo.

Objectifs

Ces travaux de recherche vise à étudier le gliome du tronc cérébral (DIPG), un cancer pédiatrique toujours incurable. Aucun des traitements actuels ne prolonge la vie des enfants atteint de DIPG. Dans ce contexte, il est nécessaire de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques mais aussi d’optimiser celles développées récemment afin que le traitement soit le plus efficace possible. Nos études récentes ont mis en évidence une nouvelle combinaison de deux composés chimiques validée chez la souris, mais nos données sur les lignées cellulaires montrent que certaines cellules tumorales résistent à ce traitement en se transformant en cellules souches tumorales. Le projet vise à mieux comprendre ce phénomène afin d’optimiser l’efficacité de notre combinaison médicamenteuse. Des analyses moléculaires et histologiques seront réalisées sur les tumeurs après prélèvement afin d’apprécier l’action de chacune des deux drogues et de la combinaison sur la pourcentage de cellules souches cancéreuses et sur certains gènes dans un contexte in vivo.

Bénéfices attendus

Démontrer que l’association de deux nouveaux médicaments bloque la formation de tumeur chez la souris. Etudier l’effet des deux composés, seules ou en association, sur la proportion de cellules souches tumorales aau sein des tumeurs. Mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs continuent de se développer en présence de ces composés, même si elles se développent moins vite que les tumeurs chez les souris contrôles.

Procédures

Injection sous anesthésie de cellules dans le tronc cérébral (une fois, 5 minutes ). Suivi du poids et du développement tumoral sous anesthésie (3 fois par semaine, 20 minutes)

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée avec la greffe de cellules tumorales dans le tronc cérébral et la formation de tumeur dans le cerveau. Dans certaines conditions du projet, des agents anticancéreux seront administrés aux animaux afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales à cette nouvelle thérapie. Les nuisances attendues sont la manipulation des cages et des souris lors des expériences, un léger stress termique dû à l'anesthésie qui est pris en charge par l'utilisation d’un tapis chauffant et une douleur due à l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille. Comme les souris sont manipulées sous anesthésie générale, toutes ces nuisances ont un effet limité sur les animaux.

Devenir

Les 120 souris de ce projet seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse pas des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris (souris ayant un système immunitaire à capacité limitée). Sources bibliographiques consultées (PubMed, CEVMA). Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiment stromales et tumorales en action in vivo chez la souris.

Réduction

Nos effectifs seront déterminés de façon adéquate et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux. Les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Ces animaux sont hébergés en cages à raison de 5 souris par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera euthanasié sans attendre.

Choix des espèces

1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. Pour le modèle intracrânien de gliome, l’injection de cellules dans les souris sera réalisée au deuxième jour après la naissance. À cet âge, une injection intracérébrale est faisable sans procédures chirurgicales, ce qui réduit considérablement la souffrance animale. Il est aussi important que le cerveau soit à un stade de développement précoce pour être proche du microenvironnement présent chez les enfants atteints de gliomes du tronc cérébral.