Rongeurs
Pré-conditionnement des cellules stromales mésenchymateuses ex vivo avec alpha-tocophérol : accélération de la régénération osseuse ?
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
133 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 28 mis à mort sans réveil comme donneurs de cellules et 105 opérés du crâne sous anesthésie en souffrance modérée. Un défaut osseux est créé chirurgicalement dans la calotte crânienne puis comblé par un biomatériau, les rats étant hébergés deux à huit semaines avant mise à mort pour analyser la régénération osseuse. Le porteur décrit une douleur post-opératoire prise en charge par analgésie et des points limites déclenchant l'euthanasie. Il affirme que ces études de reconstruction osseuse "ne peuvent être menées que sur des animaux".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l’hypothèse selon laquelle le traitement, pré-implantation, de cellules souches autologues avec une molécule nommée l’alpha-tocophérol (AT) peut améliorer leur participation au phénomène de réparation osseuse. Cette hypothèse est établie sur la base des résultats montrant que l’AT favorise la formation de cellules productrices de tissu osseux à partir de cellules souches mésenchymateuses. Ces effets sont obtenus sans effet toxique de l’AT.
Bénéfices attendus
Les précédentes expériences effectuées in vitro suggèrent que les CStroM traitées avec l’AT pourraient avoir une meilleure capacité de régénération osseuse se traduisant par une résolution des défauts plus rapide et de meilleure qualité. Dans ce cas, nous allons tester, sur un modèle animal, la preuve de principe d’une procédure thérapeutique (accélération de la régénération osseuse) innovante. La mise au point d’un essai préclinique sur grand animal est la perspective directe de ces expériences, utilisant les réactifs et consommables de grade clinique, compatibles avec une procédure ex vivo de médicament de thérapie innovante (MTI). Dans la même perspective, nous préparerons ces cellules pour le développement d’un MTI et d’un essai clinique de grade 1/2 en médecine humaine. De même, ces résultats peuvent orienter la recherche sur l’effet de l’AT ex vivo sur les cellules souches isolées à partir d’autres tissus, ce qui pourrait, à son tour, ouvrir des perspectives vers le développement d’autres MTI.
Procédures
Les animaux (rats) prévus pour ce projet seront soumis à une seule procédure chirurgicale (procédure 1, durée environ 30 minutes, 105 rats), à l'exception des rats donneurs de cellules qui seront euthanasiés pour obtenir des cellules souches mésenchymateuses (28 rats).
Impact sur les animaux
Durant ce projet, uniquement une douleur post chirurgie est attendue pour les animaux. Comme indiqué dans la suite du formulaire, l’estimation de la souffrance sera réalisée dans les 5 premiers jours par l’expérimentateur et/ou par le personnel de l’animalerie. Cette estimation sera ensuite réalisée quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Les animaux seront surveillés concernant leurs activités et leurs comportements [voir annexe 2 et 3]. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd.
Devenir
Les animaux (105 rats) ayant subi l'unique procédure 1 seront hébergés entre 2 et 8 semaines puis sacrifiés pour prélever les implants et réaliser les différentes analyses ayant pour but de quantifier la régénération osseuse induites par les matériaux implantés.
Remplacement
Le processus de développement et de validation des biomatériaux utilisés pour la reconstruction osseuse nécessite des études précliniques qui ne peuvent être menées que sur des animaux et, dans le cas de ce projet, sur des rongeurs. Les études faisabilité, de fonctionnalité et de régénération osseuse chez l’animal sont indispensables pour le développement des biomatériaux. Ces tests menés chez le rongeur sont une étape nécessaire pour permetre la suite de notre projet dirigé vers la clinique. Le principe général est de créer chirurgicalement un défaut osseux dans la calvaria puis de mettre en place un biomatériau de comblement permettant de stimuler la reconstruction osseuse. Les procédures d’évaluation comprennent un suivi clinique (inflammation, douleur), ainsi qu’un suivi histologique et radiologique par microscanner, après euthanasie des animaux.
Réduction
Afin d'utiliser le moins d'animaux possibles mais également afin d’avoir un nombre suffisant d’échantillons à la fin de l’étude, tout en prenant en compte le risque de perte d’animaux, une approche statistique nous a permis d'établir que notre projet comprendra des groupes de 5 rats pour l'expérience préliminaire puis de 8 rats pour chaque condition dans les expériences suivantes. Pour l’analyse statistique, nous comparerons les résultats obtenus avec les différents échantillons.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et dans des cages avec de l'enrichissement adapté afin de leur offrir un cadre d'hébergement optimal: litière en copeaux de peupliers et des jouets. Après la chirurgie, chaque animal se réveillera dans une cage séparée pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, l’animal reviendra dans sa cage d’origine. L'anesthésie des animaux sera réalisée au masque (anesthésie gazeuse) par de l’isoflurane (4,5% pour l’induction, puis 2.5% pour le maintien). L'analgésie sera réalisée en pré oépratoire par une par une injection sous-cutanée d’un anesthésique local (lidocaïne) et par une injection sous-cutanée de buprénorphine, 30 minutes avant l'intervention, ainsi qu'une injection en post-opératoire. L'estimation de la souffrance animale sera constamment mesurée: 1/ Tout au long de l’intervention chirurgicale, les signes avant-coureurs du réveil seront surveillés et, si un de ces signes apparait, une augmentation temporaire du taux d'isoflurane à 4,5% sera réalisée. Si les signes persistent, l'animal, qui sera toujours sous anesthésie sera euthanasié par dislocation cervicale. 2/ L’estimation de la souffrance sera mesurée dans les 5 premiers jours post chirurgie concernant leurs activités et comportements. Les critères utilisés seront ceux de Lloyd et al. : le score limite est de 14 et au-delà, l’animal sera euthanasié. Toute souffrance plus modérée sera traitée par l’administration quotidienne, par voie intra-péritonéale, de buprénorphine pendant 3 jours. La persistance de douleurs entraînera l’euthanasie de l’animal. Les critères suivants seront prépondérants dans la détermination du point limite : apparence de l’animal, prise d’eau et de nourriture, signes cliniques (rythme cardiaque et respiratoire), comportement naturel et provoqué. En cas de blessures corporelles suite à un combat, l’animal sera isolé et soigné avant de retourner dans sa cage pour être surveillé en continu. En cas de problème de cicatrisation des plaies, les soins nécessaires seront effectués. Selon la gravité, la plaie sera ré-ouverte pour enlever pus ou hématomes, et un traitement antibiotique. Les animaux ayant atteint les points limites seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le défaut de calvaria chez le rongeur est un modèle largement utilisé dans notre recherche, validé dans la littérature. C'est un modèle de choix pour étudier l’influence des cellules et biomatériaux sur la régénération osseuse. Pour ce projet, nous devons nous placer dans des conditions expérimentales in vivo qui miment l’allogreffe. Nous travaillerons ainsi avec une souche allogénique de rats couramment utilisé pour ce type d’expérimentation : des rats Sprague Dawley. Nous utiliserons un modèle de rat plutôt qu'un modèle plus petit (comme la souris) car ce modèle est mieux adapté aux types de matériaux (nature et taille) et car nous avons déjà une bonne expertise de la culture des CStroM de rats qui rend ce projet réalisable sans mise au point.. Les animaux seront commandés et hébergés environ 2 semaines avant l’intervention pour permettre leur acclimatation. Nous utiliserons des animaux adultes (10 à 12 semaines pour les rats). Cela permettra d’éviter que la croissance osseuse des animaux vienne interférer avec les processus de régénération.
Étude du rôle des macrophages dans le développement du cancer buccal.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 541 d'entre elles étant réutilisées et les autres tuées. Elles reçoivent une biopsie de la queue à la naissance, un cancérigène dans l'eau de boisson pendant deux à quatre mois qui provoque des tumeurs de la langue, et un gavage, les tumeurs entraînant des difficultés d'alimentation et une perte de poids. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort pour prélever les organes et que les parents reproducteurs sont euthanasiés après six mois. Il affirme que seules des souris génétiquement modifiées permettent d'étudier le rôle des macrophages dans ce cancer.
Objectifs
Le carcinome à cellules squameuses oral (OSCC) est le cancer de la langue le plus courant, touchant principalement les fumeurs, les personnes alcooliques ou porteuses d’un papillomavirus. Malgré sa prévalence, il reste peu étudié en comparaison avec d’autres cancers. Les macrophages sont connus pour s'infiltrer dans divers types de tissus cancéreux, contribuant à la progression tumorale en favorisant l'angiogenèse, la métastase ou le développement d'un environnement immunosuppresseur. A l’inverse, certains sous-types de macrophages vont avoir un rôle antitumoral, notamment aux prémices du développement tumoral. La diversité et les fonctions spécifiques de sous-populations de macrophages lors du développement de l’OSCC sont encore peu claires. En effet, l'hétérogénéité des macrophages et le rôle des différentes populations dans la promotion de la croissance tumorale font encore l'objet de controverses. De plus, la plupart de cette caractérisation reste très superficielle car réalisée chez l'homme. A travers l’utilisation de modèles animaux permettant de supprimer spécifiquement et localement les macrophages de la langue, nous proposons d’étudier leur rôle au cours du développement tumoral de l’OSCC.
Bénéfices attendus
Les cancers de la tête et du cou sont le sixième type de cancer le plus courant. Ils regroupent plusieurs types de cancers qui se développent souvent dans les cellules squameuses tapissant les surfaces muqueuses de la cavité buccale, du pharynx, du larynx ou de la cavité nasale. Toutefois, le cancer de la bouche est le type le plus fréquent des cancers de la tête et du cou, avec environ 377 700 nouveaux cas et 177 700 nouveaux décès signalés chaque année dans le monde. L’OSCC est le cancer de la bouche le plus courant, représentant 90% de tous les cancers buccaux et se trouvant le plus souvent sur la langue. Malgré les traitements disponibles tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, les taux de mortalité et de morbidité restent élevés, avec un taux de survie à 5 ans et après traitement de moins de 50%. De plus, selon l'Observatoire mondial du cancer, l'incidence de l’OSCC devrait augmenter d’au moins 40% d'ici 2040, ce qui en fait une préoccupation majeure de santé actuelle et future. Ce projet va nous permettre de comprendre la dynamique des macrophages dans un cancer encore trop peu étudié, tant chez l'homme que chez la souris. L'utilisation d'un modèle unique va donc nous permettre d'aller plus loin dans la compréhension du rôle des macrophages dans le développement de la maladie, ainsi que des mécanismes moléculaires impliqués, que ce soit au stade précoce ou tardif du développement. À terme, ces données pourraient donc ouvrir la voie à de nouvelles voies thérapeutiques en particulier celles impliquant l’immunomodulation.
Procédures
1008 souris se verront prélever un morceau de queue 7 à 10 jours après leur naissance. 314 souris seront soumises à un traitement avec une molécule cancérigène ajouté à l'eau de boisson pendant des périodes allant de 2 à 4 mois maximum. 84 souris seront traitées avec une molécule cancérigène ajouté à l'eau de boisson pendant 4 mois et seront traitées avec une molécule qui permet à notre modèle murin de fonctionner, à travers un gavage de moins de 10 secondes par voie orale 2 fois à 7 jours d'intervalle.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé. - L'induction de l'OSCC se fait par la prise d'une molécule cancérigène diluée dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 4 mois. Au fur et à mesure de son développement, ce cancer provoque des lésions sur la langue, entraînant finalement l'apparition de tumeurs. Ces lésions et tumeurs induisent des difficultés d'alimentation, entraînant une perte de poids à la fin du protocole. - L'administration d'une molécule par voie orale à l'aide d'une seringue avec embout flexible), permettant à notre modèle murin peut entraîner un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration, qui dure environ 10 secondes.
Devenir
Après 6 mois d'accouplement, les parents sont euthanasiés. Les bébés sont utilisés pour (i) remplacer les parents, (ii) être utilisés dans ce projet ou être utilisé dans de futures projets. À la fin des procédures, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes.
Remplacement
Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil d'expression de gènes est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. Nous anticipons que le développement de la tumeur fournira un nouvel environnement et donc de nouveaux signaux instructifs permettant la différenciation de nouveaux sous-types de macrophages. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et le microenvironnement de la tumeur. Ces interactions sont basées sur le recrutement de cellules circulantes, la présence de macrophages linguaux différenciés avant l’apparition de la tumeur, dont on ne sait pas reproduire le profil in vitro, et un profil évolutif des cellules tumorales au cours du temps qui possèdent également leur propre profil. De plus, les macrophages pourraient également impliqués dans le recrutement ou la communication avec d’autres cellules immunitaires circulantes, dont on ne pourra pas connaître la nature exacte si les expériences in vivo ne sont pas effectuées. Enfin, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique, le niveau de risque acceptable et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
De la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage dès le début du traitement. Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées si nécessaire. Une surveillance renforcée sera mise en place deux fois par jour si les souris perdent plus de 10 % de leur poids initial, présentent une diminution de leur mobilité ou un pelage hirsute. Les souris seront euthanasiées en cas de perte de poids supérieure à 20 %, de comportement sévèrement altéré (vocalisations spontanées, automutilation, immobilité et absence de réaction) ou d'anomalie physique (piloérection, dos arrondi). Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les conditions d'hébergement des souris respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE : - Les cages utilisées dans les zones ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. - Du coton ou du sizzle pad pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. - Les animaleries bénéficient d'une Température régulée à 21°C, d'une Hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée (250 lux à un mètre du sol). - Les animaleries sont calmes (58Db).
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour répondre de manière irréfutable aux questions posées. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 6 semaines jusqu'à la fin du traitement, puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages lors du développement tumoral à l’âge adulte.
Production liquide d’ascite (produit dérivé)
- Production de routine
- Tests réglementaires
4800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules dans le péritoine, qui provoque une production de liquide d'ascite et un gonflement de l'abdomen surveillé chaque jour, le liquide étant récolté après mise à mort. Ce liquide d'ascite entre dans la fabrication de tests de diagnostic de la toxoplasmose et de la rubéole. Le porteur indique que cette cellule ne peut à ce jour être conservée qu'in vivo et que des essais de substitution sont "en cours d'étude".
Objectifs
La production de ce liquide d'ascite (produit dérivé) entre dans la formulation de tests de diagnostics de maladies infectieuses tel que la recherche de Toxoplasmose et de Rubéole. Il est utilisé dans son entièreté sans purification préalable et amène une stabilité aux tests.
Bénéfices attendus
Cette ascite issue de la multiplication d'une cellule qui est utilisé directement dans nos diluants, sans étape de purification préalable et a un rôle de stabilisant et de ballast. Cela améliore ainsi la spécificité des tests.
Procédures
Selon le protocole chaque souris recevra 1 seule injection de cellules sans injection préalable d'un activateur du système immunitaire. Cette injection dure quelques secondes. L'incubation dure 2 semaines maximum. Durant cette phase de developpement de la cellule, un suivi quotidien est réalisé (à l'aide d'une grille d'évaluation de la douleur afin de d'avoir une objectivité sur l'apparition d'éventuels points limite). La récolte de l'ascite est réalisée stérilement sur les animaux préalablement euthanasiés.
Impact sur les animaux
La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d'ascite. Cela engendre un gonflement de l'abdomen de l'animal. Ce gonflement de l'abdomen fait l'objet d'une surveillance quotidienne et une cotation est réalisée chaque jour afin d'évaluer la douleur engendrée par ce geste.
Devenir
Les animaux dédiés ne sont utilisés que pour ce protocole. A la fin de celui-ci, Le liquide d'ascite est récolté post mortem.
Remplacement
La cellule permettant la production de cette ascite est à ce jour conservée in vivo uniquement et il n'y a pas à ce jour d'alternative fiable utilisable en routine pour remplacer cette cellule en l'état, car une perte de viabilité de la cellule très importante est constatée lors des cycles congélation/décongélation. Cela empêche donc la conservation de la cellule en in vitro. Cependant des essais de faisabilité du retrait ou de la substitution de cette ascite sont en cours d’étude.
Réduction
La quantité d'animaux nécessaire est déterminée sur la base de prévisions de fabrication des tests utilisant l'ascite. Afin de réduire l'utilisation de cette ascite, la totalité des cas d'emplois à été répertorié. Chaque cas d'emploi a été analysé afin d'identifier la possibilité d'un retrait ou de substitution de l'utilisation de cette ascite. La réduction de certains cas d'emploi est déjà acquise (arrêt produits et arrêt d'un cas d'emploi). Pour les autres références la faisabilité est en cours d'analyse en travaillant prioritairement sur les plus gros consommateurs de liquide d'ascite. Le développement des nouvelles références se fait systématiquement sans usage de liquide ascite. Développement en cours d'un lignée cellulaire stabilisée congelée afin d'essayer de substituer le mode de conservation in vivo actuel.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, cependant, le protocole ne nécessite pas d'amorce intrapéritonéale (pas d'injection de pristane) et cela fait diminuer considérablement la sévérité du protocole. De plus, les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. La mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet au technicien d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer. Les animaux sont en hébergés en cages équipées d'enrichissement de type "maison".
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé du fait de l'origines des cellules à multiplier Pour cette application, nous utilisons des animaux matures âgées à minima de 8semaines.
Etude des mécanismes de l’atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent un prélèvement de queue, des injections intraveineuses, deux chirurgies sous anesthésie et des séjours en cage métabolique, une atteinte rénale leur étant induite pour en étudier les mécanismes avant prélèvement des reins. Le porteur affirme que "seule l'expérimentation animale" permet d'étudier ces maladies rénales rares dans un organisme vivant. Les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort après le seul génotypage.
Objectifs
Les maladies rénales rares et sévères sont à mauvais pronostic et sont associées à des risques élevés d'insuffisance rénale terminale. Ces maladies représentent 11% des causes d'insuffisance rénale terminale en France. Ces maladies sont des maladies complexes et seule l'expérimentation animale, résumant l'ensemble des interactions cellulaires au sein du rein, dans un organisme vivant, permettra d'étudier les mécanismes impliqués dans la destruction rénale au cours de ses maladies. Nous avons identifié une protéine potentiellement impliquée dans ces maladies et nous allons tester le rôle de cette protéine chez des souris où cette protéine aura été inactivée et chez qui nous aurons induit les maladies rénales que nous étudions. Nous réaliserons des prélèvements d'urine pour évaluer la fonction des reins et les animaux serons mis à mort à la fin de la procédure pour récupérer les reins et analyser les lésions.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies rénales rares et sévères. Ce projet permettra d'établir si le mécanisme identifié pourrait faire l'objet d'un ciblage pharmacologique à visée thérapeutique.
Procédures
Baguage à l'oreille et prélèvement d'un morceau de queue de 1 mm sur animal vigile (1 fois 2 min), injection intra veineuses sous anesthésie générale (1 à 3 selon la procédure, 5 minutes), chirurgies sous anesthésie générale (2 chirurgies pour une procédure, 20 minutes). recueil d'urine en cage métabolique (3 à 7 selon les procédures, 8H)
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, stress lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleur post-opératoire. Effet lié aux modèles: insuffisance rénale pouvant induire une perte de poids modérée ou une fatigue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Soit ils n'auront pas un génotype d'intérêt et sont mis à mort sans expérimentation autre que le génotypage, soit ils sont d'intérêt et sont mis à mort pour prélèvement des tissus.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte rénale dans les maladies rénales rares et sévères incluant les cultures cellulaires (in vitro). Les cibles identifiées sont d'abord testés sur des cellules en culture. En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours des maladies rénales comme les interactions entre les glomérules et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous avons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.
Réduction
Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un logiciel dédié. Nous optimisons l'utilisation des organes pour les différentes analyses afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies avec eau et nourriture ad libitum et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Une grille de score de souffrance et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. Les cages sont enrichies en coton et bâton de bois. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri-opératoire.
Choix des espèces
La physiologie des fonctions rénales chez la souris étant similaire à celle de l’homme, les expériences menées chez la souris offrent des modèles valides d’étude des pathologies humaines. De plus, les modèles utilisés au cours de ce projet sont établis et validés par la communauté scientifique. Stade de développemnt: de la naissance à l'age adulte car nous avons un élevage. Seuls les animaux adultes agés de 2 à 6 mois sont utilisés pour les modèles expérimentaux. Les pathologies étudiées touchent essentiellement les adultes donc nous réaliserons les modèles expérimentaux chez des souris adultes.
Archivage de lignées murines par cryoconservation de sperme ou d’embryons
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
35 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des stimulations hormonales par injection, des microchirurgies de transfert d'embryons sous anesthésie et des biopsies pour génotypage, pour archiver des lignées génétiquement modifiées par congélation de sperme et d'embryons. Le porteur indique que les mâles reproducteurs et donneurs de sperme, les femelles donneuses d'ovocytes et les femelles ayant subi le transfert d'embryons sont toutes mises à mort, comme les animaux nés des transferts et utilisés pour le contrôle qualité. Il affirme que la congélation des semences est "la seule méthode possible" pour sauvegarder ces lignées murines.
Objectifs
Les équipes de recherches utilisent de nombreux modèles génétiques différents chez la souris, pour supporter des programmes de recherche visant à la fois à étudier le rôle de gènes dans le développement, à caractériser l’impact de mutations génétiques identifiées chez des patients et à évaluer des stratégies thérapeutiques. Les opérations de stockage et de congélation en azote liquide des lignées génétiques impliquées vise à garantir la disponibilité de ces lignées à l'état cryoconservé permettant au besoin de revivifier la lignée en cas de problème survenu sur la lignée à l'état respirant (perte, dérive génétique, contamination) et de faciliter les échanges de ces lignées entres les différents sites hébergeurs par l'envoi des semences cryoconservées.
Bénéfices attendus
L'archivage et la sauvegarde des lignées par cryoconservation de sperme et/ou d'embryons permet de garantir la disponibilité des lignées murines traitées et de favoriser/simplifier les échanges entre différents sites.
Procédures
-hébergement en situation d'isolement de 1 à 2 semaines maximum - Stimulation hormonale : 2 injections intrapéritonéales (durée inférieure à 30 secondes) réalisées à 48h d'intervalle - Microchirurgie sous anesthésie générale (durée de l'intervention inférieure à 30 min) nécessitant 2 injections, une en IP et une en sous-cutanée - Biopsies de tissu pour génotypage (moins d'1 minute)
Impact sur les animaux
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs (utilisés pour la production du sperme ou des embryons) sont hébergés en situation d'isolement intermittent entre deux périodes d'accouplement. L'isolement peut générer de l'anxiété, la souris étant un animal vivant en groupes sociaux. Les femelles pseudo-gestantes peuvent faire l'objet de douleurs post-chirurgicales suite à la réimplantation des embryons par micro-chirurgie. Un stress peut aussi apparaitre en raison de la contention des animaux lors des stimulations hormonales ou pour l'anesthésie des femelles pseudo-gestantes. Le prélèvement de tissu pour génotypage peut entrainer une douleur et un stress en lien avec la contention de l'animal.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort. En effet, les mâles reproducteurs sont mis à mort en fin de projet et ceux donneurs de sperme doivent être mis à mort afin de prélever le sperme. Les femelles pseudo-gestantes ayant été sujettes à la chirurgie de transfert d'embryons ne peuvent subir un deuxième transfert d'embryons. Les femelles donneuses sont mises à mort pour permettre la récolte d'ovocytes post-mortem. Les animaux issus des transfert d'embryons (contrôles qualités) ne sont pas conservés.
Remplacement
Il n'y a pas de remplacement possible, la congélation des semences est la seule méthode possible pour la sauvegarde de lignées murines.
Réduction
Les nombres d'animaux utilisés sont réduits au maximum et l'estimation a été faite en se basant sur la littérature scientifique et sur la base des années d'expérience dans ces approches. Pour les cryoconservations de sperme, 2 animaux sont nécessaires par lignée. Pour les cryoconservations d'embryons, en moyenne, 45 animaux seront nécessaires par lignée
Raffinement
La procédure chirurgicale de transfert d'embryons associe anesthésie générale et analgésie post et per-opératoire, avec la mise en oeuvre de points limites opérationnels pour le monitoring du temps post opératoire. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en carton.
Choix des espèces
L'archivage des lignées murines déja existantes impose l'utilisation du modèle murin. Les animaux utilisés sont des reproducteurs à l'âge adulte pour les femelles receveuses et les males reproducteurs ou donneur de sperme, aprés la puberté et avant tout vieillissement. Les femelles donneuses utilisées sont des femelles impubères (4 semaines) pour faciliter l'efficacité du traitement de superovulation. Les animaux issus des transferts d'embryons dans le cadre des contrôles qualités effectués seront âgés de 7 à 10j.
Cibler le microbiote des tiques pour perturber leur alimentation/survie et bloquer leur compétence vectorielle vis-à-vis de bactéries (rickettsies)
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Lapins : 12
100 souris et 12 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des injections, portent une capsule fixée sur le dos et sont infestées par des tiques, les lapins étant utilisés pour produire du sérum, avant mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur indique que l'alimentation des tiques provoque un inconfort modéré et que la pose des capsules a été optimisée pour le limiter. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la réponse immunitaire de la souris à une vaccination anti-microbiote de tique.
Objectifs
L'implication du microbiote (bactéries symbiotique de la tique) de la tique dans la survie des tiques et dans la transmission des agents pathogènes transmis par ces dernières a déjà été signalée pour différentes espèces de tiques. Ces preuves renforcent le fort potentiel du microbiote des tiques en tant que cible pour le développement de stratégies de contrôle. Il est prouvé que la présence de certaines espèces de ces bactéries (symbiotes) favorise l'établissement d’agents pathogènes chez les tiques, alors que la présence d'autres espèces de bactéries a été associée à l'absence d’agents pathogènes chez la tique. Dans ce contexte, l'objectif principal de ce projet de recherche est de cibler deux types de bactéries symbiotiques pour évaluer les effets de la vaccination de souris par ces bactéries sur la composition du microbiote de la tique, sur l'limentation et la survie de tique et enfin sur l'acquisition d'un agent pathogène par la tique.
Bénéfices attendus
Les tiques transmettent des maladies graves à l'homme et aux animaux. Cependant, la lutte contre les tiques repose uniquement sur les acaricides, qui peuvent contaminer l'environnement et les produits d'origine animale (par exemple, le lait et la viande) consommés par l'homme. En outre, les acaricides peuvent sélectionner des populations de tiques résistantes. Malgré la gravité des maladies transmises par les tiques, la prévention repose uniquement sur l'évitement des piqûres de tiques. Les tiques abritent une communauté de microbes (microbiote) comme les autres animaux. Chez les tiques, le microbiote joue un rôle dans la survie et le développement des tiques ainsi que dans leur capacité à transmettre des agents pathogènes. Ce projet vise à développer une stratégie plus sûre de lutte contre les tiques, basée sur des vaccins anti-microbiote de tique utilisés chez la souris.
Procédures
Souris animaux vigiles : 2 injections et 3 prélèvements. Pose de capsule sur le dos des souris. Infestation avec tiques Lapins = Animaux vigiles : 2 injections et 2 prélèvements.
Impact sur les animaux
Chez les souris, l’alimentation des tiques induit un inconfort modéré. De plus, les souris peuvent simplement se sentir mal à l'aise lorsque la capsule est placée sur leur dos. Cependant, le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser l'inconfort chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pas de symptômes attendus suite à l'inoculation des agents pathogènes mais surveillance quotidienne des animaux (souris et lapins).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.
Remplacement
Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec des bactéries non pathogènes afin d'évaluer les effets sur la composition du microbiote de la tique, l'alimentation/survie de la tique et l'acquisition d'une bactérie pathogène (Rickettsia) par la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne afin d'analyser les effets sur le microbiote des tiques et la colonisation des pathogènes. Afin de disposer d'un plus grand volume de sérums pour des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation de souris supplémentaires. Dans le cadre de ce projet nous ne cherchons pas à simplement infecter des tiques par des bactéries, nous avons besoin d’évaluer l’efficacité d’une vaccination chez la souris avec deux bactéries sur le gorgement/survie et capacité à s’infecter des tiques. Il existe des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas d’évaluer la réponse immunitaire des souris suite à une vaccination. La production/cultures des bactéries est par ailleurs réalisée par culture cellulaire in vitro.
Réduction
Chaque souris peut nourrir au maximum 30 tiques. Mais par souris entre 20-25 tiques vont se détacher sans faire un repas complet ou mourir donc nous obtiendrons 5-10 tiques gorgées par souris donc il faut prévoir 5 souris pour groupe pour obtenir 25-50 tiques gorgées par groupe au total, nombre nécessaire à nos analyses. Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir le nombre de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Nous avons comptabilisé le nombre minimal de lapin nécessaire à l’obtention du volume necessaire de serum pour nos futures experimentations in vitro. Pour nos expérimentations futures in vitro, nous avons besoin durant les 5 années du projet d’un volume total de 60ml de sérums de lapins immunisé pour chaque bactérie (deux bactéries) et le même volume pour chaque lapin contrôle (deux contrôles). Nous avons donc estimé avoir besoin de 3 lapins par groupe (environ 20ml de sérum pouvant être récupéré par Lapin) soit un total de 12 lapins sur les 5 ans du projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées par lot de 3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Il n’y a aucune souffrance attendue suite à l’infection par les bactéries lors des immunisations, les infections sont asymptomatiques chez les souris et les lapins. Pas de points limites dans ces conditions. Cependant, après inoculation des agents pathogènes, l’état clinique des animaux (état général) sera contrôlé chaque jour, pour arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de déshydratation ou signes neurologiques (début de paralysie notamment). Nous n'attendons donc pas de symptômes importants tels que des paralysies chez les souris, mais nous suivrons les animaux tous les jours afin de contrôler l'apparition de symptômes éventuels. Lorsque les souris auront des capsules sur le dos avec des tiques, elles devront être hébergées en cage individuelle, en effet les souris sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Mais ces souris seront hébergées dans les conditions classiques avec l'enrichissement nécessaire à leur bien être en augmentant le nombre de carré de coton et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages d'à côté. Pour les lapins, à leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). Les lapins seront observés quotidiennement pendant toute l'expérimentation. Comme les lapins sont des animaux très sensibles à la manipulation, ils seront quotidiennement contrôlés et manipulés par les animaliers et l’expérimentateur pour les habituer à leur présence et aux manipulations.
Choix des espèces
Les 3 lignées de souris ont été sélectionnées car elles sont les plus sensibles aux agents pathogènes (bactéries notamment) transmis par les tiques. Lapin blanc de Nouvelle-Zélande car ce sont les animaux les plus appropriés pour obtenir un grand volume de sérum vacciné en une seule expérience et permettra d'obtenir suffisamment d'anticorps spécifiques contre les bacteries à l'étude. De plus ils ne peuvent pas être utilisés pour infecter des souris car ils ne développement pas de bactériemie suffisante. Souris 7-8 semaines. Lapins = 4-5 semaines. Adaptation des animaux durant une semaine avant l'expérimentation. Souris gardées au plus 39 jours (entre 20 et 39 jours selon procédure). Lapins seront gardés au maximum 30 jours. Mise à mort de tous les animaux au maximum à J39.
Les neurones inhibiteurs longue distance de l’hippocampe: des tours de contrôle dysfonctionnelles ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié classée en souffrance sévère et l'autre en souffrance légère. Les animaux subissent des chirurgies d'induction d'une épilepsie chronique, des injections de virus, l'implantation de dispositifs d'enregistrement, puis de l'imagerie calcique, des enregistrements EEG et des tests comportementaux cognitifs et émotionnels, avant prélèvement de l'encéphale. Le porteur décrit les crises d'épilepsie, le maintien en cage individuelle pendant huit à douze semaines et les chirurgies répétées du crâne comme des atteintes sévères au bien-être des animaux non-humains. Les souris au génotype non souhaité, classées en léger, ne subissent que le génotypage avant mise à mort.
Objectifs
L’épilepsie du lobe temporal, type le plus fréquent d’épilepsie incurable, se caractérise par des crises d’épilepsie souvent générées dans l’hippocampe. Toutefois, l’ampleur des altérations cognitives, anatomiques et fonctionnelles chez les patients suggère que la maladie implique le dysfonctionnement d’un large réseau de régions cérébrales, bien au-delà de l’hippocampe seul. Il est crucial d’étudier les mécanismes qui contrôlent les interactions entre l'hippocampe et les autres régions du cerveau pour mieux comprendre les échecs fréquents des thérapies actuelles, dont celles ciblant l’hippocampe. Nous nous intéressons à un type de neurones qui jouerait dans des conditions normales un rôle de « tour de contrôle » entre différentes régions du cerveau : les neurones inhibiteurs à projection longue. Nous pensons qu’un dysfonctionnement de ces neurones pourrait jouer un rôle primordial dans le réseau épileptique. Pour le vérifier, nous combinerons imagerie calcique et enregistrements électrophysiologiques in vivo sur des souris épileptiques en comportement avec des virus rétrogrades ciblant les neurones inhibiteurs à projection longue-distance. Ainsi, nous examinerons le rôle pathologique de ces neurones dans les altérations à grande échelle liées à l’épilepsie du lobe temporal et déterminerons les potentiels bénéfices de leur manipulation au niveau thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance de neurones inhibiteurs particuliers, qui connectent l'hippocampe avec d'autres régions cérébrales, dans les altérations à grande échelle associées à l'épilepsie du lobe temporal. En cas de succès, ces neurones pourraient être la cible de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de formes incurables d'épilepsie.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) un génotypage (optionnel), b) des chirurgies d'induction d'un état chronique d'épilepsie (1-4h), c) des chirurgies (30-90minutes) d'injection de virus chez l'adulte ou à P0 (optionnel), d) des chirurgies d'implantation de dispositifs d'enregistrements par électrophysiologie ou par imagerie calcique, e) des mesures de leur activité neuronale (maximum 1h en imagerie, 24/7 en EEG télémétrique, une technique permettant d'enregistrer les crises d'épilepsies sur des animaux libres de leurs mouvements), f) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions cognitives ou émotionnelles, réputées altérées en condition d'épilepsie (1/2 journée). A la dernière étape du protocole expérimental, l'encéphale sera prélevé sous anesthésie profonde pour analyser les tissus
Impact sur les animaux
Dans le cas d’animaux subissant l’ensemble d’une procédure, l’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus sont de classe sévère et peuvent être résumés selon les points suivants: - Le stress lié au maintien des souris adultes en cages individuelles après induction de l'épilepsie et pendant la majeure partie de la procédure (soit généralement 8-12 semaines) afin de limiter les bagarres et faciliter le suivi, - l'inconfort et le stress généré par les interventions (optionnelles) sur des souriceaux nouveau-nés et leur maintien transitoire hors de la cage maternelle pour observation pendant 2h30 à 3h30 - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - L'inconfort associé au réveil post-chirurgical et le risque infectieux lié aux anesthésies et interventions chirurgicales répétées (craniotomie, implantation) afin de réaliser des injections intracérébrale et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale – Les démangaïsons pouvant être provoquées par les sutures de la peau du crâne. Dans le cas de l'utilisation de lignées transgéniques, les animaux au génotype non-souhaité sont classés en léger puisqu’ils ne subissent qu'une intervention (génotypage).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux subissent une anesthésie profonde terminale afin de prélever l'encéphale et d'effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Notre but est de comprendre le rôle d'un type de neurones particuliers de l'hippocampe dans des désordres cognitifs et électrophysiologiques à large-échelle associée à l'épilepsie du lobe temporal. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro (que nous utilisons régulièrement par ailleurs) n'est pas applicable pour ce projet-ci. En termes de modèle animal, les souris sont un excellent modèle animal par rapport à d'autres existants parce qu'elles reproduisent fidèlement les altérations cardinales observées chez les patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal, sont capables de réaliser des tests de comportement transposables chez l'homme (à la différence d'autres animaux tels les poissons zèbres) et comptent d'autres avantages (vitesse de reproduction, capacité de transgenèse).
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés : Nous utilisons une procédure raffinée d'induction de l'épilepsie qui augmente considérablement le taux de réussite de la procédure, et limite par conséquent le nombre d'animaux nécessaires pour générer des cohortes d'animaux épileptiques chroniques. De plus, nous privilégions chaque fois que cela sera possible l’utilisation d’animaux sauvages (appelés aussi wildtype ou WT) combinée à des constructions AAV spécifiques des neurones inhibiteurs afin de limiter quand cela est possible le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des souris du génotype voulu. Le cas échéant, nous utiliserons des lignées transgéniques telles que GAD-Cre, PV-Cre ou SOM-Cre disponibles dans le laboratoire.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement afin de limiter l'impact de nos expérimentations sur le bien-être des animaux: - Les animaux sont hébergés dans des cages avec un environnement enrichi (composé d'igloos cartonnés, de tunnels en carton et de papier foisonnant), en présence d'eau et de nourriture ad libitum - Notre procédure raffinée d'induction de l'épilepsie, basée une échelle des symptômes et sur l'injection de caféine, permet de prévenir la survenue des stades les plus sévères du status épilepticus (associés à de la souffrance et la mort). - Chaque intervention invasive (e.g., chirurgie) est effectuée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie optimales. - Nous mettons un soin particulier à constamment surveiller les constantes biologiques et la souffrance des animaux , particulièrement dans les heures et jours suivant les interventions invasives (e.g., induction de l'épilepsie, chirurgie) jusqu'à la mort des animaux. Des grilles de suivis ont été mises en place, et le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction.
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux dont souffrent les patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeurs, altérations histologiques). Ils sont donc un excellent modèle pour cette maladie humaine, et sont utilisés de manière routinière dans le laboratoire. L'induction de l'épilepsie est effectuée sur des souris agées de 2 mois environ, un stade favorisant la survie des animaux, ainsi que le taux d'induction de l'épilepsie. Les enregistrements (imagerie calcique, électrophysiologie) et les tests comportementaux s'effectuent 6-12 semaines plus tard, à un stade où les animaux ayant subi le protocole d'induction ont subi des altérations histologiques conduisant à une épilepsie chronique (se manifestant par des crises spontanées récurrentes, des désordres cognitifs ainsi que que des altérations histologiques).
Développement d’un nouveau biomatériau naturel poreux pour une médecine régénérative en vue de traiter les communications bucco-sinusiennes EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une communication bucco-sinusienne est créée chirurgicalement au palais sous anesthésie, puis comblée par un biomatériau à base de collagène, avec un suivi par scanner pendant trois semaines avant mise à mort au 21e jour pour analyse histologique. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des difficultés d'alimentation, des infections et un risque de mortalité estimé inférieur à 5 pour cent. Il affirme qu'il n'est "pas possible de se passer d'animaux" pour vérifier l'efficacité du biomatériau avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales. Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorisent la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...). Le but de ces travaux est d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs situés dans un même bâtiment (un établissement pour l'expérimentation y compris la chirurgie et l'hébergement, le second pour l'imagerie).
Bénéfices attendus
- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rongeur
Procédures
L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes (EU1/2). Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle (EU 2/2). Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes, pour être disséqués et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons (EU 1/2).
Impact sur les animaux
Douleurs : Il est possible que des signes de douleur post-opératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).
Devenir
Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse).
Remplacement
Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composée de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface.
Raffinement
La totalité des procédures effectuées sera réalisée par un personnel qualifié composé de concepteurs de projet et d’applicateurs de procédures expérimentales ainsi de chirurgiens ORL. Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages utilisées et le nombre d’animaux par cage sont conformes à la règlementation en vigueur. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et la structure possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie. Le transfert des cages se fera sur chariot (moins de 20 minutes de transfert entre deux services situés dans un même bâtiment, au même étage). Le biberon est retiré des cages pour la durée du transfert pour éviter tout déversement de liquide dans la litière. Les animaux gardent accès à la nourriture.
Choix des espèces
Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.
Caractérisation de l’effet anti-inflammatoire de la molécule TEM2085 dans deux modèles d’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite au collagène et une colite au Dextran Sodium Sulfate leur sont induites, puis des composés sont administrés par gavage répété, pour tester la molécule TEM2085 dans deux modèles de maladies inflammatoires. Le porteur indique que la douleur des deux modèles, sévère, ne peut être soulagée par aucun antalgique sans fausser les résultats, les animaux étant mis à mort pour analyses histologiques. Sur le remplacement, il affirme que cette étude in vivo est une part "impérative" du développement préclinique et conclut que le projet ne peut être remplacé par aucune alternative.
Objectifs
Dans le cadre d'un projet européén ayant pour objectif d'accélérer la mise sur le marché d'une nouvelle thérapie anti-inflammatoire, la molécule TEM2085 est apparue comme le meilleur composé sur la base de test pharmacologique in vitro et in vivo en raison de sa stabilité et de son efficacité dans le modèle de psoriasis chez la souris. L'expérimentation animale est nécessaire au développement pré-clinique de cette molécule. La présente étude est menée pour évaluer son efficacité dans le modèle d'arthrite au collagène comme modèle de polyarthrite rhumatoïde, ainsi que sur le modèle de colite au Dextran Sodium Sulfate comme modèle de rectocolite hémorragique, une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. S'il s'avère efficace dans ces modèles, le TEM2085 pourra être développé en tant que médicament dans de multiples maladies inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu pour la société est une potentielle nouvelle solution thérapeutique pour les maladies inflammatoires chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. En effet, ces maladies restente encore incurables et les thérapies actuelles sont inefficaces ou le deviennent chez environ 1/3 des patients et sont associées à des effets indésirables graves. Le bénéfice pour notre structure de recherche est de comprendre comment le TEM2085, qui s'est déjà avéré efficace dans un modèle de psoriasis, agit, et si son mécanisme d'action est partagé dans l'arthrite et dans la colite. Il s'agit d'une étude préliminaire qui décidera de l'avancement de cette molécule pour des essais cliniques.
Procédures
Nuisance n°1 Induction de l'arthrite sous anesthésie générale, d'une durée de 3 min environ, temps d'induction compris, cette anesthésie est réalisée sous isoflurane. Nuisance n°2 Développement des maladies: Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par la colite et l'arthrite. La douleur considérée comme sévère pour les deux modèles, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire. Nuisance n°3 Administration des composés pharamcologiques par gavage répétés. Le gavage d'une durée de 15 secondes par animal maximum est réalisé par du personnel expérimenté. Une habituation au gavage sera effectué au préalable avec gavage d'une solution sucrée.
Impact sur les animaux
Perte de poids et douleurs pour les animaux induits par la colite et l'arthrite. La douleur considérée comme sévère dans les deux modèles, ne peut être prise en charge pharamacologiquement car à ce jour aucune molécule antalgique n'a été identifiée comme dépourvue d'effet anti-inflammatoire.
Devenir
Des analyses histologiques sur les articulations (arthrite) ou sur l'intestin (colite) seront réalisées à l'issue des procédures expérimentales nécessitant la mise à mort des animaux.
Remplacement
La présente étude a été planifiée après une recherche documentaire approfondie et de nombreuses études in vitro. Après avoir soigneusement analysé les études thérapeutiques cruciales in-vivo, il a été observé que les modèles de souris mâles DBA/1J et de souris C57BL/6 sont les modèles de référence pour respectivement, la polyarthrite rhumatoide et la rectocolite hemorragique. De plus, compte tenu des développements déjà réalisés sur cette molécule, cette étude in-vivo est cruciale et constituera un jalon pour progresser sur l'avenir de la molécule TEM2085. Cette étude est une partie impérative du développement préclinique de la molécule. Après avoir consulté la littérature et considéré l'importance de cette étude pilote, le présent projet ne peut être remplacé par aucune autre étude alternative.
Réduction
Ce projet est planifié en gardant à l'esprit le nombre minimum d'animaux nécessaires (8 animaux par groupe) pour atteindre le niveau de signification pour chaque modèle. Le projet est divisé en trois groupes : le groupe témoin inflammatoire, le groupe traité avec le TEM2085 et le groupe traité avec le médicament approuvé par la FDA, l'upadacitinib. Pour une étude comparative, il est important d'inclure ce groupe témoin qui servira de norme pour les comparaisons nécessaires pour comprendre l'impact du médicament sur la gravité et la progression de la maladie. Le deuxième groupe est traité avec le TEM2085, cette molécule a montré des résultats positifs dans un modèle de psoriasis chez la souris, par conséquent, elle peut être une molécule thérapeutique potentielle pour la polyarthrite rhumatoide et la rectocolite hemorragique également. Par conséquent, le groupe TEM2085 est très important à inclure dans le présent projet. Le troisième groupe de l'étude est le groupe upadacitinib. Comme ce médicament est très efficace dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde et de la rectocolite hémorragique, il est important de l'utiliser comme molécule de référence. Ce groupe aidera à comprendre l'efficacité thérapeutique du TEM2085. Compte tenu de l'importance de chaque groupe dans l'étude, il n'est pas possible de réduire le nombre de groupes et d'animaux. Une analyse par test statistique pour les comparaisons entre les trois groupes sera réalisée. Sur la base des études in vitro/in vivo antérieures, la force de l’effet de TEM2085 a été évaluée et considérant une puissance de 80% et un risque alpha de 5%, un effectif de n=8 animaux/groupe d’étude devrait être suffisant pour révéler des différences significatives entre les groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par 4 dans des cages conventionnelles conformes pour cette espèce (directive 2010/63/EU) au sein de notre animalerie conventionnelle. L'enrichissement est apporté par des objets (tunnel, maison) dédiés à cet usage. Les injections intra-dermiques sont réalisées sous anesthésie gazeuse générale. Les deux modèles sont bien connus et maîtrisés au laboratoire en termes de douleurs. Nous surveillerons quotidiennement les animaux. Les animaux seront pesés deux fois par semaine. Un changement de litière bi-hebdomadaire puis quotidien lorsque les animaux seront en phase d’arthrite sévère ou de colite sévère, l'utilisation de tunnel permettra de diminuer le stress occasionné par le changement de litière. Si des anomalies du comportement (vocalisation, pilo-erection, cachexie) ou des troubles du mouvement pouvant traduire une douleur intense et/ou une perte pondérale supérieure a 25% par rapport à J0 étaient observés, les animaux concernés seraient mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. L’apparition éventuelle d’une infection au niveau du site d'injection nous obligerait également à mettre à mort l’animal.
Choix des espèces
Les souris mâles DBA1/J ont été largement étudiées dans la littérature comme modèle expérimental de la polyarthrite rhumatoïde. L'immunisation avec le collagène de type II provoque une réponse auto-immune similaire à celle de l'homme. Les souris atteintes d'arthrite au collagène développent une synovite, des érosions du cartilage et des articulations, tout comme les humains. Ces résultats démontrent que cette espèce est le modèle de référence de l'arthrite expérimentale. Le modèle de référence pour la rectocolite hémorragique est la souris C57BL/6 induite par le DSS. Dans ce cas, 3 % de DSS sont ajoutés à l'eau de boisson des souris (J0 àJ3). À cette concentration, le DSS pénètre la membrane muqueuse de l'intestin et agit comme une toxine chimique qui endommage les cellules de l'épithélium colique. Cette lésion entraîne le développement d'un contenu intestinal pro-inflammatoire de type colite aiguë. Le modèle de souris C57BL/6 induite par le DSS a été bien établi dans la littérature pour la rectocolite hémorragique. Ces caractéristiques font de ce modèle un modèle standard et le plus pertinent pour réaliser des études précliniques in vivo. Des souris adultes mâles seront utilisées pour cette étude car totalement développées d'un point de vue immunologique et sans influence hormonale immunomodulatrice des oestrogènes.
Effet du régime alimentaire maternel et paternel sur les malformations congénitales cardiaques des nouveaux nés et impact sur la santé cardiovasculaire des adultes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
199 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont soumises à des régimes carencés en vitamine D ou riches en graisses induisant une obésité, à un gavage et à des échocardiographies sous anesthésie, avant une mise à mort pour collecter les embryons. Le porteur étudie l'effet de l'alimentation parentale sur les malformations cardiaques de la descendance, en menant en parallèle un modèle d'organoïdes cardiaques encore à optimiser. Il présente le passage à l'animal comme une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Les cardiopathies congénitales sont des malformations cardiaques se développant au cours de la vie intra utérine. Elles surviennent assez fréquemment et touchent environ 10 naissances sur 1000. Il s’agit de pathologies ayant une cause multifactorielle. Les facteurs les plus souvent rencontrés sont les anomalies génétiques, les maladies métaboliques maternelles voire paternelles ou la consommation de drogues, de médicaments ou d’alcool. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de différents facteurs nutritionnels, seuls ou en combinaison, sur l’apparition de ces anomalies. (1) La carence en vitamine D : une alimentation maternelle carencée en vitamine D affecte le développement cardiaque de la progéniture par différents mécanismes dont les mécanismes non génétique (2) L’obésité maternelle : bien que fortement suspectée comme ayant un impact négatif sur le développement cardiaque, nous ne savons toujours pas si et comment l’obésité maternelle affecte les embryons. Nous ne savons pas du tout l 'impact du statut nutritionnel paternel. (3) Le sexe fœtal : la réponse métabolique du nouveau-né semble être spécifique au sexe de l’individu . Il est donc intéressant d’analyser les différences développement cardiaque en condition pathologique en fonction du sexe. (4) La flore intestinale : La flore intestinale est susceptible de jouer un rôle de médiateur dans au moins une partie de l’effet des régimes maternels déficients en vitamine D et riches en graisses et avoir un effet délétère sur la formation cardiaque de la progéniture. Cette flore est de plus différent eentre les deux sexes. Notre projet permettra une meilleure connaissance de l 'origine des pathologies cardiaques congénitales.
Bénéfices attendus
le projet devrait permettre de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaire de l impact des regimes maternel ou paternel sur les malformations cardiaques.
Procédures
Gavage 1 min un seul par souris. Echocardiographie sous anesthésie: 30 min 1 seule /souris. Le gavage implique une contention de 30 s de la souris. L’échocardiographie est la technique d’imagerie de choix pour le suivi longitudinal de la fonction cardiaque in vivo et une technique non invasive. Il s'agit d'une procédure indolore ne nécessitant pas d’analgésie. Elle se fait sous anesthésie générale gazeuse simplement pour maintenir la souris immobile sur le dos
Impact sur les animaux
L’obésité des souris en régime gras et le régime sans vitamine D peut leur apporter un inconfort qui néanmoins n'affecte pas leur mobilité ou leur agilité. Elles ne présentent pas non plus de signes de souffrance. Les souris seront observées chaque jour par l’expérimentateur pour contrôler leur état de santé. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie sur un matelas chauffant pour le maintien de leur température. Le gel nécessaire à l’échographie est préchauffé pour minimiser toute nuisance ou inconfort ou stress thermique. Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus prend seulement 30 s et la souris est conditionnée deux jours avant le gavage à la contention de 30 s pour diminuer le stress. Le gavage sera fait une seule fois pour chaque souris pour induire la recombinase at avec une sonde trempée dans l’eau sucrée. L’expérimentateur visite les souris chaque jour de sorte de les habituer au contact humain. Une grille de score jointe au projet sera suivie quotidiennement.
Devenir
Les prélèvements de sang se feront une seule fois par ponction cardiaque au moment de la mise à mort pour la collecte des embryons. Les autres souris seront mises à mort avant reveil au terme de l 'echocardiographie
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme. Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro; Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle requiert encore une optimisation pour mimer la vraie formation et le fonctionnement d'un coeur.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d’effets secondaires liés à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique Les même souris et embryons serviront à de multiples analyses cardiaques. Nous avons donc d' ores et déjà reduit le nombre d animuax dans ce projet au statistiquement strict nécessaire ( test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes à l aide du logiciel Graphpad selon les recommandations de "Analyses statistiques des données acquises lors d’analyses fonctionnelles chez la souris. Méthodologie [stat.ME]. 2012. ffdumas-00729021f" . Les données acquises sur cellules humaines validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Des points limites clairs seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. Dans la mesure du possible, les souris seront plusieurs par cage afin de respecter leur instinct grégaire. Leur milieu sera enrichi par du Sizzle Kraft et des buchettes chaque semaine pour leur permettre de se cacher de la lumière et de les occuper à confectionner leur nid, cela a pour but de réduire leur stress. Les animaux seront observés tous les jours de la semaine et les week-ends, de leur arrivée à leur mise à mort.
Choix des espèces
la souris est un bon modèle de developpement cardiaque comparé à l 'homme et a un microbiote semblable au microbiote humain. La souris permet une étude intégrée de la physiologie
Activation neuronale des crises épileptiques induites par un agent pharmacologique chez la souris génétiquement modifiée.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du léger au sévère. Une biopsie de la queue est prélevée à six jours pour le génotypage, puis un agent pharmacologique déclenche des crises d'épilepsie, le porteur reconnaissant une mortalité d'environ 20 % liée aux crises. L'objectif est d'identifier les neurones activés lors d'une crise, à l'aide de souris génétiquement modifiées. Il affirme que l'imagerie cérébrale humaine et les cultures cellulaires ne sont "pas encore suffisamment crédibles" pour cette étude.
Objectifs
Notre objectif est d'utiliser les souris pour identifier les cellules activent lors d’une crise épileptique. Nous proposons le projet actuel pour étudier si les crises induites par un agent pharmacologique activent des cellules neuronales similaires ou différentes.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à déterminer les neurones actifs lors d'une crise d'épilepsie. Pour y parvenir, nous utiliserons un modèle animal capable de générer des crises sans effets négatifs à long terme. Nous espérons décrire les circuits cérébraux impliqués dans la génération de crises et, ainsi, contribuer à identifier des marqueurs de l'épilepsie qui peuvent se traduire par de meilleurs soins et une meilleure prévention de l'épilepsie humaine.
Procédures
Toutes les souris produites (80) pour obtenir le nombre de souris d'intérêt (56) feront l'objet d'une biopsie par le prélèvement de 1mm de bout de queue à l'âge de 6 jours pour réaliser le génotypage et la sélection des souris. Les animaux seront soumis à trois injections, où ils recevront d'abord une injection intrapéritonéale avec de substance témoin 30 minutes avant une deuxième injection (sous-cutanée) avec l’agent pharmacologique selon chaque groupe expérimental. Deux heures après la deuxième injection, ils recevront une troisième injection (intrapéritonéale) pour marquer les cellules activées. Une semaine plus tard, nous répéterons la première et deuxième injection et puis marquer les cellules actives encore une fois. À la fin de l’expérience, les animaux seront euthanasiés et leurs cellules marquées analysées. Les animaux des groupes qui recevront l’agent pharmacologique développeront une crise d'épilepsie associée à des comportements épileptiques. Cette crise n'est ni permanente ni récurrente.
Impact sur les animaux
La réalisation de la biopsie pour génotypage va générer une lègère douleur de courte durée sur les souris âgées de 6 jours. À chaque traitement avec l'agent pharmacologique, les animaux développeront une brève crise épileptique. Cette crise pourrait entraîner une mortalité d'environ 20 % parmi les effectifs.
Devenir
Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie à la fin du deuxième jour de l'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animal pour réaliser ces études. Les alternatives actuelles telles que l'imagerie cérébrale humaine et les cultures cellulaires ne sont pas encore suffisamment crédibles pour étudier les mécanismes neuronaux. Par conséquent, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour analyser ces processus neurobiologiques complexes.
Réduction
La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Le nombre d'animaux par groupe doit être suffisamment élevé pour assurer une forte probabilité de détection d'un effet réel, tout en respectant les exigences légales et éthiques préconisant une utilisation minimale des animaux. Les données précédentes ont été utilisées pour calculer la variabilité interindividuelle des crises induites par un agent pharmacologique. Ainsi nous avons calculé une taille d'échantillon de 8 animaux par groupe, totalisant 7 groupes. Par conséquent, nous utiliserons 56 souris.
Raffinement
Nos souris transgéniques constituent actuellement un modèle animal le plus avancé en génie génétique pour identifier les populations neuronales activées à un moment donné. Pour assurer les meilleures conditions d'hébergement, nous mettrons 3 ou 4 animaux par cage pour favoriser leurs interactions. Des enrichissements environnementaux systématiques seront mis en place pour améliorer au maximum le bien-être des animaux. Les conditions d'élevage, les soins postopératoires, l'hébergement et les différentes étapes de la procédure expérimentale sont contrôlés pour réduire ou éliminer toute détresse potentielle. Nous avons également établi des critères d'interruption des expériences et d'exclusion des animaux en raison de la douleur, de la souffrance physique, de l'agressivité, de la perte de poids évaluée à l'aide d'évaluations individuelles.
Choix des espèces
Les modèles de souris ont été largement utilisés dans la recherche sur l'épilepsie, en raison de leur capacité à imiter les caractéristiques clés de l'épilepsie humaine. De plus, l'utilisation de souris transgéniques offre l'avantage de marquer les neurones qui sont activés lors d'états comportementaux spécifiques. Cette combinaison de modèles de souris établis et d'outils génétiques innovants fournit une plate-forme puissante pour étudier les mécanismes complexes sous-jacents à l'épilepsie. Nous utiliserons des souris adultes de l'âge de 3 mois (14-16 semaines). Les animaux adultes ont consolidé leur développement et leurs structures cérébrales, étant également plus résistants aux crises que ceux en développement.
Détermination des conditions de greffe et de croissance de tumeurs implantées par voie sous-cutanée ou intraveineuse, chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente
- Recherche appliquée
- Cancers
5 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des greffes de cellules tumorales sous la peau ou en intraveineuse, des injections répétées et jusqu'à seize prélèvements sanguins, le porteur reconnaissant des ulcérations, des nécroses tumorales et des paralysies possibles. Ce projet ne vise pas encore une thérapie mais seulement à caler les conditions de greffe et de croissance des tumeurs, en amont d'études d'efficacité, avec jusqu'à cent séries sur cinq ans. Le porteur juge l'usage de la souris "indispensable" et invoque un "besoin médical" considérable.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet préliminaire, situé en amont des études d’efficacité anti-tumorale de composés thérapeutiques, consiste à déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études. Ces études seront menées chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès dans le monde en 2020. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de composés thérapeutiques.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Greffe de cellules tumorales en intraveineuse (1 injection, 15 s) ; Administration de la molécule déplétante/neutralisante (maximum 1 jour sur 2 pendant 16 semaines, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (16 fois/maximum, 30 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutanée ou en intraveineuse. Stress et douleur légère lors de l’administration de la molécule déplétante/neutralisante en intra-péritonéal, sous-cutané, per os ou intraveineux. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à la greffe tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur (tumeur en sous-cutanée), paralysie (tumeur en intraveineux).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 15 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, dans les modèles de greffe en sous-cutanée et 10 souris maximum par groupe pour ceux en intraveineuse, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Ces études sont menées avec des analyses statistiques basées sur les tests ANOVA, Mann Whitney, test T de Student, test de Log-rank et/ou de Gehan-Breslow-Wilcoxon. Les volumes de prélèvements de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 100 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Les volumes de prélèvements de sang seront limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permettra de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un prélèvement terminal, sous anesthésie générale pourra également être réalisé. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Les cellules tumorales greffées en intraveineuse pourront induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et l’activation du système immunitaire. Enfin, le modèle murin est un modèle de choix du fait de l’existence de souris immunodéprimées et de souris génétiquement altérées qui permettent d’évaluer le rôle de nos composés thérapeutiques sur le système immunitaire. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.