Rongeurs
Évaluation des effets d’une thérapie peptidique sur la régénération musculaire chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une lésion du muscle par injection de chlorure de baryum et deux prélèvements sanguins au niveau de l'œil, une partie étant des rats porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne qui se dégrade jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique administrer des analgésiques et présente la thérapie peptidique testée comme dépourvue de toxicité. Il renvoie les bénéfices pour les enfants malades au long terme et affirme que la validation à l'échelle de l'"organisme entier" ne peut se faire in vitro.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare qui est causée par différentes mutations qui peuvent survenir tout au long du gène de la dystrophine porté par le chromosome X. La myopathie est rapidement invalidante.notamment avec la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles respiratoires et du muscle cardiaque entraine une insuffisance cardiorespiratoire fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune thérapie curative. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, avec le désavantage de provoquer un grand nombre d’effets secondaires qui dégradent la qualité de vie des patients. L'absence de dystrophine dans les cellules cardiaques et les fibres des muscles squelettiques induit une dysfonction et une fragilité puis une rupture des membranes cellulaires, soumises à des forces d'étirement lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux non contractile). Cette combinaison d’évènements empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice du traitement avec un peptide candidat sur les capacités régénératives du muscle compromises dans le modèle original du rat DMD. Ce peptide est un nouvel acteur dans la gestion de la progression de la DMD grâce à son nouveau mécanisme d'action. Il permet de rééquilibrer la balance vers la regénération aux dépens de l’inflammation dans les muscles atteints par la maladie. Plus particulièrement, il devrait améliorer la contribution des cellules souches du muscle à la réparation musculaire. Ce traitement devrait donc permettre de bénéficier simultanément de différentes propriétés thérapeutiques sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. En cas de bénéfice évident chez les rats, les données précliniques produites seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. A long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. La diminution de la dégénérescence musculaire, aussi bien au niveau des muscles squelettiques qu’au niveau du coeur, retarderait la progression de la maladie et pourrait même prévenir la perte de la marche et l'insuffisance respiratoire ou cardiaque fatale. Cette thérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant ou en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires. Nous prévoyons également une étude comparative avec les glucocorticoides seuls ou en combinaison avec le peptide étudié afin de vérifier ses effets et de voir un potentiel effet conjugué des deux traitements. Le but est également de permettre d’obtenir un terrain favorable aux thérapies curatives ultérieures.
Procédures
Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbital 2 fois. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus un traitement anti-douleur injectable. La procédure d’induction de la blessure du muscle tibial antérieur sera réalisée sous anesthésie générale et induite par l'injection intramusculaire d'un produit chimique après un traitement anti-douleur local. Cet acte nécessitera moins de 5 minutes. Les animaux seront ensuite réveillés et traités avec un anti-douleur injectable toutes les 8h pendant 2 jours au minimum et jusqu’à la mise à mort en cas de signe de douleur après ces deux jours. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
La lésion musculaire induite par le chlorure de baryum provoque la mort des cellules musculaires qui entraine une sensibilité excessive d'origine inflammatoire. Nous connnaissons bien les conséquences de ce processus temporaire et avons anticipé toute forme de ressenti de la douleur par les injections de buprénorphine, très efficace par expérience sur ce type de procédure. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Ces défaillances combinées conduisent à la nécessité d'une mise à mort compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie ce qui garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures de ce projet n’incluent que des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. En ce qui concerne le traitement, il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide étudié. En effet, il est reconnu que la thérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. Pour ce qui est du traitement avec le Déflazacort (anti-inflammatoire), sur la durée de traitement envisagée, nous n’attendons pas d’effet indésirable majeur mais nous serons particulièrement attentifs à la possible perte de poids observée précédemment avec d'autres molécules de la même famille.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires nécessaires.
Remplacement
Le peptide extracellulaire utilisé a été identifié comme une protéine cible de médicaments dans de nombreuses maladies, en particulier dans les troubles associés à l'inflammation. Le tests in vitro ont démontré son efficacité sur la prolifération cellulaire cependant la validation à l'echelle de l'organe ou de l'organisme entier ne peuvent être reproduit in vitro. Le traitement avec une forme ameliorée de cette protéine lors d’une lésion musculaire chez la souris, favorise la guérison du tissu en induisant la prolifération des cellules souches musculaires et en mobilisant les macrophages sans accentuer dramatiquement l'inflammation. Sur la base de ces résultats préliminaires, nous souhaitons avec ce projet valider les effets d’un traitement avec ce peptide chez le rat DMD qui représente une modèle plus robuste de la dystrophie musculaire de Duchenne que le modèle souris mdx couramment utilisé.
Réduction
Le modèle de rats DMD est maintenant bien caractérisé et reproduit de façon très similaire le développement de la pathologie humaine. Les calculs de puissance statistique recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce qui a été validé avec d'autres projets terminés utilisants des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). La correction des données avant analyse statistique a été optimisée et adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. En raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wild type, WT) et DMD traités avec un placebo ou le diluant du produit à tester, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible ici de ne pas inclure d'animaux WT, sans perte d'information biologique de référence.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de l'homme constitue un modèle apprécié. Les outils récents d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin. Pour la procédure de lésion musculaire induite, nous utiliserons des rats sauvages de 10 semaines puisqu'il s'agit ici de tester l'effet du composé sur la régénération musculaire dans un modèle de lésion induite bien calibré dans notre laboratoire. Pours les procédures de traitement avec les corticoides seuls ou en combinaison avec le composé à tester, nous utiliserons des animaux DMD à l'âge de 10 semaines. Notre étude de caractérisation du modèle rat DMD ainsi que les résultats in vitro montrent que la fibrose musculaire (remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux) est significativement augmentée et quantifiable dès l’âge de 3 semaines. Le démarrage du traitement à 10 semaines permettra d’évaluer la capacité du composé testé à réduire l’endommagement musculaire et par conséquent, à différer l’installation progressive de la fibrose et ses conséquences fonctionnelles sur les muscles.
Etude de l’impacte des mouvements sur le traitement d’informations visuelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 2 196 d'entre elles, 44 étant tuées sous anesthésie sans réveil. Elles reçoivent une barre de fixation de la tête, des injections de vecteurs viraux dans le cerveau et des implants d'électrodes, une partie étant maintenue tête fixée et placée sous restriction alimentaire jusqu'à 80 % de leur poids pour les motiver à une tâche comportementale. Le porteur décrit des risques d'infection et un stress lié à l'immobilisation. Il conclut qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit fidèlement les circuits neuronaux d'un organisme en mouvement, pour une recherche sur l'intégration entre vision et déplacement.
Objectifs
Ce que nous percevons n’est pas nécessairement ce que nous voyons. Notre cerveau est capable de contextualiser ce que nous voyons. Ainsi, lorsque nous bougeons rapidement la tête, nous savons que ces objets qui entrent dans notre champ visuel ne sont pas des projectiles prêts à nous atteindre mais bien des éléments mis en mouvement par notre propre déplacement. Cette distinction est essentielle pour la survie de tout organisme. Le cerveau doit ainsi avoir connaissance de nos déplacements pour pouvoir correctement interpréter nos stimulations visuelles. Dans de nombreuses maladies neurologiques (maladie de Parkinson, trouble du spectre de l’autisme, par exemple) il est fréquent que cette intégration des informations visuelles avec nos déplacements soit défectueuse. Pour étudier ce phénomène, nous allons nous concentrer sur l’intégration de signaux venant de deux organes : les yeux, véritables caméras sur le monde extérieur, et l’oreille interne, semblable à un détecteur de mouvements de notre tête. Chez les mammifères, l’intégration de ces deux signaux s’effectue dans le cortex visuel, partie superficielle postérieure de notre cerveau. En revanche, les circuits neuronaux connectant l’oreille interne aux aires visuelles sont encore peu connus, tout comme leur capacité à intégrer simultanément nos mouvements de la tête avec les informations visuelles reçues. De plus, les études menées jusqu’à présent se heurtaient à des limites technologiques et n’étaient effectuées que sur des animaux immobiles. Pour ce projet, nous utiliserons la souris, modèle d’étude offrant de nombreux outils génétiques essentiels. Ce projet permettra de disséquer et mettre en lumière de nouveaux circuits neuronaux impliqués dans l’intégration sensorielle et ainsi apporter de nouvelles solutions thérapeutiques pour certaines maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Nos systèmes sensoriels sont notre principale voie d'accès au monde qui nous entoure. Certaines maladies touchant les systèmes moteurs, telles que la maladie de Parkinson ou les troubles de l'équilibre comme la maladie de Ménière, peuvent avoir un impact indirect sur notre perception du monde. De plus, il est aujourd'hui établi que certaines maladies cérébelleuses affectent nos capacités cognitives ainsi que notre perception. Par exemple, les lésions cérébelleuses à la naissance sont l'un des principaux facteurs de risque du trouble du spectre de l'autisme. Cette perspective est également cohérente avec les rapports anatomiques montrant une forte connectivité entre le cervelet et le reste du cerveau. À long terme, une compréhension plus approfondie des circuits connectant le système le cervelet au cortex aura certainement un impact médical, car les dysfonctionnements corticaux signalés dans plusieurs maladies proviennent peut-être de ces connexions ou sont exacerbés par ces dernières. Par conséquent, la compréhension de ces circuits et de leurs fonctions physiologiques fournit un nouveau point d'entrée pour le développement d'approches thérapeutiques pour des troubles du traitement sensorimoteur. L'un des plus grands mystères de la biologie est de comprendre comment le cerveau aide les organismes, y compris nous-mêmes, à relever le défi fondamental d'évaluer rapidement et efficacement notre environnement et d'agir en conséquence. Bien que ce projet ne résolve pas complètement cette énigme, comprendre comment le cerveau des rongeurs intègre rapidement et efficacement les informations visuelles et de mouvement est une étape importante vers la compréhension de la manière dont notre cerveau construit une représentation précise du monde extérieur. Mon équipe apportera une contribution significative à notre compréhension du traitement sensoriel et de la perception lorsque nous nous déplaçons. Bien que la vision soit l'un des sens les plus étudiées, les études se sont principalement concentrées sur des animaux immobiles, négligeant ainsi le rôle crucial de nos mouvements dans la perception du monde environnant. En comblant cette lacune, nous pourrons mieux appréhender la façon dont les organismes représentent et évoluent dans leur environnement, aussi bien en état physiologique normal qu'en période de maladie.
Procédures
Nous allons combiner des enregistrements électrophysiologiques et d'imagerie sur des souris possédant une barre de fixation de tête afin d’enregistrer l'activité du cerveau sur des animaux habitués à être tête-fixée (enregistrement ponctuels) et des animaux libres de leurs mouvements (enregistrement longitudinaux). Les souris pourront recevoir l'injection de vecteur viraux au de différentes zones du cerveau et une minorité de ces mêmes animaux seront utilisés pour des enregistrements électrophysiologiques in vitro. La combinaison de techniques ainsi que des enregistrements longitudinaux nous permettent de minimiser le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, tout en prenant en compte le bien-être de l'animal qui sera extrêmement bien habitué aux conditions expérimentales. Certains animaux seront aussi entrainés a effectuer une tâche comportementale et seront donc placé sous restriction alimentaire afin de les motiver à effectuer la tâche comportementale. Le temps pour effectuer la majorité de ces chirurgies se situe entre 30 et 90 minutes. Une souris ne peut pas être enregistrée plus de 2 fois par jour avec un intervalle d'au minimum 5 h entre ces deux enregistrements. La durée d'enregistrement varie entre 30-120 minutes en condition tête fixée et peu atteindre 5h quand l'animal est libre de ces mouvements avec accès à l'eau, la nourriture et nidification. La durée d'entrainement à la tâche comportementale n'excédera pas 90 jours.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet tels que l’implantation d’électrodes, le maintien de la tête fixée, et l’apprentissage de tâches comportementales, peuvent avoir des effets sur le bien-être des animaux et peuvent entrainer des nuisances ou des effets indésirables. Il est donc essentiel de minimiser ces impacts autant que possible tout en respectant les normes éthiques et de bien-être animal. Voici les effets indésirables les plus fréquemment rencontrés lors de ces interventions : 1. Anesthésie : Dépression respiratoire ou cardiaque, hypothermie, impact sur le tractus digestif. 2. Implantation d’électrodes et de fenêtres optiques: Infection/Inflammation de la zone implantée et inconfort du a l’implant. 3. Maintien de la tête fixée: Stress et inconfort liée à l’immobilisation. 4. Injection stéréotaxique: Suture qui s’ouvre, infection au niveau des suture, voir risques liés à l’anesthésie. 5. Tâche comportementale: Stress lié à la privation alimentaire, perte de poids, impact comportemental/hormonal/métabolique. Notez que ce sont les principales/aux nuisances et effets indésirables qui peuvent etre rencontrés lors de nos expériences. Ceci n'est pas une liste exhaustive et ces effets sont rares lors de nos manipulations.
Devenir
L’issue de chacune des procédures est la mise à mort des animaux afin de pouvoir procéder au prélèvement du cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, vérifier l’expression et la localisation des infections virales, vérifier les zones enregistrées, et d'effectuer des enregistrements electrophysiologiques in vitro.
Remplacement
Diverses alternatives non animales sont disponibles dans le domaine des neurosciences, notamment les approches in silico, in vitro, et ex-vivo. Dans notre projet, nous utilisons des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie optique pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le traitement sensoriel et la perception. Concernant l'approche in silico: Même si les modèles mathématiques peuvent fournir des hypothèses utiles afin de limiter le nombre d'expériences sur les animaux, ils ne peuvent pas remplacer les expériences réelles sur des animaux vivants, bien plus complexes que les modèles actuellement utilisés. Concernant les approches in vitro et ex vivo: Nous continuerons à explorer des alternatives in vitro et ex-vivo telles que la culture cellulaire ou les organoïdes cérébraux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité des circuits neuronaux – encore moins lors de mouvement chez l’animal éveillé. Ainsi, malgré les progrès dans le domaine des alternatives non animales, il n'existe actuellement aucune méthode entièrement substitutive qui puisse reproduire fidèlement les interactions neuronales complexes observées dans un organisme vivant en mouvement.
Réduction
Dans notre laboratoire, nous allons prendre des mesures pour réduire le nombre d'animaux impliqués dans nos expériences. Pour y parvenir, nous avons adopté une stratégie de multiplication des mesures sur les mêmes animaux. Par exemple, nous réalisons des enregistrements éléctrophysiologiques répétées durant plusieurs sessions consécutives chez le même animal, et nous associons plusieurs méthodes d’imagerie, d’analyse du comportement, d’électrophysiologie et d’optogénétique sur le même animal. Nous allons quantifier et évaluer toutes les observations de manière statistique à l'aide de test non parametriques. Ainsi, nous réduisons le nombre de souris utilisées autant que possible tout en garantissant la possibilité d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. En adoptant cette stratégie, nous nous engageons à réduire au minimum le nombre d'animaux impliqués dans nos expériences, tout en veillant à la qualité des données collectées.
Raffinement
Nous prenons des mesures pour garantir le bien-être des animaux utilisés dans nos expériences in vivo, tout en respectant les principes des 3R pour minimiser leur souffrance. Cela grâce à l'utilisation d'anesthésie et d'analgésie adaptés à chaque manipulation. Après les chirurgies, les animaux sont placés dans une chambre spécialement conçue pour le réveil post-opératoire afin de réduire leur stress. Après leur réveil complet, ils sont réintégrés doucement dans leur cage d'origine pour éviter l'isolement. Pour les expériences in vivo, nous effectuons un suivi quotidien en observant leur poids, leur état général, leurs expressions faciales, et leur comportement, et ce pendant plusieurs jours suivant les chirurgies. Si des signes de douleur sont détectés, nous administrons un traitement adapté. Nous utilisons une grille de suivi du bien-être des animaux afin de déterminer les points limites appropriés à chaque animal. En dehors du suivi post-opératoire, nous permettons aux animaux de s'habituer à l'environnement d'enregistrement avant les sessions d'enregistrement, réduisant ainsi leur stress global. Lors d'une restriction alimentaire au cours d'un apprentissage comportemental, le poids et l'apparence des animaux seront surveillés de façon quotidienne afin de veiller au bien-etre des animaux étudiés. Par exemple, si le poids corporel devient inférieur à 80 % du poids initial, les animaux ont un accès libre à la nourriture pendant au moins une semaine. Enfin, dans ce projet, nous veillons à ce que les animaux soient logés dans des cages spacieuses, enrichies, et adaptées à leurs besoins comportementaux et physiologiques. Ces mesures, conformes aux principes des 3R, sont essentielles pour assurer le bien-être des animaux dans nos expériences et diminuer la variabilité de nos résultats (notion de réduction).
Choix des espèces
L'utilisation de la souris en recherche fondamentale est justifiée par plusieurs raisons essentielles. Tout d'abord, les souris partagent de nombreuses similitudes avec les humains au niveau neurologique et comportemental. Les souris sont utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents aux comportements humains. Ceci étant possible grâce aux nombreux outils génétiques disponibles uniquement chez la souris. En effet, les chercheurs ont développé de nombreux modèles de souris transgéniques et utilisent des approches virales pour cibler spécifiquement les circuits neuronaux d'intérêt, afin de révéler leur rôle sur des processus physiologiques et des comportements. En résumé, l'utilisation de souris dans notre projet est cruciale pour comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à la perception sensorielle et au comportement. L’étude ne comporte pas d’aspects liés au développement. Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 1 à 12 mois.Nous utilisons exclusivement des souris adultes dans notre projet pour plusieurs raisons fondamentales. Tout d'abord, la vision chez les souris adultes est déjà à un état stable et mature. De plus, en étudiant la vision chez la souris adulte, nous pouvons éviter les variations importantes qui sont courantes chez les jeunes souris en développement. Les souris en croissance subissent des changements constants dans leur cerveau et leur système visuel, ce qui est intéressant mais peut compliquer l'interprétation des résultats. En travaillant avec des souris adultes, nous minimisons ces variables. Enfin, les souris adultes sont plus faciles à entraîner pour des tâches comportementales, ce qui facilite la mise en œuvre de nos expériences et la collecte de données de manière efficace. En somme, l'étude de la vision chez la souris adulte est plus adaptée à notre projet afin de pouvoir liés mécanismes neuronaux et comportements.
Effets de la perturbation du rythme circadien sur le fonctionnement de l’axe reproducteur chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
369 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 290 tuées à l'issue et 79 gardées vivantes pour être réutilisées. Elles subissent un décalage horaire imposé pendant trois semaines, des frottis vaginaux répétés jusqu'à treize semaines et jusqu'à neuf microprélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours, pour étudier l'effet d'un rythme de travail posté sur la fertilité. Le porteur décrit une irritation vaginale et une douleur modérée liée à l'incision de la queue. Il affirme que l'étude de ces mécanismes exige des "organismes entiers vivants" et ne peut se faire sur des cellules isolées.
Objectifs
La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.
Bénéfices attendus
A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 290 animaux. 79 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.
Effet d’un extrait végétal standardisé dans la prévention des dérèglements métaboliques et inflammatoires associés à l’obésité chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
40 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans une intervention unique de prélèvement sanguin puis d'euthanasie. Leurs organes, notamment des segments d'intestin, sont prélevés pour tester ex vivo un extrait végétal censé agir sur les troubles liés à l'obésité. Le porteur indique n'attendre aucune nuisance et présente les rats comme une étape avant l'espèce cible, le chien, pour prélever des organes qu'il dit non prélevables chez ce dernier. Il affirme que le remplacement des rats n'est pas possible pour compléter les études in vitro et in vivo du projet.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de réaliser des expérimentations ex vivo innovantes pour explorer l'action d'un extrait végétal standardisé, notamment au travers d'un challenge sur des organes d'intérêt (comme les segments d'intestins). En effet de nombreuses études ont révélé le rôle central de la dysbiose intestinale dans l'initiation et l'entretien du syndrome métabolique. L'extrait végétal standardisé étudié pourrait avoir une action prébiotique et être utilisé comme substrats par les micro-organismes de l'Hôte de manière bénéfique. Le premier sous-objectif de ce projet est d'étudier l'impact d'un extrait standardisé sur des dérèglements induits ex vivo mimant ceux observés dans l'obésité. Le second sous-objectif est de comparer cet effet ex vivo entre l'extrait standardisé et plusieurs de ses composants majeurs connus pour leur action bénéfique sur les paramètres étudiés.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse principale est que l'action synergique des composants majeurs de l'extrait végétal standardisé réduisent les effets délétères du challenge mimant les désordres métaboliques de l'obésité. Par ailleurs l'éffet totum de la plante devrait être supérieur à celui de ses composants majeurs. Ainsi ce projet pourrait explorer de nouveaux effets non ou peu connus de cet extrait végétal standardisé et proposer une nouvelle approche pour lutter contre les troubles de l'obésité.
Procédures
Une intervention pour tous les animaux (40 rats) : anesthésie, prélèvement sanguin et euthanasie.
Impact sur les animaux
Les animaux ne recevront pas de traitements invasifs et seront euthanasiés. Une seule contention sera réalisée pour l'injection intra-péritonéale. Pas de nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux.
Devenir
Avant le prélèvement des organes les rats seront euthanasiés.
Remplacement
Le remplacement des rats n'est pas possible pour répondre aux questions de l'étude et compléter les études in vivo et in vitro associées au projet. Les rats sont utilisés afin de valider les effets de l'extrait végétal standardisé étudié avant de mettre en oeuvre les protocoles dans l'espèce cible : le chien ; pour limiter le nombre d'expérimentations sur celui-ci. L'utilisation du rat nous permet aussi d'étudier des organes, non prélevables chez le chien.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum afin de pouvoir effectuer une analyse statistique dont la puissance est suffisante pour pouvoir montrer un effet et anticiper les différences interindividuelles pour répondre aux objectifs de l'étude. Le nombre de prélèvement et de paramètres testés étant répété sur chaque rat, cela permet de réduire leur nombre au minimum et d'avoir des données suffisantes pour répondre aux questions posées par une utilisation optimisée de ces dernières sur chaque animal.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera surveillé tout au long du protocole par leur observation quotidienne de l’état général et du comportement. Les conditions d'hébergement et les méthodes expérimentales utilisées seront les plus adaptées pour réduire toute souffrance et tout dommage que pourraient ressentir les animaux. L'enrichissement du milieu de vie est régulièrement amélioré (mise à disposition des tunnels, des morceaux de bois, du Sizzle dry Kraft pour occuper chaque individu dans la cage). Les animaux sont deux par cages avec eau et nourriture à volonté.
Choix des espèces
Nous utilisons le rat en prémice de l'espèce cible (chien) afin de compléter notre étude pour valider les effets de notre extrait végétal standardisé tout en poussant les analyses sur des organes spécifiques afin d'approfondir notre exploration (comme l'étude de la perméabilité et la réactivité intestinale qui requiert l'analyse de l'intestin en chambre de Ussing et en chambres d'organes isolés), non prélevables chez le chien. Les rats sont acclimatés à l'âge de 6 semaines avant de commencer l'étude à 8 semaines (cycle de 12h jour/nuit). Cela permet d'éviter des résultats faussés par le stress induit lors du changement d'environnement.
Rôles des macrophages périvasculaires dans la physiopathologie des événements hémorragiques dans un modèle d’hyperglycémie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
272 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ischémie cérébrale provoquée, une injection dans le cerveau, la pose d'un cathéter, des séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements de sang répétés à la queue, une hyperglycémie étant induite par injections de streptozotocine, pour étudier le rôle de certaines cellules dans les hémorragies cérébrales après un AVC. Le porteur mentionne un déficit moteur ou cognitif possible et un test comportemental dont il ne précise pas la nature. Les retombées pour les patients sont renvoyées à un horizon lointain, et le porteur affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information.
Objectifs
Les transformations hémorragiques (HT) sont des complications fréquentes chez les patients victimes d'un accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Elles se produisent lorsque le sang traverse la barrière hémato encéphalique (BHE) lésée et pénètre dans le cerveau après un AVC. Une hyperglycémie est présente chez environ 28 à 40 % des patients souffrant d'un AVC. Le plus souvent, cette hyperglycémie est la cause d'un diabète pré-existant chez le patient. Or, l'hyperglycémie augmente le risque de HT ce qui est associé à une aggravation de l'issue de l'AVC et une augmentation de la mortalité. En effet, l'hyperglycémie potentialise l'inflammation, et entraîne une augmentation de la perméabilité de la BHE et donc une augmentation des HT. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment périvasculaire rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Au sein de cet espace, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Les PVM participent à la BHE. De par leur localisation, ces cellules sont à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau. Cependant, le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié et d'autant plus dans des conditions avec comorbidité. Ce projet vise donc à caractériser le rôle des PVM dans la physiopathologie des HT en présence d'un facteur de comorbidité qu'est l'hyperglycémie. Notre hypothèse, basée sur les études précédentes et sur la localisation privilégiée des PVM à l’interface entre le compartiment vasculaire et le parenchyme cérébral, est que les PVM pourraient jouer un rôle déterminant dans les HT et pourraient être affectés par l'hyperglycémie. Pour ceci, nous disposons au sein du laboratoire d'une technique permettant de dépléter spécifiquement les PVM dans les espaces périvasculaires ce qui permet ainsi d'étudier leurs rôles.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de l'implication des macrophages périvasculaires dans les transformations hémorragiques, et notamment dans un contexte de comorbidité, permettra une meilleure compréhension de ce phénomène et à terme, une meilleure prises en charge des patients victimes d'un AVC.
Procédures
#Procédure 1 et 2 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale et pose d'un cathéter veineux (40min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et à J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (15 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16, J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17 , J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min). #Procédure 3 et 4 : Injection intrapéritonéale (30 sec/injection) sur animaux vigiles en contention de J0 à J5 (males), J0 à J6 (femelles). Procédures chirugicales : Injection intracérébroventriculaire (30 min) à J16 (males), J17 (femelles), modèle de transformation hémorragiques (35min) à J21 (males), J22 (femelles). Evaluation des transformations hémorragiques à J22 et à J26 (males), J23 et J27 (femelles) par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (11 min). Prélèvement d'une goutte de sang au niveau de la queue sur animaux vigiles en contention pour mesure de glycémie aux jours J0, J5, J10, J14, J16 , J21 et J26 (males), J0, J6, J11, J15, J17, J22 et J27 (femelles) (30sec/prélèvement). Test comportemental aux jours J0, J16, J21, J22, J26 (males), J0, J16, J21, J22, J26 (femelles) (1 min).
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont du stress lié à la contention (test fonctionnel, prélèvements sanguins), l'induction et le maintient de l'anesthésie (imagerie IRM, procédures chirurgicales). Des douleurs eventuelles liées à la chirugie (pose de cathéter, injection intracérébroventriculaire, ischémie thromboembolique), un déficit moteur ou cognitif (ischémie thromboembolique). De plus le modèle d'hyperglycémie via injection multiple de streptozotocine peut entrainer de la glucosurie, de la polyurie, de la polydipsie.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tissus pour réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est, avec le rat, l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA (activateur tissulaire du plasminogène) au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés, la littérature et un test de puissance statistique. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisé.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Une habituation aux gestes et dispositifs de contention sera réalisée au préalable afin de réduire le stress des animaux lors de ces manipulations. Le réveil des animaux post-chirurgie se fera au calme, dans une enceinte chauffée ventillée individuelle avant leur retour dans la cage. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale et placées dans une armoire chauffée ventilée. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture sera mis en place. Du fait des effets indésirables induit par l'hyperglycémie, une attention particulière sera portée sur l'hydratation (turgescence cutanée) et l'hygiène de la cage des animaux avec des changements de biberons et de cages plus fréquement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’humain. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’humain et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des PVM dans les HT dans le cadre d'une hyperglycémie. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Etude de l’oncogenèse des leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Les souris rendues déficientes pour le gène PTEN développent une leucémie vers onze semaines et sont euthanasiées dès les premiers signes, tandis qu'environ 75 % des animaux générés, dépourvus du génotype recherché, sont tués sans être utilisés. Chaque souris subit une biopsie de la queue et un baguage de l'oreille pour le génotypage, le développement tumoral pouvant entraîner perte d'appétit, de poids et de sociabilité. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe pour modéliser la leucémogenèse et conclut au caractère "crucial" du modèle murin.
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies induites par la prolifération anormale et incontrôlée de cellules lymphoïdes T immatures. Le devenir des patients atteints de LAL-T reste mauvais avec environ 30% de rechute dans les deux ans suivant le diagnostic. Un des défis dans ce domaine est donc d’améliorer la prise en charge thérapeutique de ces patients et cela passe notamment par une recherche fondamentale qui vise à mieux définir les circuits moléculaires oncogéniques responsables de la pathogenèse (avec pour objectif, in fine, de cibler thérapeutiquement ces circuits). Dans ce contexte, le but de ce projet est de mieux comprendre l’oncogenèse des LAL-T en utilisant des modèles murins. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de mimer les LAL-T humaines. Nous nous focaliserons sur le gène PTEN qui est déficient dans environ 20% des LAL-T humaines. Ainsi, les objectifs de ce projet seront de 1°) générer des souris PTEN-déficientes (ces souris développent des LAL-T vers l’âge de 11 semaines); 2°) d’analyser par des technologies de biologie cellulaire et moléculaire différents organes des souris PTEN-déficientes tels que le thymus (organe dans lequel la leucémie se développe) et la rate (organe envahi par les cellules leucémiques). Les souris PTEN-déficientes seront disséquées à différents âges (entre 4 et 11 semaines) ce qui nous permettra d’analyser les stades pré-leucémiques (absence de signes cliniques) et d’étudier les étapes de transformation tumorale.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de suivre les processus de leucémogenèse. Nous pourrons analyser des souris aux étapes pré-leucémiques (absence de signes cliniques), ces étapes sont impossibles à étudier avec les échantillons humains. Le modèle murin de LAL-T nous permet également de maîtriser certaines voies telles que la signalisation du récepteur antigénique des cellules T (TCR). Dans ce contexte les souris PTEN-déficientes seront croisées avec des souris exprimant un TCR transgénique d’intérêt. Notre projet contribuera à une meilleure compréhension du processus de leucémogenèse des lymphocytes T et potentiellement il mettra en lumière de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les souris seront génotypées, pour cela une biopsie de queue sera réalisée ainsi qu'une identification à l'oreille (bague). La durée du prélèvement caudale est de l’ordre de 5 secondes. Le génotypage sera réalisé une fois dans la vie de l'animal à l'âge de trois semaines.
Impact sur les animaux
Toutes les souris seront soumises à une biopsie caudale entrainant une nuisance sur les animaux. De plus, une partie des souris développeront une leucémie T. Dans le cadre du génotypage, toutes les souris subiront une biopsie de queue ainsi qu’un baguage à l’oreille (afin de les identifier). Grâce à ce génotypage nous saurons précisément quelles sont les souris qui seront leucémiques et nous pourrons les surveiller en conséquence. Dès 10-11 semaines, les animaux seront soumis à des observations et pesées à une fréquence adaptée, qui peuvent être source de stress. Le développement tumoral pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. De manière générale, nous prendrons le soin d’évaluer l’apparition des signes de la douleur des animaux grâce à la grille d’évaluation de la douleur/points limites fournie en annexe 1.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure. En effet, les souris de génotype homozygote (PTEN-déficientes) développeront une tumeur et seront euthanasiées avant ou dès l’observation des premiers signes cliniques afin de leur éviter une souffrance. Notre procédure impose l’utilisation de souris hétérozygotes pour nos accouplements (car les femelles homozygotes tomberaient malade en cours de gestation). Par conséquent la majorité des animaux générés (environ 75%) ne possèdera pas le génotype d’intérêt, ne développera pas de tumeur et ne sera pas utilisés dans notre étude ; donc ces animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucune alternative à l’expérimentation animale lorsqu’il s’agit de modéliser le processus complexe de leucémogénèse. Le modèle murin est donc crucial pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux impliqué dans ce projet a été déterminé en fonction du nombre de portées générées. Nous estimons obtenir pour chaque souche 16 portées (d’environ 6 bébés) par an (donc 96 souris). Ainsi 96 souris x 3 souches x 5 ans (durée du projet) généreront au final 1440 souris. De plus, nous limiterons le nombre d'animaux: 1) En réalisant seulement 4 accouplements par an pour chaque souche, ce qui permet d’obtenir un nombre suffisant de souris d’intérêt, car selon la loi Mendélienne, 25% des souris générées posséderont le génotype d’intérêt. 2) En utilisant les deux sexes pour nos expériences de biologie moléculaire et cellulaires. 3) En utilisant les souris ayant un génotype sauvage en tant que contrôles dans nos expériences.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet seront réalisées en tenant compte du bien-être animal dans le strict respect des réglementations en vigueur et en étroite collaboration avec la structure du bien-être animal de notre établissement. L’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température 20-22°C, renouvellement d’air : 15 volumes/heure, éclairage artificiel lumière avec un cycle de 12h), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Le nombre d’animaux adultes par cage sera au maximum de 5. L’environnement sera enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. L’état de santé des souris sera quotidiennement surveillé par du personnel compétent afin de déceler le plus précocement une altération du bien- être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage. De plus, nous avons établi des points limites : si les animaux les atteignent, ils seront euthanasiés ce qui mettra fin à la procédure.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’étude du système immunitaire et des hémopathies. Par ailleurs, la communauté scientifique possède un large spectre de souris mutantes que nous pouvons utiliser dans le cadre de notre projet visant à décrypter l’oncogenèse des LAL-T. Dans ce contexte, le modèle murin est le modèle le plus pertinent pour suivre les processus de leucémogenèse. Dans notre projet nous utilisons des souris dans lesquelles le gène PTEN a été inactivé (souris appelées Ptendel dans notre projet). Nous analyserons des souris adultes, âgées entre 1 mois et environ 3 mois, car notre but est d’étudier des souris à différents stades de la leucémogenèse (de pré-leucémique à leucémique).
Thérapie génique innovante pour la gestion de la spasticité après lésion médullaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
679 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Chaque animal subit une section complète de la moelle épinière, chez le nouveau-né comme chez l'adulte, pour induire une spasticité, puis des injections que le porteur pratique sans analgésie au motif que l'animal "ne ressent plus rien" sous la lésion. Il décrit chez les adultes des troubles urinaires persistants imposant une vidange manuelle de la vessie, un risque d'infection et de mutilation, et chez les nouveau-nés un risque de cannibalisme maternel envers les petits blessés. Le porteur affirme que le modèle murin lésé reste "indispensable" faute d'exploration fonctionnelle directe possible chez l'humain.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est de trouver un traitement efficace pour réduire la spasticité. La spasticité est un trouble moteur qui survient tardivement après une lésion de la moelle épinière. Elle se manifeste par une forte résistance musculaire à l’étirement, en raison d'une hyperexcitabilité du réseau de neurones qui connecte le muscle. Elle s’accompagne souvent de spasmes (mouvements involontaires) et d’une hypersensibilité à des stimuli sensoriels normalement bénins. Ce que l'on constate au niveau cellulaire, c'est une excitabilité anormalement élevée des neurones moteurs (MNs). Toutefois, les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de cela ne sont pas élucidés. Des travaux récents ont montré l'implication d'une famille de protéines présente à la surface des MNs, dans ce phénomène. Leur présence est fortement diminuée après la lésion de la moelle épinière, conduisant à une plus grande excitabilité du neurone et contribuant à l'apparition de la spasticité. En tentant de générer de nouvelles protéines à la surface du neurone grâce à l'outil génétique et en faisant une étude approfondie des mécanismes mis en jeu d'un point de vue fonctionnel et structurel, ce projet a pour but de diminuer la spasticité du réseau neuronal contrôlant la locomotion.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables du déséquilibre entre excitation/inhibition au sein du réseau moteur sous-lésionnel. En ciblant spécifiquement ces protéines par l'outil génétique sur le modèle murin, ces études approfondies fourniront des données solides pouvant être transposées à la recherche clinique. En effet, ce travail proposera des outils thérapeutiques innovants pour répondre précisément aux besoins des patients souffrant de spasticité, car à l'heure actuelle le choix médicamenteux est très restreint avec beaucoup d'effets secondaires indésirables, et avec une efficacité éphémère. Ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté biomédicale travaillant sur la spasticité.
Procédures
Une lésion de la moelle épinière sera réalisée sous anesthésie générale sur l'ensemble des animaux de ce projet (durée intervention 5-8min sur nouveau-né, 30min chez animal adulte) suivie d'une seule injection d'un composé potentiellement thérapeutique dans la patte postérieure gauche et droite de chaque animal (durée de l'intervention 5min). Le mode d'injection intrathécale juste au-dessus de la surface de la moelle épinière est envisagé en alternative de l'injection en intramusculaire chez l'animal adulte (durée de l'intervention 10min sous anesthésie générale). Une implantation d'électrodes sera faite sur les souris adultes sous anesthésie gazeuse (durée de l'intervention 30min). Une fois lésés, les animaux ne ressentent plus la douleur dans leur arrière train donc toute injection dans la cavité du péritoine (durée intervention 1min) se fera sans analgésie préalable aussi bien chez la souris nouveau née que chez la souris adulte. Chez les jeunes souris cette injection sera faite soit une fois par jour sur une période de 7 jours, à partir du sixième jour après la naissance (noté P6), soit 2 jours consécutifs à P6/P7, à P13/P14 et à P20/P21. Ches les souris adultes les injections se feront juste avant les expérimentations. Des enregistrements électromyographiques (EMG) des muscles de la patte postérieure avec l'animal en contention sans analgésie préalable (car l'animal ne ressent plus rien en dessous de la lésion) et des vidéos de l'animal pour observer son comportement seront faits.
Impact sur les animaux
Afin d'induire une hyperexcitabilité de la moelle épinière et des symptômes de spasticité, nous procédons à une lésion complète de la moelle épinière chez les souris, tant néonatale qu'adulte. Suite à cette intervention les symptômes de la spasticité se manifestent quelques jours seulement après la lésion chez les jeunes souris. En revanche, chez les souris adultes, ces symptômes apparaissent après plusieurs semaines. Bien que les souris opérées pendant leur période néonatale retrouvent spontanément une récupération satisfaisante de la vessie, celles opérées à l'âge adulte montrent des troubles de la vessie plus persistants, nécessitant une vidange manuelle jusqu’à la restauration complète de la fonction urinaire (généralement trois semaines après la lésion). Une autre conséquence de la chirurgie peut être l’émergence de la douleur. Suite à l’intervention, une perte de poids (10%) peut être observée. Chez les souris adultes des risques d'infections urinaires sont à prévoir ainsi qu'un risque de mutilation. L'isolement des animaux adultes opérés qui est nécessaire le temps de la cicatrisation du site d'incision, peut induire du stress. Les manipulations et les changements de lieux, des animaux pour les enregistrements electromyographiques et vidéos peuvent également engendrer du stress.
Devenir
Les animaux participant à la procédure 1 (21 souris) seront euthanasiés à la fin de celle-ci, car ils ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expériences. Quant aux animaux participant aux procédures 2, 3 et 4 (658 souris), ils seront également euthanasiés et leurs tissus seront prélevés pour une étude approfondie de l'activité et la fonctionnalité des cellules nerveuses mais aussi pour les protéines présentes à leur surface.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre et à lutter contre la pathologie du système moteur suite à une lésion de la moelle épinière. Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux sollicités. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle, en effet, le modèle de spasticité chez la souris possède les principales caractéristiques de la spasticité chez l'homme. Comme la compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, le modèle murin, reste pour le moment, indispensable. Nous supposons ainsi que l'identification d'un acteur principal dans cette pathologie chez la souris, aurait un potentiel thérapeutique significatif pour l'homme.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 679 animaux lésés. Il s'agit d'une continuation directe des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Afin de minimiser davantage ce nombre, les médicaments testés seront administrés en série aux mêmes groupes expérimentaux lors des différentes procédures. À l'exception de la procédure 1, où les animaux seront euthanasiés à la fin, les tissus seront prélevés à la fin des autres procédures pour être utilisés, ce qui permettra de limiter encore le nombre d'animaux. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. L'expérimentateur ne sera pas informé du groupe expérimental afin d'éviter tout biais possible.
Raffinement
Souris nouveau-nées - Les animaux anesthésiés, reçoivent une injection d'analgésique. Une fois opérées, les souris sont maintenues en fratrie et ramenées à la mère. Pour minimiser les épisodes de cannibalisme de la mère envers les nouveau-nés blessés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements anxieux. De plus, nous utilisons des friandises autorisées comme récompense pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...).Que ce soit pour la chirurgie ou les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur et les zootechniciens, en observant des points limites. Souris adultes - Chez les individus adultes,une injectiond'analgésique sera administrée deux fois dans les 24 heures suivant la lésion de la moelle épinière ou l'implantation des électrodes d'enregistrement. Deux fois par jour, leur vessie sera vidée manuellement jusqu'à la récupération de la fonction urinaire. Leur température et leur hydratation seront également vérifiées, et tout signe clinique de douleur sera surveillé. Une semaine après la lésion, les animaux seront logés par deux par cage, avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès illimité à la nourriture et à l'eau. De la même manière, l'hébergement sera enrichi à l'aide de rondin de bois et tunnel et de matériel de nidification. Du gel nourrissant sera proposé aux animaux âgés de plus de 15 jours à chaque sortie de leur zone d'hébergement pour les séries d'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle de souris est utilisé dans notre étude car c'est un modèle de spasticité reconnu. Nous supposons que l'identification des mécanismes moléculaires engendrant cette pathologie pourrait avoir un potentiel thérapeutique significatif pour d'autres mammifères, y compris l'homme. La compréhension de ces mécanismes ne peut être obtenue par une exploration fonctionnelle directe chez l'humain, ainsi une grande partie de cette recherche a déjà été menée sur des lignées cellulaires et par modélisation. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal lésé demeure essentielle. Le modèle de spaticité chez la souris juvénile est choisi en première intention car l'apparition de la spasticité est plus rapide (5 à 6 jours) que chez l'adulte (4 semaines). Ce modèle est également compatible avec les investigations fonctionnelle qui font appel à la technique d'électrophysiologie, ce qui n'est pas le cas du modèle de spasticité adulte. Enfin la gestion des animaux opérés est plus simple car c'est essentiellement la mère qui s'en charge. Juste une surveillance accrue des animaux pour déceler une souffrance, ou un comportement anormal relative à la chirurgie est faite par l'expérimentateur et le zootechnicien. Nous avons choisi cette lignée de souris pour les raisons suivantes : (1) les mères de cette souche ont un bon instinct maternel et prennent généralement bien soin des nouveau-nés, y compris ceux qui sont blessés ; (2) les portées sont plus nombreuses que chez les autres souches de souris, avec une moyenne de 12-14 nouveau-nés par portée ; (3) les nouveau-nés sont plus gros à la naissance (poids moyen = 1,6 - 1,8 g), ce qui augmente le taux de survie après une lésion de la moelle épinière. Une partie des animaux sera utilisée à un stade développemental précoce correspondant à la première, deuxième et troisième semaine postnatale. Un autre groupe d’animaux sera étudié à l’âge adulte (procédure 4), afin de valider l'efficacité de cette thérapie génique sur un système mature, mais également pour se rapprocher le plus possible des essais cliniques chez l'homme.
Etude de l’inflammation via la caractérisation en IRM moléculaire des molécules d’adhésion cellulaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Une inflammation cérébrale leur est induite par injection intracérébrale d'une protéine bactérienne, et un accident vasculaire cérébral par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivis de la pose d'un cathéter et d'une imagerie moléculaire, avant mise à mort pour immunohistochimie. Le porteur indique que l'AVC peut entraîner un affaiblissement transitoire de la patte avant et que la pose du cathéter provoque une douleur modérée. Il affirme que la biodistribution des particules d'imagerie doit être étudiée dans un organisme complet et que l'expérience ne peut être totalement remplacée par des études in vitro.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Notre étude sera basée sur l’expression de molécules d’adhésions qui sont impliquées dans la migration des cellules immunitaires au sein du parenchyme cérébral. Il a été montré dans la littérature que l’inflammation post-AVC jouait un rôle dans la physiopathologie de la maladie, c’est pourquoi il nous apparait pertinent de caractériser l’expression de ces molécules d’adhésion.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication des molécules d'intérêts lors d'une inflammation
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Nous allons injecter une protéine bactérienne inactive dans une région du cerveau spécifique afin d’induire une inflammation du cerveau (durée : inférieure à 30min). Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) Induction du modèle d'AVC par une injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne (durée : 1h30) Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) Imagerie moléculaire avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. De plus, l’injection de LPS en intra-striatale peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le LPS est un PAMP, motif moléculaire associé à un agent pathogène, qui active la voie NF-κB par l'intermédiaire du TLR4 et induit l'expression de cytokines pro-inflammatoires telles que TNFα, IL-6 et IL-1β. Enfin, l'injection intraveineuse de traceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée. Des analgésiques sont prévus afin de limiter et minimiser autant que possible la gêne occasionnée. Concernant les souris ayant eu un AVC, il est possible de voir apparaitre un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l’AVC.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses en immunohistochimie
Remplacement
Avant toute étude in vivo nos particules ont été testées in vitro afin de vérifier leur bon fonctionnement et spécificité. Cela nous permet de réduire le nombre d’animaux en ne leur injectant pas de particules inefficaces. Les expériences in vivo ne peuvent être totalement remplacée par des études in vitro car nous avons besoin de mettre en évidence l’affinité de nos particules pour les molécules d’adhésion endothéliales exprimées en conditions inflammatoires dans un organisme complet. En effet ; l’étude de leur bio-distribution in vivo est un point essentiel à notre projet de recherche. Après les expérience d’imagerie, les animaux sont perfusé afin de récupérer les tissus. Des études de microscopie sont réalisées par la suite sur ces tissus afin de confirmer nos observations réalisées in vivo. Cela nous permet également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cage standards répondant aux normes européennes actuelles (directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur la grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle des molécules d’adhésion cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.
Développement préclinique d’un traitement des maladies mitochondriales liées à des défauts de l’ADN mitochondrial, par thérapie génique sur deux modèles murins (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
5 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées, dans le second volet d'un projet mené sur deux établissements. Comme dans le premier, des lignées privées d'un gène mitochondrial développent une maladie cardiaque grave ou des crises d'épilepsie mortelles, avant une thérapie génique par injections pratiquées jusque sur des nouveau-nés anesthésiés par hypothermie. Chaque animal subit échocardiographies, prélèvements sanguins hebdomadaires et injections intrathécales, les tests comportementaux restant non précisés. Le porteur affirme ne pas pouvoir prédire sur cellules la production de protéine dans un organisme vivant et conclut à la nécessité de la souris.
Objectifs
Les mutations du gène d'intérêt sont responsables de maladies rares qui peuvent être graves. Ces maladies se manifestent souvent dès l'enfance et peuvent affecter plusieurs parties du corps, comme le cerveau, le cœur et le foie. Malheureusement, il n'y a actuellement aucun traitement pour ces maladies, et les traitements existants visent uniquement à soulager les symptômes sans arrêter la progression de la maladie. Ce gène d'intérêt est responsable de la production d'une protéine essentielle pour notre corps, en particulier pour produire de l'énergie dans nos cellules. Cependant, lorsque ce gène est altéré par des mutations, il provoque des problèmes dans la production d'énergie, ce qui peut être très dommageable. Notre projet vise à atteindre trois objectifs principaux : 1. Nous allons créer deux modèles de souris malades en les privant du fonctionnement du gène d'intérêt, soit dans le cœur et les muscles, soit dans les neurones. Nous pensons que ces souris développeront des problèmes similaires à ceux que l'on observe chez les humains. 2. Nous allons développer des virus spéciaux pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. Ces virus agissent comme des petits véhicules pour réparer le gène défectueux. 3. En utilisant ces modèles de souris, nous espérons développer un traitement pour les maladies liées aux mutations du gène d'intérêt en utilisant la thérapie génique. En injectant ces virus dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Parce que c'est difficile de faire en sorte que ces virus atteignent le cerveau, nous allons d'abord utiliser des souris où le gène d'intérêt est éteint dans le cœur et les muscles, comme modèle alternatif pour développer notre approche thérapeutique. Avant de tester ces virus sur des souris malades, nous allons d'abord effectuer des tests sur des souris en bonne santé pour comprendre comment le gène étranger fonctionne dans les organes affectés. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Jusqu'à présent, il n'existe aucun traitement pour guérir ou contrôler l'évolution des maladies causées par les mutations du gène d'intérêt. Pour remédier à cette situation, nous travaillons sur la création de modèles de souris qui reproduisent ces maladies. Ces souris nous permettront d'évaluer en toute sécurité et sur le long terme l'efficacité des virus spéciaux conçus pour réparer le gène d'intérêt défectueux. Si ces tests sur les souris réussissent, cela signifie que nous pourrions éviter d'entreprendre des essais inutiles sur des humains, réduisant ainsi leurs souffrances. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques. Notre objectif principal est de développer des traitements pour les personnes atteintes de ces maladies en utilisant des virus adaptés à l'injection chez les humains. Cela pourrait apporter un grand espoir à ceux qui sont touchés par ces maladies.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les gestes suivants: 1. Échocardiographie : Un examen échographique du cœur qui dure 20 minutes par souris. Il sera effectué une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines lors de la création, et l'étude des souris malades ou une semaine avant l'injection lors de la sélection, de l'optimisation et du développement du traitement. La durée sera jusqu'au point limite adapté pour les souris contrôles malades, ou 12 semaines après ce point pour celles qui ont reçu des injections et présentent une amélioration de leur état de santé lors du développement et de l'optimisation du traitement. 2. Tests comportementaux durent de 5 à 30 minutes par souris. Ils seront réalisés une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines ou une semaine avant l'apparition de problèmes comportementaux, et se poursuivront jusqu'au point limite prédéterminé. 3. Injections : a) Injections dans la veine temporale dureront environ 5 minutes par souriceau et seront effectuées une fois, sous anesthésie par hypothermie. b) Les injections intrathécales, sous anesthésie générale (environ 40 min par souris), et dans la veine caudale (5 min par souris) seront réalisées une fois. 4. Le prélèvement de sang au niveau de la veine maxillaire, dure ~1 min par souris et sera effectué une fois par semaine. a) Pour les souris injectées par voie intrathécale et dans la veine caudale, les prélèvements de sang commenceront une semaine avant l'injection, puis 72 heures après l'injection, et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. b) Pour les nouveau-nés, les prélèvements commenceront à l'âge de trois semaines et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. Tout le projet se déroulera dans dans l'établissement 1, à l'exception des échographies qui auront lieu dans l'établissement 2.
Impact sur les animaux
Les souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans les neurones naîtront sans signe de problème, mais elles développeront progressivement des difficultés de marche et de coordination. En fin de vie, ces souris connaîtront des crises d'épilepsie mortelles. Pour les souris où l'expression du gène d'intérêt est abolie dans le cœur et les muscles squelettiques, elles naîtront sans problème apparent, mais avec le temps, elles développeront une maladie du cœur grave, comme cela a été observé dans d'autres modèles de souris similaires. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les souris seront soumises à des situations stressantes liées à l'injection, aux tests comportementaux, au transport depuis l’institut jusqu'au centre spécialisé en échocardiographie, ainsi qu'à l'anesthésie pour les échocardiographies. Les injections intrathécales peuvent causer une certaine douleur après l'injection, mais des mesures seront prises pour minimiser leur inconfort.
Devenir
Mise à mort pour l'analyse des tissus.
Remplacement
Nous effectuerons des tests sur des cellules pour identifier les morceaux génétiques qui n'expriment pas du tout ou très faiblement le matériel génétique prévu. Cependant, il est important de noter que, même si nous pouvons déterminer ces caractéristiques sur cellules, nous devons encore utiliser des modèles animaux pour nos recherches. C'est parce que nous ne pouvons pas prédire avec certitude combien de la protéine souhaitée sera produite à l'intérieur d'un organisme vivant, et si la quantité générée sera suffisante pour traiter la maladie.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes et des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour évaluer l'efficacité du traitement de manière fiable et statistiquement significative. Pour la création et l'étude des modèles de souris malades, nous réduirons le nombre d'animaux en effectuant plusieurs types d'analyses, lorsque cela est possible. Par exemple, la détermination du début et de la progression du phénotype sera effectuée en parallèle avec des tests comportementaux et les tissus extraits des souris à un stade avancé seront utilisés pour des expérimentations de biologie moléculaire. L'échographie est une autre méthode qui nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires, car elle permet de suivre l'évolution des souris au fil du temps, évitant ainsi une mise à mort répétée. Une approche similaire peut être appliquée à la sélection des vecteurs, l’optimisation et le développement du traitement.
Raffinement
Nous mettons en place des pratiques visant à réduire la souffrance des souris tout au long de notre recherche. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Les souris seront surveillées au moins deux fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance ou d'anxiété. Lors des injections effectuées sur les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress. Cela inclut l'éloignement temporaire de la mère, la préservation de la litière de la cage maternelle, et un prélèvement de sang minime, effectué par un personnel expérimenté de la veine sous-maxillaire considérée comme étant une des zones les moins sensibles. Pour les injections intrathécales, une anesthésie générale sera administrée, et des analgésiques seront utilisés avant et après l'injection pour éviter toute douleur. Nous mettrons en place un suivi régulier des souris. Les cages seront aménagées avec des éléments pour leur bien-être, tels que des boules de coton, des maisons pour se cacher, et des objets à ronger. L'isolement prolongé sera évité autant que possible pour assurer une stimulation sociale. Le transport des souris entre l’institut et le centre expert en échocardiographie se fera dans des cages de transport spécialement conçues, dans des véhicules adaptés pour réduire les vibrations et le bruit.
Choix des espèces
L'utilisation de mammifères est essentielle pour évaluer l'efficacité des virus dans le développement de la thérapie génique. Les souris sont couramment choisies pour les essais de phase I/II en raison de leur similitude physiologique avec les humains et de leur facilité d'élevage et de soins. De plus, les modèles de souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans le cœur et le cerveau peuvent développer une pathologie qui ressemble aux symptômes de la maladie gène d'intérêt chez l'homme. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines et plus. Nous commencerons par des nouveau-nés, car à cet âge, le virus peut atteindre le cerveau. Cependant, étant donné que l'expression du virus peut diminuer pendant la croissance rapide des nouveau-nés, nous utiliserons également des souris jeunes adultes (3 à 6 mois) pour certaines parties de nos expériences.
Modulation cholinergique des neurones épineux moyens du striatum afin d’améliorer les stéréotypies dans un modèle des troubles du spectre de l’autisme chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
332 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères à modérées. Elles portent une mutation reproduisant des comportements répétitifs proches de l'autisme et subissent des tests comportementaux d'exploration, des injections, et pour une partie une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de trente à quarante minutes sous anesthésie. Le projet teste si des traitements augmentant une substance du striatum réduisent ces stéréotypies. Le porteur affirme que les méthodes in vitro ne peuvent remplacer l'organisme entier et que des souris vivantes sont nécessaires, les tests comportementaux étant décrits comme sans stress ni souffrance.
Objectifs
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) sont diagnostiqués sur la base de troubles du comportement, notamment des déficits de la communication et des interactions sociales, ainsi que des comportements répétitifs (stéréotypies) avec des champs d’intérêts restreints. Les causes des TSA sont encore mal connues, mais plusieurs recherches ont établi que de mutations dans certains gènes sont impliquées. Plusieurs de ces gènes participent, d’ailleurs, au développement et au fonctionnement du cerveau. Nos travaux apportent un faisceau d’arguments convergents, à partir d’études menées chez l’Homme et sur des modèles de souris, en faveur de l’existence d’un lien direct entre des mutations d’un gène et les TSA. En particulier, nos souris avec des mutations de ce gène montrent des comportements répétitifs (stéréotypies) qui miment ceux typiques des TSA. Notre hypothèse, basée aussi sur nos travaux précédents, est que ces comportements répétitifs soient dus à une réduction des niveaux d’une substance chimique sécrétée par les neurones d’une zone du cerveau nommée striatum, comme dans d’autres cas de comportements stéréotypés. A l’heure actuelle il n’existe pas des traitements médicamenteux généralisés pour les TSA, cependant certains des symptômes peuvent être pris en charge spécifiquement. Dans ce contexte, nous proposons d’utiliser nos souris afin tester si leurs comportements répétitifs peuvent être améliorés par un traitement qui vise à augmenter les niveaux de cette substance dans le cerveau. Dans ce cadre, nos objectifs principaux sont : 1. Effectuer des tests comportementaux permettant de mettre en évidence des stéréotypies chez les souris mutantes, par rapport à leurs contrôles. 2. Tester des traitements qui augmentent les niveaux de cette substance sont capables d’améliorer ces déficits comportementaux. Cela pourrait fournir des indications thérapeutiques pour le traitement des comportements stéréotypés, associés ou pas aux TSA.
Bénéfices attendus
Des mutations dans plusieurs gènes sont impliquées dans les troubles du spectre de l’autisme (TSA). Dans ce contexte, ce projet a pour objectif de tester des traitements permettant de corriger des comportements stéréotypés chez la souris modèle des TSA dus à la mutation d’un de ces gènes. Si ces traitements se révèlent efficaces dans cette phase préclinique, ils pourraient être testés en phase clinique afin d’améliorer les comportements stéréotypés chez des patients atteints des TSA. D’ailleurs, un des traitements testés dans ce projet est actuellement utilisé en clinique pour le traitement de certaines formes de TSA et pour la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Ce projet comprend 3 types d’intervention : Intervention 1 : Tests comportementaux sur l’ensemble des animaux qui ne comportent pas de souffrances ou stress, afin de détecter des comportements stéréotypés spontanés typiques des modèles murins des TSA. Un test par souris, durée max 30 minutes. Intervention 2 : Injections systémiques i.p. et s.c. sur animal vigile afin d’induire une anesthésie générale et d’administrer les traitements post-opératoires (analgésiques e anti-inflammatoires) et pharmacologiques. Pour les traitements pharmacologiques d’une partie des animaux : deux injections par souris (1 pour l’habituation et 1 pour le traitement), éventuellement des injections quotidiennes sur 5-7 jours si le traitement unique est inefficace. Durée des injections : quelques secondes. Intervention 3 : Injections intracérébrales par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale gazeuse (isoflurane) pour une partie des animaux. Une chirurgie (bilatérale) par souris. Durée de la chirurgie : 30-40 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une batterie de tests comportementaux pour évaluer les effets bénéfiques des traitements prévus sur les stéréotypies. Ces tests sont basés sur des comportements spontanés d’exploration et ne comportent pas de stress ni de souffrance des animaux. Une partie des animaux subira des injections i.p. de solution saline ou de produits chimiques qui sont non toxiques et non douloureux ; les injections pourraient engendrer du stress de contention et de la douleur aiguë. Une partie des animaux subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale profonde (classée modérée), pouvant engendrer douleur post-opératoire et stress. Cette chirurgie ne comporte pas de lésions ou d’autres interventions qui peuvent affecter le bien-être animal après l’opération.
Devenir
A la fin des procédures, les souris ne seront pas utilisées pour d’autres expériences dans le cadre de ce projet ou d’autres projets de recherche. Par conséquent, toutes les souris seront mises à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de l’isolement des neurones du contexte physiologique. De plus, l’utilisation de souris vivantes est nécessaire pour tester l’efficacité des traitements visant à améliorer les stéréotypies.
Réduction
Nous nous efforçons d’utiliser le moins d’animaux possible (optimisation des conditions d’élevage, des croisements etc.), tout en veillant à ce que le nombre d’animaux utilisé soit représentatif. Ce projet, d'une durée de 5 ans, nécessitera l'utilisation de 332 souris mâles adultes, réparties en plusieurs groupes (n= 12 à 14 par groupe en fonction du type d’expérience). Cela a été estimé sur la base d’expériences antérieures, et grâce à des outils statistiques permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires. Cependant, ce nombre prévu pourra être réduit en fonction des résultats obtenus dans les tests comportementaux. Ce projet de recherche devrait permettre une meilleure compréhension de la pathophysiologie du trouble de l’autisme et permettre à terme de développer une approche thérapeutique pour cette maladie.
Raffinement
La chirurgie est optimisée pour réduire la durée de l’opération (environ 30-40 min) et minimiser la souffrance. La souffrance est modérée car la chirurgie est réalisée sous anesthésie générale profonde gazeuse. Les principaux paramètres vitaux sont contrôlés tout au long de la chirurgie. Afin de diminuer la douleur, un analgésique puissant à action prolongée est administré 30 minutes avant la chirurgie. En complément, un analgésique anti-inflammatoire est administré à la fin de l'opération pour anticiper l’apparition d’éventuelles douleurs et hydrater l’animal, puis en postopératoire pendant au moins 3 jours, la durée de traitement dépendant de la réponse observée. Après le réveil de l’anesthésie, les animaux sont surveillés afin de détecter des signes éventuels de souffrance ou de stress, qui seront pris en charge le cas échéant. Personnel animalier et expérimentateurs s’assurent d’une bonne récupération postopératoire des animaux. Des grilles d’évaluation adaptées sont mises en place pour évaluer des signes de souffrance ou mal-être potentiels des animaux. L’analyse comportementale sera réalisée chez les animaux vigiles qui ne doivent pas être stressés pour ne pas compromettre leurs performances. Pour favoriser le bien-être et l’interaction sociale, les souris seront hébergées de deux à quatre par cage avec eau et nourriture à volonté, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques (température, humidité) et sanitaires, ainsi que le bien-être des animaux, sont strictement contrôlés. Ils auront à leur disposition de la litière foisonnante (diminuant le stress de l’animal et facilitant sa thermorégulation) ainsi qu’un environnement enrichi par des bûchettes en peuplier et des tubes en PVC. Afin de diminuer l’inconfort/stress générés par ce type d’expérimentation comportementale, les souris auront une période d’habituation d’une semaine aux salles d’expérimentions où elles seront manipulées par l’expérimentateur en charge de l’étude.
Choix des espèces
Les troubles du spectre de l’autisme (TSA) ne peuvent être étudiés qu’in vivo, car ils sont définis par des comportements caractéristiques (déficits dans les interactions sociales et mouvements répétitifs ou stéréotypés) qui nécessitent d’animaux vivants pour être mis en évidence. La possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est indispensable pour reproduire les symptômes des TSA dus à la délétion d’un gène. Nous utiliserons donc ces souris pour des expériences visant à mettre en évidence des stéréotypies, afin de tester si des traitements qui peuvent restaurer la fonction d’une région du cerveau impliquée dans les TSA peuvent améliorer ces comportements. L’âge des souris utilisées sera de 12 à 14 semaines au début de la procédure : cela a l’avantage d’avoir des animaux adultes capables d’effectuer les tâches comportementales prévues dans la procédure expérimentale, tout en minimisant la durée de leur stabulation.
Etude du système endocannabinoïde dans le syndrôme de Sanfilippo.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
396 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 72 dans des procédures sans réveil et 324 classées légères. Chaque animal reçoit une injection intrapéritonéale tous les trois jours pendant deux semaines, pouvant provoquer stress et douleur, avant d'être disséqué pour prélever le cerveau. Le projet, mené sur des souris génétiquement modifiées reproduisant le syndrome de Sanfilippo, étudie le rôle d'une enzyme dans la neuro-inflammation associée à cette maladie. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne remplace un "animal entier" vivant et présente les pistes thérapeutiques comme un objectif du projet.
Objectifs
Les maladies de surcharge lysosomale (MSL) constituent un groupe hétérogène d’environ 70 maladies caractérisées par un dysfonctionnement du lysosome. Ces maladies sont individuellement rares mais touchent globalement plus d’un cas pour 4000 naissances. La maladie de Sanfilippo (MPSIIIB), une maladie des MSL, est caractérisée par une accumulation des Oligosaccharides d’Héparane Sulfate (HSO) dans les tissus y compris dans le système nerveux central (SNC). Cette accumulation progressive induit une série de conséquences pathologiques incluant une neurodégénérescence, une neuro-inflammation et un stress oxydant. La neuro-inflammation très précoce est en grande partie à l’origine des premiers symptômes de la pathologie. Il a été montré, dans des modèles murins de MPSIII, que l’utilisation d’anti-inflammatoires tels que l’aspirine ou la prednisolone permettait de réduire la neuro-inflammation, améliorer les symptômes et entraîner une normalisation de certains marqueurs de la neuropathologie. Les limites de l’utilisation de ce type de molécules sont en grande partie dues à des doses d’efficacité excessives et à un mauvais passage de la barrière hématoencéphalique (BHE). Par conséquent, il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques anti-inflammatoires. Parmi ces nouvelles cibles, des études très récentes soulignent l’intérêt d’une manipulation du système endocannabinoïde (ECS) dans la prise en charge des MSL. Le rôle anti-inflammatoire de l’ECS est aujourd’hui clairement démontré et est, de fait, une nouvelle voie thérapeutique potentielle lors de pathologies neurodégénérescentes. Nous avons récemment découvert au laboratoire une nouvelle enzyme impliquée dans l'ECS et présente dans le SNC. Le but de ce projet est d'étudier le rôle de cette enzyme dans les évènements clés de la neuro-inflammation associée au syndrôme de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettront de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement du syndrome de Sanfilippo et notamment pour le traitement de la neuro-inflammation associée.
Procédures
Les animaux utilisés pour cette étude seront soumis à 1 injection en intra-péritonéal tous les 3 jours pendant 2 semaines (soit maximum 5 injections). Après la mise à mort, les cerveaux seront prélevés.
Impact sur les animaux
Durant l'expérimentation, les animaux seront soumis à 1 injection tous les 3 jours durant 2 semaines en intra-péritonéal pouvant provoquer du stress et/ou de la douleur chez l'animal. L'état général des animaux pourrait être de ce fait altéré.
Devenir
Tous les animaux inclus dans chaque procédure seront mis à mort et disséqués afin de collecter les cerveaux pour les différentes analyses.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative pour analyser le rôle du système endocannabinoïde dans la neuro-inflammation lors de pathologies neurodégénérescentes. Cette étude nécessite la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Pour cela, il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Nous utiliserons des souris C57BL6 sauvages ou génétiquement modifiées. Le nombre de 6 animaux par groupe expérimental avec 3 expériences indépendantes est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs adaptés.
Raffinement
Pour cette étude et dans le but d'éviter et d'atténuer toute forme de souffrance des animaux, un contrôle quotidien sera effectué durant toute la durée d'expérimentation. Après une pesée initiale le jour de la première injection des molécules en intra-péritonéal, les animaux seront pesés tous les 2 jours. Durant toute la période d'expérimentation, l'état général et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement par le personnel de zootechnie. Un enrichissement du milieu sera ajouté (igloo, carrés de coton) pour permettre aux animaux de faire leur nid. Dans le cas où un animal montrerait une altération de son état général, il sera euthanasié. Tout le personnel de zootechnie et les expérimentateurs sont particulièrement bien formés et attentifs au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle du fait de la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Toutes les lignées murines utilisées sont déjà disponibles au laboratoire et sont adaptées pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo ainsi que pour développer des thérapies pour les maladies de surcharge lysosomale. Pour les 2 procédures, les animaux seront utilisés à 1, 2 et 4 mois afin d'étudier les premiers signes et la progression de la neuro-inflammation. Ce choix est en accord avec les précédentes études déjà menées au laboratoire ainsi que la bibliographie.
Développement préclinique d’un traitement des maladies mitochondriales liées à des défauts de l’ADN mitochondrial, par thérapie génique sur deux modèles murins (1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
5 060 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées modérées. Le projet crée des lignées privées d'un gène mitochondrial dans le cœur, les muscles ou les neurones, animaux qui développent une maladie cardiaque grave ou des crises d'épilepsie mortelles, puis teste une thérapie génique par injections, y compris chez des nouveau-nés anesthésiés par hypothermie. Chaque souris subit échocardiographies, prélèvements sanguins hebdomadaires et injections intrathécales, les tests comportementaux étant évoqués sans être précisés. Le porteur affirme ne pas pouvoir prédire sur cellules la quantité de protéine produite dans un organisme vivant et conclut à la nécessité du modèle murin, la thérapie pour les patients restant renvoyée à d'éventuels essais futurs.
Objectifs
Les mutations du gène d'intérêt sont responsables de maladies rares qui peuvent être graves. Ces maladies se manifestent souvent dès l'enfance et peuvent affecter plusieurs parties du corps, comme le cerveau, le coeur et le foie. Malheureusement, il n'y a actuellement aucun traitement pour ces maladies, et les traitements existants visent uniquement à soulager les symptômes sans arrêter la progression de la maladie. Ce gène d'intérêt est responsable de la production d'une protéine essentielle pour notre corps, en particulier pour produire de l'énergie dans nos cellules. Cependant, lorsque ce gène est altéré par des mutations, il provoque des problèmes dans la production d'énergie, ce qui peut être très dommageable. Notre projet vise à atteindre trois objectifs principaux : 1. Nous allons créer deux modèles de souris malades en les privant du fonctionnement du gène d'intérêt, soit dans le coeur et les muscles, soit dans les neurones. Nous pensons que ces souris développeront des problèmes similaires à ceux que l'on observe chez les humains. 2. Nous allons développer des virus spéciaux pour transporter la version normale du gène d'intérêt humain dans le corps des souris malades. Ces virus agissent comme des petits véhicules pour réparer le gène défectueux. 3. En utilisant ces modèles de souris, nous espérons développer un traitement pour les maladies liées aux mutations du gène d'intérêt en utilisant la thérapie génique. En injectant ces virus dans les souris malades, nous espérons restaurer la fonction de la protéine défectueuse dans les organes touchés. Parce que c'est difficile de faire en sorte que ces virus atteignent le cerveau, nous allons d'abord utiliser des souris où le gène d'intérêt est éteint dans le coeur et les muscles, comme modèle alternatif pour développer notre approche thérapeutique. Avant de tester ces virus sur des souris malades, nous allons d'abord effectuer des tests sur des souris en bonne santé pour comprendre comment le gène étranger fonctionne dans les organes affectés. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Jusqu'à présent, il n'existe aucun traitement pour guérir ou contrôler l'évolution des maladies causées par les mutations du gène d'intérêt. Pour remédier à cette situation, nous travaillons sur la création de modèles de souris qui reproduisent ces maladies. Ces souris nous permettront d'évaluer en toute sécurité et sur le long terme l'efficacité des virus spéciaux conçus pour réparer le gène d'intérêt défectueux. Si ces tests sur les souris réussissent, cela signifie que nous pourrions éviter d'entreprendre des essais inutiles sur des humains, réduisant ainsi leurs souffrances. Une fois que nous aurons prouvé que notre approche de thérapie génique fonctionne sur les souris malades, nous pourrons envisager de la tester sur des êtres humains dans le cadre d'essais cliniques. Notre objectif principal est de développer des traitements pour les personnes atteintes de ces maladies en utilisant des virus adaptés à l'injection chez les humains. Cela pourrait apporter un grand espoir à ceux qui sont touchés par ces maladies.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les gestes suivants: 1. Échocardiographie : Un examen échographique du coeur qui dure 20 minutes par souris. Il sera effectué une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines lors de la création, et l'étude des souris malades ou une semaine avant l'injection lors de la sélection, de l'optimisation et du développement du traitement. La durée sera jusqu'au point limite adapté pour les souris contrôles malades, ou 12 semaines après ce point pour celles qui ont reçu des injections et présentent une amélioration de leur état de santé lors du développement et de l'optimisation du traitement. 2. Tests comportementaux durent de 5 à 30 minutes par souris. Ils seront réalisés une fois par semaine à partir de l'âge de quatre semaines ou une semaine avant l'apparition de problèmes comportementaux, et se poursuivront jusqu'au point limite prédéterminé. 3. Injections : a) Injections dans la veine temporale dureront environ 5 minutes par souriceau et seront effectuées une fois, sous anesthésie par hypothermie. b) Les injections intrathécales, sous anesthésie générale (environ 40 min par souris), et dans la veine caudale (5 min par souris) seront réalisées une fois. 4. Le prélèvement de sang au niveau de la veine maxillaire, dure ~1 min par souris et sera effectué une fois par semaine. a) Pour les souris injectées par voie intrathécale et dans la veine caudale, les prélèvements de sang commenceront une semaine avant l'injection, puis 72 heures après l'injection, et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. b) Pour les nouveau-nés, les prélèvements commenceront à l'âge de trois semaines et se poursuivront une fois par semaine jusqu'à la limite prédéterminée ou jusqu'à 12 semaines après cette limite. Les tests comportementaux, les injections et le prélèvement de sang auront lieu dans un établissement n°1, et seulement l’échocardiographie sera réalisée dans un établissement partenaire n°2.
Impact sur les animaux
Les souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans les neurones naîtront sans signe de problème, mais elles développeront progressivement des difficultés de marche et de coordination. En fin de vie, ces souris connaîtront des crises d'épilepsie mortelles. Pour les souris où l'expression du gène d'intérêt est abolie dans le cœur et les muscles squelettiques, elles naîtront sans problème apparent, mais avec le temps, elles développeront une maladie du cœur grave, comme cela a été observé dans d'autres modèles de souris similaires. En plus de la maladie cardiaque, ces souris peuvent présenter une perte de poids, des difficultés de mouvement et adopter une posture anormale. Les souris seront soumises à des situations stressantes liées à l'injection, aux tests comportementaux, au transport depuis l’institut jusqu'au centre spécialisé en échocardiographie, ainsi qu'à l'anesthésie pour les échocardiographies. Les injections intrathécales peuvent causer une certaine douleur après l'injection, mais des mesures seront prises pour minimiser leur inconfort.
Devenir
Mise à mort pour l'analyse des tissus.
Remplacement
Nous effectuerons des tests sur des cellules pour identifier les morceaux génétiques qui n'expriment pas du tout ou très faiblement le matériel génétique prévu. Cependant, il est important de noter que, même si nous pouvons déterminer ces caractéristiques sur cellules, nous devons encore utiliser des modèles animaux pour nos recherches. C'est parce que nous ne pouvons pas prédire avec certitude combien de la protéine souhaitée sera produite à l'intérieur d'un organisme vivant, et si la quantité générée sera suffisante pour traiter la maladie.
Réduction
Nous avons utilisé des méthodes et des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour évaluer l'efficacité du traitement de manière fiable et statistiquement significative. Pour la création et l'étude des modèles de souris malades, nous réduirons le nombre d'animaux en effectuant plusieurs types d'analyses, lorsque cela est possible. Par exemple, la détermination du début et de la progression du phénotype sera effectuée en parallèle avec des tests comportementaux et les tissus extraits des souris à un stade avancé seront utilisés pour des expérimentations de biologie moléculaire. L'échographie est une autre méthode qui nous permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires, car elle permet de suivre l'évolution des souris au fil du temps, évitant ainsi une mise à mort répétée. Une approche similaire peut être appliquée à la sélection des vecteurs, l’optimisation et le développement du traitement.
Raffinement
Nous mettons en place des pratiques visant à réduire la souffrance des souris tout au long de notre recherche. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie et lors de l'injection du vecteur thérapeutique, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Les souris seront surveillées au moins deux fois par semaine pour détecter tout signe de souffrance ou d'anxiété. Lors des injections effectuées sur les souriceaux nouveau-nés, nous prendrons des mesures pour minimiser leur stress. Cela inclut l'éloignement temporaire de la mère, la préservation de la litière de la cage maternelle, et un prélèvement de sang minime, effectué par un personnel expérimenté de la veine sous-maxillaire considérée comme étant une des zones les moins sensibles. Pour les injections intrathécales, une anesthésie générale sera administrée, et des analgésiques seront utilisés avant et après l'injection pour éviter toute douleur. Nous mettrons en place un suivi régulier des souris. Les cages seront aménagées avec des éléments pour leur bien-être, tels que des boules de coton, des maisons pour se cacher, et des objets à ronger. L'isolement prolongé sera évité autant que possible pour assurer une stimulation sociale. Le transport des souris entre l’institut et le centre expert en échocardiographie se fera dans des cages de transport spécialement conçues, dans des véhicules adaptés pour réduire les vibrations et le bruit.
Choix des espèces
L'utilisation de mammifères est essentielle pour évaluer l'efficacité des virus dans le développement de la thérapie génique. Les souris sont couramment choisies pour les essais de phase I/II en raison de leur similitude physiologique avec les humains et de leur facilité d'élevage et de soins. De plus, les modèles de souris où l'expression du gène d'intérêt est supprimée dans le cœur et le cerveau peuvent développer une pathologie qui ressemble aux symptômes de la maladie gène d'intérêt chez l'homme. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge. Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines et plus. Nous commencerons par des nouveau-nés, car à cet âge, le virus peut atteindre le cerveau. Cependant, étant donné que l'expression du virus peut diminuer pendant la croissance rapide des nouveau-nés, nous utiliserons également des souris jeunes adultes (3 à 6 mois) pour certaines parties de nos expériences.