Rongeurs

156 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules de mélanome sous la peau, jusqu'à dix gavages et six injections dans l'abdomen, pour tester une molécule censée resensibiliser les tumeurs aux traitements. Le porteur indique que la tumeur au flanc peut gêner les déplacements et que le gavage peut irriter la trachée. Les retombées pour les patients atteints de mélanome résistant restent formulées comme une perspective, l'objectif immédiat étant de démontrer l'effet de la molécule chez la souris.

Objectifs

Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Nous avons identifié, à travers l’étude de cellules de patient, un gène fréquemment altéré et impliqué dans la résistance aux traitements. Nous avons identifié une molécule capable d'inhiber l'action de ce gène et de resensibiliser les cellules tumorales de patients, initialement résistantes, aux traitements conventionnels. Ce projet a pour but de démontrer chez la souris l’efficacité de cette molécule sur la sensibilité des cellules de mélanome, dans un organisme vivant complexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra potentiellement de mettre en évidence l’effet thérapeutique de notre molécule sur le mélanome et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales, un gavage par jour ou tous les deux jours pendant deux semaines soit 6 ou 10 gavages et pour certains animaux. Certains subiront aussi 6 injections de traitement dans l'abdomen. Tous les animaux seront soumis à de la contention, qui durera moins d'1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra potentiellement les gèner dans leur déplacement. Le gavage peut provoquer une irritation de la trachée, entrainant des difficultés pour l'alimentation. La contention va également leur générer du stress. Aussi, les injections peuvent induire des plaies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole, au maximum 1 mois après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date. Les tumeurs seront récupérées pour être analysées.

Remplacement

Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de notre molécule. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé grâce à des outils statistiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique et moléculaire de la tumeur).

Raffinement

Des points limites précis ont été définis pour identifier le plus précocément possible toute souffrance de l'animal. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et tous les jours lorsque le traitement par gavage débutera. Après traitement, les souris seront suivies 3fois par semaine jusqu'à leur mise à mort. Pour le gavage, nous utiliserons l’excipient CornOil, le moins irritant et le mieux toléré pour la souris. Nous avons également choisi des lignées non métastatiques car nous n'évaluerons pas cette donnée dans nos procédure. Aussi, le phénotype dommageable des souris ne s'exprime pas dans les conditions ventilées de l'animalerie dans laquelle elles sont hébergées.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une puce sous-cutanée, est logé seul pendant deux mois et demi, soumis pour la moitié d'entre eux à un régime gras, puis à des tests comportementaux et à un prélèvement terminal de sang et de cerveau. Le porteur reconnaît que l'isolement crée un stress chez cette espèce grégaire et que les tests peuvent provoquer anxiété et douleur modérée. L'étude cherche à relier chez le mâle et la femelle les effets d'un régime gras sur les rythmes de 24 heures, le métabolisme et la mémoire.

Objectifs

Une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez les souris mâles, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi des altérations des rythmes de 24 h et de la mémoire. Les souris femelles avec un régime gras grossiraient relativement moins que les souris mâles. Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels un régime alimentaire riche en gras modifie la santé métabolique et la mémoire chez des souris mâles et femelles. Notre hypothèse principale est que, chez un même animal, les altérations de la mémoire seront corrélées aux altérations des rythmes de 24 h et du métabolisme. Notre hypothèse secondaire est que les altérations des rythmes de 24 h pourraient être réduites chez les souris femelles, ce qui pourrait se traduire par une résistance métabolique relative au régime gras et à moins de perturbations de la mémoire que chez les souris mâles. AVENANT: Notre hypothèse tertiaire est qu'un accès du régime gras et sucré chronomodulé (c'est-à-dire ici limité à la période habituelle d'alimentation chez la souris) pourrait, comme chez les individus mâles, réduire l'impact nutritionnel sur les fonctions cognitives des souris femelles.

Bénéfices attendus

La nature des facteurs nutritionnels qui modulent les rythmes de 24 h et les liens qui connectent la régulation des rythmes journaliers d'alimentation avec la mémoire sont encore très mal connus. L’identification des mécanismes sous-jacents pourrait permettre d’améliorer la prévention et le traitement des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, ainsi que les altérations de la mémoire par des approches de nutrition prenant en compte les rythmes de 24 h (approches de nutrition chrono-modulée).

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pendant 2.5 mois. La moitié sera nourrie avec un régime alimentaire riche en gras pendant 5.5 mois. Le premier groupe sera exposé à 3 conditions particulières d'éclairement (d'une durée de 2 semaines) pour étudier les rythmes de 24 h. Chaque étape sera séparée par 2 semaines de récupération. Le second groupe sera placé en cage métabolique (5 jours) et soumis à 2 tests comportementaux (l’un de 2 jours et l’autre de 3 jours)), séparés par 2 semaines de récupération. Un prélèvement terminal de sang sera effectué sur tous les animaux, suite à une chirurgie d'environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les souris recevront une puce électronique sous-cutanée, ce qui pourrait provoquer une légère inflammation au site d'injection. Les souris seront gardées en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement. Les tests comportementaux pourront induire de l'anxiété et une douleur modérée. Le régime gras devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l'objet même du modèle expérimental. AVENANT: Le régime chonomodulé devrait limité le surpoids des animaux.

Devenir

L’étude de la rythmicité de 24 h de l’expression des protéines dans différentes structures ainsi que celle des rythmes de 24 h des hormones et des métabolites plasmatiques impliquent la mise à mort des animaux pour prélever en même temps leur cerveau et leur sang.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre rythmes de 24 h et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.

Réduction

Notre suivi longitudinal des animaux exposés à des tests physiolgoiques et comprtementaux succcessifs réduit le nombre d’individus utilisés. Le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire pour 4 temps par 24h) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures. La rythmicité à l'échelle de 24 h sera validée par une analyse statistique adaptée. L'effet d'un régime favorisant le surpoids sera évalué sur les rythmes de 24 h, le métabolisme et sur des tests de mémoire chez la souris mâle et la souris femelle par des analyses statistiques adaptées.

Raffinement

Les souris seront maintenues en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles. Pour limiter ce stress d'isolement chez la souris qui est un animal grégaire, les cages seront ouvertes, de sorte que les animaux garderont des contacts olfactifs et auditifs avec leurs congénères de la même pièce. Un morceau de bois à ronger, du matériel de coton pour faire un nid constitueront un environnement enrichi pour la souris et devrait limiter le stress d’isolement. Avant les tests comportementaux, les animaux seront manipulés régulièrement afin de minimiser leur état relatif de stress. De plus, toutes les souris seront manipulées quotidiennement pendant la semaine précédant les tests comportementaux afin de les habituer à la manipulation et réduire ainsi le stress qui peut y être associé. De même, une attention particulière sera apportée lors des tests comportementaux pour qu’ils se déroulent dans les conditions les plus calmes possibles afin de ne pas perturber les souris, ce qui risquerait d’altérer leurs réponses comportementales. Entre chaque test, un délai de deux semaines sera respecté pour permettre aux animaux de récupérer. Tout au long de la procédure nous ferons un suivi de l'état général de l'animal à l'aide d'une grille de score et nous avons établi des points limites permettant de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

La souris est devenue un modèle animal classique en nutrition et en chronobiologie par l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Une fois ce projet achevé qui permettra d'établir un modèle expérimental, nous pourrons chercher comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris génétiquement modifiées exposées aux mêmes procédures expérimentales. Les souris traitées seront nourries dès le sevrage avec une alimentation riche en gras. Puis les souris seront phénotypées 3 mois plus tard au stade jeune adulte. Ce protocole a été validé chez la souris mâle pour ses effets sur le métabolisme et la mémoire. L'originalité du projet présent est de relier ces fonctions aux rythmes de 24 h et à leurs perturbations, à la fois chez les mâles et les femelles.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs d'une forme de myopathie de Duchenne, ils reçoivent des injections sous-cutanées deux fois par semaine pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire et des tests de force et de respiration, pour évaluer une protéine médicament combinée à une thérapie génique. Le porteur décrit des gestes réalisés sur des rats habitués et une perte de poids limitée, et prévoit une sédation systématique pour l'injection intraveineuse. Il qualifie d'"indispensable" le recours à ce modèle de rat, présenté comme plus fidèle à la maladie humaine que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Les mutations décrites induisent l'absence d'une protéine appelée dystrophine, ce qui conduit à une dégénérescence de l’ensemble des muscles du cœur, de la locomotion et de la ventilation. Le pronostic de la DMD est très sombre, la plupart des jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardio-respiratoire. Il n’existe pas à ce jour de traitement pour la DMD mais des stratégies de thérapie génique visant à la restauration de dystrophine sont prometteuses et en cours d’évaluation. Nous posons l'hypothèse qu’une thérapie préalable induisant un maintien de l’intégrité et de la croissance musculaire amplifierait le bénéfice de ces thérapies géniques, limitées lorsque les fibres musculaires dégénèrent et laissent place à du tissu conjonctif et graisseux, tous deux non contractiles. La protéine médicament testée dans ce projet est un acteur clé du maintien de la masse musculaire en inhibant la dégradation et en stimulant la synthèse protéique. Cette étude a pour objectif d’évaluer le bénéfice de la combinaison protéine médicament / thérapie génique dans un modèle de rat DMD. En cas de validation chez le rat d'un effet synergique des deux approches combinées, la pertinence d’un essai clinique chez les enfants atteints de DMD, encouragée par des résultats précliniques robustes, serait augmentée et le processus sans doute accéléré.

Bénéfices attendus

Nos laboratoires cherchent à identifier des traitements combinés à base de protéine médicament et de thérapie génique pour optimiser la restauration de la fonction perdue dans les muscles dystrophiques. La protéine médicament joue un rôle dans le maintien de la masse musculaire par une potentialisation du processus de nécrose-régénération des fibres musculaires. Nous attendons donc à court terme une synergie protéine médicament/thérapie génique qui optimisera l'efficacité chez le rat DMD de la première génération de médicaments de thérapie génique. À plus long terme et en cas de succès, nous soutiendrons le développement clinique de cette protéine comme traitement utilisable chez le patient DMD en complément des outils de thérapie génique (seconde génération de médicaments).

Procédures

Procédure 1 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous-cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. En fin de procédure, un unique test d’agrippement et une quantification non-invasive du patron ventilatoire seront réalisés (durée totale de 45 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). Procédure 2 (8 semaines) : chaque animal vigile sera injecté par voie sous- cutanée (20 secondes) deux fois par semaine, soit 16 fois. Au cours de la procédure, trois séries d'évaluation non-invasive sur animal vigile seront réalisées à 4 semaines d'intervalle : évaluation de la force d’agrippement, du patron ventilatoire et du rythme cardiaque par ECG (durée totale d’une heure). Une semaine avant la fin de la procédure, ils seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et soumis à une échocardiographie (20 minutes). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés par une injection sous-cutanée (20 secondes) et prélevés au sinus rétro-orbitaire (1 ml de sang). À l'issue du prélèvement, les animaux toujours anesthésiés sont évalués pour la force musculaire de leur muscle tibial antérieur (30 minutes).

Impact sur les animaux

A 5 mois, les conséquences de la maladie impactent très peu la qualité de vie des animaux. Afin de privilégier une méthode la moins invasive possible pour les animaux, nous avons optimisé notre produit et réussi à obtenir des données fiables de pharmacocinétique et d'efficacité en l'administrant par voie sous-cutanée, réalisée avec une aiguille très fine. Le geste réalisé sur des rats habitués est réalisé sans contention ferme, au cours d'un moment d'interaction positive. Les injections répétées en sous-cutané sur un même site d’injection pouvant entrainer l’apparition de granulomes (jamais observés sur nos précédentes cohortes), nous alternerons néanmoins les sites d’injection. L’unique injection intraveineuse sera effectuée dans la veine de la queue chez les rats âgés de 12 semaines (4 semaines au démarrage plus 8 semaines de prétraitement). Pour prévenir une réponse de stress éventuelle des rats en raison de la nécessité de réaliser cette injection sur des rats maintenus quelques minutes dans un tunel de contention, ils seront de façon systématique préalablement sédatés. Si besoin, les plus agités (anxieux) seront en plus légèrement anesthésiés pendant 5 minutes. Tous ces traitements sont parfaitement tolérés par les animaux et maîtrisés. Nous avons montré qu'ils évitent les conséquences perverses d'une réponse de stress exagérée, en particulier les arythmies cardiaques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Ce qui a pu être testé de l'efficacité des composés sans l'usage d'animaux a été réalisé en amont de ce projet. Les composés que nous allons administrer engage leur cible biologique et améliorent la croissance et la survie des fibres musculaires. Leur innocuité dans un organisme mammifère a été validée chez des souris. Cette étape est indispensable pour évaluer l'éventuelle toxicité du produit administré, mais aussi de tous les composés issus de leur transformation par les organes du corps, en particulier le foie. Nous avons préalablement contrôlé que les protéines médicaments étaient bien actives dans des cellules musculaires, et avons réalisé les premières expériences chez la souris modèle (peu sévère) de la DMD. Nous souhaitons aujourd’hui tester l’efficacité de ce traitement combiné dans un modèle dystrophique plus sévère et plus proche de la physiopathologie humaine, le modèle du rat DMD. L’utilisation de ce modèle nous parait indispensable pour évaluer le bénéfice du traitement sur des processus tels que le maintien précoce de la masse musculaire mais aussi la régénération du muscle déjà atteint.

Réduction

Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur le modèle de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons de plus optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. Nous utilisons 8 rats par groupe, ce qui permet d'obtenir des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Additionnellement, les analyses prévues ont toutes été optimisées afin de minimiser le nombre d’anesthésie/injection/stress et dérangement subis par les animaux. Tous les tests pouvant être réalisés lors de la même anesthésie ont été regroupés et les tests réalisés sur animaux réveillés sont également rassemblés afin de limiter le stress et la fatigue induite par le dérangement des animaux pendant leur période de repos.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format).

1 360 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est vacciné puis, 28 jours plus tard, reçoit en six points une injection intradermique de toxine diphtérique pour contrôler l'activité du vaccin, ce qui provoque des érythèmes et un inconfort dans les 48 heures. Le porteur indique qu'aucun antalgique ne peut être administré, faute de données sur son interaction avec l'essai. Il affirme que l'évaluation de l'activité du vaccin exige un "organisme entier" et qu'aucune méthode in vitro n'est disponible.

Objectifs

L'objectif du projet est de vérifier la conformité des vaccins contenant la valence diphtérie vis à vis de leur activité antidiphtérique avant leur libération sur le marché.

Bénéfices attendus

La conformité des résultats d'activité des vaccins pour la valence antidiphtérique est réglementairement nécessaire à la libération des lots de vaccins et donc à leur mise à disposition des patients.

Procédures

6 jours après l'arrivée, chaque lot de cobayes est vacciné par voie sous-cutanée au niveau de l'aine avec une dose de vaccin comprenant la valence antidiphtérique. Cette vaccination dure moins de 30 s par animal. 28 jours après la vaccination, les animaux sont challengés avec différentes doses de toxine diphtérique pour vérifier la protection du vaccin. Pour cela chaque cobaye reçoit en 6 points 6 doses différentes de toxine. L'administration se fait par voie intradermique en 3 points sur chaque flanc préalablement rasé. Les injections de toxine durent environ 2 min par cobaye.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie sous-cutanée n’entraine pas de nuisances visibles ni au niveau du comportement ni de l’aspect des animaux. L'administration de la toxine par voie intradermique 28 jours après n'entraine pas non plus de nuisances visibles au moment de l'injection. On peut néanmoins s'attendre à un léger stress lié à la contention et une douleur modérée pour ces injections. Dans les 48h suivant cette épreuve, les cobayes développent des réactions aux points d'injection sous forme d'érythèmes plus ou moins étendus qui peuvent créer un inconfort.

Devenir

A la fin d'un essai tous les animaux sont euthanasiés car ils ne peuvent être réutilisés en essai.

Remplacement

La réponse immunitaire engendrée par la vaccination nécessite l'organisme entier. A ce jour aucune méthode in vitro n'est disponible pour évaluer l'activité des vaccins diphtériques.

Réduction

Plusieurs stratégies permettent de limiter l'utilisation des animaux : - contrôle en méthode monodose lorsque la méthode a pu être validée, -optimisation des essais : le test de plusieurs lots de vaccins en même temps versus une même référence est privilégié lorsque la programmation des essais le permet -limitation des retests au maximum - mise en place de "reducing": contrôle d'un pourcentage de la production et non de tous les lots pour certains vaccins dont la stabilité de la production a été prouvée.

Raffinement

L'enrichissement mis à disposition des animaux est le suivant: - Mise à disposition permanente de foin compressé - Utilisation de tubes en PVC servant de cachette en semaine, remplacés par des balles les week-ends. En cas d'observation d'anomalies du bien-être, les animaux sont isolés et bénéficient d'une surveillance renforcée. Si l'anomalie engendre une souffrance trop importante, les animaux sont immédiatement euthanasiés. Les médications antalgiques ne peuvent pas être administrées en l'absence de connaissances sur leurs interactions avec l'essai.

Choix des espèces

Le cobaye est le modèle le plus sensible utilisé pour les essais basés sur les réactions dermiques inflammatoires c’est pourquoi il a été retenu par la Pharmacopée Européenne. Les cobayes pèsent entre 250 et 300 g à leur arrivée ce qui correspond à un âge de 4-5 semaines.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles sont infectées par des bactéries après mise en narcose, puis tuées 72 heures plus tard pour un prélèvement sanguin et tissulaire terminal. L'objet est d'étudier la réponse immunitaire à des bactéries responsables de sepsis et de tester une molécule candidate. Le porteur qualifie la souris de modèle "incontournable" et affirme que le recours à l'animal est "inéluctable".

Objectifs

Les infections chez les patients atteints de mucoviscidose ou de la maladie granulomatose chronique (CGD :Chronic Granulomatous Disease) et âgés sont en recrudescence en raison de l'acquisition par les bacteries de mecanismes de resistance aux antibiotiques. C’est particulièrement vrai pour les bactéries P. aeruginosa, B. cenocepacia, C. violaceum ou S. Typhimurium responsables de sepsis. Afin de comprendre et d'étudier les aspects par lesquels ces pathogènes altèrent la réponse immunitaire et la physiologie de l'hôte, nous souhaitons utiliser un modèle d'infection chez des souris sauvages et génétiquement invalidées pour des gènes de la réponse antibactérienne. L'ensemble de ces gènes est commun a l'Homme et la souris. L'utilisation de modèles génétiquement invalides pour des effecteurs de la réponse immune nous permet d'isoler les cibles essentielles quant à l'élimination des bactéries pathogènes par l'organisme mais également de pouvoir, à terme, moduler la réponse antibactérienne de manière appropriée. Compte tenu de la susceptibilité aux infections microbiennes des patients, nous avons identifié́ une molécule qui permet de limiter in vitro les effets inflammatoires induits par les pathogènes. Ce projet vise à la fois à étudier et approfondir les connaissances quant à la dérégulation de la réponse immune mais également évaluer le potentiel anti-inflammatoire et antibactérien d’une molécule prometteuse.

Bénéfices attendus

Dans ce projet nous distinguons deux types de bénéfices : - Scientifique : les connaissances générées seront utiles quant à la compréhension de notre immunité au regard des bactéries étudiées - Santé : Notre molécule pharmacologique d’intérêt pourra démontrer son efficacité quant à la réduction de l’inflammation pathologique induite par ces bactéries dans nos modèles infectieux.

Procédures

Durant cette étude, les animaux seront prétraités à la molécule d’intérêt ou avec l’excipient seul (dose unique pour laquelle l’administration nécessite une dizaine de secondes de manipulation). 3 heures post traitement, après avoir provoqué un état de narcose, les animaux seront infectés. La dose infectante sera administrée en 1 fois. La durée de l’opération est de l’ordre de 30 s. Après infection, les individus seront transférés dans leur cage et le réveil sera vérifié. 72h post infection, tous les animaux seront anesthésiés par injection afin de procéder au prélèvement sanguin terminal et tissulaire.

Impact sur les animaux

Du stress pourra être engendré lors de la préhension et la contention des animaux afin de procéder aux administrations (10 à 30s). Concernant la fréquence des nuisances, il y aura une nuisance modérée due à l’injection unique de bactéries d’une durée de 10 à 30 secondes et une nuisance due à l’injection du traitement d’une durée de 30 secondes. L’infection en tant que telle peut produire une nuisance chronique légère en lien avec la réaction inflammatoire générée durant 3 jours (temps maximal de suivi du protocole).

Devenir

Tous les animaux seront, après anesthésie, mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sanguins et de tissus.

Remplacement

Dans ce projet, nous étudions l'activité anti-inflammatoire et anti bactérienne d’une molécule d’intérêt dans un système complexe. Les études in vitro ont déjà été réalisées sur des cellules de patients et ont montré une activité antibactérienne et anti inflammatoire prometteuse. Il n'existe, aujourd’hui, aucun modèle alternatif et le recours à l’utilisation de l’animal est inéluctable afin d’étudier l’impact des infections au niveau tissulaire et organique.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 1680 souris sera utilisé. Nous utiliserons des cohortes d'individus réduites à la taille minimum afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos tests statistiques à l’aide de modèles murins déjà validés par plusieurs publications au sein de notre équipe, à savoir 10 individus par groupe (7 pour les analyses anti inflammatoires/antibactérienne et 3 pour les analyses histologiques). L’étude sera réalisée en tripliquât afin de reproduire et confirmer les données obtenues.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans une structure zootechnique adaptée et répondant aux normes règlementaires en matière d'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Ils sont hébergés selon les normes réglementaires et éthiques en vigueur et bénéficient d'un enrichissement pendant la stabulation. Une surveillance quotidienne des animaux et une inspection de leur état général (posture, pelage) seront effectuées tout au long de l'expérience par des membres du personnel formés de l'équipe zootechnique et par le personnel de l’équipe scientifique, Nous disposons d’une structure en charge du bien-être animal avec un vétérinaire, qui assiste les expérimentateurs notamment pour gérer le stress et/ou la douleur des animaux.

Choix des espèces

La mise en place d'un modèle d'infection pulmonaire est extrêmement développé chez la souris adulte car le modèle murin (de par son utilité, sa versatilité, la présence de modèles génétiques proches de l'humain et les équipements scientifiques disponibles) demeure alors incontournable. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique un grand nombre des observations faites chez l’humain. De plus, de par la présence de nombreux outils génétiques développés chez la souris, la diversité des modèles utilisés ne peut être obtenue que dans l’espèce murine. Cependant les modèles cellulaires sont couramment utilisés au sein de notre laboratoire et constituent un préalable avant la mise en place de modèles animaux. Néanmoins, ces modèles cellulaires sont limités quant à l'information obtenue sur la complexité et l'intégration de la réponse immune dans son ensemble.