Rats
Étude de l’effet rénal de l’inhibition de l’endocytose de la myoglobine par la cilastatine en cas de choc hémorragique associé à la rhabdomyolyse
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Tous tués sans avoir repris conscience, 156 rats sont maintenus sous anesthésie générale pendant six heures pour reproduire un choc hémorragique associé à une destruction musculaire. Ils subissent une ponction de la vessie sous échographie, la pose d'un cathéter dans la veine de la queue et d'un autre dans la carotide gauche, puis six prélèvements sanguins étalés sur toute la durée, avant le prélèvement des organes. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'un "léger stress de courte durée" au moment de la mise en cage d'induction, l'anesthésie sans réveil dispensant selon lui de toute évaluation de la douleur. Il affirme que ces expériences sont "indispensables" faute de pouvoir simuler les conséquences d'un traumatisme musculaire sévère.
Objectifs
Le traumatisme sévère est un problème de santé publique majeur qui touche une population jeune. Il associe le plus souvent un choc hémorragique (perte de sang massive) à un traumatisme musculaire. Il induit fréquemment une insuffisance rénale aiguë. La destruction des cellules musculaires lors du traumatisme est responsable de la fuite du contenu intracellulaire dont la myoglobine (protéine qui assure le stockage de l’oxygène au sein du muscle). De nombreuses études désignent cette myoglobine comme un des facteurs responsables de la dysfonction rénale lors d’un traumatisme musculaire. La myoglobine relarguée par les muscles endommagés est re capturée par les cellules rénales, limitant ainsi son évacuation dans les urines. Nous avons observé lors des travaux précédents une synergie lésionnelle entre choc hémorragique et traumatisme musculaire. En effet, cette association induit une inflammation extrême et une défaillance multi-viscérale dont une défaillance rénale. L’association myoglobine et choc hémorragique reproduit les mêmes effets. En cas de choc hémorragique, la myoglobine injectée en intraveineux n’est plus éliminée, contrairement à ce que nous observons lors d’un traumatisme musculaire seul ou lors d’une injection de myoglobine seule. Ainsi, nous pensons que restaurer l’élimination rénale de la myoglobine pourrait limiter ou supprimer ses effets délétères. Notre projet a donc pour objectif de limiter les effets délétères de l’association choc hémorragique et traumatisme musculaire sur le fonctionnement des organes, principalement sur la fonction rénale en permettant l’élimination de la myoglobine. Nous souhaitons étudier une stratégie thérapeutique basée sur l’inhibition pharmacologique du récepteur responsable de la recapture de la myoglobine par les cellules rénales.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels le traumatisme sévère conduit à la défaillance multiviscérale pourrait aider à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et/ou permettre de développer des outils pour la prise en charge et le suivi de l'évolution clinique des patients.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis à une anesthésie générale gazeuse sans réveil, avec analgésie, avec phase d'induction de très courte durée (
Impact sur les animaux
L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée.
Devenir
Euthanasie pour prélèvement d'organes, de sang et d'urine à l'issue de tous les animaux dans toutes les procédures pour des études histologiques et biologiques.
Remplacement
Compte tenu des contraintes des études cliniques et de notre incapacité à simuler les conséquences d’un traumatisme musculaire sévère sur l’organisme et un état de choc hémorragique, des expérimentations animales sont indispensables pour accélérer une amélioration de la prise en charge des patients. De plus, nos connaissances sur les mécanismes de régulation de la pression artérielle systémique ainsi que sur la physiologie rénale ne sont pas suffisantes pour envisager une modélisation suffisamment robuste pour remplacer l’animal.
Réduction
Nous visons à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé en faisant le maximum de mesures par animal tout en nous assurant une analyse statistique fiable et complète de nos travaux.
Raffinement
L’ensemble de la procédure sera réalisé sous anesthésie générale et contrôlée par l’observation des signaux physiologiques tels que la pression artérielle et/ou la fréquence respiratoire. L’anesthésie sera toujours associée à une analgésie réalisée par l’administration d’un analgésique dès l’induction de l’anesthésie et 3 heures après l’induction ou pas du traumatisme. Pour maintenir la température de l’animal à 37.4°C, les rats anesthésiés seront placés sur un matelas chauffant. Leur température sera contrôlée par sonde rectale. L'induction de l'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. L’anesthésie est sans réveil : aucune évaluation de la douleur sur animal éveillé ne sera nécessaire.
Choix des espèces
La richesse de la bibliographie disponible sur le modèle murin et des données disponibles sur le choc hémorragique ou la rhabdomyolyse sur ce type de modèle, nous permet de comparer et de discuter nos résultats expérimentaux. De plus, nous avons une expérience importante dans l’utilisation de ce modèle. Enfin, l’évaluation de l’efficacité de traitements à coût élevé nécessite l’utilisation de petits animaux. Les rats utilisés seront des adultes pesant 350g (300 à 400g). Le choix de ce stade de développement est calqué sur celui le plus fréquemment utilisé dans les études publiées afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine.
Dosages biologiques de gonadotropines humaine (hFSH) et équine (eCG) chez la ratte
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Injectées une fois puis tuées trois jours plus tard pour peser leurs ovaires et leur utérus, 1 200 jeunes rattes de vingt à vingt-trois jours sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ce dosage biologique suit les protocoles des pharmacopées, que le projet dit précisément vouloir remplacer par un test sur lignée cellulaire, ce qui n'empêche pas de programmer vingt expérimentations de soixante animaux sur quatre ans. Le porteur indique que les rattes arrivent juste après le sevrage, sans semaine d'habituation, parce qu'elles produiraient sinon leurs propres gonadotropines et deviendraient inutilisables pour le dosage. Il compte parmi les bénéfices attendus l'arrêt des prélèvements de grands volumes de sang sur des juments gestantes, qu'il qualifie d'"évident bénéfice éthique".
Objectifs
Dans les deux projets , nous sommes amenés à réaliser des dosages biologiques des gonadotropines équines et humaines. Un but commun dans ces deux programmes est de remplacer les dosages in vivo de la pharmacopée par des dosages biologiques in-vitro, extrèmement sensibles et spécifiques, sur une lignée cellulaire établie, bien décrite et facilement disponible.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu est de réduire, voire éventuellement de remplacer, les dosages in vivo sur rattes des gonadotropines eCG/PMSG et FSH par des dosages biologiques in vitro sur une lignée cellulaire. Le second bénéfice, par le développement de eCG recombinantes monocaténaires originales (produites en cultures de cellules) est de diminuer ou même de cesser les prélèvements de grands volumes de sang sur des juments gestantes (évident bénéfice éthique). En outre, la production de gonadotropines recombinantes, permettra d’améliorer leurs propriétés physicochimiques et biologiques, plus faciles à exprimer efficacement et à purifier .Ces bénéfices seront donc d’abord éthiques par la réduction, puis éventuellement le remplacement, des dosages in vivo des gonadotropines par des dosages sur lignées cellulaires. Ces bénéfices seront aussi financiers si l’on considère les coûts 1/ des tests in vivo sur rattes par rapport à ceux sur lignées cellulaires et ceux 2/ de la purification en une seule étape des gonadotropines recombinantes par rapport à celles des gonadotropines naturelles provenant des juments gestantes. Ces bénéfices , enfin, seront aussi techniques grâce aux propriétés mieux choisies et mieux contrôlables des hormones recombinantes par rapport aux gonadotropines naturelles.
Procédures
Dans la grande majorité de nos dosages (gonadotropines à longue demi-vie dans la circulation sanguine), il n’y aura qu’une seule injection à J1 puis l’euthanasie / nécropsie à J4. Aucune intervention ni prélèvement dans l’intervalle. Très exceptionnellement, nous pourrions être amenés à tester une gonadotropine à courte demi-vie et devoir pratiquer deux injections supplémentaires à J2 et J3. Chaque injection ne dure que quelques secondes entre la prise de l’animal et son retour dans la cage avec ses congénères
Impact sur les animaux
Les injections en sous cutanée peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection ainsi qu’un éventuel œdème et la ou les différentes contentions peuvent entrainer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après la stimulation gonadotrope à fin de nécropsie pour prélever les ovaires et utérus qui seront pesés et, occasionnellement, caractérisés plus finement en microscopie.
Remplacement
Le but du premier projet est justement , à terme, de pouvoir remplacer les rattes utilisées dans les protocoles recommandés par les pharmacopées (internationale et européenne) par le dosage in vitro sur lignées cellulaires. A cette fin, un certain nombre d'expérimentations en parallèle sont indispensables pour corréler les deux dosages entre eux en introduisant le facteur d'encombrement moléculaire des hormones qui détermine leur demi-vie dans la circulation sanguine.
Réduction
Nous avons prévu, au cours des quatre ans des deux projets, 20 expérimentations de 60 animaux chacun. De manière générale, les 60 animaux par expérimentation se décomposent de la manière suivante: 3 produits x 4 doses x 5 réplicats/dose. Pour réduire le nombre d'animaux, nous dosons au moins deux produits ensemble contre une même gamme de référence et utilisons seulement 5 réplicats / dose au lieu de 7 dans les pharmacopées. Nous suivons ce protocole depuis des années et les calculs d'activités par parallel line assay (PLA) sont statistiquement solides dans ces conditions. Le second projet porte sur le design et la production de nouvelles gonadotropines recombinantes originales dont l’activité biologique in vivo doit être définie avant transfert chez les animaux de rente (saisine complémentaire chez la brebis). Ces 20 expérimentations sur 4 ans sont vraiment un minimum que nous ne dépasserons pas pour l’ensemble des deux projets. D’autant plus que le premier a précisément pour but de ne plus requérir à l’avenir ces dosages in vivo. Par ailleurs, le second projet bénéficiera des avancées du premier et permettra en cas de réussite, de remplacer l’hormone naturelle par des copies recombinantes obtenues en cultures de cellules et ainsi ne plus saigner de juments gravides. Ces 20 expérimentations sur 4 ans sont vraiment un minimum que nous ne dépasserons pas pour l’ensemble des deux projets sachant que le premier a, en outre, pour but de se passer à l’avenir de ces dosages in vivo.
Raffinement
Les animaux ne séjournent que quatre jours (mardi à vendredi) dans l'animalerie et bénéficient d'un environnement enrichi. Néanmoins, comme lors de nos précédentes demandes, nous ne pouvons pas avoir une semaine d'habituation avant expérimentation. En effet, les rattes doivent être sevrées et encore immatures (20-23 jours) . Or la puberté intervient vers 28-30 jours. Comme les animaux nous sont livrés juste après sevrage, les rattes produiraient leurs gonadotropines endogènes pendant cette période et seraient inutilisables pour nos dosages. L'acquisition de portées avec leur mère conduirait à sacrifier inutilement les mères ainsi que les mâles de la portée (ce qui, évidemment, va à l'encontre de notre but de sacrifier un nombre le plus réduit possible d'animaux). Concernant le stress/angoisse des animaux, nous avons l’habitude de les manipuler avec douceur et ils ne manifestent aucun signe de peur. Le milieu est enrichi et permet aux jeunes rattes de s’entasser dans leur nid (tube carton).
Choix des espèces
Les rattes immatures de 20-23 jours sont les animaux tests de la pharmacopée pour les dosages des gonadotropines car les ovaires de ces animaux y sont sensibles mais les animaux ne produisent pas encore de gonadotropines endogènes (seulement à J28-30 environ).
Caractérisation d’un nouveau transporteur de sucres à partir de foie de rats
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tués sans reprise de conscience, 176 rats sont mis à jeun douze à seize heures en cage individuelle, puis anesthésiés, ouverts et exsanguinés pour prélever leur foie. Un seul individu est utilisé à la fois, chaque foie fournissant assez de lysosomes pour une douzaine de mesures valables quelques heures seulement, ce qui conduit à en tuer un autre pour chaque nouvelle condition à tester. Le porteur reconnaît que l'isolement et la perte de poids liés au jeûne peuvent stresser l'animal. Il écarte les lignées de cellules hépatiques cancéreuses au motif que leurs lysosomes sont altérés, et déclare l'usage d'un "organisme entier vivant" "indispensable".
Objectifs
A l’intérieur des cellules, les lysosomes représentent le centre de recyclage des déchets. Une nouvelle activité de transport permet de transporter des petites molécules de sucre (appelées oligosaccharides), vers l’intérieur des lysosomes où elles seront entièrement dégradées. Ce nouveau type de transport n'avait été identifié que par son activité à partir de lysosomes isolés de foies de rat. Notre but est donc de caractériser les différents constituants protéiques impliqués et de développer un dosage fluorescent qui permettra plus rapidement de doser cette activité de transport.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont doubles: premièrement, si tous les constituants impliqués dans le transporteur sont caractérisés, cela permettra de mieux comprendre le recyclage d'une classe de sucre indispensable (oligosaccharides) à la santé humaine; deuxièmement, il existe plusieurs maladies héréditaires rares qui affectent la population humaine, maladies qui induisent une perturbation de la production de ces oligosaccharides, ce qui entraine des symptômes sévères. L'identification du mécanisme de recyclage de ces sucres nous permettra de proposer des stratégies potentielles pour traiter ces patients.
Procédures
Un seul rat Wistar à la fois est mis à jeûn pendant 12 à 16 heures. Une injection en sous-cutanée d'un antalgique est réalisée suivie d'une anesthésie gazeuse avant l'ouverture de la paroi abdominale puis exsanguination et prélèvement du foie. Les procédures chirurgicales ne durent en tout que 10 minutes.
Impact sur les animaux
Chaque rat mis à jeûn est isolé dans une cage pendant un laps de temps entre 12 - 16 heures. Le fait d'être seul en cage associé à la perte de poids consécutive au jeun, peut occasionner un stress pour l'animal.
Devenir
Dans la mesure où on prélève le foie, un organe vital, pour analyses, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Bien qu'un transport des oligosaccharides existe vraisemblablement dans des lignées de cellules qui ont été établies à partir de cellules cancéreuses hépatiques, ces lignées ne sont pas un bon modèle d’étude pour des transporteurs lysosomaux. En effet, les cellules cancéreuses montrent des altérations des lysosomes qui pourraient donc perturber le transport des oligosaccharides. L’utilisation d’un organisme entier vivant est donc indispensable et notre choix s'est porté d'une part sur les rats car c'est chez cette espèce que ce transporteur lysosomal a d'abord été découvert.
Réduction
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’un projet de recherche et de travaux précédemment publiés. Les études de transport déjà réalisées au sein de notre équipe, en utilisant des lysosomes extraits de foie de rats et des expérimentations préliminaires, ont donc permis de réduire au maximum le nombre d’animaux par approche pour obtenir des résultats interprétables. Nous optimisons donc au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal: ainsi un seul rat Wistar est utilisé à la fois car le fractionnement subcellulaire du foie d'un seul animal permet d'obtenir suffisamment de lysosomes pour faire une douzaine d'expériences de transport en triplica. Dans la mesure où les lysosomes ne sont fonctionnels que quelques heures, il est donc nécessaire de sacrifier un autre animal pour tester de nouvelles conditions expérimentales. La variabilité entre les différentes préparations de lysosomes issues de différents animaux, est prise en compte par l'utilisation d'un témoin interne de transport. Les résultats de transport sont donc normalisés entre différents lots de lysosomes. Pour cette raison, on ne fait pas d'analyses statistiques avec des lots de lysosomes issus d'animaux différents.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée sur le bien-être des animaux pendant la stabulation dans l’animalerie, par une surveillance journalière qui sera assurée par le personnel de l'animalerie et qui appliquera les points limites habituels de l’animalerie. Lorsqu’un rat doit entrer dans la procédure, il est placé seul dans une cage et mis à jeun pendant 12 à 16 heures et un enrichissement de sa litière est apporté pour pallier au stress de l’isolement.
Choix des espèces
L’utilisation de rats pour ce projet se justifie pour 2 raisons : 1) le prélèvement du foie d'un seul rat permet d'obtenir suffisamment de lysosomes pour tester de nombreuses conditions de transport lysosomal d'oligosaccharides; 2) c’est un petit mammifère dont le comportement est bien connu ce qui permet d’évaluer facilement le bien-être de l’animal. Tous les animaux utilisés sont adultes (âgés d'au moins 10 semaines) car le poids du foie permet de préparer suffisamment de lysosomes pour effectuer une douzaine de conditions de transport en triplica.
Evaluation de la toxicité subchronique de composés naturels et de nouveaux aliments administrés par voie orale chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour évaluer la toxicité de quinze composés naturels et nouveaux aliments, 1 200 rats reçoivent une administration orale quotidienne pendant 90 jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour un quart d'entre eux et sévère pour les autres, tous tués pour prélever l'ensemble de leurs organes. Le porteur indique que les fortes doses peuvent provoquer la mort, une perte de poids importante, des tremblements, des convulsions, une paralysie ou un arrêt de l'alimentation, et précise qu'aucune médication ne pourra les soulager puisqu'il s'agit d'études de toxicité. Les rats passent aussi 24 heures isolés en cage à métabolisme et subissent un prélèvement de sang dans le cœur juste avant leur mise à mort. Le porteur écarte le remplacement au motif d'une "obligation réglementaire", l'enjeu déclaré étant de permettre la commercialisation de ces produits.
Objectifs
La toxicité est la mesure de la capacité d’une substance à provoquer des effets néfastes et mauvais pour la santé ou la survie chez toute forme de vie (animale telles qu’un être humain, végétale, fongique, bactérienne), qu'il s'agisse de la vitalité de l'entité ou d'une de ses parties (ex: foie, reins, poumons.... chez l'animal). Différentes doses de la substance d’essai sont administrées quotidiennement par voie orale à plusieurs groupes d’animaux d’expérience, à raison d’une valeur de dose par groupe et ce durant 90 jours, afin de déterminer pour chaque substance évaluée la dose sans effet nocif observable. Pendant la période d’administration de la substance, les animaux sont observés attentivement en vue de déceler d’éventuels symptômes de toxicité conformément aux recommandations des autorités de régulation. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans, réalisé selon les exigences européennes et nord-américaines, sera d’évaluer la toxicité subchronique éventuelle de 15 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments (appelés Novel Foods), administrés par voie orale chez des rats mâles et femelles. Pour chaque composé à évaluer, 3 doses seront utilisées dans les 2 sexes, définies selon les données d’études in vitro et d’études de toxicité aiguë in vivo effectuées au préalable, en comparaison avec le véhicule de mise en solution de chacun des 15 composés à évaluer. Un suivi quotidien des animaux, régulier de leur évolution pondérale et de leur prises alimentaire et hydrique, et un ensemble de tests fonctionnels et d’analyses sanguines, urinaires et d’organes seront effectués sur l’ensemble des animaux. L’ensemble des données générées permettra de définir la dose maximale sans effet nocif observable de chacun des 15 composés évalués.
Bénéfices attendus
Un nouvel aliment (ou Novel Food) reste défini dans le Règlement de l’Union Européenne comme étant un aliment pour lequel la consommation humaine est restée négligeable dans l’Union Européenne avant le 15 Mai 1997, lorsque la première réglementation sur les nouveaux aliments est entrée en vigueur. Les nouveaux aliments ne peuvent pas être mis sur le marché ou utilisés dans des denrées alimentaires destinées à la consommation humaine tant qu’ils ne sont pas inscrits sur la liste de l’Union Européenne, qui stipule les spécifications du nouvel aliment et ses conditions d’utilisation (dose, matrice alimentaire, etc.), et regroupant les nouveaux aliments autorisés à être mis sur le marché dans l’Union Européenne. Une demande dite Novel Food doit prouver la sécurité du nouvel aliment et sera transmise aux autorités pour évaluation. Un tel dossier a pour objectif de caractériser le nouvel aliment et prouver sa sécurité à travers des tests toxicologiques et microbiologiques. L’enjeu social est donc de prouver l’absence éventuelle de toxicité des 15 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments pour une utilisation future chez l’homme et d’un point de vue économique de permettre le développement de la consommation de ces 15 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments par l’industrie agro-alimentaire afin de proposer de nouvelles alternatives pour l’alimentation de demain.
Procédures
La totalité des rats utilisés dans ce projet, 1200, sera soumise à l’administration orale pendant 90 jours de chacun des 15 composés à évaluer à 3 doses et d’un composé neutre (placebo), pour les 2 sexes. Ces traitements seront effectués sur animal vigile, en moins d’une minute par jour pour chaque rat. Un examen ophtalmologique sera réalisé 2 fois sur la totalité des animaux à l’état vigile, avant le début des traitements et à l’issue des 90 jours de traitement, en 5 minutes environ. Des tests comportementaux sensori-moteurs seront effectués au cours de l’avant-dernière semaine de traitement sur l’ensemble des animaux pour mettre en évidence une toxicité éventuelle des composés administrés sur les sphères sensorielle et motrice. Cinq tests seront ainsi effectués une seule fois en 20 minutes environ pour chaque rat. La totalité des animaux sera placée individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 24 heures afin de recueillir leurs urines avant leur euthanasie. A la sortie des cages à métabolisme, la totalité des animaux sera placée sous anesthésie profonde afin de réaliser un prélèvement de sang directement dans le cœur, immédiatement avant leur euthanasie.
Impact sur les animaux
L’administration d’une forte dose de composé pourrait éventuellement induire une mortalité directe ou retardée des animaux, une perte de poids importante, ou des modifications importantes de leur comportement telles qu’une immobilité totale, des tremblements importants (convulsions), une paralysie, un arrêt de l’alimentation... Ces effets pourraient être observés rapidement, quelques jours après le démarrage des traitements, ou avoir lieu sur un temps plus ou moins prolongé après le démarrage des traitements. La réalisation des tests comportementaux sensoriels et moteurs au cours de l’avant-dernière semaine de traitement va engendrer un stress mais limité dans le temps, ces tests étant effectués en 20 minutes environ. La mise en cage spéciale (cage à métabolisme) des rats pendant 24 heures, nécessaire pour recueillir individuellement les urines de 24 heures de chaque rat, va induire un stress modéré par l’isolement et la perte des interactions sociales entre congénères.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 1200 rats nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort avant réalisation du prélèvement de l’ensemble des organes pour la réalisation d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet qui constitue une obligation réglementaire. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer la toxicité d’ingrédients et d’aliments pendant un temps prolongé sur un organisme entier. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ces évaluations toxicologiques permettant d’obtenir des résultats prédictifs quant aux objectifs envisagés, selon les recommandations internationales en vigueur, soit 10 animaux par groupe expérimental. Pour chaque composé à évaluer, 4 groupes expérimentaux de chaque sexe seront nécessaires, soit un total de 80 rats, 40 mâles et 40 femelles, pour chacun des 15 composés à évaluer. Une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée à l’issue des expérimentations pour comparer chacun des 3 groupes traités avec le composé à évaluer avec le groupe témoin traité avec le véhicule de mise en solution du composé à évaluer, pour chaque sexe.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’administration orale des composés à évaluer et à la suite de celle-ci pendant les 90 jours de traitement. Les animaux seront ainsi observés deux fois par jour au minimum au cours des 90 jours de traitement, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 90 jours de traitement jusqu’à leur euthanasie, leurs prises alimentaire et hydrique seront relevées 2 fois par semaine, et des observations cliniques seront réalisées chaque semaine. Etant donné qu’il s’agit d’études de toxicité, aucune médication ne pourra être donnée aux animaux pour soulager leur éventuelle souffrance. Par contre si un animal présente un niveau de souffrance trop important se traduisant par des tremblements importants (convulsions), une paralysie, une immobilité complète, un arrêt de prise alimentaire…, il sera euthanasié en conformité avec les recommandations éthiques. Le jour et l’heure de son euthanasie seront notés avec le plus de précision possible et une autopsie macroscopique sera réalisée pour détecter toute anomalie en termes de forme, taille et couleur sur l’ensemble des organes et tissus des cavités abdominales et thoraciques et de la surface corporelle. Une analyse des organes et tissus anormaux observés, prélevés et fixés sera réalisée. Les rats seront hébergés par 2 dans des cages transparentes, avec du papier kraft placé dans chaque cage comme enrichissement. Les animaux seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active, respectant ainsi leur horloge biologique. Ils seront alimentés par un régime standard et de l’eau à volonté.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet et celle qui est recommandée par la ligne directrice suivie pour mener de telles études de toxicité orale subchronique. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 125-150 g. Cela correspond au poids de rat à utiliser selon les recommandations internationales en vigueur qui seront suivies pour mener de telles études.
Exploration de marqueurs sanguins de la neuropathie périphérique induite par des anticancéreux : étude sur modèles animaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour chercher des marqueurs sanguins précoces de la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats reçoivent huit injections en 25 jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie constitue "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et que les douleurs qu'elle provoque seront mesurées par des tests d'allodynie pouvant durer une heure par animal. Il présente le recours à des stimulations moins intenses comme un raffinement, alors que la douleur reste l'objet même de la mesure. Les résultats seront comparés à une étude menée chez des patients traités par oxaliplatine ou paclitaxel.
Objectifs
La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). Cette neuropathie est une atteinte des nerfs périphériques qui se caractérise par des désordres sensitifs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients. Aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine (un antidépresseur) est recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques. Enfin, le repérage précoce de cette neuropathie est un autre enjeu, car il est admis qu’un repérage précoce des patients permet de limiter la sévérité et les séquelles à de la neuropathie. Le repérage de la neuropathie repose idéalement sur l’association d’un examen médical et d’autoquestionnaires, mais très chronophage en routine. Récemment des marqueurs sanguins, comme le neurofilament light chain, permettrait un diagnostic des neuropathies et des désordres neurologiques. Cependant, selon la littérature scientifique, ce marqueur sanguin n’est pas assez précoce (les modifications de ce marqueurs sanguins apparaissent quand des lésions des nerfs sont déjà bien établies). Enfin et actuellement, aucun marqueur sanguin ne peut être recommandé en routine. Plus récemment, des petits ARN (acide ribonucléique relargué par les cellules) représentent de nouveaux marqueurs d’intérêt, notamment dans le cas de la douleur, et probablement plus précoces. L’objectif de cette étude sera d’explorer les modifications d’expression de ces petits ARN dans le sang d’animaux exposés à des anticancéreux neurotoxiques responsables de neuropathie.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d’étudier de nouveaux marqueurs de neurotoxicité chez l'animal. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge des neuropathies induites par les anticancéreux est très limitée, et qu’à défaut un repérage précoce des patients permettrait une meilleure prise en charge de la neuropathie (réduction de dose, arrêt ou switch d'anticancéreux) afin de limiter l'évolution et la sévérité de la neuropathie. Les résultats de ce projet seront confrontés à une étude clinique similaire chez des patients atteints de cancer et exposés à de l'oxaliplatine (cancer colorectal) ou du paclitaxel (cancer bronchopulmonaire). De plus, en identifiant des nouveaux biomarqueurs sanguins communs au rongeur et à l'Homme, ces marqueurs sanguins permettrait d’affiner (« refine ») la qualité des études réalisées chez l'animal, avec un meilleur potentiel de transposition clinique (recherche translationnelle).
Procédures
Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, voie intraveineuse ou intrapéritonéale, durée injection de 10 secondes (max). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.
Impact sur les animaux
L’induction de la neuropathie chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie sera associée à des douleurs qui seront mesurées dans le cadre de ce projet. Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bihebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au traitement anticancéreux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des 4 expérimentations/temps de mesure afin d’effectuer des prélèvements.
Remplacement
Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuroapthies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au maximum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux permettant l'analyse des résultats à l'aide de tests statistiques adéquates. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de trop réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (tests statistiques moins fiables, perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux).
Raffinement
Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles douloureux seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant des seuils de douleurs pour des stimuli non douloureux pour un individu sain (on parle d’allodynie). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation douloureuse moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage, dans une salle climatisée (température et hygrométrie controlées) avec un cycle lumière /obscurité 12/12h et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.
Choix des espèces
Le rat est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat possède une activité et un comportement spontanées tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Pratique formative aux études précliniques chez le rat anesthésié
- Enseignement supérieur
Tués avant tout réveil, 420 rats subissent deux injections puis une chirurgie sous anesthésie générale de moins de trente minutes, suivie d'une heure de mesures physiologiques, pour des travaux pratiques d'étudiants en licence. Les gestes sont réalisés par des enseignants, les étudiants assurant le suivi de l'anesthésie, à raison d'un rat par étudiant. Le porteur indique que des alternatives sans animaux existent, plateformes, logiciels et jeu pédagogique, mais les juge inadaptées aux objectifs pédagogiques, tout en annonçant une plateforme de réalité virtuelle en cours de montage. Il présente ces travaux pratiques comme une formation de base "indispensable", et prévoit d'utiliser des rats "surnuméraires" de sa propre structure.
Objectifs
L'objectif de ce projet est l'acquisition de la démarche éthique, des gestes techniques et de la démarche expérimentale à mettre en place lors des études précliniques pour des étudiants en Licence sciences de la vie. Ces étudiants pourront ainsi accéder via une poursuite d’études en master et en thèse à des métiers comportant des procédures expérimentales chez l’animal (départements de pharmacologie de l’industrie pharmaceutique, laboratoires de physiopathologie et de pharmacologie des centres de recherche en biologie-santé, ...). L’ organisation pédagogique universitaire est la suivante sur les 2 dernières années de la licence : o En seconde année (effectifs de 400 étudiants) les étudiants sont sensibilisés à l’acquisition du signal biologique par voie numérique de paramètres enregistrables chez l’homme (pouls artériel, volume et fréquence respiratoires, transmission nerveuse) ainsi qu'à la manipulation des animaux dans le cadre d’enregistrement de paramètres biologiques chez l’animal vigile (volume pulmonaire, pression artérielle). o En troisième année (effectifs de 80 à 150 étudiants), interviennent les travaux pratiques sur le rat anesthésié dans le cadre du projet faisant l’objet de cette demande. L'utilisation d'animaux et la chirurgie pratiquée par des personnels expérimentés permettra aux étudiants d’acquérir une approche concrète de la problématique et de la méthode scientifique des études précliniques avec un regard critique sur les conditions et limites d'utilisation des animaux. Le contexte scientifique du projet correspond à la mise en place de conditions d'études précliniques dans le cadre des fonctions cardiaques, respiratoires, digestives et rénales. Les différents paramètres physiologiques seront évalués par les étudiants en conditions normales et comparés à ceux obtenus sous différents stimuli ou lors de traitements pharmacologiques. Enfin, afin de sensibiliser les étudiants à la pertinence du choix de la méthode de mesure pour l'optimisation et la pertinence des résultats obtenus, différentes modalités de mesure pourront être utilisées, évaluées et comparées. Ces résultats constitueront une base de données scientifiques indispensables à un travail de réflexion et d'analyse.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intègre dans une démarche de formation technique et scientifique fondamentale pour l’obtention d'une Licence scientifique dans le domaine de la biologie-santé. Les mises en situation d'études précliniques des étudiants et l'acquisition de compétences en enregistrement du signal biologique sur petit mammifère font partie de la formation scientifique de base indispensable pour aborder concrètement leurs formations ultérieures et leur activité professionnelle à venir.
Procédures
Chaque rat aura 2 injections par voie intrapéritonéale en condition vigile (une injection d'un mélange d'antalgiques en préopératoire et une injection pour l’induction de l'anesthésie). La durée totale pour chaque contention et injection sera inférieure à 10 secondes. Sous anesthésie générale, chaque rat sera l’objet d’une intervention chirurgicale qui n’excédera pas 30 min et de mesures physiologiques qui n’excéderont pas une heure. Le temps maximum sous anesthésie générale ne dépassera pas 1 heure et 30 min.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures étant sans réveil, les nuisances attendues sont donc les effets connus du stress ainsi qu'une douleur légère et transitoire au moment de la contention, de l'injection d'antalgiques et d'anesthésique et de la phase d'endormissement qui est inférieure à 5 min.
Devenir
Pour l'ensemble des procédures expérimentales, la mise en place invasive de capteurs, de canules et de cathéters n’autorise pas la réutilisation des animaux et conditionne leur mise à mort. Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience par surdosage d'anesthésique.
Remplacement
Ce projet vise à répondre aux exigences du Programme Pédagogique National prévoyant des travaux pratiques d’initiation à l’évaluation de fonctions physiologiques et de l’activité biologique de molécules médicamenteuses. Il s'agit d'un apprentissage concret de la problématique scientifique et surtout des conditions et des limites de l'utilisation d'animaux dans un cadre expérimental adapté à la formation. Des alternatives non-animales sont actuellement disponibles (Plateformes, logiciels, jeu pédagogique) mais ne sont pas réellement adaptées aux objectifs pédagogiques de la formation. Cependant, certaines de ces alternatives seront mises en place à la prochaine maquette d'enseignement ainsi qu'une bibliothèque obtenue grâce au présent projet regroupant des données expérimentales et des films illustrant l’importance des gestes techniques. De plus, afin de répondre à la fois aux objectifs pédagogiques et éthiques, la mise en place d'une plateforme de réalité virtuelle est en cours de montage avec des financements associés.
Réduction
En comparaison de la maquette de formation précédente, le nombre utilisé a été réduit de 2,5 animaux par étudiant à 1 animal par étudiant dans la nouvelle configuration. La réduction sur l'ensemble du projet de 3 ans est donc de 195 animaux pour un effectif étudiant augmenté de quarante-deux pour cent (80 à 140 étudiants). De plus, les données expérimentales seront partagées entre les sous-groupes d’étudiants, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux à son minimum.
Raffinement
Afin de diminuer au maximum la souffrance des animaux dans ce projet, une médication analgésique sera pratiquée en préopératoire. Par ailleurs, dans le but de réduire le stress et la douleur induite, tous les actes seront réalisés sous anesthésie générale en condition de température contrôlée (tapis chauffant) et sous anesthésie locale lors des incisions. L'ensemble des gestes de contention, d'injections IP et IV, de chirurgie de même que la mise à mort sont effectués par une personne compétente en expérimentation animale et en chirurgie à savoir un enseignant. Les étudiants réalisent le suivi de l’anesthésie et remplissent la fiche de suivi (sous notre supervision donc 5 personnes au total par rat). Les étudiants sont responsabilisés par l’observation des signes cliniques de l’animal dans toutes les phases expérimentales et pendant l’acquisition des données biologiques. La grille d'évaluation des signes cliniques est éditée pour chaque individu afin de suivre le plus précisément possible l'évolution de l'état physiologique et de l'anesthésie. Les quatre personnes réalisant l'ensemble des gestes sur les animaux (contention, injection, chirurgie) sont tous compétentes en chirurgie sur petit animal avec une expérience avérée de plusieurs années. Lors de chaque séance de TP, 4 personnes compétentes seront présentes dans la salle de TP pour 4 rats, soit 1 personne compétente par rat.
Choix des espèces
Le rat de souche Wistar est un modèle pertinent pour la chirurgie en regard de sa taille et de sa faible sensibilité au stress. De plus, il s’agit d’une souche très utilisée dans toutes les disciplines de la recherche biomédicale. Les rats utilisés, âgés de 10 à 12 semaines, ont une physiologie des régulations stable. L'intérêt est d'utiliser des animaux adultes matures permettant de réaliser des lots suffisamment homogènes afin d'effectuer une étude statistique. Nous envisageons d'utiliser des rats surnuméraires issus de notre structure.
Effets thérapeutiques des microvésicules dans un modèle d’ischémie-reperfusion coronaire chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Soumis à une ligature d'artère coronaire pour provoquer un infarctus, 192 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'acte chirurgical dure une heure et s'accompagne d'injections intraveineuses, de sept mesures de pression artérielle dont certaines sur animal éveillé, et de mesures de température par voie rectale. Le porteur annonce pour l'ensemble des animaux une mobilité réduite, des douleurs post-opératoires et un stress lié aux manipulations, et prévoit un isolement en cage individuelle pendant les 24 heures suivant l'opération. Il décrit une surveillance de la douleur par score de grimace, orbites rétrécies, renflement du nez, oreilles rejetées en arrière, et affirme que la procédure a un caractère de "stricte nécessité" parce que la réponse immunitaire mobilise l'"organisme entier".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires constituent l’une des premières causes de décès dans les pays développés. L’infarctus du cœur est déclenché par l’obstruction des artères coronaires qui alimentent le cœur en sang et donc en oxygène. Sans l’oxygène, les cellules du muscle cardiaque (myocarde) meurent rapidement et le cœur ne réussit pas à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins du corps, ce qui peut conduire à l’arrêt du cœur. La restauration de l'apport sanguin au niveau des artères obstruées est essentielle pour réduire les conséquences de l’infarctus du myocarde. Une approche thérapeutique permettant la reperfusion est de favoriser la dilatation des artères coronaires. Nous avons démontré que l’utilisation de petites vésicules naturelles, appelées microvésicules (MV), portant à leur surface une protéine spécifique, sont capables d’améliorer la fonction vasculaire dans des modèles cellulaires. Cependant, ces modèles d’étude sont limités pour évaluer l’efficacité de ces MV dans l’amélioration de la fonction cardiaque. Ainsi, le but de ce projet est de déterminer si les MV sont capables de réduire les conséquences associées à l’obstruction des artères coronaires en les injectant après l’infarctus du myocarde dans un modèle de ligature d’artère coronaire chez le rat. L’expérimentation animale prévue dans ce projet permettra d’obtenir des données pour mieux comprendre les mécanismes protecteurs des MV ainsi qu’envisager leur utilisation comme un outil thérapeutique potentiel chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Démontrer l’innocuité et efficacité in vivo du traitement avec MV et valider leur participation dans la préservation ou l’amélioration de la fonction des cellules cardiaques lors d’un infarctus de myocarde. En plus, la confirmation des effets in vivo aidera dans la validation de ces MV comme un nouvel outil thérapeutique pour le traitement des conséquences de l’infarctus de myocarde chez l’Homme.
Procédures
Quatre interventions impliquant tous les animaux : induction d’un infarctus de myocarde (durée acte chirurgical : 1 heure), injection intraveineuse réalisée pendant l’anesthésie (durée de chaque injection < 5 minutes), mesure de la pression artérielle (5 minutes, 7 mesures), mesure de la température corporelle (< 1min, 2 mesures).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les rats seront les suivants : 1) Mobilité réduite dans des cages à cause de l’acte chirurgical après l’induction de l’infarctus de myocarde ; 2) Douleurs post-opératoires à cause de l’acte chirurgical ; 3) Stress lié aux manipulations (prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de la température au niveau rectal). Les effets indésirables concernent l’ensemble des animaux.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus seront effectués sur les animaux euthanasiés. Il est nécessaire d'analyser la réduction de la taille de l'infarctus par études d'histologie dans le cœur pour valider les doses plus efficaces des MV.
Remplacement
La procédure expérimentale a un caractère de stricte nécessité et ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet porte sur les effets des MV sur l’infarctus de myocarde, c'est à dire sur un coeur avec une artère ligaturée puis reperfusée et leur impact dans la fonction cardiaque ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les mécanismes cellulaires mis en jeu lors d'un infarctus de myocarde font participer le tissu cardiaque en hypoxie mais également une réponse immunitaire de l'organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de ligature coronaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront réalisées sur un même animal.
Raffinement
Nous avons raffiné nos approches afin de réduire au minimum la détresse imposée aux animaux qui seront hébergés dans un milieu enrichi permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Une analgésie pré- et post-opératoire sera réalisée et renouvelée aussi souvent que nécessaire. L’état de santé des animaux sera donc évalué de façon régulière pendant les 24 heures après l’acte chirurgicale en observant leur comportement. Les indices pouvant suggérer une douleur au moyen du score de grimace (rétrécissement des orbites oculaires et yeux mi-clos, renflement du nez, renflement des joues, positionnement des oreilles vers l'arrière, changement de position des vibrisses) seront surveillés. En plus, plusieurs paramètres seront évalués (suivi des cicatrices, formation d’abcès, apparence physique, comportement, réponses comportementales aux stimuli) sur la base d’attribution de scores suivants (cicatrice sans saignement = score 0, cicatrice saignante = score 1, cicatrice inflammée = score 3, formation d'abcès = score 4, cicatrice nécrosée = point limite; apparence physique normale = score 0, pas de toilettage = score 1, poil ébouriffé = score 2; doleur post-opératoire = score 3, détresse cardiorespiratoire = point limite; comportement normal = score 0, prostration et apathie = point limite ). Après l’acte chirurgical, les rats seront placés pendant 24h dans des cages individuelles. Dans la cage, chaque animal aurait à disposition des tubes de carton pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture.
Choix des espèces
Ce projet vise à analyser les effets thérapeutiques des MV lors d’un infarctus de myocarde. À cette fin, le choix de l'espèce Rattus norvegicus est basé sur notre connaissance de ce modèle ainsi que la disponibilité de données dans la littérature associées à l’étude de modifications dans la taille de l’infarctus. Les rats seront utilisés à l’âge de 7-8 semaines auquel les animaux sont considérés comme adultes.
Réalisation des travaux pratiques d’une formation règlementaire aux bases fondamentales de la chirurgie expérimentale avec utilisation de rongeurs vivants.
- Formation professionnelle
Rats : 20
Tous tués à l'issue d'une opération unique, 190 souris et 20 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques d'un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels à la chirurgie expérimentale. Chaque animal reçoit d'un stagiaire une injection d'anesthésique et une injection d'analgésique, subit une intervention pouvant durer deux heures trente, avec un risque d'hémorragie en cas de mauvaise hémostase ou de souffrance en cas de monitoring insuffisant de l'anesthésie, puis est mis à mort. Le porteur justifie cette mise à mort par le fait que le suivi post-opératoire ne peut pas être intégré à la formation et qu'aucun autre projet ne prévoit d'utiliser les animaux opérés. Il décrit cinq heures de travaux pratiques préalables sur substituts synthétiques, cuisses de poulet et cadavres de rongeurs, avant de conclure que l'apprentissage sur tissus vivants reste "indispensable" et que la Commission nationale de l'expérimentation animale impose le recours à des animaux vivants.
Objectifs
L’objectif du projet est la formation obligatoire des personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales dans le cadre des projets scientifiques, plus précisément la partie travaux pratiques (8h) de cette formation d’une durée totale de 22h. Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes réalisant des procédures chirurgicales sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.
Procédures
Les animaux sont d’abord soumis à une anesthésie : Après contention de l’animal, le stagiaire effectue une injection intrapéritonéale unique d’un anesthésique, et une injection sous-cutanée unique d’un analgésique afin de raffiner au mieux la technique et d’éviter toute douleur à l’animal. La durée de la chirurgie, depuis l’induction de l’anesthésie jusqu’au réveil est de 2h30 maximum. Chaque animal subit une seule intervention et à l'issue de la procédure l'animal est mise à mort
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles pour les animaux sont :- une hémorragie en cas de mauvaise réalisation de l’hémostase - une souffrance liée à une monitoring insuffisant de l’anesthésie Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire)
Devenir
Mise à mort Cela est justifié par le fait que le suivi post-opératoire sur plusieurs jours ne peut pas être intégré à la formation et que l’utilisation d’animaux ovariectomisés n’est pas prévue dans un autre projet.
Remplacement
Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, la première et majeure partie des travaux pratiques (les 5 premières heures) se déroule sur substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie (cuisses de poulets) et cadavres de rongeurs préférentiellement issus d’euthanasies indépendantes des besoins de la formation (A chaque session : au maximum 2 animaux euthanasiés /stagiaire peuvent être requis pour le TP d’anatomie et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). L’utilisation de substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie est un atout pour les participants et les intervenants qui peuvent ainsi rapidement se concentrer sur les gestes chirurgicaux, sans avoir à gérer les contraintes inhérentes à l’accès en animalerie et au suivi d’animaux opérés, disposer aisément de leurs notes et supports vidéo ou Power point. En outre, les participants peuvent s’entraîner et répéter, à leur rythme, les gestes chirurgicaux, sans avoir le stress de la surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal vivant. Cela favorise la sérénité et la confiance dans l’apprentissage de la chirurgie expérimentale. Néanmoins, l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants et vascularisés ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente. La Commission Nationale de l’Expérimentation Animale (CNEA) impose donc l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations à la chirurgie expérimentale. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour cette partie des travaux pratiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons préférentiellement des animaux de réforme (sortis de procédures expérimentales légères ou modérées et dont l’état général n’est pas affecté, ou surnuméraires) ou de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus de l’établissement d’accueil. Dans le cas où de tels animaux ne seraient pas disponibles en quantité suffisante dans cet établissement, des animaux de réforme étant alors demandés à un élevage agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire : Pour la première partie des travaux pratiques, sur cadavres, au maximum 2 animaux euthanasiés /stagiaire peuvent être requis pour le TP d’anatomie et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). Pour la partie sur animal vivant, un seul rongeur par participant (rat ou souris, choix de l’espèce en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation et des besoins pédagogiques exprimés par les participants) est utilisé pour la réalisation d’une chirurgie complète. 2 animaux supplémentaires sont prévus à chaque session, dans le cas où un décès surviendrait avant la réalisation complète de la chirurgie par un ou 2 stagiaires (problème lors de l’anesthésie ou atteinte d’un point limite lors de la chirurgie). Afin de limiter également le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.
Raffinement
En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques sur animaux en dernière partie de formation. Dans l’attente, les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment. Toutes les techniques enseignées font d’abord l’objet d’une démonstration et d’un apprentissage sur support inerte ou animal mort afin de remplacer l’animal vivant par des méthodes alternatives tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé pour pratiquer sur animal vivant. Pour limiter toute douleur per-opératoire, un analgésique adapté est administré aux animaux opérés dès l’induction de l’anesthésie et sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie et observation des phases du réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques (manipulation atraumatique et aseptique des tissus, lutte contre l’hypothermie, soins post-opératoires…) Les personnes encadrant les travaux pratiques sont particulièrement attentives à tout signe de douleur ou de détresse. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure chirurgicale en cours sera immédiatement interrompue et une personne compétente prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire).
Choix des espèces
Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Néanmoins, les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche in vivo, certains concepts sont particulièrement développés pour les rongeurs, et les travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs également. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est fait en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation, et des besoins pédagogiques exprimés par les participants. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.
Développement de traitement dans un modèle rongeur de la maladie de Lesch-Nyhan
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Injectés au cerveau avec une neurotoxine à l'âge de trois jours, 1 127 rats seront tous tués par surdose médicamenteuse, 650 d'entre eux dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Devenus adultes, ils reçoivent cinq jours par semaine pendant cinq semaines un composé antiparkinsonien qui provoque des mouvements involontaires et, chez les animaux lésés, les automutilations caractéristiques de la maladie de Lesch-Nyhan. Leur activité locomotrice et leurs stéréotypies sont enregistrées trois heures d'affilée en cage d'actimétrie. Le porteur signale aussi que la manipulation des nouveau-nés peut entraîner leur rejet par la mère, et rattache le projet à son "activité préclinique de service".
Objectifs
La maladie de Lesch-Nyhan (LN) est une maladie génétique rare qui se manifeste par des troubles neurologiques et comportementaux. Actuellement la prise en charge est symptomatique car il n’existe aucun traitement permettant de guérir les patients de cette maladie. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour développer de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation d’un modèle rongeur de cette maladie afin d’en reproduire les symptômes et d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements. Ce modèle est généré par l’administration chez des ratons nouveau-nés d'une toxine dans le cerveau. A l’âge adulte, un traitement est administré au sein du système nerveux central et ses effets seront observés au niveau comportemental et cellulaire. Le but de ce projet est de permettre l’émergence de nouveau médicament pour cette maladie.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Les expérimentations sont essentiellement menées sur l’animal. Actuellement la prise en charge de cette maladie est symptomatique car il n’existe aucun traitement permettant de guérir les patients. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Ce projet préclinique a pour but de permettre l’émergence de traitement pour la maladie de Lesch-Nyhan.
Procédures
Les animaux subiront au maximum deux procédures chirurgicales d’une durée d’une heure, ces chirurgies seront espacées de minimum 4 semaines. A l’âge adulte les animaux recevront un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson, injecté (durée injection : 30 secondes) 5 fois par semaine pendant 5 semaines, qui entraine des troubles moteurs tels que des mouvements involontaires dans les 2 heures suivant l’injection. A 3, 4 et 5 semaines après l’injection intracérébrale, nous observerons au cours d’une session test l’activité locomotrice, les stéréotypies et les automutilations induites par une injection unique du composé. L'activité locomotrice est mesurée dans des cages d'actimétrie et enregistrée pendant 3 heures.
Impact sur les animaux
La maladie de Lesh-Nyhan (LN) est une maladie rare et invalidante. Les nuisances attendues sont celles associées à l’administration de neurotoxine chez les nouveau-nés et d'un traitement à l’âge adulte. L’injection de neurotoxine peut entrainer une perte de poids et la manipulation des animaux nouveau-nés peut entrainer un rejet de la mère. A l’âge adulte les animaux recevront un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson, 5 fois par semaine pendant 5 semaines, qui entraine des troubles moteurs tels que des mouvements involontaires dans les 2 heures suivant l’injection. Ce composé, chez les animaux lésés en néonatal, peut également entrainer des automutilations caractéristiques de la maladie de LN.
Devenir
A l’issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par surdose médicamenteuse et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rat pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme. -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénératives, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une étude de puissance a été effectuée, permettant d’établir le nombre à 14 animaux par groupe pour des résultats statistiques exploitables. Afin de réduire le nombre d’animaux, une analyse préliminaire est menée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à la mise en place du modèle de LN. L’utilisation de tous les animaux issus de la portée (mâles et femelles) nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. Lorsque cela sera possible, après le sevrage, les animaux utilisés uniquement pour le training maternel seront réutilisés pour d’autres études.
Raffinement
Mesures précoces : le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée quotidiennement par les techniciens qui signalent tout problème aux expérimentateurs (weekend et jours fériés inclus). Des critères de bien-être seront évalués. Si un ou plusieurs signes sont observés les animaux sont pesés quotidiennement. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi des soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution de ces signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animaux à surveiller ». Cette fiche est close quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, un réchauffement, une nourriture adaptée et des traitements vétérinaires si nécessaire. Raffinement des conditions d’hébergements : les animaux seront hébergés en groupes sociaux (en fratrie avec la mère jusqu’au sevrage puis 2 rats par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (nid de papier, maison en carton, bâton de bois à ronger). Les animaux seront surveillés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Raffinement des procédures : les chirurgies sont réalisées sous anesthésie par le froid (nouveau-né) et à l’isoflurane (adulte) avec administration d’analgésique et d’anesthésie local permettant de réduire la douleur et l’angoisse des animaux. Un gel ophtalmique est appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Un suivi post opératoire spécifique de 3 à 7 jours est mis en place. Des mesures spécifiques peuvent être prises comme : si l’animal manque de tonus, une injection de sérum physiologique sera réalisée. En cas de plaies celles-ci seront nettoyées et désinfectées. Si malgré ces soins, les scores restent mauvais durant deux jours consécutifs, une décision de mise à mort par surdose médicamenteuse est prise par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de neurotoxine ou de virus est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. Dans notre étude nous utiliserons des rats nouveau-nés de 3 jours. Le modèle de la maladie de Lesch-Nyhan nécessite que la lésion par neurotoxine soit réalisée pendant la période critique pour le développement de neurones dopaminergiques.
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives, avec placement des animaux en cage métabolique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1250
Placés en cage à métabolisme sur sol grillagé, mis à jeun jusqu'à seize heures et privés d'eau jusqu'à quatre heures, 1 250 souris et 1 250 rats seront tous tués pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués, par voie orale, intranasale, intratrachéale, intravésicale ou intracérébrale, certaines administrations passant par une minipompe implantée chirurgicalement. La phase sur animaux vivants peut durer douze mois. Le porteur reconnaît que le sol ajouré gêne la locomotion et que ces cages sont plus petites que les cages standard, et conclut que la pharmacocinétique réelle des molécules "devra donc être vérifiée chez le rongeur".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide ou radioactive, avec placement en cage à métabolisme d’une durée maximale de 72h. La deuxième procédure traitera le cas particulier où des placements longs ou répétés en cage à métabolisme seront nécessaires, uniquement pour les souris. Pour les deux procédures et dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc, dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon ); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure . Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme au maximum 168h ou 7 fois 24h espacées de 24h sur 2 semaines glissantes si une mise à jeun n’est pas prévue. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Afin de réaliser certains tests de biodistribution, il pourra être nécessaire de mettre les animaux à jeun d’alimentation, au maximum 16 heures. Pour certaines administration intravésicales, il pourra être nécessaire de les priver d’eau au maximum 4h. Cela pourra générer une sensation de faim, de soif et une légère déshydratation, et une perte de poids légère. Des pertes de poids liées aux composés administrés pourraient être observées. Dans le cas des placements en cage à métabolisme, les animaux pourront être hébergés individuellement (avec les congénères visibles), dans des cages plus petites que les cages standard, avec un fond ajouré gênant modérément la locomotion. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat. Dans le cas du placement en cages à métabolisme, les animaux seront sur un sol grillagé ce qui pourrait gêner leur locomotion.
Devenir
Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupe seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront effectuées
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : 10% de perte du poids : animaux pesés quotidiennement et des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. 10-15%: animaux réhydratés une fois par jour. > 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% : point limite. En cas de suspicion de toxicité, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront mis en suivi clinique. Ces animaux seront examinés tous les jours et recevront si nécessaire un traitement pharmacologique avec l’objectif de l’étude. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. Toute opération chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie en matinée afin d’assurer un meilleur suivi post-chirurgical (observation toutes les 2 heures durant les 6 heures post opératoires puis au moins 1 fois par jour). La couverture analgésique débutera avant le début de la chirurgie pour une durée minimale de 48h pouvant être rallongée en cas de besoin selon les recommandations du comité d’éthique. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : • Les administrations IV, IM, IP, SC, ID de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Les administrations IN, IT, intravésicale, intrathécale, intracérébrale (avec cadre stéréotaxique) de composés tests se feront sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID et avant les administrations intravésicales, intracérébrales et intrathécales. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermales, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermales se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur.• L’implantation d’une mini pompe (IP, IV ou SC) ou la pose d’implants sous-cutanés seront réalisées sous anesthésie générale Isoflurane et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique 30 min avant l’anesthésie, puis jusqu’à 48 heures post chirurgie si besoin. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées si nécessaire.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera utilisée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, du fait de son faible poids et car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Dans le cas contraire, le rat sera utilisé. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Toutefois, le rat sera aussi très utilisé en particulier du fait des études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée car il est imposé par la règlementation de réaliser des études sur le rat. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Thérapie cellulaire à base de cellules gliales entériques dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat: comparaison entre la voie intracérébrale et intranasale EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Chacune subit deux chirurgies sous anesthésie, l'une pour provoquer une lésion du cerveau et l'autre pour y greffer des cellules gliales issues de l'intestin, puis des séances d'IRM et des tests comportementaux étalés sur douze mois. Une partie reçoit en plus des instillations dans le nez une fois par semaine pendant un mois, sur animaux éveillés, le porteur présentant cette voie comme "peu invasive". Les tests comportementaux sont annoncés sans être détaillés, décrits seulement comme des tâches sensori-motrices renforcées positivement.
Objectifs
Ce projet vise à contribuer aux études de réparation tissulaire et récupération fonctionnelle dans un modèle de lésion cérébrale chez le rat. Chez l'homme, après une lésion cérébrale, les moyens de récupération reposent essentiellement sur la réadaptation et la réorganisation cérébrale grâce aux mécanismes de "Plasticité Cérébrale". Ceux-ci sont insuffisants pour obtenir une récupération fonctionnelle totale. L’objectif de ce projet s’inscrit dans une approche cellulaire innovante (cellules gliales périphériques) pour favoriser la régénération tissulaire, jusqu’à atteindre une amélioration fonctionnelle. Ces cellules ont un potentiel neurogénique et neuroprotectif, qui semble intéressant dans le contexte de la médecine régénérative pour favoriser la régénération du tissu nerveux. Dans le but de répondre aux besoins chez les patients atteints de lésions cérébrales, le projet testera la faisabilité d’une voie peu invasive : la voie intranasale, qui sera comparée à la voie intracérébrale.
Bénéfices attendus
Aujourd'hui, les thérapies cellulaires pour la régénération du tissu nerveux sont limitées par leur faible sécurité et efficacité. Nous proposons une nouvelle source de cellules et approche : la greffe de cellules gliales issues du système nerveux entérique. Actuellement, l'utilisation de cellules non souches pour la régénération du tissu nerveux est peu explorée. En outre, nous proposons l'utilisation d'une voie d'administration peu invasive : la voie intranasale, qui aura un impact translationnel important.
Procédures
Dans les deux Procédures, les animaux subiront : 1) Des tests comportementaux (animaux vigiles) : 2 semaines avant les chirurgies, puis 1 semaine, 3 mois, 6 mois et 12 mois post-chirurgie ; 2) IRM (animaux endormis sous anesthésie) : 24h post-chirurgie, puis 3, 6 et 12 mois post-chirurgie ; 3) deux chirurgies (animaux endormis sour anesthésie) : l’une pour induire une atteinte du tissu cérébrale et l’autre pour tester le traitement a base de cellules (greffe). Dans la Procédure 2, l'instillation des cellules se fera par voie intranasale 1 fois par semaine pendant 1 mois (4 instillations en tout), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables sont dus aux chirurgies. Elles peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : douleur modérée, isolement, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Ces effets peuvent durer jusqu’à 48h. Les tests comportementaux pourraient engendrer un stress léger dû au fait que les animaux sont enlevés de leur environnement habituel. L’instillation du traitement par les nez pourrait engendrer du stress léger parce que les animaux seront vigiles.
Devenir
96 animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux afin de réaliser les analyses histologiques.
Remplacement
La stratégie thérapeutique par greffe de cellules gliales entériques décrite dans ce projet nécessite d'être évaluée sur des animaux vivants, selon les recommandations pour la conduite des études précliniques portant sur les thérapies pour les lésions cérébrales. Les résultats primaires (test comportementaux) et secondaires (IRM et histologie du cerveau) ne peuvent pas être obtenus in vitro sur des cellules ou même sur des organoïdes. De plus, il s'agit d'une étude longitudinale au cours de laquelle les résultats primaires et secondaires seront évalués à différents times points. Enfin, pour la comparaison de deux voies d'administration (intracérébrale et intranasale) le projet nécessite des évaluations in vivo.
Réduction
Nous utiliserons 96 rats femelles adultes âgés de 12 semaines sur 5 ans. Le nombre d'animaux a été calculé sur la base de nos expériences antécédentes et de la puissance statistique obtenue avec un logiciel pour les statistiques. L’étude longitudinal permet un suivi plus personnalisé de l’animal tout en obtenant un nombre conséquent d’informations ce qui nous permet d’en limiter le nombre. Comme l’exige le principe de Réduction, nous utilisons des petits groupes d’individus.
Raffinement
Les animaux seront conditionnés pour la réalisation de taches sensori-motrices toujours renforcés positivement et non anxiogènes. Les animaux seront évalués par les expérimentateurs qui les ont entrainés. Avant les chirurgies, une anesthésie complète est prévue avec présence d'analgésie pour limiter la douleur. Les animaux seront suivis tous les jours 1 fois par jour la semaine suivant la chirurgie et recevront un analgésique pour limiter la douleur post-chirurgie (à 6h), dont la posologie sera adaptée en fonction de chaque animal. 24h avant la chirurgie (habituation) et après la chirurgie, du DietGel sera fourni pour faciliter le nourrissage et l’hydratation et donc favoriser une bonne récupération de l'animal. Aux vues de la durée de l’expérimentation (jusqu'à 12 mois), un système d’enrichissement multiple sera mis en place. Un objet d’enrichissement (tunnel, corde, boules colorées) sera changé tous les mois pour répondre au besoin néophile de l’espèce. Dans le cadre d'implémenter les stratégies de raffinement, nous habituerons les animaux à recevoir une instillation intranasale sans être anesthésiés et/ou contentionnés. Cela évitera un stress répété dû aux anesthésies.
Choix des espèces
Les rats sont un modèle privilégié pour l'étude des lésions cérébrales et pour tester l’efficacité des stratégies thérapeutiques. Le modèle de lésion cérébrale utilisé dans ce projet a été validé et publié par notre équipe et, comparé aux modèles de lésion cérébrale chez les souris, il engendre une mortalité significativement inférieure. Les tests comportementaux prévus dans ce projet ont aussi été adaptés au modèle rat et validés par notre équipe. Animaux adultes (rats femelles) âgés de 12 semaines afin de se rapprocher de la démographique humaine au stade adulte.
Induction de maladie démyélinisante chez le petit animal de laboratoire à la Cuprizone. Et évaluation de l’action de cellules thérapeutiques par injection intracérébrale dans ce modèle animal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1125
Nourris quotidiennement à la cuprizone pour provoquer une dégénérescence du cerveau, puis injectés dans le cerveau sous anesthésie, 1 125 souris et 1 125 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue pour un donneur d'ordre extérieur des cellules thérapeutiques dont la nature n'est pas précisée, avec mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires et autopsie systématique. Interrogé sur le remplacement, le porteur ne mentionne aucune alternative sans animaux et recopie mot pour mot son paragraphe sur la surveillance des effets indésirables. Il justifie le choix du rongeur par la transposition des doses aux "premiers patients", et présente l'injection intracérébrale comme porteuse de "grands espoirs thérapeutiques sur le long terme".
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)
Procédures
L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Dans le cas ou leur hébergement ne pourra se faire en groupes, un enrichissement adapté sera fourni et un suivi renforcé sera effectué. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.