Rats

Pour évaluer par imagerie des candidats-médicaments contre le cancer et les maladies immunitaires, 8 000 souris et 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués en fin d'étude pour prélever leurs organes. Ils reçoivent une greffe de tumeur, parfois par chirurgie, une irradiation pour permettre la prise de greffe, des injections répétées, jusqu'à dix micro-prélèvements de sang en six jours, et des séances d'imagerie sous anesthésie répétées pendant quatre-vingt-dix jours au plus. Le porteur reconnaît que la répétition des anesthésies constitue un risque cardiovasculaire et que le développement du greffon peut provoquer perte de poids et troubles fonctionnels. Il affirme que l'animal vivant reste le moyen "incontournable" d'établir ces données, et rattache aussi le projet à la formation professionnelle de son personnel.

Objectifs

Les objectifs du projet consistent à évaluer par imagerie les propriétés in vivo des composés thérapeutiques en développement ou des sondes d’imageries utilisées comme biomarqueurs pour suivre l’évolution des pathologies cancéreuses, immunologiques et inflammatoires au cours d’un traitement chez le rongeur. Les outils d’imagerie permettent de mener plusieurs types d’études : - Etude de la bio-distribution des composés ou sondes marquées et/ou leur pharmacocinétique et/ou pharmacodynamie en documentant la distribution des composés dans les tissus en fonction du temps, et d’élucider les relations existantes entre l’exposition du futur médicament à la cible thérapeutique et son effet sur les pathologies cancéreuses, et la réponse immunologiques potentiellement mobilisée par imagerie non invasive. - Evaluation et la caractérisation de l’efficacité de candidats médicaments sur des modèles tumoraux en tissus profonds dans l’organe d’origine de la tumeur ou dans des modèles métastatiques fidèles aux pathologies observées chez le patient et suivi par imagerie non invasive. Cette approche permet également de mettre en évidence le gain thérapeutique potentiel des candidats médicaments par rapport aux traitements standards utilisés chez le patient ou développés par les concurrents, ainsi que de mettre en évidence les synergies de traitement possibles grâce à l’emploi de nos candidats médicaments en combinaison avec d’autres traitements expérimentaux ou validés en clinique. L’ensemble de ces activités permet de valider les thérapies les plus prometteuses et de proposer des doses actives, efficaces et tolérées qui pourront être testées ensuite chez l’homme. Ce projet va permettre de contribuer au dossier pharmacologique préclinique nécessaire à l’obtention de l’autorisation de mise sur le marché par les autorités de santé des composés testés en clinique.

Bénéfices attendus

A court terme ce projet permet d’optimiser la structure de candidats médicaments sur la base d’une bio-distribution optimisée entre les tissus cibles et les tissus d’élimination en fonction du temps, de valider le mécanisme d’action et de l’engagement de la cible ou des cellules immunitaires effectrices in vivo, d’identifier le potentiel thérapeutique de molécules ciblant un processus pathologique, une tumeur, une maladie immune et de déterminer la posologie optimal à envisager et permettre la démonstration d’une efficacité thérapeutique chez l’animal dans un modèle proche de la pathologie humaine, et ainsi permettre de valider ou de contribuer à l’arrêt ou à l’avancement des phases précliniques du projet considéré. A plus long terme, les données générées grâce à ce projet permettent d’augmenter les connaissances scientifiques sur les processus cancéreux, immunologiques ou inflammatoires impliqués dans diverses pathologies humaines et feront l’objet de publications et de partage des données collectées avec la communauté scientifique. Les données générées permettent de supporter l’entrée des composés retenus en phase clinique d’évaluation et de contribuer à la constitution des dossiers d’autorisations de mise sur le marché des nouveaux médicaments évalués. L’approche par imagerie permettra potentiellement d’envisager l’évaluation de méthodes comparables pour le diagnostic ou le suivi des pathologies citées.

Procédures

Génotypage des animaux génétiquement modifiés par une biopsie tissulaire unique en 5 secondes sur animal vigile: 2 mm de biopsie de queue réalisée entre 10 et 21 jours d’âge. Irradiation 30 secondes par cage pour immunosuppression transitoire (72h environ) permettant la prise de greffe. Epilation au niveau ventral ou dorsal, sous anesthésie générale 10 minutes par souris à fourrure sombre pour les besoins d’un suivi par imagerie optique. Injections uniques ou répétées (10 secondes) en intraveineux ou en intra-péritonéal ou sous cutané ou per os de composés ou de cellules. Chirurgie sous anesthésie générale (10 à 30 minutes) avec prémédication sous-cutanée d’anesthésique local au site d’incision et prise en charge de la douleur par injection de dérivé morphinique sur 24 à 36h (3 à 4 injections 10 secondes). Suivis par imagerie non invasive du développement de la pathologie (une semaine à 90 jours maximum) : Les animaux sont imagés (25 minutes) sous anesthésie quotidiennement sur une durée courte (1 semaine à 10 jours) ou 1 à deux fois par semaine pour des modèles pathologiques suivi entre 14 et 90 jours. Prélèvements sanguins par micro-prélèvements de 5µl de sang à la veine de la queue (30 secondes) sur souris vigiles (10 prélèvements sur 6 jours) ou prélevés à raison de 20µl de sang limité à 5 fois sur la première semaine et 20µl 1 à 2 fois par semaine ensuite sur 6 semaines maximum.

Impact sur les animaux

La mise en place des modèles tumoraux, et les transferts adoptifs de cellules immunitaires peuvent engendrer des nuisances en particulier si les techniques d’implantation tumorales nécessitent de la chirurgie. Le développement du greffon peut induire une perte de poids ou des problèmes fonctionnels en fin de développement. La répétition des anesthésies générales pour la prise d’images peut constituer un risque cardiovasculaire. Les procédures de traitements thérapeutiques, les contentions, les injections de cellules, les prélèvements sanguins, les injections des produits de contraste d’imagerie entrainent des stress de courtes durées, répétés dans le temps.

Devenir

Les souris et les rats sont euthanasiés en fin d’étude car les objectifs d’étude nécessitent des prélèvements d’organes.

Remplacement

Actuellement, l’utilisation d’animaux vivants reste le moyen incontournable de montrer les relations pharmacocinétique-pharmacodynamie, le devenir (bio distribution), la tolérance et l’efficacité du candidat médicament dans un organisme complexe. Pour s’assurer de la tolérance et de l’efficacité des médicaments, il est nécessaire de mettre en œuvre des études chez l’animal vivant mimant la complexité d’une pathologie (exemple : action de composés sur des cellules effectrices relayant l’action du système immunitaire sur la pathologie). De manière générale, seules les molécules thérapeutiques ayant préalablement démontré une activité inhibitrice de la réponse cancéreuse, immunitaire ou inflammatoire in vitro dans des essais fonctionnels (activité antiproliférative ou cytotoxique direct, ou réponse immunitaire induite) pourront faire l’objet d’une évaluation in vivo dans nos modèles.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est préalablement basé sur les publications scientifiques. Sur la base des données expérimentales, un biostatisticien est consulté pour optimiser le nombre d’animaux à utiliser à l’aide d’un test de puissance statistique en fonction de l’objectif et du design de l’étude (nombre de groupes d’animaux, type de comparaisons et répétition des mesures dans le temps), du nombre et de la variabilité des paramètres mesurés en fonction de la méthode d’imagerie employée et de l’importance des effets mis en évidence. Les méthodologies statistiques sont appliquées pour proposer une analyse des données appropriée afin de mener les études pour répondre à l’objectif fixé en réduisant au maximum les biais expérimentaux avec un minimum d’animaux. Les techniques d’imagerie permettent un suivi longitudinal multiparamétrique. Les paramètres de distribution du composé ou de l’évolution de la réponse au traitement sont mesurés de façon non invasive en fonction du temps pour chaque animal. Plusieurs paramètres sont suivis en simultané à chaque session d’imagerie permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés dans l’étude.

Raffinement

Les rongeurs sont hébergés en groupe de 4 à 5 par cage et un enrichissement standard est donné (tunnel carton, matériel de nidification). Les préhensions des animaux se font à l’aide des tunnels d’enrichissement si l’animal est dedans ou dans le creux de la main formant une coupe dans le cas des souris, ou par la peau du dos pour le rat. Les protocoles d’anesthésie et de gestion de la douleur sont revus avec le vétérinaire responsable. Une prémédication avec analgésique local et une couverture avec un opiacé sont mis en place pour les chirurgies en complément de l'anesthésie générale. Les sessions d’imagerie s’effectuent sous anesthésie gazeuse (ou fixe) en caisson chauffé à 37°C pour garder l’animal immobile et sans stress le temps de la prise d’image. Les animaux sont suivis jusqu’au réveil en armoire ventilée chauffante ou réchauffés à 25-28°C pour optimiser leur réveil. -Le recours à l’imagerie constitue un raffinement en soi puisqu’il permet de générer des informations spécifiques de la réponse au traitement de façon non invasive et répétée tout au long de l’étude, sur les mêmes animaux. Il permet de caractériser la cinétique de développement du modèle tumoral en tissu profond, et sur la base de données quantitatives d’imagerie, de définir des critères d’arrêt anticipés pour les études d’efficacité sur le modèle considéré. Les rongeurs immunodéprimés sont stabulés en racks stériles ventilés pour les préserver des risques d’infection lié à leur statut. Si les animaux sont irradiés, ils sont supplémentés en complément alimentaire hydratant trois jours avant l’irradiation pour éviter une déshydratation réactionnelle.

Choix des espèces

De nombreux modèles animaux souris et rat se sont imposés en recherche biomédicale. La présence de gènes équivalents à ceux de l’Homme et la facilité actuelle de modification du génome des rongeurs en font un outil indispensable dans la compréhension et le traitement des pathologies en étudiant les effets moléculaires, pharmacologiques et toxicologiques. La facilité d’utilisation, la compatibilité avec les méthodes d’imagerie non invasives nucléaires et optiques, la compatibilité avec l’étude des composés sur des effectifs pertinents d’un point de vue statistique, la disponibilité des modèles humanisés exprimant les cibles thérapeutiques d’intérêt, et de souris transgéniques exprimant un reporteur d’imagerie d’intérêt, ainsi que la faible variabilité de réponse attendue d’un animal à l’autre par rapport à d’autres espèces permettent de tester plus de traitements et de sélectionner ceux qui génèrent des effets plus robustes et reproductibles nous ont conduit à choisir la souris et le rat comme modèles. Les animaux utilisés sont de jeunes adultes de façon à avoir un système immunitaire mature et stable permettant un développement tumoral et une réponse immunitaire reproductibles. Souris : en général à partir de 6-8 semaines Rats : en général à partir de 6-8 semaines

Pour évaluer des candidats-médicaments anticancéreux pour le compte de clients, 62 500 rongeurs, 57 500 souris et 5 000 rats, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue parce qu'ils portent des tumeurs. Ils reçoivent une greffe tumorale, des castrations, ovariectomies et surrénalectomies, des implantations de minipompe ou de cathéter, des séances d'imagerie sous anesthésie, des biopsies ou résections de tumeur et des irradiations. Le porteur, prestataire de services en recherche préclinique, décrit près de 250 études par an et un volume ajusté "en fonction des demandes". Il indique que les méthodes de reconstruction de tumeurs en 3D restent "marginales" et affirme que les rongeurs immunodéprimés sont "indispensables" à l'implantation de cellules tumorales humaines.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Mise en place d’un système d’identification de l’animal, sous anesthésie générale (en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

La greffe tumorale pourra engendrer une douleur et un stress léger. L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Pour les études sur modèles hormonodépendants (modèles prostatiques/ovariens), les animaux pourront être castrés/ovariectomisés avec ou sans surrénalectomie entrainant une douleur modérée sur 1 ou 2 jours et un stress modéré. Les autres chirurgie (biopsie et, resection de tumeurs) entraineront une douleur modérée sur 1 ou 2 jours et un stress modéré Les traitements pourront induire un stress léger. Une chirurgie comme la résection de la tumeur pourra engendrer une douleur modéré sur 1 à 2 jours Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. Près de 250 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit. Pour des études permettant de sélectionner des composés, il sera proposé d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le vétérinaire. L’impact de ces procédures sera toujours analysé par la structure chargée du bien-être des animaux. Toutes les procédures invasives et faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de mesure des volumes tumoraux seront adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites des antalgiques pourront être prescrits sous l’autorité du vétérinaire. Les chirurgies pratiquées dans ce projet sont des procédures de gravité modérée, réalisée sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées de façon aseptique et les animaux reçoivent des l’antalgiques, avec surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de mal être des animaux. Les expérimentateurs et les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. En cas de suspicion de toxicité, un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal ou sur l’arrêt des traitements. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites (mais sans dépassement du point limite) est observé, l’animal est mis en observation et un traitement de soins est mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique.

Choix des espèces

LLes petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.

Exposées sans contact à un rat prédateur ou à un congénère agressif, soumises à des chocs électriques aux pattes, à une contention prolongée, à une séance de nage ou à dix jours d'isolement, 1 660 souris et 8 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Certaines subissent en plus jusqu'à trois chirurgies cérébrales, ou une ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique pendant trente jours. Les huit rats ne sont pas étudiés, ils servent de stimulus de peur, et une souche de souris est choisie pour son agressivité. Le porteur affirme que les fonctions visées, mémoire et peur, rendent l'animal vivant "incontournable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier les circuits neuronaux sous-jacents à l’atténuation de souvenirs traumatiques. Cela est important parce que les expériences traumatisantes génèrent de souvenirs très intenses qui souvent dégénérer en e trouble de stress post-traumatique. Malgré la fréquence élevée de ce trouble, les traitements disponibles sont pas très efficaces, ce qui indique que c’est nécessaire de mieux comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à l'atténuation de la mémoire traumatique. Dans cette étude on va étudier l’atténuation de souvenirs traumatiques induits par l'exposition à des menaces naturelles, comme l’exposition à un prédateur ou à un congénère agressif. Cela nous permettra d’identifier les réseaux de neurones et les mécanismes neurophysiologiques nécessaires au bon fonctionnement de ce phénomène d’atténuation. Ce travail pourra contribuer au développement de stratégies thérapeutiques pour soulager les individus affectés par le trouble de stress post-traumatique chez lesquels l’extinction des souvenirs traumatiques est déficitaire.

Bénéfices attendus

Cette étude aidera à comprendre comment le cerveau peut se remettre de souvenirs traumatisants et atténuer les fortes réponses émotives qui y sont associées. Ce qui est unique dans ce projet, c'est qu'il modélisera cela en utilisant les souvenirs naturels de peur des souris résultant d’une exposition à un prédateur ou à un congénère agressif. Cela modélise avec plus de précision que les études classiques la complexité des traumatismes rencontrés en clinique. Ce faisant, notre projet permettra d'étudier les déficiences neurales à l'origine des déficits d'extinction et, à terme, de développer des cibles pour une thérapie spécifique dirigée contre le syndrome de stress post- traumatique.

Procédures

Notre projet implique des chirurgies cérébrales (la procédure chirurgicale dure au maximum 45 minutes. Temps de récupération post-chirurgicale complète max 5 jours ; les souris subiront un maximum de trois interventions chirurgicales espacées d'au moins une semaine). Certains souris subiront aussi des stress physiques (stimulation électrique aux pattes provoquant la peur (3 min), ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique (max 30 jours) et/ou psychologiques d’une durée de maximum 10 minutes (contention prolongée, exposition sans contact à un prédateur, exposition à un congénère agressif, séance de nage). Enfin certains animaux seront isolés pour maximum 10 jours.

Impact sur les animaux

- Extinction éthologique: Isolement (max 10 jours, modéré) + exposition sans contact à un Prédateur/exposition à un congénère agressif/exposition à un stimulation électrique 0,8 mA, 2 secondes, 3 fois (modéré)= total modéré - Extinction éthologique (modéré) + 1 chirurgie stéréotaxique (modéré) = total sévère - Extinction éthologique (modéré)+ 3 chirurgie stéréotaxique (modéré) = total sévère - Extinction éthologique (modéré) + contention prolongée (moderé)+ séance de nage (moderé) = total sévère - Extinction éthologique (modéré) + ligature du nerf sciatique provoquant une douleur chronique (sévère)= total sévère La méthode de génotypage et d'identification pour totes les souris est fait par poinçonnage auriculaire.

Devenir

La mise à mort est prévue pour tous les souris expérimentales afin de prélever les cerveaux pour l'analyse biologique. Les souris CD1 et les rats seront mises à mort à la fin de chaque procédure (ils ne peuvent pas être conservée d’une procédure à l’autre parce que le délai entre les procédures nécessaire pour analyse des données est trop long).

Remplacement

Du fait des du sujet de ce projet, qui est de comprendre de fonctionnes complexes du cerveaux comme la mémoire et la peur, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives qui prévoit pas l’utilise d’animaux vivantes pour obtenir des données sur ces processus mentale, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Le modèle souris est idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.

Réduction

Nous allons utiliser le moins d'animaux possible tout en obtenant des résultats biologiquement et statistiquement significatifs pour notre projet. Nous utilisons des calculs statistiques pour déterminer combien d'animaux sont nécessaires, en nous basant sur des données déjà disponibles dans des études similaires. Toutes les procédures expérimentales ont été perfectionnées afin d’obtenir des taux de réussites les plus élevés possibles, par le biais par exemple : De la mise en place de techniques chirurgicales communes et du partage des connaissances de “savoir- faire”. D’une veille technologique et d’une régulière mise à jour des équipements. De l’utilisation d'animaux qui sont pas à corriger. Cela nous permet de produire le nombre exact d’animaux nécessaires aux procédures expérimentales sans avoir à éliminer les animaux superflus. Enfin, nous avons réalisé des études pilotes basées sur l'analogie avec la littérature qui ont permis d'estimer le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation avec le logiciel G*Power en considérant un α = 0.05 et Puissance = 0.95 (la taille de l'effet a été calculée pour chaque type d’expérience).

Raffinement

Les tests comportementaux que nous proposons sont particulièrement sensibles au niveau de stress des souris. Nous portons donc une attention particulière au bien-être des souris à la fois dans les conditions d'hébergement (enrichissement des cages : maison, matériel de nidification, bâtonnet en bois à ronger)) et dans la conception des tests expérimentaux (réduction de la douleur et de l'angoisse infligée à son minimum nécessaire pour produire les comportements recherchés). Les protocoles de chirurgie utilisés répondent aux meilleurs standards de l’anesthésiologie et de la prise en charge de la douleur. L’hypothermie induite lors de ces protocoles est contrée par l’utilisation d’un tapis chauffant spécialement conçu. Les conditions de réveil sont particulièrement surveillées. Les animaux seront régulièrement manipulés afin de les familiariser aux expérimentateurs. Des points limites adaptés et précoces nous permettront également de réagir de manière anticipée à toute dégradation superflue du bien-être de nos animaux.

Choix des espèces

Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes alternatives qui prevoiyent pas l’utilise d’animaux vivantes ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons : -La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. -Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas sacrifier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Enfin, la souris constitue un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension de l’atténuation des souvenirs aversifs, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Dans cette étude, des rats vont également être utilisé. Ces rats sont utilisés comme stimulus aversif envers nos souris expérimentales et non directement comme sujets étudiés. Pour cette raison, le nombre de rats utilisés dans cette étude est extrêmement limité (

Pour tester des candidats médicaments contre la douleur chronique, 3 835 souris et 624 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue. Le porteur inflige des atteintes du nerf sciatique, une incision de la voûte plantaire ou la ligature d'un nerf lombaire, et précise qu'aucune médication antalgique systématique ne sera appliquée puisque la douleur constitue le paramètre étudié. Les animaux qui perdent plus de 15 % de leur poids, qui présentent une paralysie de la patte opérée ou qui se blessent entre eux sont tués sans délai. Aucun placement ni aucune mise en liberté n'est prévu, la mise à mort servant, selon lui, à ne pas prolonger la douleur provoquée.

Objectifs

Une douleur qui dure plus de trois mois est définie comme chronique et en tant que telle représente un des problèmes de santé publique les plus importants dans les pays développés. Les douleurs chroniques affectent environ 20% de la population adulte, et sont pour la plupart résistantes aux traitements thérapeutiques actuels. De plus, l'utilisation de la morphine, molécule de référence pour le traitement de la douleur, est limitée en raison de l'apparition d'effets secondaires et de phénomènes de tolérance. Nous avons démontré que l’activation d’un récepteur neuronale spécifique est nécessaire et suffisant pour générer expérimentalement une douleur neuropathique (douleur liées aux nerfs) chez les rongeurs. Plus important encore, nous avons montré que, lorsque l’état de douleur neuropathique était installé, l'inhibition de ce récepteur suffisait à annuler les symptômes douloureux. De plus, nos découvertes récentes étendent le champ d’application aux maladies douloureuses pouvant être traitées avec des opioïdes (épargne morphinique) et élargissent le champ d’application des inhibiteurs de ce récepteur aux douleurs inflammatoires (DI). Ces résultats ont été publiés et fait l’objet de plusieurs brevets. Dans ce projet, l'implication de ce récepteur, nouvelle cible innovante dans les douleurs chroniques, sera étudiée. De façon plus précise, les effets de nouveaux antidouleur, des inhibiteurs de ce récepteur, seront générés et explorés dans des modèles d'étude des différents types de douleurs chroniques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but, dans un premier temps, de compléter nos connaissances sur l’intégration de l’information douloureuse et son maintien, ainsi que d’amener de nouvelles clés à la compréhension des mécanismes autour de la douleur chronique. Ce travail, mené depuis maintenant plusieurs années, nous a déjà permis de mettre en avant un acteur essentiel dans les douleurs neuropathiques périphériques, mais surtout une cible potentielle pour de nouveaux composés thérapeutique. Le manque évident de traitement aux douleurs neuropathiques agit comme motivateur principal à ces travaux de recherche. Au vue de l’avancée de cet étude, il convient maintenant de développer nos composés antagonistes (bloqueur) au récepteur découvert et de tester leur efficacité sur les différents modèles de douleur (à la fois neuropathique et inflammatoire) dans le but d’avancer des candidats pré-cliniques pour le traitement des douleurs chroniques et réaliser ensuite des études cliniques chez l’homme.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à 5 types de procédures chirurgicales différentes, induisant des douleurs neuropathiques ou inflammatoires. Les trois premières induisent des douleurs neuropathiques chez la souris et portent atteinte au nerf sciatique de manières différentes en fonction de la procédure, ces interventions durent entre 5 et 10 minutes et se font sur animaux anesthésiés par inhalation. La quatrième se fait également sur la souris et induit une douleur inflammatoire par une simple incision de la voûte plantaire, cette intervention dure 5 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation. La cinquième se fait sur le rat et induit une douleur neuropathique par ligation (léger nœud) d'un nerf partant de la moelle épinière au niveau lombaire, cette intervention dure entre 15 et 20 minutes et se fait sur animaux anesthésiés par inhalation. Les prèlevements submandibulaires et de la veine caudale se feront sur animaux endormis et anesthésiés et durent approximativement 2 à 3 minutes.

Impact sur les animaux

La douleur étant le paramètre étudié, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne sera appliquée. D’autre part, des tests de toxicologie in vitro sont systématiquement réalisés sur nos composés avant tout test sur l’animal pour assurer la sûreté de nos produits. Aucun des composés déjà testés n’ont montré de problème de toxicologie, ni l’apparition d’effets secondaires sur l’animal. De ce fait, la douleur induite par nos différents modèles sera la seule nuisance pour les animaux. En cas de troubles comportementaux (perte de poids rapide supérieure à 15%, paralysie de la patte opérée, pilo-érection) suite à la chirurgie, les animaux seront euthanasiés sans délai afin d’éviter la mort par inanition. En cas de lésions dues à des attaques entre les animaux, ceux-ci seront séparés et/ou le milieu enrichi par ajout d’igloo. Si les attaques continuent et/ou les lésions sont trop importantes ou douloureuses pour l’animal, celui-ci sera euthanasié sans délai.

Devenir

La douleur chronique étant étudiée, et donc induite, chez ces animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement la mise à mort afin de ne pas prolonger inutilement la douleur. Aucun placement ou mise en liberté n’est donc prévu pour ce projet.

Remplacement

A ce jour, il n'y a pas de modèles non animaux permettant d'étudier les mécanismes du système nerveux impliqués dans la transition entre douleur aiguë (court terme) et douleur chronique (long terme). Les effets pharmacologiques des molécules utilisées sur la chronicisation douloureuse, l'analgésie et l'état émotionnel, doivent être évalués au travers de systèmes intégrés par différents tests comportementaux, qui viennent appuyer et confirmer les données obtenues par des approches cellulaires. Il est donc indispensable d'avoir recours à des investigations sur l'animal afin de proposer des alternatives thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de la douleur. La souris et le rat étant des mammifères dont la physiopathologie est proche de l'Homme, ces espèces seront utilisées dans le cadre du projet.

Réduction

Une stratégie par étape/boucle sera mise en place afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés de manière rationnelle et efficace pour l’obtention de 2 candidats médicaments. Ainsi tous les antagonistes générés ne seront pas testés sur chacune des procédures, seulement les deux candidats médicaments devront être testés sur l’ensemble des procédures, ce qui réduit drastiquement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de rats et de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations précédentes réalisées. Ce nombre a été confirmé par le calcul de puissance via une analyse a priori à l’aide d’un logiciel. Le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 8 rats par groupe pour observer une différence de 20% entre les animaux contrôles et les animaux traités. Pour les souris, le calcul de puissance à 80% indique un nombre de 13 souris par groupe pour observer une différence de 20% entre les animaux contrôles et les animaux traités.

Raffinement

Précédent chaque expérimentation, une habituation de minimum une semaine est réalisée au cours de laquelle les animaux sont placés dans la pièce expérimentale pendant minimum 1h et exposés aux différents tests sans application du stimulus nociceptif. Cela permet aux animaux de s’habituer à l’environnement et à l'expérimentateur limitant ainsi l’impact du stress (angoisse) lié à la procédure expérimentale. En outre, les rats seront soumis à une habituation supplémentaire d’une semaine au cours de laquelle l’expérimentateur manipulera chaque rat individuellement. Cette période d’habituation leur permettra de s’acclimater uniquement à l’expérimentateur et aux différentes contentions réalisées par celui-ci durant l’expérimentation. Ces périodes d’habituation sont fondamentales afin d’assurer une reproductibilité des tests nociceptifs et donc de limiter l’hétérogénéité des animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, afin de limiter la douleur chez les animaux, toute expérience est limitée dans le temps (maximum 1 mois après la lésion). Afin de limiter la douleur pendant les procédures expérimentales, tout acte opératoire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les animaux sont gardés en cage collective (10 souris/cage) dans une animalerie dans laquelle la température et l'hygrométrie sont contrôlées. Les locaux sont en légère surpression, les cages possèdent des couvercles filtrants, et les animaux bénéficient d'un enrichissement du milieu (copeaux, igloos en plastique, bâtonnets de cellulose). Un suivi de l’animal sera également mis en place afin de déterminer les points limites les plus précoces. Une fois par semaine seront relevés : le poids de l’animal, l’aspect de son pelage, ses comportements ainsi que sa vitesse de respiration. Un score pré-établi associé à chacun de ces paramètres nous permettra de determiner si la fréquence de ce suivi devra être augmenté ou si l’animal devra être euthanasié afin d’éviter des souffrances trop importantes.

Choix des espèces

La souris et le rat étant des mammifères dont la physiopathologie est proche de l'Homme, ces espèces seront utilisées dans le cadre du projet. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 6 et 12 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement. Les rats seront utilisés entre 5 et 6 semaines pour les mêmes raisons citées ci-dessus.

Rendues obèses par un régime enrichi en graisse pendant un à quatre mois, opérées du cœur ou irradiées dix minutes sans anesthésie, 1 770 souris et 70 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit des risques d'arrêt cardio-respiratoire pendant la chirurgie, des arrêts cardiaques liés à l'insuffisance cardiaque provoquée, et un affaiblissement général après irradiation par perte du système immunitaire. Les tests métaboliques imposent huit prélèvements de sang à la queue en deux heures sur des animaux vigiles. Travaillant à l'échelle de l'organisme, le porteur juge "nécessaire" un modèle animal proche de la pathologie visée.

Objectifs

La fibrillation atriale est l’arythmie la plus fréquente en pratique clinique. Sa prévalence augmente avec le vieillissement de la population faisant craindre une épidémie dans les 50 prochaines années. La cardiomyopathie atriale définie une déformation du myocarde atrial, un remodelage du tissu et une désorganisation de la hiérarchie du tissu. A l’échelle fonctionnelle, les conductions électriques sont anormales et favorisent les troubles du rythme (arythmie). Récemment, il a été décrit une accumulation de tissu gras à l'épicarde de l'oreillette. Les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques de la fibrillation atriale, dans lesquels ce tissu gras épicardique semble dégénérer et libérer des facteurs qui diffusent librement dans le myocarde. Une infiltration de cellules immunes est observée, perturbant l’environnement homéostasique. Quiescent dans le cœur sain, l’épicarde atrial est réactivé en réponse à un stress, et devient une source de progéniteurs capables de se différencier en myofibroblastes et en adipocytes. Un stress de l'environnement réactive les progéniteurs et induit une transformation de ces cellules en adipocytes qui composent le tissu gras. Aujourd'hui, rien n’est connu sur les échanges et l'impact des cellules inflammatoires avec les progéniteurs. Les objectifs sont d'identifier les cellules immunitaires infiltrées et de comprendre leur rôle.

Bénéfices attendus

Les projets portant sur la compréhension du changement de structure et de fonction de l'oreillette dans le contexte de l'obésité et de l'insuffisance cardiaque permettront de cibler le rôle de l'inflammation et ses conséquences dans le développement précoce des troubles du rythme atrial.

Procédures

Toutes les souris des lignées seront prélevées d'un petit bout de queue. La biopsie est déposée dans un tube. Une première partie des animaux (souris uniquement) sera mise sous régime enrichie en graisse pendant 1, 2 ou 4 mois. Nous réaliserons des tests métaboliques pour tester l'évolution de syndromes métaboliques impliquant une injection intrapéritonéale unique ou un gavage unique (quelques secondes sur animal vigile) suivi de la prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures au niveau de la queue (quelques secondes sur animal vigile). Des mesures cardiaques seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Une seconde partie des animaux (souris et rats) subira une chirurgie cardiaque unique effectuée sous anesthésie générale et locale, avec une prise en charge analgésique multimodale. L'intervention est de 20 minutes. Des mesures cardiaques sous anesthésie seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. Une troisième partie des animaux (souris uniquement) sera irradiée durant 10 minutes par animal non anesthésié. Le lendemain, elles sont transplantées avec des cellules issues de la moelle osseuse de souris donneuses par injection intraveineuse sous anesthésie. Elles seront ensuite mises sous régime enrichi en graisse pendant 1, 2 et 4 mois. A terme du régime, nous réaliserons des tests métaboliques pour tester l'évolution de syndromes métaboliques impliquant une injection intrapéritonéale unique ou un gavage unique (quelques secondes sur animal vigile) suivi de la prise d'une goutte de sang répétée 8 fois en 2 heures au niveau de la queue (quelques secondes sur animal vigile). Des mesures cardiaques sous anesthésie seront effectuées par un monitoring adapté (échocardiographie) qui dure 5 minutes par animal et des tests de troubles de rythme qui dure 5 minutes par animal seront aussi réalisés. En fin de période des procédures d'obésité (2 et 4 mois de régime), ou de chirurgie cardiaque (7jours, 1mois et 2 mois), l’ensemble des animaux seront anesthésiés, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie immédiatement suivi d’une euthanasie selon une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

L'utilisation de lignées transgéniques nécessite l’identification génétique des animaux réalisée par un seul prélèvement à l’extrémité́ caudale (1-2mm) ce qui peut être source de stress et d’une douleur de courte durée. L’utilisation de régime obésogène provoque une prise de poids pouvant conduire à une obésité associée à diverses pathologies cardio-métaboliques. Les challenge métaboliques induisent un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures. La chirurgie peut conduire à des risques anesthésiques incluant : détresse respiratoire, hypothermie, arrêt cardio-respiratoire. Elle peut également engendrer des douleurs post-opératoires, des difficultés de déplacements et à s'alimenter. De plus, l'insuffisance cardiaque induite par la chirurgie peut conduire dans certains cas à des arrêts cardiaques. L'irradiation conduit à une perte du système immunitaire et donc à un affaiblissement général en plus d’un risque infectieux accru.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés à la fin des actes pour réalisation des prélèvements et analyses.

Remplacement

Les projets ont pour but de comprendre l’influence du métabolisme et de l'immunité sur l’activité cardiaque et le remodelage atrial. Comme nous travaillons sur les modifications à l’échelle de l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un modèle expérimental proche de la pathologie ciblée dans notre étude. Toutefois, des biopsies de tissu provenant d'études antérieures seront utilisées pour ne pas reproduire les expériences. Des lignées de cellules seront aussi utilisées.

Réduction

La taille des effectifs est établie avec un calcul de puissance en amont et par la suite des analyses seront effectuées en plus du nombre d'animaux. Les lots d'animaux d'expérimentation sont 1770 souris et 70 rats ce qui fait la somme totale de 1840 animaux.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux sont en cage par 5 avec du matériel d'enrichissement. Les souris rendues obèses seront surveillée quotidiennement, des tests de glycémie seront réalisés pour surveiller l'obésité et le diabète. La prise de poids est effectuée de manière hebdomadaire. Les points limites sont évalués par un personnel compétent, notamment sur l'aspect du pelage, le comportement et la mobilité. Dans le projet de l’insuffisance cardiaque, les animaux sont en cage par 5. Le jour de la chirurgie, ils sont anesthésiés puis rasés sur le thorax et désinfectés avec un antiseptique dermique. Une dose d'analgésique sera injectée en sous cutané chez l’animal 30 minutes avant la procédure chirurgicale et 10 minutes avant la fin de la procédure. De plus, une prise en charge de la douleur les 3 jours suivants sera également assurée au cours de la 1ère semaine, durant laquelle les animaux seront aussi nourris avec de la bouillie et l'apport d'eau sera facilité. Les souris seront surveillées quotidiennement et la prise de poids sera évaluée de manière hebdomadaire. Les points limites seront évalués quotidiennement par un personnel compétent et formé. Le comportement, la mobilité, la prise de poids, l'aspect du visage, l'aspect de la cicatrice seront des critères évalués quotidiennement par un scoring. Dans le projet de l’irradiation, les souris seront surveillées quotidiennement, une attention particulière sera effectuée sur la consommation de l’eau dans lequel un antibiotique sera ajouté pour contrôler la fragilité à l’infection. Une alimentation directement dans la cage pour faciliter l’hydratation en post-irradiation avec de la nourriture molle sera employée.

Choix des espèces

La souris est l’animal le plus approprié pour nos études concernant la réponse systémique dans le développement des arythmies cardiaques. Il s'agit du seul modèle dans lequel ont été générées des lignées déficientes pour l’expression de gènes d'intérêt. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications cardiaques dans un espace de temps raisonnable. La souris est l'espèce pour laquelle la technologie de transgénèse est la plus fiable et la mieux établie. Le rat est l'animal le plus approprié pour nos études concernant l'isolement de cellules progénitrices de l"épicarde. Le modèle d'insuffisance cardiaque permet d'augmentere le nombre de cellules progénitrices in situ, de les isoler et de travailler par la suite in vitro. Souris et rats adultes de 8 semaines à 12 semaines d’âge. Ce stade de développement corrobore avec le début de l’âge adulte, un stade qui correspond au début du développement des maladies cardiovasculaires chez l’homme.