Rongeurs

150 souris domestiques sauvages vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées sur place. Elles sont piégées vivantes et gardées une nuit, soumises à trois tests comportementaux, la latence à quitter un tube sombre, un test de champ libre et un test de mobilité dans un sac sombre, puis marquées à l'oreille avec prélèvement d'un échantillon de peau. Le porteur indique un stress lié à la capture et à la manipulation et un risque de prédation lié aux pièges, limités par un temps court dans le piège. Le projet compare des populations urbaines, rurales et sauvages pour étudier leur adaptation à l'urbanisation.

Objectifs

Tous les êtres vivants existent dans un monde qui change. Alors que certains organismes s’adaptent facilement ou même prospèrent dans des environnements nouveaux ou difficiles, d’autres succombent même à de légers changements dans leurs conditions environnementales. Pourquoi certains animaux réussissent-ils là où d’autres ne réussissent pas ? Pour répondre à cette question, il faut comprendre les mécanismes phénotypiques, génétiques et épigénétiques qui aident une population à s’adapter à de nouveaux environnements. Ce domaine de recherche a longtemps été au cœur de l’écologie évolutive, mais il est maintenant encore plus important que jamais étant donné la menace urgente du changement climatique induit par l’homme. Les contrastes entre les populations urbaines et rurales sont un moyen puissant d’aborder la façon dont différents traits phénotypiques et (épi)génétiques influencent l’adaptation des organismes : les populations vivant en milieu urbain font face à une variété de conditions environnementales que les populations rurales ne subissent pas, ex. pollution et fragmentation de l’habitat. L’objectif de ce projet est de déterminer comment les traits comportementaux, génétiques et épigénétiques diffèrent entre les populations sauvages, rurales et urbaines de la souris domestique (Mus musculus domesticus). La souris domestique sauvage est un modèle d’étude particulièrement intéressant pour aborder ces questions: espèce commensale avec une forte capacité d’adaptation, elle est aussi un organisme très étudié sur le plan comportemental et génomique: on sait que les souris présentent une variation comportementale quantifiable répétable et héréditaire de la proactivité, et nous disposons d’une variété d’outils génomiques, y compris un génome bien annoté, chez cette espèce modèle. Nous faisons l’hypothèse que les environnements urbains induisent des réponses comportementales adaptatives, répétables et quantifiables. Deuxièmement, nous faisons l’hypothèse que les phénotypes comportementaux adaptatifs reposent à la fois sur des adaptations génétiques et épigénétiques (méthodes non décrites ici).

Bénéfices attendus

Ces travaux fourniront un aperçu des mécanismes sous-jacents à la capacité de tolérer et de s’adapter à de nouveaux environnements. Ils nous permettront de mieux comprendre les capacités d’adaptation des espèces envahissantes, mais aussi de mieux comprendre et prédire la vulnérabilité des espèces à l’extinction face aux changements environnementaux induits par l’homme. Parce que ce travail concerne la souris domestique, une espèce hautement commensale — à la fois un vecteur de maladie et un ravageur agricole — les données de ce projet pourront être utilisées pour éclairer les programmes de lutte contre les rongeurs qui ont une incidence directe sur la santé publique et l’économie. Enfin, les résultats de cette étude aideront à relever les défis en suspens dans les domaines de l’écologie comportementale et de la biologie évolutive.

Procédures

Capture-vivant (N=150). Les souris seront piégées et maintenues toute la nuit pendant la phase nocturne de pose du piège dans la nature et relâchées au lever du jour. Nous passerons jusqu'à 14 nuits consécutives sur un site de piégeage et y retournerons après un mois. Ainsi, il est possible que chaque souris subisse plusieurs piégeages. Tests comportementaux (N=150). Chaque souris sera équipée à trois tests comportementaux consécutifs : latence pour quitter un tube sombre, champ libre et test de mobilité dans un sac sombre. Marquage auriculaire et prélèvement d'échantillons auriculaires (N=150). Chaque souris recevra une étiquette auriculaire sur l'oreille droite et aura un échantillon de peau prélevé sur l'oreille gauche. Ces procédures durent moins de 2 minutes et sont réalisées avec des outils sanitaires appropriés.

Impact sur les animaux

Les pièges peuvent attirer les animaux sauvages (comme les sangliers) ou les prédateurs domestiques (comme les chiens ou les chats) et ainsi augmenter le risque de prédation. La capture et la manipulation des animaux peuvent également engendrer un stress. Toutefois notre protocole a pour objectif de réduire au maximum ces nuisances potentielles : en réduisant la durée de séjour dans le piège d’un animal, en ajoutant dans le piège du coton permettant la construction d’un nid, en manipulant l’animal le plus rapidement possible et en utilisant des objets sombres (tunnel, sac) lors du passage d’un test à un autre.

Devenir

À la fin de l’échantillonnage comportemental et tissulaire, les souris seront relâchées sur place (souris en milieu naturel).

Remplacement

Ce projet de recherche s’intéresse au comportement de la souris et à la variation génétique des animaux sauvages. Les questions précises que nous posons au sujet de l’adaptation aux environnements urbains n’ont pas d’analogie directe dans les modèles de culture cellulaire ni dans les modèles non vertébrés. De plus, il s’agit de questions empiriques auxquelles on ne peut répondre en utilisant des approches théoriques.

Réduction

Nous aimerions avoir un échantillon uniforme de souris dans nos différentes catégories environnementales. Notre but est d’étudier 10 souris adultes par site de piégeage et d’avoir 5 sites de piégeage par type d’environnement. Cette stratégie assurera une représentation égale pour chaque type d’environnement et une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Ce projet se limite à la capture, à l’observation comportementale, aux mesures morphologiques et à l’échantillonnage de tissus. Le temps passé dans les pièges sera aussi réduit que possible car les pièges seront placés juste avant le coucher du soleil et relevés au lever du soleil. Les pièges comprennent de la nourriture, un abri, et un morceau de coton, permettant une protection du froid et de la chaleur ainsi que la construction d'un nid. S’il y a beaucoup de souris à traiter en même temps, les souris resteront dans leurs pièges avec une tranche de pomme pour prévenir la faim et la déshydratation. Être dans un piège ne nuit pas aux animaux capturés lorsque le piégeage est fait de façon responsable, par exemple, si les pièges ne sont pas exposés à des températures extrêmes. Ici, nous ne prévoyons pas de piéger en hiver, et tous les pièges contiendront du coton, qui fournit une bonne isolation. Nous limiterons l’exposition des pièges aux températures trop chaudes en installant des pièges au coucher du soleil et en les vérifiant au lever du soleil. La mortalité dans les pièges devrait donc être très faible. L’observation comportementale et les mesures morphologiques ne nécessitent pas des gestes invasifs et n’induisent pas des dommages aux animaux. Les tests comportementaux ne durent pas plus de 15 minutes. L’échantillonnage des tissus se fera au moyen de poinçons auriculaires, une procédure courante qui ne nécessite pas de sédation. Au total, les souris seront manipulées et testées pendant au plus 30 minutes, ce qui minimisera le stress sur les animaux. Nos critères de mauvaise santé pour l’euthanasie seront une fourrure mate et/ou une posture voûtée.

Choix des espèces

La souris domestique (M. m. domesticus) est le seul mammifère non domestique qui a récemment été introduit dans un large éventail d’habitats (rural, urbain, feral), c’est donc une espèce de choix pour les travaux proposés. De plus, la souris domestique dispose d’une abondance inégalée d’outils génomiques disponibles, y compris des bases de données génétiques nombreuses et un génome bien annoté qui seront utiles pour nos études génétiques à partir des prélèvements réalisés ici. Enfin, des nombreuses études indiquent que les souris présentent des variations quantifiables et héréditaires dans les traits comportementaux que nous étudions ici dans le contexte particulier d’un gradient d’urbanisation. Toutes les souris utilisées dans ce projet sont des adultes car nous nous intéressons uniquement au comportement des animaux sexuellement matures. Les souris juvéniles, gravides ou allaitantes seront libérées immédiatement sur le lieu de capture.

1572 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections intramusculaires répétées de vecteurs synthétiques et des prélèvements de sang hebdomadaires, avant euthanasie et autopsie pour doser les vecteurs et évaluer leur toxicité. Le projet vise à mettre au point des vecteurs transportant des fragments d'anticorps, notamment pour la reproduction et une alternative à la contraception hormonale. Le porteur affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reproduit l'organisme entier.

Objectifs

Le traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale pourraient potentiellement voir le jour sur la base de la modulation réalisée par des petits fragments d’anticorps communément appelés nanobodies, qui grâce à leur taille inférieure aux anticorps classiques peuvent pénétrer plus facilement au sein des tissus ciblés. Afin de permettre leur délivrance, nous souhaitons évaluer l’utilisation de vecteurs synthétiques facilitant l’adressage des « gènes » codant pour ces nanobodies et induisant leur production par le tissu ciblé. Dans ce contexte, nous cherchons à améliorer le ciblage de la thérapie à l’aide de vecteurs synthétiques. En effet, les acides nucléiques ne traversant pas spontanément les membranes biologiques, l’objectif de notre projet est d’inventer et d’optimiser de nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour faciliter l’entrée des gènes dans les cellules. C’est pourquoi, nous voulons injecter nos vecteurs synthétiques chez la souris adulte pour observer la réponse globale de l’animal. L’analyse des résultats, des différents prélèvements des sites d’injections, du sang, ou de différents d’organes permettra d’ajuster la composition des vecteurs que nous développons et de trouver le meilleur vecteur pour les thérapies futures. Le projet proposé ici a pour objet (1) de déterminer les meilleures voies d’administration de ces fragments d’anticorps, d’étudier leur comportement in vivo, (2) d’optimiser leur séquences et formulation pour leur utilisation in vivo ; et (3) de confirmer leurs effets fonctionnels sur la reproduction.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité des composés étudiés. De plus, l’efficacité des vecteurs synthétiques administrés dans différents organes sera caractérisée. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques de reproduction chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention et de traitement des troubles de la reproduction ainsi que le développement d’alternatives à la contraception hormonale, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Selon la procédure, les animaux subiront soit : - Procédure 1 : Des injections intramusculaires des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min et sera répétée 7 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Des prélèvements sanguins sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. - Procédure 2 : Des injections intramusculaires (dans les deux muscles tibiaux) des vecteurs sous anesthésie et après analgésie de l'animal. La procédure durera moins de 5 min sera répétée 1 fois. Des prélèvements de sang seront également effectués en submandibulaire sur animal vigile pour alléger au maximum la sévérité des actes effectués. Cinq prélèvements sanguins sont prévus sur animal vigile sur toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés ont été anticipés avant la mise en œuvre du projet. Les vecteurs synthétiques testés possèdent des caractéristiques très précises et un degré de pureté élevé. Des études préliminaires de toxicologie et de biodistribution réglementaires ont déjà démontré la parfaite innocuité et absence de mortalité de ces nouvelles classes de vecteurs synthétiques pour le transport intracellulaire de gènes thérapeutiques. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, un gonflement ou une formation de nodules au site d’injection… Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’injection (intra-musculaire) du vecteur. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le vecteur et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les vecteurs, évaluer leur efficacité, et / ou réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

De manière systématique, les vecteurs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des vecteurs testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, les vecteurs utilisés dans notre étude sont de nature polymérique et ne sont pas capables de délivrer des « gènes thérapeutiques » dans des cellules en culture. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. C’est d’ailleurs par cette approche que cette nouvelle classe de vecteur a été récemment validée et est actuellement en phase de développement clinique chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Un premier tri in vitro a été réalisé afin de ne sélectionner que les vecteurs ayant démontré la meilleure efficacité de transfection. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs, 10 animaux par groupe au maximum ont été prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse après analyse des résultats des études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un analgésique local lors des prélèvements sanguins, et des traitements antalgiques sont prévus en cas d’apparition de signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine. Les observations permettront d'effectuer une estimation de la douleur générée et, le cas échéant, de mettre en place des moyens adaptés pour la soulager de façon appropriée, efficacement et sans interférence avec le protocole (grâce à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées à ce projet). Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de sang).

Choix des espèces

Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents vecteurs seront utilisés.

360 souris et 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit une injection sous-cutanée sur animal vigile, puis des prélèvements de sang sous anesthésie générale sans réveil, avant mise à mort, pour entraîner des stagiaires aux gestes de base de l'expérimentation animale. Le porteur indique que les gestes sont pratiqués par des novices sous supervision, après entraînement sur animaux factices. Il justifie ces travaux pratiques par l'obligation réglementaire de formation "indispensable" à la certification des stagiaires.

Objectifs

Les réglementations française et européenne imposent l’obligation légale de formation de tout applicateur de procédures sur animaux vivants utilisés à des fins scientifiques. L’objectif général de ce projet est de répondre à la nécessité de formation en campus universitaire et de recherche. Cette formation concerne : (i) les étudiants en formation initiale notamment pour leur stage en laboratoire (première et deuxième années de master dans le domaine biomédical) ; (ii) les personnels universitaires et des établissements publics de recherche, en formation continue. Plus précisément, les procédures prévues dans le projet visent à répondre à la demande des autorités nationales de certification de la formation d’inclure dans la partie pratique de la formation la réalisation par les stagiaires de protocoles de base (injections, anesthésie, mise à mort) sur animal vivant.

Bénéfices attendus

À l’issue de leur formation validée, les stagiaires obtiendront une attestation de formation à l’expérimentation animale niveau applicateur, indispensable à leur formation de master et/ou leur projet professionnel. Ils auront eu une expérience concrète de la manipulation et de la contention des Rongeurs (souris et rats) ainsi que de gestes de bases à pratiquer sur animaux vigiles ou anesthésiés, dans le respect des normes éthiques et réglementaires de l'expérimentation animale.

Procédures

Chaque animal sera soumis à 2 interventions, l’une sur animal vigile, l’autre sur animal anesthésié sans réveil. La première intervention, sur animal vigile, est limitée à l’injection sous-cutanée (20 secondes), donc à une douleur légère, et à la manipulation, la contention et l’observation de l’animal associées à l’injection, d’une durée totale de 20 minutes. La seconde intervention consiste en la réalisation des prélèvements sanguins pratiqués sous anesthésie générale profonde, d’une durée maximale de 20 minutes, suivie de la mise à mort sans réveil, donc sans effet douloureux.

Impact sur les animaux

La manipulation par des novices peut être une source additionnelle de stress ou de douleur légère pour les animaux. Cet effet possible est limité par un entrainement préalable des stagiaires sur animaux factices (rat et souris) et par une démonstration faite par un enseignant immédiatement avant la réalisation des gestes sur animal vivant par les stagiaires. De plus, chaque geste pratiqué par un stagiaire est effectué sous la surveillance directe et continue d’un encadrant. Les autres interventions sur les animaux sont menées intégralement sous anesthésie générale sans réveil avant la mise à mort terminale, également sous surveillance d’un encadrant. L’absence de douleur est assurée par le monitorage de la profondeur de l’anesthésie.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux sont mis à mort. La formation approuvée par les autorités nationales de certification de la formation à l’expérimentation animale inclut, durant la session pratique, l’apprentissage des méthodes de mise à mort et la vérification d’absence de signes vitaux, sachant que ces gestes feront sûrement partie des missions de nos stagiaires dans leur futur laboratoire/animalerie

Remplacement

La formation à l'expérimentation animale sur rongeurs et lagomorphes, approuvée par les autorités nationales de certification de la formation à l’expérimentation animale, prévoit 7,5h d’enseignements pratiques, conformément à la réglementation. Sur ces 7,5 h, seules 4 h concernent la manipulation d’animaux vivants. Les stagiaires sont préparés aux séances avec des animaux vivants grâce à des mises en situation sans animaux et des séances sur animaux factices. Il reste néanmoins nécessaire, en fin de formation, de placer les stagiaires en situation réelle et de les former à l’abord de l’animal vivant. Il s'agit d'une exigence ministérielle pour agréer la formation. Cela permet ainsi de garantir la qualité des gestes qui seront appliqués ultérieurement par les stagiaires dans le cadre de leurs activités scientifiques impliquant des animaux. La manipulation d’un rat et d’une souris étant différente, il est nécessaire de former les stagiaires aux particularités de chacune de ces deux espèces.

Réduction

Nous réduisons le nombre d’animaux par séances de travaux pratiques à 1 animal pour 3 stagiaires en veillant à limiter les contraintes et le stress sur les animaux et donc limiter l’atteinte à leur bien-être. Nous réduisons aussi le nombre d’animaux en nous procurant dans la mesure du possible des animaux de réforme (non utilisables pour de la recherche) auprès des fournisseurs.

Raffinement

En amont des procédures proprement dites, le bien-être des animaux et l’absence de stress ou douleur sont assurés lors de l’accueil et de l’hébergement des animaux par : – un hébergement en groupes sociaux stables dans un environnement calme avec un enrichissement adapté à l’espèce. – une période d’acclimatation de 6-8 jours dans la zone de stabulation avant les TP. – une durée des TP limitée à 2h. Durant la procédure proprement dite, la limitation de la douleur, de la souffrance et du mal-être est assurée par : – un entrainement préalable des stagiaires sur animaux factices. – un taux d’encadrement des stagiaires important (1 formateur pour 5 stagiaires et 2 animaux) : chaque manipulation par un stagiaire est supervisée par une personne compétente. – une démonstration par l’encadrant compétent avant toute manipulation par le stagiaire. – des consignes de calme systématique (niveau sonore faible) garantissant un déroulement optimal du TP et de l’anesthésie des animaux. – un seul acte réalisé sur animal vigile : injection sous-cutanée de liquide physiologique au niveau de la nuque (peu douloureux et sans conséquence délétère). – la réalisation des autres actes sous anesthésie analgésique générale sans réveil avec monitorage consciencieux. – le maintien de la température corporelle des animaux à 37°C (valeur physiologique) durant l’anesthésie grâce à un coussin chauffant adapté. – des volumes injectés faibles avec un matériel adapté (taille des aiguilles). – un volume de sang prélevé faible (

Choix des espèces

En France, la souris et le rat sont les animaux les plus fréquemment utilisés à des fins scientifiques (respectivement près de 61 % et 8,7 % des utilisations) (Direction générale de la recherche et de l’innovation - Statistiques nationales, 2021), c’est pourquoi la formation pratique s’appuie sur ces deux espèces. Les stagiaires travailleront sur des animaux adultes (stade le plus couramment utilisé, posologie adaptée, prélèvement de sang plus "facile")