Rongeurs

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur colorectale leur est implantée par chirurgie au niveau du côlon, suivie de traitements et de séances d'IRM sous anesthésie, pour valider cette imagerie comme outil de suivi tumoral. Le porteur présente le projet comme la création d'une expertise destinée à "offrir à l'industrie pharmaceutique" un service d'évaluation de molécules. Les bénéfices pour la santé humaine sont annoncés à long terme.

Objectifs

Le projet présenté se déroulera dans deux établissements utilisateurs et vise à démontrer l'intérêt et la valeur ajoutée de l'utilisation de l'imagerie par résonance magnétique (IRM) pour étudier l'efficacité de nouveaux composés en cancérologie sur des souris porteuses de cancer. L'IRM est une technique d'analyse de tumeurs implantées chez l'animal qui est non invasive, précise et utilisée chez le patient. Il est attendu de l'IRM qu'elle permette à terme d'améliorer et d'optimiser les études en cancérologie sur animaux, en travaillant avec des modèles de cancers implantés directement dans l'organe d'origine du cancer pour mimer au plus proche ce qu'il se passe chez le patient. Ce projet porte sur le suivi par IRM d'un modèle de cancer colorectal implanté directement au niveau du colon chez la souris. Ce modèle de cancer présente un intérêt fort pour évaluer l’efficacité thérapeutique de potentiels traitements anticancéreux, mais ne peut pas être étudié avec des techniques de suivi de volumes tumoraux classiques : mesures à la main quand les tumeurs sont implantées directement sous la peau. En effet, après l'implantation de la tumeur directement au niveau du colon, il est impossible de mesurer et de suivre l’évolution de la tumeur celle-ci se développant au niveau de l’organe et donc d’observer l’effet d’un traitement. Ce projet vise donc à créer une expertise en oncologie centrée sur l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour la recherche biomédicale. Cette collaboration permettra d’offrir à l’industrie pharmaceutique le service requis pour l’évaluation in vivo chez l’animal de l’efficacité des molécules anticancéreuses développées avant leurs tests en phases cliniques chez le patient.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra de mettre en place un protocole de suivi tumoral capable d'étudier l’efficacité de potentiels traitements anticancéreux dans des modèles implantés directement dans l'organe, qui sont non mesurables avec les techniques classiques. Ceci permettra de simplifier l’utilisation de ces modèles de cancer qui miment la pathologie chez les patients et donc d’ouvrir potentiellement l’accès à de nouveaux traitements pour ces types de cancer. Il permettra aussi d'obtenir des données scientifiques afin de promouvoir l'utilisation d'une technique non invasive (l'IRM), technique dont la précision permettra à terme de réduire et raffiner nos études utilisant des animaux.

Procédures

- implantation par chirurgie et sous anesthésie de tumeurs au niveau de la couche extérieure du colon, 20 minutes maximum - anesthésie fixe durant l’IRM maximum 30 minutes - traitement par voie intrapéritonéale 30 secondes 10 injections pour les animaux traités au composé expérimental et 2 pour les contrôles et ceux traités avec l'immunothérapie- traitement par voie intraveineuse 30 secondes durant 6 séances. Une entreprise réalisera l'implantation chirurgicale des cellules tumorales dans l'Etablissement utilisateur 1, l'Etablissement utilisateur 2 hébergera les souris et effectuera les gestes techniques concernant les traitements, et enfin une entité présente dans l'Etablissement utilisateur 2 gérera la partie imagerie.

Impact sur les animaux

Potentielle perte de poids, une douleur sur plusieurs heures liée à l'implantation par chirurgie de tumeurs par ouverture de la cavité abdominale au niveau du côlon, contrôlée par de l'analgésie et réalisée sous anesthésie gazeuse. Une gêne dûe à une croissance de tumeurs au niveau du colon, du stress dû aux contentions pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite aux injections à la seringue en intrapéritonéal pour les traitements, une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille suite à l'injection à la seringue à la queue en intraveineuse pour l'agent de contraste et un stress dûe à l'anesthésie gazeuse pour l'IRM.

Devenir

Suite à la procédure, les animaux seront mis à mort deux semaines après début du traitement pour les prélèvements de tumeurs fraîches.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). L’étude par IRM du développement d’une tumeur ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Le projet sera fait sur le nombre d’animaux nécessaires afin de conclure de façon fiable statistiquement avec le test approprié (comparaison de moyennes et analyse de courbes d’espérance de vie) à l’efficacité du traitement tout en ayant une bonne prise tumorale. 32 souris seront utilisées et réparties en quatre groupes de 8 souris. Pour cette étude d’efficacité de nouvelles molécules sur un modèle de cancer colorectal complexe de part son implantation directement au niveau de l'organe, un effectif de 8 souris par groupe sera utilisé afin de pouvoir être capable d'observer une efficacité d'inhibition du volume tumoral de 25% du composé si cela vient à se passer. Pour chaque groupe, les volumes de tumeurs prélevées à la fin de la procédure seront analysées afin de confirmer les données obtenues par IRM et limiter les anomalies d’analyses pour des études futures utilisant l’IRM. Le recours à l’imagerie pour le suivi tumoral évite l’ouverture ou la mise à mort de l’animal pour visualisation direct de la tumeur, et donc une diminution du nombre d’animaux expérimentés.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas d'amaigrissement. Des prélèvements de tumeurs en point final seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Concernant l’acte de chirurgie, les animaux seront traités avec un antidouleur avant la chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse moins invasif et pour un réveil moins difficile. Le personnel est formé à la chirurgie quant à la mise en place du modèle et notre partenaire quant à la réalisation de l’IRM et l’administration des traitements. Afin d’éviter des transports réguliers tous les deux jours minimum des souris, les animaux seront transportés une fois avoir récupérés de la chirurgie pour une période d’acclimatation.

Choix des espèces

La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Les souris seront âgées de 6 semaines, car la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe un mélanome par injection de cellules sous anesthésie, puis on administre un anesthésique testé comme agent anti-tumoral et on réalise des prélèvements de sang. Le porteur affirme que l'étude des interactions entre traitements et système immunitaire rend "indispensable" le recours à un "organisme vivant entier". Les retombées annoncées, un possible usage en chirurgie du cancer chez l'humain, restent au conditionnel.

Objectifs

Des études rétrospectives ont suggéré un possible rôle anti tumoral des anesthésiques après observation d’une diminution de récidives métastasiques et une meilleure survie chez les patients ayant reçu ces produits. Le but du projet est donc d'étudier si un anesthésique utilisable en chirurgie oncologique induit une réponse anti-tumorale in vivo en diminuant la croissance tumorale. C'est aussi de démontrer si les effets antitumoraux de cet anesthésique peuvent être potentialisés par les traitements anti-cancéreux conventionnels et en fin de démontrer si cet anesthésique diminue le stress glucocorticoïde. Le dernier objectif est de démontrer si les effets anti-tumoraux médiés par cet anesthésique, s'ils existent, impliquent une réponse du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Démontrer si l'anesthésique étudié pourrait être un nouvel agent anti-tumoral in vivo. Ce résultat pourrait amener à des essais cliniques randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement cet agent est utilisé comme complément analgésique per-opératoire et n'a aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique

Procédures

Génération de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes) -traitement par injection (1 fois, durée 1 minute) -prélèvements sanguins sous anesthésie (2 fois, durée 3 minutes) -

Impact sur les animaux

Greffe et croissance de tumeurs : gêne physique légère à modérée. Injections: stress et contrainte temporaire et légère.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des analyses en cytométrie, biologiques ou histologiques.

Remplacement

Les effets des traitements anticancéreux seuls ou en association impliquent des processus multiparamétriques avec des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier (échnge de cellules et d'information (humorales) entre les différents organes et tissus de l'organisme). On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro, il est indispensable d'avoir recours à un organisme vivant entier. Notre hypothèse est que l'association de la dexmedetomidine aux traitements anticancéreux conventionnels potentialiserait la réponse anti-tumorale. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable pour étudier l'immunité et l'efficacité des traitements combinés sur la réponse anti-tumorale. La compréhension de cette potentialisation et sa reproduction in vivo ouvriraient la possibilité d'associer systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction potentialisée des cellules tumorales résiduelles.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de souris déterminés en nombres par calcul de puissance et pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront analysés selon des méthodes de statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris et les tumeurs seront mesurés plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids (sizzlenests), de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver l'efficacité d'une association de traitements anti-cancéreux afin d'augmenter la réponse antitumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitements. Le modèle souris est le modèle mammifère de choix en oncologie préclinique. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, mimant la population de patients.

8 032 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, celles destinées aux prélèvements étant tuées et les reproducteurs gardés pour l'élevage. On leur inflige deux modèles de colite chimique provoquant perte de poids, diarrhée et présence de sang dans les selles, avec des gavages quotidiens et des administrations intra-rectales sous anesthésie, pour tester des bactéries et composés anti-inflammatoires. Le porteur indique que ces composés sont d'abord criblés in vitro, mais que la complexité immunitaire rend les modèles cellulaires "pas suffisants". Les retombées annoncées pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l'intestin sont placées à court et long terme.

Objectifs

L’objectif final de ce projet est de pouvoir proposer des alternatives ou des compléments aux traitements actuels de pathologies du tube digestif : maladie de Crohn et rectocolite ulcéreuse, qui forment le groupe des MICI (Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin). Les traitements actuels sont encore imparfaits puisqu’ils ne permettent pas une guérison complète. L'un des axes possibles pour améliorer la qualité des traitements est l'utilisation d'éléments capables de moduler la réponse inflammatoire de l'hôte en lien avec son microbiote. Nous cherchons à explorer la piste d'utilisation de bactéries entières, de composés bactériens ou de composés autres (type prébiotique, de natures plus diverses et souvent dérivés de plantes) capables de moduler la composition du microbiote en ce sens. Cette étude nécessite de reproduire l’inflammation liée aux MICI et pour ce faire, nous utiliserons deux modèles d’inflammation intestinale induite par des composés chimiques chez la souris. Le premier génère une inflammation très localisée au niveau du colon. Nous utilisons un protocole que nous déclinons sous forme classique « aigue » ou sous forme chronique (avec une alternance de phases inflammatoires et de phases de rémissions). Le second modèle possède la capacité d’altérer l’intégralité du tractus digestif. Ces deux modèles sont complémentaires vis-à-vis de la diversité des symptômes retrouvés dans les MICI. Les objectifs de ce projet sont de : - Evaluer la capacité anti-inflammatoire de bactéries ou composés bactériens ou de substances anti-inflammatoires dans ces deux modèles d’inflammation. Cette évaluation passera par le suivi de la reprise de poids et par la mesure de plusieurs paramètres. Les substances testées auront toutes été criblées au préalable via des tests in vitro sur cellules, qui auront mis en avant leurs capacités anti-inflammatoires. - Affiner nos connaissances sur les interactions entre hôte/micro-organismes ou composés et plus précisément sur les mécanismes d’actions de potentiels probiotiques ou prébiotiques sur des inflammations intestinales. Le cœur des projets de recherche de notre équipe est l’évaluation des propriétés anti-inflammatoires de composés, à des visées de complémentation pour des patients atteints de MICI. Les procédures décrites ici sont très utilisées au sein de notre équipe et servent pour plusieurs projets scientifiques. Les composés testés sont systématiquement validés in vitro avant d’être testés in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet seront à court terme de permettre une validation des propriétés anti-inflammatoires de composés dans des modèles murins pré-cliniques. Des études cliniques humaines pourront ainsi être menées par la suite sur ces composés, en cas de résultats probants. A long terme, ces composés pourront ainsi être proposés aux patients atteints de MICI en tant que compléments aux traitements actuels, pour soulager les patients de symptômes liés aux pathologies du tube digestif et améliorer ainsi leur qualité de vie. Un autre bénéfice de ce projet sera une meilleure compréhension des mécanismes d’action des bactéries ou composés bactériens sur l’inflammation intestinale. Cela peut passer par exemple par la mise en évidence de molécules produites par les bactéries testées qui pourront être purifiées et étudiées plus en détail par la suite. Les interactions de ces composés avec l’hôte et plus particulièrement avec le microbiote intestinal pourront également être étudiées, ce qui permettra d’avancer dans la compréhension de mécanismes plus globaux, à l’échelle de l’hôte. Des approches par imagerie sur des animaux vivants seront également mises en œuvre afin de disposer de données supplémentaires.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions/prélèvements suivants : - Prélèvements de fécès fraiches : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés. Un prélèvement = maximum 10 minutes. Pour 2 496 animaux, il y aura des prélèvements quotidiennement sur 14 jours consécutifs (donc 14 collectes pour 2 496 animaux); pour les autres animaux (4 896) ce sera 3 ou 4 collectes en tout. - Gavages : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés. Un gavage par jour prévu pour chaque souris sur la durée des procédures. Leurs durées varient entre 4 et 22 jours. Un gavage = 5-10 secondes. - Anesthésies générales: sur animal vigile, 4 896 animaux concernés (une ou deux fois selon le modèle). Une anesthésie = une piqûre réalisée en 15-20 secondes environ. - Administrations intra-rectale : sur animal anesthésié, 4 896 animaux concernés (une ou deux fois selon le modèle). Une administration = 20 secondes. - Anesthésies gazeuses: sur animal vigile, 7 440 animaux concernés (tous les deux jours pendant 5 ou 14 jours, selon le modèle). Une anesthésie = 5 minutes. - Injections sur animal anesthésié : 4 896 animaux concernés 3 fois et 2 496 concernés 8 fois. Une administration = 15 secondes. - Prélèvements de sang : sur animal vigile, 7 392 animaux concernés (concerne une seule fois chaque animal). Un prélèvement = une durée totale de 1 minute environ. - Biopsies à la queue sous anesthésie locale pour génotypage: 640 animaux. Une biopsie = quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ce protocole proviennent majoritairement des colites. En effet, les deux produits chimiques induisent une inflammation de l’intestin. Les principaux symptômes attendus sont pour les deux modèles : une perte de poids et des signes cliniques tels que pelage hérissé, posture voûtée, yeux mi-clos. Spécifiquement pour le second modèle : une diarrhée transitoire (2 à 3 jours) et présence éventuelle de sang dans les fécès.

Devenir

Tous les animaux qui doivent subir des prélèvements d'organes/tissus seront mis à mort. Les animaux reproducteurs seront gardés en vie.

Remplacement

A l’heure actuelle, l’étude in vitro des effets de bactéries, de composés bactériens ou d’autres substances sur l’inflammation intestinale comporte encore des limites. Des modèles cellulaires existent et sont bien décrits : ils seront d’ailleurs utilisés en amont de notre projet pour effectuer un premier criblage de composés candidats (lignée cellulaire en monocouche et/ou organoïdes intestinaux). Cependant, ces modèles in vitro ne reflètent pas de manière idéale la complexité des interactions entre le microbiote intestinal et les bactéries ou composés candidats. L’intérêt d’un modèle in vivo est également d’étudier la réponse du système immunitaire de l’hôte à l’administration de ces bactéries ou composés bactériens. Malgré le fait que certains paramètres peuvent être évalués à partir de modèles in vitro, la complexité des mécanismes immunitaires chez l’hôte fait que ces modèles in vitro ne sont pas suffisants pour permettre de valider des composés ayant pour visée une complémentation chez l’humain.

Réduction

Les bactéries ou composés bactériens testés seront issus d’un programme de criblage in vitro au préalable. Ces criblages auront pour but d’identifier des composés potentiellement intéressants. Ainsi seuls les composés les plus prometteurs sont envisagés pour un test in vivo. Par ailleurs, nous utilisons toujours une approche statistique pour déterminer la taille de nos groupes en fonction de l’intensité des effets que nous souhaitons mettre en évidence et des données déjà disponibles. Pour les analyses, nous effectuerons des tests statistiques de comparaison adaptés à nos effectifs et à nos questions. D’autres types de tests pourront également être menés, notamment pour les analyses de microbiotes où des procédures dédiées existent.

Raffinement

Les animaux sont hébergés à plusieurs afin de ne pas les exposer à un stress lié à l’isolement. Les quelques fois où les animaux seront séparés pour être manipulés ne représentent qu’un temps très court (10 minutes maximum), pour la récupération de fécès dans des pots. Nous incluons des enrichissements dans les cages : cellulose à déchiqueter et permettant la nidification, bâtons à ronger, maisonnettes en carton (sans encre). Les sondes de gavages sont en plastique souple et fin, à bords arrondis et de taille adaptée pour empêcher les blessures et réduire l’éventuelle douleur. Les manipulateurs maitrisant les gestes, le temps d’intervention et donc le stress seront réduits. Nous utiliserons des anesthésies adaptées en temps et aux besoins des essais. Lors des anesthésies impliquant un temps d’endormissement supérieur à 15 mn, un gel oculaire sera appliqué pour prévenir le dessèchement des yeux des animaux. Des pads chauffants seront également placés sous les cages pour maintenir la température corporelle des animaux pendant l’anesthésie. Des tapis chauffants électriques pourront aussi être utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin de réduire au maximum la douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition, toxicologie, cancérologie et immunologie. Elle est par ailleurs un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies inflammatoires intestinales, notamment car il est possible d’induire une colite chez la souris dont les réponses cliniques, tissulaires et immunitaires générées sont comparables à celles observées chez l’humain. Les animaux sont utilisés à un âge de 6 à 12 semaines. Cet âge constitue un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos propres données. De plus, les souris adultes possèdent un système immunitaire mature, ce qui est essentiel pour étudier les effets anti-inflammatoires de nos produits.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles reçoivent des injections dans le péritoine six jours sur sept pendant deux mois, subissent des tests de locomotion, de démarche et de sensibilité à un filament appliqué sur la patte, puis une chirurgie terminale. Le porteur indique que ses données in vitro montrent déjà un effet du composé testé, mais qu'un passage in vivo reste une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain. Les retombées annoncées pour d'autres formes de la maladie sont renvoyées au long terme.

Objectifs

La maladie de Charcot Marie Tooth (CMT) est une maladie génétique touchant le système nerveux périphérique (SNP). Les patients souffrant de CMT présentent une faiblesse et atrophie musculaire prédominante aux membres inférieurs, des déformations squelettiques des extrémités, ce qui entraine une difficulté pour se mouvoir et pour les formes de CMT les plus sévères, la nécessité d'un fauteuil roulant. Contrairement à la maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique), la CMT ne réduit pas l’espérance de vie des patients, mais affecte fortement leur qualité de vie. Une des formes les plus fréquente de CMT est la forme CMT2A. Les motoneurones des souris modèles de la CMT2A présentent des défauts dans les interactions entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique (RE) ainsi que dans la dynamique et le transport des mitochondries. Le composé Pre-084 promeut les interactions entre le RE et les mitochondries en favorisant notamment le transfert de calcium. Le Pre-084 a déjà montré un effet thérapeutique dans de nombreuses maladies neurologiques liées à des défauts de contacts RE-mitochondries, telle que la maladie d’Alzheimer, la Sclérose latérale amyotrophique ou encore le syndrome Wolfram. Ce projet a pour but de tester une approche thérapeutique basée sur l'administration du composé Pre-084 dans un modèle murin modélisant de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A).

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet nous permettra de déterminer si le traitement Pre-084 représente une possibilité thérapeutique pertinente pour la CMT2A. A plus long terme ces approches pourront être mise en place pour d'autres formes de CMT et déboucher sur des essais cliniques pour la CMT.

Procédures

160 animaux subiront un traitement par injection dans le péritoine 6 jours sur 7. Les animaux seront contentionnés quelques secondes pour permettre ces injections. 320 animaux seront évalués par des tests de comportement pour mesurer la locomotion, démarche et réponse sensitive. Chaque test sera réalisé sur deux jours (entrainement et test) en incluant des moments de récupération pour les animaux entre chaque essais et entre chaque test (au moins deux jours). 160 animaux subiront une chirurgie terminale ayant pour objectif de réaliser une perfusion de paraformalédhyde.

Impact sur les animaux

Dans le cas de l'approche par voie intrapéritonée, les animaux subiront à l’âge adulte (soit avant soit après apparition des premiers symptômes) des injections dans le péritoine 6 jours par semaine pendant deux mois. Ces injections seront réalisées en quelques secondes (contention et piqûre compris) au moyen de fines seringues à insuline . Ces injections répétées sont généralement bien tolérées, néanmoins il peut apparaitre de petites inflammations locales ou légères irritations. Dans la suite de l'étude, le traitement dans l'eau de boisson ne devrait pas générer d’inconfort. Ce traitement a déjà été utilisé dans plusieurs études et ne provoquent pas d’effets indésirables chez l’animal. Au cours du traitement, les animaux subiront trois tests comportementaux à trois temps (avant, pendant et à la fin du traitement) qui permettent d'analyser la locomotion, la démarche et la réponse sensitive des souris. Seule la mesure de la réponse sensitive entraîne un inconfort de courte durée suite à l’exposition à un filament de 0.5 mm qui vient exercer des forces croissantes sur la patte de la souris.

Devenir

A l'issu des études comportementales l'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de déterminer l'effet bénéfique des thérapies proposés au niveau cellulaire sur les tisssus atteints dans la pathologie de Charcot Marie Tooth (CMT)

Remplacement

Il est difficile d'accéder aux cellules de patients du système nerveux périphériques (neurones moteurs et sensitifs et cellules de Schwann). Les neurones moteurs et sensitifs de patients peuvent être différentiés à partir de cellules pluripotentes humaines induites et constituer ainsi un modèle humain de la pathologie CMT pour les formes axonales. Nos données préliminaires ont déjà montré un effet bénéfique du Pre-084 sur un modèle in vitro de la CMT2A. Néanmoins le passage in vivo est une étape indispensable pour établir la preuve de concept et la mise au point de la dose du traitement, sa biodisponibilité, afin d'envisager par la suite un essai thérapeutique chez l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum nécessaire (= 20 animaux par groupe) pour mettre en évidence un effet significatif sur des paramètres de locomotion et de sensibilité en se basant sur nos travaux précédents et en prenant en compte un risque alpha inférieur ou égal à 0.05, une puissance de test de 80% et un effet modéré de 30%. Afin de réduire le nombre d'animaux, nous privilégions une étude longitudinale c'est-à-dire que les mêmes groupes d'animaux seront suivis à différents stades (3,4 et 5 mois ou 6,7 et 8 mois selon le début du traitement) afin de suivre à long terme l'effet bénéfique des thérapies. Au total nous utiliserons 320 animaux répartis de la manière suivante selon deux études: Pour l'approche 1 (traitement par injections intra-péritonéale), qui sera réalisée à deux temps: début du traitement (en pré-symptomatique de 3 mois à 5 mois) et début du traitement (en symptomatique de 6 mois à 8 mois). Il y aura (20 animauxX4groupes)X2temps=160 animaux. Le même nombre d’animaux (160) sera utilisé pour l’approche 2. A noter que l’étude 2 (traitement per os) ne sera mise en place que si on obtient un effet bénéfique du traitement dans l’étude 1

Raffinement

Afin d’améliorer le bienêtre animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture à volonté, enrichissement, stabulation en petit groupe). L’environnement est enrichi à l’aide de maisonnettes en carton. Nous nous assurerons de diminuer le stress des souris en les manipulant en coupe ou en tunnel. Dans le cas du maintien de la lignée, les gestes de biopsies (perçage d’oreille) seront couplés à l’identification afin de limiter leur manipulation et gestes invasifs. Dans le cas d'apparition des petites inflammations locales ou légères irritations suite aux injections intra-péritonéales répétées, nous privilégierons soit une injection du côté opposé de l’abdomen, soit nous laisserons l’animal sans traitement quelques jours le temps de récupérer ou d’être soigné au besoin (Povidone Iodée- Vétédine®). Au cours des tests, nous mettons en place des temps de repos entre chaque essai pour limiter l’inconfort de l’animal. Des points limites seront définis et les animaux seront mis à mort lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption.

Choix des espèces

La souris reste un des modèles les plus aisés à modifier génétiquement et proche de l'homme (99% des gènes sont homologues). Elle est l'espèce la plus utilisée pour modéliser des maladies neurodégénératives ou neuromusculaires telles que la CMT. Elles développent la plupart du temps des anomalies observées chez l'homme et ont permis de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous-jacents à ces pathologies. Dans notre cas, la lignée utilisée pour la CMT2A reproduit une partie des anomalies histologiques et comportementales observés chez les patients souffrant de CMT2A telles qu'une dénervation musculaire et des défauts locomoteurs et sensitifs modérés. Pour les deux études, les traitements seront réalisés à deux temps: avant (3mois) et après le déclenchement de la maladie (5mois) afin de déterminer si l'effet du traitement permettra d'empêcher le développement de la maladie et/ou de la ralentir une fois celle-ci déclarée. L'ensemble des groupes de souris de ces études seront suivis pendant les deux mois de traitement (soit de 3 à 5 mois ou de 6 à 8 mois).