Rongeurs
Etude collaborative de l’impact de l’insuffisance cardiaque sur la sévérité du Covid 19 et de l’efficacité de son traitement chez la souris (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque de près de deux heures provoquant un infarctus et une insuffisance cardiaque, puis une infection intranasale par le SARS-CoV-2, entre deux établissements reliés par transport. Le porteur veut mesurer l'effet d'une maladie cardiaque sur la gravité du Covid et l'efficacité d'antiviraux, en reconnaissant des preuves existantes "contradictoires". Il répète que l'objectif ne peut être atteint sans modèle animal et invoque la "nécessité" de l'étude in vivo.
Objectifs
Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.
Procédures
Au préalable, les animaux transgéniques sont genotypés et identifiés par la méthode de biopsie de phalange, réalisée entre le 7ème et 10ème jour de vie des souriceaux. Au sein de l’établissement EU1/2, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines postopératoire (20 min). Au sein de l’établissement EU 2/2, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo en injection intranasale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des perfusions et prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).
Impact sur les animaux
Il n’a pas été identifié d’effet indésirable court-terme ou long-terme conséquent à la biopsie de phalange telle que réalisée en routine dans l’établissement. Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2/2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.
Devenir
La mise à mort des animaux est justifiée par la nécessité de procéder à des prélèvements incompatibles avec le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie. De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test »), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe sociaux et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et la mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.
Mesure de biomarqueurs d’imagerie cérébrale en IRM haut champ dans des modèles murins de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie intracrânienne pour détruire localement la myéline, ou une immunisation induisant une encéphalomyélite avec parésie et paralysie progressive des membres, suivies de séances d'IRM sous anesthésie. Le porteur met au point des biomarqueurs d'imagerie de la sclérose en plaques et affirme que la paralysie "n'entraîne pas de douleur en soi". Il conclut que l'étude de la pathologie ne peut être remplacée par des systèmes in vitro fiables.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d’évaluer et de mettre au point des mesures par imagerie de résonance magnétique, technique non invasive, à très haut champ magnétique pour le suivi des atteintes de la gaine protectrice des neurones, la myéline, telles celles que l’on observe chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie neurologique. Deux modèles de souris présentant des lésions dans la gaine de myéline seront utilisés: le modèle LPC, Lysophosphatidycholines, pour lequel la lésion est localiséeet le modèle EAE, Experimmental Autoimmune Encephalomyelits, pour lequel les lésions sont plus petites et réparties dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à établir de nouvelles méthodes de mesure par imagerie pour le suivi de la dynamique de la détérioration/reconstitution de la gaine de myéline –protectrice des neurones- chez les sujets atteints de sclérose en plaques au cours de la maladie. Ces phénomènes doivent être davantage explorée, à un moment où des thérapies innovantes pour aider à la reconstitution de la gaine de myéline doivent être évaluées cliniquement. De plus, la mise au point de biomarqueurs d’imagerie non invasive réalisée dans ce projet représente un bénéfice pour les futures études thérapeutiques sur le petit animal puisque l’imagerie permettra le suivi du même animal et donc de réduire le nombre d’animaux.
Procédures
Modèle LPC, Lysophosphatidylcholines, une chirurgie intracranienne pour détériorer localement la gaine de myéline des neurones pour mimer la sclérose en plaque. Une seule chirurgie sur l'animale. 4 sessions d'IRM de 2h sur 3 mois. Modèle EAE, Experimental autoimmune encephalomyelitis, obtenu par immunisation sous cutanée et injection par voie intraveineuse rétro-orbitale faites sous anesthesie gazeuse. 4 sessions d'IRM sous anesthesie de 2h sur 3 mois.
Impact sur les animaux
La démyélinisation focale au LPC nécessite une chirurgie, injection stéréotaxique, durée inférieure à 1h, et n’engendre pas de signes cliniques persistents. Seule la cicatrisation post-chirugie est à surveiller et seuls les animaux ayant complètement récupéré et cicatrisé seront éligibles au suivi par IRM haut-champ, réalisé sous anesthésie générale, 4 sessions de 2 h maximum réalisées sur 3 mois. Pour le modèle EAE, un altération de l’état général de l’animal est attendu avec un score clinique maximal généralement entre 15 et 25 jours après l’induction de l’EAE, suivi d’unerémission partielle. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère, injections i.v. à moyenne, symptômes cliniques de l’EAE et il existe une gradation des symptômes allant de la queue molle; au réflexe de redressement avec facultés affaiblies et parésie d'un membre à la paralysie des membres postérieurs et ou antérieurs. La procédure complète est de classe de gravité moyenne. Il est nécessaire de préciser que la faiblesse ou la paralysie des membres n’entraîne pas de douleur en soi, mais plutôt une gêne pour l’animal dans ses déplacements, à l’instar de la pathologie humaine.
Devenir
Ils seront mis à mort à différents temps en vue de réaliser des mesures histologiques post-mortem.
Remplacement
À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables. Nous utiliserons des modèles de pathologies très bien décrits dans la littérature, ce qui permettra un suivi précis de la sévérité de la maladie. L’animal vivant est nécessaire pour valider un biomarqueur d’imagerie avant som implémentation en clinique, dans une démarche de recherche translationnelle
Réduction
Pour chacune des procédures expérimentales, le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et interprétables, en tenant compte de la variabilité biologiques des modèles animaux. Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet est de 40. Le suivi longitudinal effectué en imagerie permet d’obtenir jusqu’à 4 points de mesure par animal pour suivre les phases de démyénisation et remyélinisation sans mise à mort intermédiaire des groupes supplémentaires d’animaux.
Raffinement
Les points limites qui permettront d'arrêter le protocole sont les suivants: cicatrisation de la plaie crânienne, changement de poids corporel , apparence physique i.e. pelage, posture et comportement (vocalisations non sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile). L'arret des souffrances si elles sont constatées se fera par traitement antalgique ou par euthanasie des animaux concernés.
Choix des espèces
L’IRM haut champ ne peut accueillir que des petits animaux de type rongeur. Nous avons réalisé une première étude sur rat du fait d’un cerveau plus grand que la souris ce qui a facilité la mise en œuvre des techniques IRM avec des volumes à explorer plus gros. L’objectif étant d’étudier les pathologies cérébrales, les procédures de cette demande se feront chez la souris afin d’étudier notamment le modèle de sclérose en plaques EAE modèle pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes de la sclérose en plaques. Animaux adultes ayant un développement cérébral achevé (7-10 semaines).
Activité physique et neurogénèse comme facteur protecteur des effets délétères de la surconsommation de sucre à l’adolescence sur le cerveau et le comportement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
346 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie cérébrale d'une heure, un isolement en cage individuelle et une surconsommation forcée de sucre à l'adolescence, avant des analyses post-mortem. Le porteur cherche à montrer que l'activité physique protège le cerveau des effets du sucre, en présentant les retombées comme des arguments pour de futures campagnes de prévention. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier un tel comportement.
Objectifs
Dans le présent projet, nous souhaitons tester l’hypothèse selon laquelle une activité physique qui favorise la production de nouveaux neurones, pourrait avoir des effets protecteurs et/ou thérapeutiques sur les effets délétères du sucre consommé en excès à l’adolescence et d’en demontrer le rôle de cause a effets par des manipulations neurobiologiques de cette neurogénèse.
Bénéfices attendus
La surconsommation de sucre au cours d’une période vulnérable de développement du cerveau qu’est l’adolescence, induit des effets délétères à l'âge adulte (dépression, perte de motivation, anxiété...). Ce projet combine approches environnementale (activité physique) et neurobiologique (cibler des populations de nouveaux neurones spécifiques) pouvant potentiellement remédier à ces pathologies. D'une part, la démonstration qu’une surconsommation de sucre à l’adolescence entraîne un déficit de nouveaux neurones, spécifiquement créés pendant cette periode, serait une donnée essentielle pour alimenter les campagnes luttant contre les mauvaises habitudes alimentaires chez les jeunes. D’autre part, la démonstration que l'augmentation de production ou d'activité de ces nouveaux neurones puisse remedier à ces déficits comportementaux à l’âge adulte, permettrait également de proposer des approches thérapeutiques et de remédiation naturelle. Une démonstration causale entre activité physique, stimulation de nouveaux neurones créés pendant l’adolescence et remédiation des déficits, serait une avancée majeure pour les neurosciences.
Procédures
Dans ce projet, 262 rats subiront une intervention chirurgicale pendant 1 heure. 134 rats recevront également un entraînement comportemental pendant 30 minutes pour toute la durée de l'apprentissage et le test (entre 20 et 40 jours). 20 rats vont passer pour les test GTT et ITT deux fois ; chaque fois, on va faire 7 prélèvements avec a chaque fois d’une goutte du sang prelevée pendant 1 seconde a fin de mesurer la glycémie. Tous les rats (346) seront isolés 16 jours pendant la surexposition au sucrose et 4 semaines pendant l’exercice physique (256). Tous les rats seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir un stress du à l'isolement en cage individuelle ou en roue d'activité, ceci sur des périodes courtes allant de 16 jours à 4 semaines. Les étapes de chirurgie peuvent entraîner quant à elles des douleurs, et dans de rares cas des infections. Les prélévements du sang peuvent entraîner de douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
De plus en plus d’études utilisent le modèle animal pour modéliser certaines pathologies chez l’homme. Les nombreuses similitudes entre les humains et les animaux en termes de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que certaines caractéristiques neuronales et hormonales permettent de justifier l’utilisation du modèle animal comme outil dans de nombreuses études. En effet, il est impossible de retrouver ces pathologies, ces caractéristiques ou la realisation d'activité physique chez un modèle in vitro ou informatique. Le modèle animal est pour cela le modèle le plus adapté.
Réduction
Dans le but de diminuer le nombre d’animaux, les expériences seront conduites uniquement chez des mâles. Un effectif maximum de 10 animaux par groupe est nécessaire pour nos analyses statistiques afin de s'abstenir de la variabilité interindividuelle. Un même groupe contrôle est utilisé pour 2 thématiques dès que cela est possible.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives (2 rats par cage maximum) dans un milieu enrichi (litière cellulose, papier ouaté, bâton à ronger, nid compact) (sauf pendant les périodes d’accès aux roues, les roues étant en elle-même un enrichissement). La surveillance des animaux est réalisée de façon quotidienne. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites ci-dessous : - perte de poids de 15% sur trois jours - automutilation - développement de plaies ou d'infections - poil mal entretenu ou aspect général anormal - changement de comportement (particulièrement la prostration) - activité cardiorespiratoire ralentie ou accélérée En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées. En cas de perte de poids, l'animal peut être réhydraté si besoin par injection sous-cutanée de saline ou saline-glucose. On peut également déposer des miettes humides issues de la nourriture habituelle directement dans la cage. En cas de douleur évidente, une injection d'analgesic est réalisée et peut être renouvelée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le responsable du projet sera averti et prendra la décision de la nécessité de mise à mort de l'animal. En post-opératoire, les animaux sont gardés sur tapis chauffant jusqu’à leur réveil avant de retourner dans leur pièce de stabulation. Ils reçoivent une injection d'analgesic toutes les jours pendant 3 jours. Les sutures sont désinfectées et surveillées. Pour éviter la douleur pendant le prélèvement, un anesthésique local va être administrée avant le procédure.
Choix des espèces
Notre projet de recherche implique une expérimentation chez le rat, qui constitue pour les neurobiologistes un support indispensable à l'étude de l'organisation et du fonctionnement du système nerveux central en situation normale mais également, et surtout, en situations expérimentales ou pathologiques. L'ensemble de nos travaux considère l'animal in vivo, et met à profit différents protocoles comportementaux développés et codifiés depuis de nombreuses années chez ces espèces, et irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau des rongeurs est proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus dans ces conditions permettent de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre de surconsommation de récompenses. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 28 jours, ce qui correspond à l'entrée dans la phase d'adolescence.
Etude chez la souris de la pharmacocinétique et de la biodistribution d’un nouveau traitement, pour le traitement de maladies dégénératives telles que la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de tauopathie, elles reçoivent une molécule radiomarquée puis sont mises à mort par exsanguination pour prélever leurs organes et mesurer la distribution du composé dans l'organisme. Le porteur situe ce travail en amont d'une future étude d'efficacité et d'un dossier clinique, présentés au conditionnel. Il affirme que la souris est la seule espèce mammifère modifiable pour exprimer la maladie d'Alzheimer et juge son usage "indispensable".
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale en vue d’une application en santé humaine. Les objectifs du projet sont de compléter un programme initial de développement de nouvelles thérapies pour le traitement des tauopathies telles que la maladie d’Alzheimer. Un nouvel agent a en effet permis de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle de souris malades. En utilisant maintenant une version de la molécule associée à un traceur radioactif (molécule radiomarquée), nous souhaitons évaluer les paramètres pharmacocinétiques de cette molécule et déterminer sa biodistribution dans l’organisme de la souris par imagerie. L’ensemble de ses informations sont nécessaires afin de sélectionner la dose et la voie d’administration pour mener par la suite une étude d’efficacité thérapeutique de la molécule.
Bénéfices attendus
Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies, ensemble de maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans les neurones d’agrégats toxiques de la protéine Tau, et dont la plus connue est la maladie d'Alzheimer. Cette étude intervient dans le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de définir l’action d’une nouvelle classe de composés à visée thérapeutique sur les tauopathies en étudiant leurs paramètres pharmacocinétiques et de biodistribution dans un organisme entier afin de pouvoir initier la mise en place d’un premier dossier clinique pour démarrer des essais cliniques chez l’humain.
Procédures
Un opérateur spécialisé réalisera une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse ou une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sera réalisé par animal sous analgésie et anesthésie chimique générale puis les animaux seront mis à mort par exsanguination afin de prélever les différents organes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure car l’étude de la biodistribution de la molécule nécessite de prélever les organes.
Remplacement
De premières manipulations réalisées en laboratoire sur des cellules de neurones ont permis de diminuer les taux des protéines impliquées dans le développement la maladie d’Alzheirmer. Cependant, la maladie d’Alzheirmer est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qu’il est possible de modifier génétiquement pour qu’elle exprime cette maladie, il est donc indispensable d’utiliser ces animaux pour développer des médicaments utilisables chez l’homme par la suite.
Réduction
Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse. Pour l’étude des tissus par imagerie, nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux par groupe (n=10 : 5 mâles et 5 femellesDe plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, seule la dose de la molécule et la voie d’administration optimales sélectionnées à l’issu des expériences sur les souris saines seront testées sur les souris développant la maladie d’alzheimer.
Raffinement
La douleur engendrée lors des administrations est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Les prélèvements présentent une douleur potentiellement plus importante, ils seront donc réalisés sous analgésie et anesthésie chimique générale. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H de la manipulation et donc au moment même de l’apparition du moindre problème.
Choix des espèces
La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qui peut être modifiée génétiquement pour modéliser la maladie d’alzheimer. (Ce modèle est disponible chez les éleveurs agréset est reconnu par la communauté scientifique, il a déjà été utilisé dans de nombreux projets scientifiques et est bien caractérisé. Les études de pharmacocinétique seront réalisées chez la souris, portant un fond génétique proche des souris porteuses de la maladie. Nous utiliserons des souris adultes car dans ce modèle la phase précoce de la tauopathie, apparaît entre 2,5 à 4 mois. Le projet prévoit l'utilisation des 2 sexes (même nombre d'animaux dans les deux sexes), la tauopathie étant décrite pour se développer de manière légèrement différente chez les mâles et les femelles dans le modèle.
Evaluation immunologique de différentes structures d’ARNm sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections de formulations d'ARN messager, un rappel à trois semaines et des prélèvements sanguins submandibulaires répétés, avant d'être tuées deux mois après la première injection. Le porteur compare douze structures d'ARN messager pour améliorer les vaccins et affirme que l'usage de l'animal est "indispensable", faute de système reproduisant l'interaction avec l'organisme. Il présente comme seul impact la douleur de la piqûre.
Objectifs
Le projet consiste en l'augmentation de l'efficacité de la vaccination parARN. Nous voulons comparer différentes structures d’ARNm. Les fins thérapeutiques sont la vaccination ARNm. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des ARNm de différentes structures avec l’organisme. De tels résultats ne peuvent pas être obtenus par des expériences in cellulo. C’est pour cette raison que l’utilisation de modèle animaux est indispensable pour évaluer l’impact des différentes structures d’ARNm sur la traduction des ARNm in vivo et la génération d'anticorps dirigés contre l'antigène codé par l'ARNm. Dans ce projet, nous allons tester 12 différentes structures d’ARNm pour maximiser l’expression de l’ARNm in vivo. L'optimisation des séquences d'ARNm permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point des vaccins ARNm plus efficaces après injection intramusculaire ou intraveineuse.
Procédures
Les souris seront anesthésiées sous anesthésie gazeuse durant les injections intramusculaire (50µL) ou intraveineuse (200µL) des formulations ARNm. Les souris seront injectées à jour 1 avec un rappel à 3 semaines. Nous prélèverons le sang à J0, J7, J14, J21 et J28 au niveau submandibulaire (20µL avec alternance droite-gauche) pour quantifier les anticorps induits par test ELISA.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à une douleur suite à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de l'injection liée à l'aiguille.
Devenir
tous les animaux seront mis à mort 2 mois après la première injection, délai suffisant pour évaluer la production d'anticorps.
Remplacement
L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.
Réduction
l’effectif des souris mis en oeuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les différentes structures d'ARNm seront évaluées par prélèvements de sérum sur les mêmes animaux au cours du temps ce qui permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques.
Raffinement
les méthodes utilisées seront mises en oeuvre par du personnel formé (niveau chirurgie) et les points limites prédictifs. Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivé. Ils seront hébergés dans une animalerie confinée dans des cages de type 2 à cinq souris par cage. Les cages contiendront un enrichissement qui sera soit un tube en carton, soit un cylindre opaque soit une petite maison transparente pour souris.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage des nstructures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.
Régulation épigénétique de l’expression du récepteur de la LH dans les cellules de la granulosa : évaluation du rôle de la lysine déméthysase KDM1A
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
58 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne sous anesthésie locale cinq jours sur sept pendant un mois, avant que leurs ovaires soient prélevés. Le porteur étudie une protéine qui modifie l'ADN et son rôle dans l'expression d'un récepteur qu'il qualifie d'"indispensable" à la fertilité, les applications thérapeutiques restant renvoyées au long terme. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité de l'ovaire au cours du cycle.
Objectifs
La fertilité de la femme est régulée par des hormones qui vont agir au niveau de différentes cellules de l’ovaire en se fixant sur des molécules spécifiques qu’on appelle des récepteurs. La régulation de l’expression de ces récepteurs au cours du cycle est cruciale pour assurer la fertilité de la femme. Des modifications de l’ADN au niveau des gènes de ces récepteurs permettent de réguler leur expression mais les protéines impliquées dans ces modifications ne sont pas connues. Au laboratoire nous avons observé une expression aberrante d’un récepteur normalement exprimé dans l’ovaire, dans des tumeurs de la glande surrénale. Nous avons montré que cette expression anormale est liée à l’absence d’une protéine spécifique qui est capable de modifier l’ADN. Cette protéine est aussi présente dans les cellules de l’ovaire qui expriment un récepteur nécessaire à la fertilité mais son rôle n’est pas connu. L’objectif de ce projet est de déterminer si dans l’ovaire, cette protéine qui modifie l’ADN permet la régulation de l’expression d’un récepteur nécessaire à la fertilité.
Bénéfices attendus
L’inhibition pharmacologique de l’activité de la protéine qui modifie l’ADN va permettre le tester l’hypothèse de son implication dans l’ovaire dans la régulation de l’expression du gène d’un récepteur indispensable à la fertilité chez la femme. A ce jour les molécules impliquées dans ce processus ne sont pas connues. A plus long terme, cela pourra ouvrir sur des stratégies thérapeutiques dans des pathologies où l’expression de ce récepteur est altérée comme dans certaines formes de syndrome des ovaires polykystiques (SOPK).
Procédures
Les animaux recevront une injection sous anesthésie locale d’une durée de 2 min 5 jours/7 pendant 30 jours.
Impact sur les animaux
La manipulation quotidienne des animaux pour les injections (5 jours/semaine) pourra générer un stress. Pour le limiter, l’injection sera réalisée par un personnel expérimenté avec du matériel stérile afin d’éviter les complications associées à ce geste, et sous anesthésie locale par crème lidocaïne. Une prise de poids en fonction de l'âge moins importante pourra être observée dans le groupe de souris recevant le traitement (nous estimons cette différence entre 10 et 20 % par rapport à un animal recevant un placebo).
Devenir
A l’issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les ovaires seront prélevés pour les différentes expérimentations.
Remplacement
L’ovaire est un système complexe composé de cellules de la reproduction et d’autres cellules qui communiquent entre elles. Il n’existe pas de modèle cellulaire qui permette de reproduire ce qui se passe dans l’ovaire. Le récepteur nécessaire à la fertilité que nous étudions est exprimé dans différentes cellules de l’ovaire en fonction du cycle. Notre étude nécessite d’étudier la temporalité de l’expression de ce récepteur et de la protéine qui modifie l’ADN en fonction du cycle. Il n’est donc pas possible d’utiliser une lignée de cellulaire.
Réduction
Il est essentiel d'utiliser le plus petit nombre d'animaux possible sans nuire à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a donc été intégrée à la construction du projet. En utilisant un calcul de puissance, nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe pour avoir des résultats exploitables statistiquement. Ce nombre minimal est de 12 animaux/groupe pour la procédure. Nous limitons ainsi le nombre d’expériences et de souris.
Raffinement
- Les conditions d’élevage et d’hébergement seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux : cages adaptées à l’animal et à sa taille en maintenant les animaux par deux minimums dans chaque cage, et par enrichissement du milieu par copeaux de bois/tunnel en carton et cabanes. * Souris : 5 animaux par cage au maximum - Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaître les points limites précoces qui ont été définis. - Les animaux seront pesés de façon hebdomadaire pour vérifier l’innocuité du traitement - Une anesthésie locale par crème lidocaïne sera utilisée pour les injections IP.
Choix des espèces
La souris est un animal dont les étapes de la physiologie ovarienne sont bien établies. Les souris femelles seront utilisées à 8 semaines, un stade où elles sont pubères et où tous les stades de développement folliculaire seront présents dans l’ovaire.
Rôle du système rénine-angiotensine au cours de la spermatogenèse chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souriceaux subissent l'amputation d'une phalange pour identification, puis les mâles une hémicastration sous anesthésie avant une mise à mort par perfusion d'un fixateur sous anesthésie profonde. Le porteur étudie le rôle d'un gène dans la spermatogenèse et attend une stérilité des mâles mutants, qu'il présente comme non douloureuse. Il affirme que ce système physiologique complexe rend le remplacement par un modèle in vitro "impossible".
Objectifs
Le système rénine-angiotensine (SRA) est un système hormonal connu principalement pour son rôle dans le maintien de la pression artérielle. Des travaux ont néanmoins démontré l’implication du SRA dans d’autres processus biologiques, comme par exemple la spermatogenèse. Le SRA met en jeu ATP6AP2, qui est une protéine trans-membranaire essentielle au développement embryonnaire et au fonctionnement de nombreux organes. Chez l’Homme, le gène Atp6ap2 est exprimé dans le testicule ; il l’est également chez la souris dans les cellules de Sertoli (les cellules somatiques du testicule). Nous avons observé que l'expression de Atp6ap2 est diminuée suite à l'altération de la voie de signalisation de l'acide rétinoïque. Le gène Atp6ap2 pourrait donc être contrôlé par l’acide rétinoïque et jouer un rôle primordial dans la spermatogénèse. Nous proposons d’utiliser une approche génétique pour comprendre le rôle du gène Atp6ap2 dans la spermatogenèse. Nous créerons pour cela une lignée de souris mutantes dans laquelle nous inactiverons ATP6AP2 dans les cellules de Sertoli. Les souris mutantes seront porteuses d’une mutation spécifique des cellules de Sertoli affectant uniquement le fonctionnement testiculaire et leurs contrôles seront des souris dans lesquelles le gène codant ATP6AP2 est normal. Les protocoles mis en œuvre permettront une analyse phénotypique morphologique et moléculaire. Les observations ainsi obtenues permettront d’identifier le rôle d’Atp6ap2 dans l’altération de la voie de signalisation de l’acide rétinoïque.
Bénéfices attendus
Ce projet augmentera nos connaissances quant au rôle de l’acide rétinoïque et à celui du système SRA dans la physiologie du testicule et la différenciation des spermatozoïdes. Chez l’Homme, des altérations du système rénine-angiotensine sont associées à un risque accru de maladies cardiovasculaires, de retard mental, ou d’épilepsie. L’identification et la caractérisation d’un phénotype testiculaire supplémentaire ainsi qu’un lien avec la voie de signalisation de l’acide rétinoïque, pourrait mieux faire comprendre l'étiologie des maladies liées au SRA ce qui pourrait potentiellement améliorer le diagnostic, le traitement ou le développement de thérapies.
Procédures
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). - Phalangectomie (avant l’âge de 10 jours) sur animaux vigiles pour identifier les animaux et prélever la biopsie. Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’une molécule (à 8-10 semaines) pour suivre l’évolution d’une cellule (traceur). Réalisée 1 fois dans leur vie. - Administration d’analgésique (15 minutes avant l’hémicastration). Réalisée 1 fois dans leur vie. - Hémicastration (2 heures après l’administration de traceur). Anesthésie gazeuse de l’animal dans une boîte à induction en plexiglas puis sous un masque (narcose en 2 à 3 minutes). La chirurgie (incision/prélèvement/suture) prend 10 minutes. Reprise de l’activité normale généralement observée en 15 minutes. - Administration de sérum physiologique (post-chirurgie). Réalisée 1 fois en fin de chirurgie. - Administration d’analgésique (post-chirurgie). Réalisée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. - Administration d’anesthésique/analgésique (à partir de l’âge de 8 jours) en dose létale pour perfuser un fixateur histologique. Etape finale réalisée 9 ou 18 jours après l’hémicastration. Les souris sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Nous allons générer des souris porteuses d’une mutation restreinte à un type cellulaire du testicule et aucun phénotype dommageable n’est attendu ; le phénotype attendu se limitant à une stérilité non obstructive chez les mâles (Atp6ap2Ser-/Y). La phalangectomie qui sera réalisée pour identifier et génotyper les animaux sera réalisée avant l’âge de 10 jours (âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées). Au cours du projet, nous privilégierons, dès qu’elles seront disponible, des techniques d’identification moins invasives et adaptées à une identification précoce de nos modèles d’étude. L’administration de substances (traceur cellulaire, anesthésique, sérum physiologique ou analgésique) entraine une douleur équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille sous la peau. En ce qui concerne l’hémicastration, elle entraîne une douleur équivalente à une chirurgie avec laparectomie et sera donc réalisée sous anesthésie et analgésie. Elle peut également entrainer une douleur les jours qui suivent mais aussi une perte hydrique, une sécheresse oculaire, une perte de poids et une hypothermie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les testicules.
Remplacement
Notre étude vise à élucider la fonction testiculaire d’un gène impliqué dans le système hormonal rénine-angiotensine, dans le système physiologique complexe qu’est la spermatogénèse. Celle-ci faisant intervenir plusieurs types cellulaires, seule une approche expérimentale utilisant le modèle animal permettra de répondre à nos questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux requis est calculé au plus juste pour satisfaire aux exigences de réduction du nombre d’animaux utilisés tout en assurant la qualité des résultats obtenus et la robustesse de leur validité statistique. A chaque stade de la spermatogénèse, nous comparerons et analyserons 3 mâles contrôles et 3 mâles mutants pour les analyses morphologiques ainsi que 10 mâles contrôles et 10 mâles mutants pour les analyses moléculaires. La stratégie des accouplements permet d’obtenir la moitié des animaux contrôles et l’autre moitié des animaux mutants. Etant donné que notre travail porte sur l’étude de la spermatogenèse, seuls les mâles serviront pour l’expérimentation. Les deux testicules seront le plus souvent fixés différemment et utilisés pour deux voire trois types d’analyses, ce qui répond parfaitement à une réduction du nombre d’animaux en accord avec le 2e R de la règle des 3R.
Raffinement
Dans le souci du bien-être des animaux, une surveillance de leur état de santé et des soins appropriés (analgésie) seront réalisés si nécessaires. Dans le cadre de souffrance ou d’altération du comportement des animaux des mesures correctives nécessaires seront prises rapidement en concertation avec les responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Les animaux générés sont mutés dans les cellules de Sertoli du testicule ce qui n’induit aucune souffrance car le phénotype attendu se limite en une stérilité des mâles. La douleur due à la biopsie de phalange pour identification des animaux est minimisée car elle sera réalisée avant l’âge de 10 jours après la naissance, âge auquel les fibres nerveuses sont non myélinisées et les doigts des souriceaux sont séparés. Nous prendrons aussi soin de n’amputer que la phalange distale d'au maximum un doigt par patte hormis le pouce. Lors du recours à l’hémicastration, la douleur générée sera minimisée par l’administration d’un analgésique en amont de l’acte chirurgical. L’animal sera surveillé durant sa phase de réveil et placé dans une litière propre additionnée d’un nid en fibres végétales sur une plaque chauffante afin de faciliter sa thermorégulation et dans le but de diminuer son stress. Pour faciliter sa réhydratation une injection de sérum physiologique sera réalisée à la fin de la chirurgie et de la nourriture sous forme de gel sera mise à disposition au fond de la cage si nécessaire. Le raffinement (3e R de la règle des 3R) est donc appliqué dans notre projet.
Choix des espèces
La petite taille de la souris, ses nombreuses ressemblances génétiques avec l'Homme, et les facilités de modification de son génome, fait d’elle un excellent modèle pour appréhender la physiopathologie des maladies humaines. Nous avons choisi une approche de génomique fonctionnelle pour laquelle la souris est particulièrement bien adaptée (possibilité de réaliser des mutations dans le génome : temps de génération court ; génome connu, outils moléculaires). D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant le système rénine-angiotensine sont conservés chez l’Homme. La spermatogenèse est un processus de différenciation et de maturation qui se met en place depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte et qui continue d’évoluer quand la souris vieillit. Il est donc nécessaire d’étudier si toutes les étapes se déroulent correctement et à un rythme normal. Nous analyserons pour cela des animaux à différent stades (10, 15, 20, 25, 35 jours 8-10 semaines et 1 an).
Impact de l’isolement social sur le comportement de rechute à la cocaïne : Rôle du circuit cortico-habénulo-mésencéphalique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont isolées socialement pendant 24 heures ou six semaines, reçoivent des injections de cocaïne et subissent des chirurgies, des tests comportementaux et des prélèvements sanguins submandibulaires que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des hémorragies et des lésions de l'os maxillaire. L'objectif est d'étudier l'effet de l'isolement sur la rechute à la cocaïne, les retombées thérapeutiques et sociales restant énoncées comme des perspectives. Le porteur qualifie le modèle murin d'"incontournable" en neurosciences et juge "indispensable" de travailler sur un animal "entier".
Objectifs
En Europe, les troubles d’usage de substances psychoactives représentent un problème majeur de santé publique, avec environ 83,4 millions d’adultes, soit 29% de la population européenne, ayant consommé une ou des substances psychoactives au cours de l’année écoulée. Parmi ces substances, l’usage de cocaïne est en constante augmentation, notamment en raison d’une importante production massivement importée (64.000 saisies représentant 213 tonnes pour l’année 2019), qui conduit à la banalisation de son usage et le développement de comportement d’addiction. Un aspect important de cette pathologie est le risque élevé de rechute lorsque les usagers essayent d’arrêter ou simplement de contrôler leur consommation. En effet, parmi les patients pris en charge pour troubles d’usage de cocaïne, 50% ont déjà été pris en charge antérieurement pour le même trouble. Bien que les travaux de recherche fondamentale et clinique aient apporté de solides connaissances sur les mécanismes mis en jeu lors de la transition entre un usage récréatif et les troubles de l’usage, la compréhension des phénomènes de rechute reste limitée. Entre autre, l’environnement social des consommateurs semble pouvoir à lui seul participer au phénomène de rechute. Notamment, une majorité de consommateur indique souffrir d’un isolement social et d’un sentiment de solitude qui pourraient être, en partie, à l’origine des comportements de rechute. Dans ce contexte, ce projet vise à évaluer, dans un modèle murin, l’impact de l’isolement social aigu (24 heures) et chronique (6 semaines) sur les comportements liés à la cocaïne et en particulier le comportement de rechute.
Bénéfices attendus
Ce projet a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la manière dont notre système nerveux fait face et s'adapte à l'isolement social et sur la manière dont les conditions sociales peuvent participer aux troubles liés à l'utilisation de substances psychoactives, notamment la cocaïne. Cet aspect fondamental aidera à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Par exemple, au niveau préclinique, notre étude apportera de nouvelles cibles neuroanatomiques pour les protocoles de stimulation magnétique transcrânienne afin de traiter certaines des conséquences de l'isolement social. En ce qui concerne les applications sociales, ces travaux aideront également les acteurs sociaux à mieux communiquer avec les personnes souffrant de troubles liés à l'usage de substances et leur famille en expliquant comment les conditions sociales peuvent aider ou aggraver leur(s) trouble(s). Ainsi, à terme, ces travaux pourraient avoir un impact positif direct sur la vie quotidienne des personnes souffrant d’isolement social et/ou de troubles de l’usage de substances et un impact économique indirect en réduisant les troubles associés à l’isolement social et en améliorant la qualité de vie de patients atteints de troubles de l’usage de substances.
Procédures
Le but de ce projet est d’étudier l’effet de l’isolement social sur les comportements d’addiction. Ainsi trois groupes de de souris seront utilisés : le premier restera groupé, le second sera isolé pendant 24h et le troisième sera isolé pendant 6 semaines. De plus, des injections aigues (1 injection unique; 30 secondes) ou chroniques [5 injections au total (1/jour) ; 30 secondes par injection] ainsi que des tests comportementaux (durée maximum 10 min) seront réalisés sur animaux vigiles. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des prélèvements sanguins (maximum de 6 prélèvements par souris ; 2 prélèvements/jour au maximum avec au moins 1h entre chaque prélèvement; chaque prélèvement durera au maximum 30 sec) ainsi que des chirurgies (durée maximum 1h). L'ensemble de ces nuisances possibles sera évalué et traité afin de réduire la souffrance animale.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures nécessitent un isolement social (objet de ce projet) d’une partie des animaux. Cet isolement sera soit aigu (24h) soit chronique (6 semaines) et peut créer un stress important aux animaux. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Les injections aigues ou répétées de cocaine peuvent induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Les stimulations aversives induisent un stress transitoire aux animaux. Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire peuvent induire une hémorragie ou encore des dommages à l’os maxillaire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de comportement de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement, 10 pour les analyses immunohistologiques et d’analyse d’activité calcique. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet (animaux groupés vs isolés, saline vs cocaïne, contrôle des virus utilisés) et que les deux sexes seront utilisés les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour cette partie du projet. De même, la combinaison de procédures comportementales avec des procédures de prélèvement sanguins permettra de ne générer qu’une cohorte de souris pour répondre à deux questions scientifiques.
Raffinement
Avant isolement et tout au long des expériences pour les animaux témoins, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton)), et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. A l'exception du milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), aucune condition spécifique ne sera mise en place pour les animaux isolés. L'objectif de cette étude étant d'évaluer l'effet de l'isolement social sur les comportements d'addiction, nous ne souhaitons pas ajouter d'éléments d'enrichissement qui pourraient être des éléments confondants, perturbant les interprétations des résultats. Ainsi, les animaux isolés seront hébergés dans des conditions identiques à celles des animaux groupés à l'exception de la présence de congénère. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Le bien-être animal sera évalué tout au long de l’isolement en prenant notamment en compte l’état général de l’animal, son poids et sa réactivité à la manipulation, permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué plus spécifiquement afin de rapidement pouvoir émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale Enfin, le bien être animal sera également évalué lors des protocoles expérimentaux, nécessitant des injections intrapéritonéale répétée, afin d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. La souris est également une espèce sociale, permettant ainsi l’étude des effets de l’isolement social sur les comportements. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.
Caractérisation des atteintes cérébrales au décours de l’insuffisance rénale aiguë chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit l'ablation d'un rein et le clampage des vaisseaux de l'autre pour provoquer une insuffisance rénale aiguë, puis des mesures de fonction rénale et d'imagerie sous anesthésies répétées. Le porteur reconnaît une douleur, une hypothermie, un risque d'arrêt cardiorespiratoire et une altération de l'état général, avant un prélèvement terminal du sang, des reins et du cerveau. Il affirme que la circulation entre le rein et le cerveau ne peut être reproduite par des organoïdes et justifie ainsi le recours à la souris.
Objectifs
L'insuffisance rénale aiguë correspond à une chute brutale mais réversible de la fonction du rein. Plus de la moitié des patients en réanimation font un ou plusieurs épisodes d'insuffisance rénale aigue. Les patients atteints d'insuffisance rénale aiguë sévère présentent fréquemment des atteintes neurologiques, à type de confusion au premier plan. Cependant, les raisons de ces atteintes cérébrales ne sont pas connues. L’hypothèse la plus répandue est celle d'une altération de la barrière existant entre le sang et le cerveau (barrière hémato-encéphalique), suivie d’une augmentation de l'inflammation cérébrale. L'objectif du projet est de comprendre pourquoi et comment une insuffisance rénale aiguë induit ces troubles neurologiques, en utilisant la souris comme modèle.
Bénéfices attendus
La meilleure compréhension des atteintes cérébrales au cours de l'insuffisance rénale aiguë permettra de développer des stratégies de prévention de ces atteintes cérébrales chez les patients.
Procédures
(1) Tous les animaux du projet seront soumis à une intervention chirurgicale qui consiste à ôter le rein droit et à poser un clamp autour des vaisseaux du rein gauche sous anesthésie générale et une prise en charge analgésiques pré et post-opératoire. Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. (2) Tous les animaux seront sourmis à la mesure de la fonction rénale qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intraveineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie ne dure que 2 minutes. (3) Les animaux seront impliqués soit dans i) une injection intraveineuse unique d'une solution (une minute sous anesthésie gazeuse), ou ii) 3 administrations par jour par voie orale d’un médicament (quelques secondes sur animal vigile), ou iii) 1 injection intra-veineuse d’un marqueur isotopique suivie d’une imagerie (2 sessions à 24h d'intervalle, 30-60 minutes sous anesthésie gazeuse). (4) Enfin, tous les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin terminale sous anesthésie et analgésie suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvement et analyses.
Impact sur les animaux
La chirurgie et l'induction d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : - hypothermie et douleur provoquées par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plans cutanés et musculaires, sutures); - risque de détresse respiratoire et d'arrêt cardio-respiratoire lors de la chirurgie; - altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; - stress induit par des manipulations quotidiennes. Les tests neurocomportementaux et l'administration du médicament par avoie orale induisent également un stress dû à la manipulation par l'expérimentateur et aux tests eux-mêmes.
Devenir
Les 300 animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever le sang, les reins et le cerveau pour analyse.
Remplacement
Notre projet porte sur la caractérisation des conséquences d'une maladie du rein sur le cerveau. Notre hypothèse est que l'altération des fonctions cognitives observées chez les patients souffrant d'une insuffisance rénale aigue est due à la libération par le rein de molécules toxiques. Ces dernières vont abîmer la barrière hémato-encéphalique, ce qui va permettre leur passage dans le cerveau et provoquer ainsi des dommages. Notre projet nécessite donc l'existence d'une circulation sanguine entre le rein et le cerveau, qu'il est actuellement impossible de reproduire en utilisant des organoïdes ou autres modèles en 3D. De plus, pour caractériser les atteintes neurologiques fonctionnelles, nous devons réaliser des évaluations neuro-comportementales des animaux, qui ne sont pas non plus modélisable in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet est de 300. Nos expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité des atteintes rénales dans notre modèle. Dans le cas de l'ischémie-reperfusion, des lots de 10 animaux sont nécessaires pour mettre en évidence les différences observables entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. L'imagerie nucléaire cérébrale nous permettra d'évaluer la cinétique de l'atteinte de la barrière hémato-encéphalique après insuffisance rénale aiguë de façon répétée dans le temps chez les mêmes animaux, et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour comparer les groupes d'animaux.
Raffinement
Les nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger, dans toutes les cages. Des points limites ont été définis. Les animaux sont observés quotidiennement et pésés régulièrement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que d'une pesée quotidienne pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car nous maitrisons le modèle d'ischémie et les méthodes d'anlyse dans cette espèce, avec lequel nous travaillons depuis des années. De plus, nous avons reproduit chez la souris de nombreux aspects de la maladie rénale observés chez l'être humain, ce qui confirme sa pertinence. Tous les animaux sont des mâles C57Bl/6JRj fournis par un éleveur agréé. Ils sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu graisseux qui peut gêner l'interruption de la circulation au niveau des vaisseaux rénaux.
Développement d’un traitement pour la déficience en acide lipase lysosomale par thérapie génique avec des virus adéno associés (AAV)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la déficience en lipase acide lysosomale, elles reçoivent des injections de vecteurs viraux dans la veine caudale et des prélèvements sanguins répétés, avant que leur foie, leur rate et leur intestin soient prélevés. Le porteur teste vingt-quatre vecteurs de thérapie génique puis les plus prometteurs, en vue d'un "traitement curatif" présenté au conditionnel. Il affirme que l'effet et l'innocuité de la stratégie ne peuvent être vérifiés que sur un animal vivant.
Objectifs
Dans le cadre du développement d’une thérapie génique pour la déficience en acide lipase lysosomale, le projet consiste à tester l’addition d'un gène médicament encodant la protéine manquante chez les patients : l'acide lipase lysosomale (LAL) en utilisant des vecteurs viraux. Plusieurs types de vecteurs et différentes constructions du gène médicament sont disponibles, il s’agit donc dans un premier temps de sélectionner la meilleure combinaison entre vecteur viral et gène médicament. Puis la meilleure construction sera évaluée a différentes doses et temps sur notre modèle de souris afin d’aboutir à la sélection d’un « médicament » efficace.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi montrer au terme du projet une efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique ce qui permetrait d’initier un développement clinique de ce produit et d'offrir un traitement curatif aux malades.
Procédures
Les animaux subiront une injection dans la veine caudale (animaux vigiles) et des prélèvements de sang (animaux anesthésiés) au niveau du sinus retro-orbitale.
Impact sur les animaux
Dans les procédures expérimentaux : les injections dans la veine caudale et des prélèvements de sang régulièrement pourront entrainer une perte des poids, des plaies au le site de prélèvement ou d'injection. Ces paramètres seront suivie toutes les semaines et pris en compte afin de diminuer la souffrance des animaux.
Devenir
Les souris de la procédure expérimentale 1 seront utilisées dans les procédures 2, 3, 4 et 5. Les souris des procédures 2, 3, 4 et 5 seront euthanasiées afin de récupérer différents organes: foie, rate, intestin pour étudier la correction de l'accumulation de lipides dans nos souris traitées par rapport à des souris saines et malades non traités ai et donc s'assurer de l'effet thérapeutique de notre stratégie et de son inocuité.
Remplacement
Nous développons une stratégie curative de la déficience en LAL par thérapie génique. Bien que cette stratégie ait été testés in vitro sur des cellules de foie et de peau de patient, cela ne permet pas d’étudier la distribution de nos vecteurs ni leur effet thérapeutique sur tous les organes ou encore de confirmer leurs innocuités. Pour cela, nous devons avoir recours à l’utilisation d’animaux sur un modèle de souris représentatif de la déficience en LAL. De plus, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étranger à l’organisme pour véhiculer le gène « médicament » jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le gène de l’enzyme LAL jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entrainé à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux malade à élever et à utiliser, nous allons procéder par étape : sélection des meilleurs vecteurs AAV-LAL in vivo sur souris saines (24 vecteurs), puis études de ces vecteurs sur souris LAL -/- (15 vecteurs) et enfin étude de la dose thérapeutique à injecter pour aboutir à la sélection du meilleur AAV-LAL « médicament » capable de réduire l’accumulation de lipides. Afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser, un premier criblage des vecteurs a été réalisé in vitro.
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures, nous avons mis en place un suivi adapté des souris LAL -/- (pesés des animaux, au besoin aliment placé au sol et maintien du lien social) et des points limites les plus précoces possibles afin de soulager ou supprimer toutes souffrances. De plus, les procédures expérimentales potentiellement douloureuses (prélèvement sanguin) seront effectuées sous anesthésie gazeuse (Isoflurane)
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle de souris LAL -/- car ce modèle reproduit les symptômes induit par de la déficience en LAL humaine : accumulation de lipide dans le foie et permet d’étudier l’effet corrective de notre approche de thérapie génique. De plus, seul des modèles de souris LAL déficient sont disponible et ont été décrit dans la littératures jusqu’à présent. Aussi, la souris est facile à manipuler, à nourrir et à se procurer. L’injection de l’AAV dans la veine caudale de souris est parfaitement maitrisée au sein de Généthon et l’étude de l’effet thérapeutique est bien décrit dans la littérature dans les souris. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront injectées à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte. Pour la procédure expérimentale P4, les souris seront injectées à 8 semaines. L’étude sur les souris saines durera 1 mois tandis que l’efficacité du traitement sur les souris LAL-/- nécessitera un suivie de 12 semaines pour les procédures 2-3 et de 8 mois pour la procédure 4.
AMENDEMENT : Identification du rôle d’une hormone dans l’absorption de nutriments chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
826 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du sans réveil au modéré. Modèles génétiques de l'hémochromatose, elles reçoivent des injections et des prélèvements sanguins répétés, certaines subissant une chirurgie abdominale sous anesthésie. Le porteur cherche à comprendre le rôle d'une hormone intestinale dans l'absorption du fer et à tester des composés mimant cette hormone, en renvoyant les retombées thérapeutiques au long terme. Il justifie l'usage de la souris par le fait qu'elle constitue le "modèle pathologique" de la maladie.
Objectifs
L’hémochromatose est une maladie de surcharge en fer fréquente. La surcharge induit une défaillance des organes vitaux au cours du vieillissement. Cette surcharge en fer est notamment due à une hyper absorption du fer par le duodénum (partie supérieure de l’intestin). Cependant il existe très peu de traitement, la diminution du fer par des médicaments et/ou les saignées sont les principales lignes de traitement. Ces traitements ne visent pas à réduire l’absorption du fer (intestin) mais seulement à diminuer le contenu en fer de l’organisme. L’hormone du fer est produite majoritairement par le foie et est le stabilisateur du taux de fer dans l’organisme. Une production de l’hormone du fer a été décrite également au niveau intestinal. Le premier objectif de ce projet est de déterminer le rôle de cette hormone produite par l’intestin dans la régulation de l’absorption du fer. En parallèle, de nouveaux outils thérapeutiques mimant l’hormone du fer ont été développés. Ces outils thérapeutiques pourraient diminuer l’absorption du fer. Le deuxième objectif de ce projet est donc de montrer l’efficacité de ces nouveaux outils thérapeutiques dans des modèles murins de surcharge en fer (hémochromatose).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont, à court terme, la découverte du nouveau rôle de l'hormone intestinale dans l'absorption du fer et à plus long terme au développement de nouveaux outils thérapeutiques pour diminuer l'absorption du fer dans l'hémochromatose.
Procédures
Sur animaux vigiles : -Contention pour injection en intrapéritonéal (15 secondes par souris (contention + injection)) -Contention pour injection en sous cutanée (15 secondes par souris (contention + injection)) - Prélèvement sanguin (30secondes). Sur animaux anesthésiés -Chirurgie abdominale ( 5 minutes par souris) -Tonte de l’abdomen (30 secondes par souris). -Prélèvement sanguin (30 secondes par souris)
Impact sur les animaux
Les souris subiront un stress lors de l’anesthésie, de la contention, des injections et du gavage.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes pour des analyses.
Remplacement
Nous utilisons un modèle murin car c'est le modèle murin pathologique de l'hémochromatose. Nous avons besoin de l'utilisation de l'animal pour que l'effet thérapeutique des lactocoques soit relevant.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. L'étude statistique permet de calculer au plus juste le nombre d'animaux à utiliser.
Raffinement
Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum et vivent en groupes sociaux. Le milieu est enrichi. Les animaux seront quotidiennement surveillés. De plus, toutes les procédures se font avec des anesthésiques et des analgésiques si nécessaire. Dans chaque procédure, des grilles de points limites ont été établie et que des mesures seront prises en fonction de ces évaluations.
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle murin car nous utilisons des souris transgéniques, modèles de la pathologie étudiée. Les souris seront âgées de 3-4 semaines juqu'à 7-8semaines car ce modèle de souris présente une surcharge en fer dès 2 mois. Un autre lot de souris sera utilisé à l'âge de 8-10 semaines. AMENDEMENT : La lignée murine Hbb th1/th1 représente un autre modèle de surcharge en fer qui est secondaire. L'utilisation de ce modèle murin permet d'élargir les domaines d'application de ces probiotiques.
Effet d’une immunothérapie cellulaire sur des modèles murins de différentes tumeurs humaines (cancer du sang, cancer des poumons, du foie et du sein).
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant quatre mois au plus, et une prise de sang chaque semaine à la joue : 675 souris dépourvues de système immunitaire et irradiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La déclaration en compte 600 en souffrance modérée et 75 en souffrance sévère. Greffées de cellules cancéreuses humaines par la veine de la queue ou, sous chirurgie, dans la rate, elles reçoivent ensuite des lymphocytes T dits "non conventionnels", issus de donneurs sains, dont l'équipe veut faire un traitement "universel" contre leucémies, lymphomes et cancers du poumon, du sein et du foie. Le porteur choisit la souris pour son comportement "bien connu et proche de l'humain", qui rendrait la douleur facile à évaluer, et prévoit chez ces souris irradiées et greffées infections, diarrhée, paralysie ou insuffisance respiratoire.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.
Procédures
Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).
Impact sur les animaux
Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant un légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.
Devenir
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Remplacement
Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.