Rats

L'atteinte d'un point limite déclenche les mesures inscrites sur une fiche d'observation, jusqu'à la mise à mort. 1 000 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par l'abdomen, la bouche, la peau, la veine ou le muscle, subissent des prélèvements de sang parfois sans anesthésie, puis une perfusion intracardiaque avant que leur cerveau soit prélevé pour enregistrer l'activité électrique de coupes cérébrales. Le porteur présente ces essais comme un moyen d'accélérer le développement de médicaments contre les maladies du cerveau, sans nommer les composés testés ni les pathologies visées, et prévoit d'utiliser des animaux de 3 à 95 semaines.

Objectifs

Les maladies du cerveau sont un fléau dans notre société. Le développement de nouveaux médicaments est un processus long et coûteux. Afin d’accélérer le développement de nouveaux médicaments, il est crucial de déterminer l’efficacité et la toxicité des candidats médicaments le plus tôt et le plus rapidement possible. Dans ce cadre, l’objectif de ce projet est de tester l'efficacité de candidats médicaments en développement sur l’activité électrique neuronale. Pour ce faire, des candidats médicaments seront administrés à des rongeurs (souris et rats) et leur effet sur l’activité électrique des cellules neuronales sera évalué par la technique d’électrophysiologie, sur coupes cérébrales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet de candidats médicaments sur la physiologie des cellules neuronales, dans le but de développer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’Homme afin de traiter les pathologies cérébrales.

Procédures

Administrations : intrapéritonéale : 5 secondes, orale : 5 secondes, sous cutanée : 5 secondes, intraveineuse : 10 secondes, intramusculaire : 5 secondes Prélèvements sanguins : avec anesthésie légère par administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie par inhalation (induction maximum 3 minutes) ou sans anesthésie, 5 secondes. Euthanasie : Administration du mélange d’anesthésiques/analgésiques (10 secondes), anesthésie par inhalation (induction maximum 3 minutes), perfusion intracardiaque d’un liquide physiologique (30 secondes), euthanasie pour prélévement du cerveau (3 secondes).

Impact sur les animaux

Les administrations et prélèvements peuvent induire un certain niveau de stress, et potentiellement une douleur modérée, qui seront limités par la maitrise des gestes techniques. Suite à l’administration des composés à tester, il se peut que des signes légers d’inconfort ou d’intolérance se manifestent (rougeur, gonflement...).

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés afin de réaliser les coupes cérébrales et procéder aux enregistrements de l’activité cérébrale sur ces coupes.

Remplacement

Les neurones et leur modulation peuvent être étudiés sur des coupes cérébrales de rongeurs par électrophysiologie. Ces approches expérimentales ne peuvent pas être remplacées par des méthodes substitutives type approche in sillico / in vitro ou culture cellulaire. L'étude de l'effet de composés en développement et une meilleure compréhension des pathologies du système nerveux central nécessitent donc l'administration de composés sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un programme adapté, (10 animaux par groupe / entre 2 et 10 groupes par étude et par espèce). Les résultats seront analysés par des tests statistiques. Nous adapterons les tests statistiques en fonction des observations.

Raffinement

Les animaux plus âgés pourront être placés individuellement pour éviter le risque de bagarre dès leur arrivée, suite à un retour d’expérience et conformément aux recommandations de l’éleveur. Ils resteront toujours en contact visuel et olfactif. Avant toute administration, une période d’acclimatation des animaux d’au moins 5 jours sera respectée. Un suivi quotidien des animaux sera effectué sans exception (Week-ends & jours fériés), les animaux seront pesés une fois par semaine dès la fin de la période d’acclimatation par les expérimentateurs pour suivre l’état de santé général. En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude. Ce suivi nous permettra de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. Les animaux seront évalués grâce à la fiche d’observation /points limites et l’atteinte d’un point limite entrainera les actions documentées dans cette fiche. Lors des prélèvements sanguins réalisés par du personnel compétent et qualifié, les animaux pourront être sous anesthésie générale. Une alternance ou rotation des sites d’injection peut être mise en place si les traitements sont sur plusieurs jours pour les différentes voies d’administrations. Afin de respecter le cycle adopté chez le fournisseur et pour des raisons d’études scientifiques, certaines études seront réalisées en cycle inversé jour / nuit pour que le rythme de l’animal soit le moins perturbé possible.

Choix des espèces

Nos expérimentations sont réalisées chez la souris et le rat, dont l’étude est extrêmement répandue au sein des laboratoires de recherche en Neurosciences, rendant les résultats pertinents pour la communauté scientifique nationale et internationale. Ces rongeurs, de petite taille et d’élevage facile, possèdent un système nerveux dont le développement est extrêmement proche de celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est suffisamment complexe. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes du fonctionnement cérébral. Les animaux seront utilisés de l'âge de 3 semaines à 95 semaines, afin de couvrir tous les âges, du jeune à l'adulte âgé.

2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie parce qu'ils ont reçu des substances dont les effets à long terme sont inconnus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées qui forment une poche d'air sous la peau de leur dos, poche ensuite regonflée, et chaque animal peut recevoir jusqu'à 224 administrations et subir jusqu'à 72 prélèvements sanguins sur cinquante-six jours. Le modèle sert à tester des anti-inflammatoires et la biocompatibilité de biomatériaux, de nanoparticules ou d'implants, y compris des molécules déjà commercialisées, pour des industriels. Le porteur écrit qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico, les réponses globales de l'organisme étant selon lui difficiles à simuler.

Objectifs

L’inflammation est un processus complexe en réponse à diverses agressions du corps. Cette réaction qui vise à éliminer l'agent agresseur, à réparer les tissus endommagés et à favoriser la guérison, se caractérise par des symptômes tels que le gonflement, la douleur et la rougeur au niveau des zones touchées. La crise inflammatoire est un mécanisme de défense vital qui aide à éliminer l'agresseur et à limiter les dommages. Cependant lorsque l'inflammation devient excessive ou persiste pendant de longues périodes, elle peut conduire à une inflammation chronique pathologique. Il est alors essentiel de disposer de traitements anti-inflammatoires pour éviter les complications à long terme. Actuellement il existe plusieurs médicaments anti-inflammatoires qui sont couramment utilisés pour contrôler l'inflammation et atténuer les symptômes de la crise inflammatoire. Cependant, ils présentent des effets secondaires parfois importants, ce qui limitent leur utilisation, et dans certains cas, l’inflammation résiste à ces traitements. Pour ces deux raisons le développement de nouvelles molécules reste un défi important. L’inflammation peut aussi avoir pour origine l’utilisation de biomatériaux, de nanoparticules ou d’implant dans le traitement de pathologies. Dans ce cadre il est important de tester la biocompatibilité des produits utilisés afin de sélectionner ceux qui seront le mieux tolérés par le corps.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements anti-inflammatoires et au développement de produits biocompatibles lorsque l’utilisation de biomatériaux est nécessaire. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique dans ce modèle, nous participons à une meilleure connaissance de sa prédictivité.

Procédures

Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir la formation d’une poche air. Les animaux auront un maximum de 224 administrations et un maximum de 72 prélèvements sanguins sur la période de maximum 56j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes. En cas injection intraveineuse, durée est d’environ 5 min. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Chacune des étapes de la formation de la poche prend moins de 3 min avec le temps de l’anesthésie et le temps l’injection. Le prélèvement du liquide de la poche prend moins de 5 min en tenant compte du temps d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les procédures mises en œuvre peuvent induire des douleurs chez l’animal notamment lors de la création de la poche, lors de l’inflammation induite ou si le produit testé induit une inflammation.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux seront utilisées pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes anti- et pro-inflammatoires in vitro, les réponses globales à court et moyen terme sont difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer nos modèles in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Néanmoins, les molécules et produits testés dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, plusieurs types de prélèvements seront associés. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous testons plusieurs molécules ou produits en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes contrôles. Comme aucune inflammation n’est attendue en l’absence d’injection de molécule immunostimulante dans la poche, le groupe sans injection de molécules immunostimulantes ne sera, en général, pas mis en œuvre. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, il comporte un tunnel en carton pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. La douleur induite par les étapes de création de la poche et de regonflage est prise en charge par un traitement anti-douleur. Les prélèvements de sang en cours d’expérience se font sous anesthésie et tous les autres prélèvements (ponction de la poche, prélèvement sanguin terminal) se font en phase terminale, sous anesthésie sans réveil. De plus nous avons établi des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études utilisant le modèle de la poche d’air. De plus ce modèle répond favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permet aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les besoins d’anti-inflammatoire et de matériaux biocompatibles peuvent apparaitre à tout âge, cependant comme beaucoup de ces phénomènes impliquent également le système immunitaire, l’utilisation de jeunes adultes au système immunitaire mature nous parait pertinent. De plus chez la souris il nous faut également des animaux pas trop petits pour des questions techniques de place dans le dos pour former une poche exploitable. Nous utiliserons donc des souris d’environ 12 semaines et rats d’environ 10 semaines au début de l’expérience.

L'introduction d'un filament dans la carotide pour provoquer un accident vasculaire cérébral tue moins de dix pour cent des animaux opérés dans les soixante-douze heures, par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne. 126 souris et 84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux gardés en vie jusqu'à six semaines avant une imagerie terminale. Les chirurgies d'une heure sous anesthésie générale injectent dans le cerveau soit un lipopolysaccharide bactérien pour déclencher une neuroinflammation, soit un peptide vasoconstricteur pour rétrécir les vaisseaux, et certains animaux subissent une seconde opération deux semaines plus tard. Le choix des espèces tient à la résolution d'imagerie pour les rats, dont le cerveau est plus gros, et pour les souris au coût des nanoparticules d'oxyde de fer et des anticorps.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. L’AVC induit une réaction inflammatoire qui contribue de manière importante aux lésions cérébrales. Le suivi par imagerie in vivo de cette réaction inflammatoire permettrait de mieux comprendre sa dynamique spatio-temporelle et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à la moduler. Pour cela, nous proposons de développer une approche en imagerie cellulaire et moléculaire in-vivo. L’objectif de l’imagerie cellulaire est de pouvoir suivre des cellules d’intérêt dans le cerveau : soit des cellules ayant des propriétés thérapeutiques visant à moduler l’inflammation (telles que les cellules souches issues du tissu adipeux) soit des cellules du système immunitaire (telles que les macrophages). L’imagerie moléculaire vise à suivre l’expression de récepteurs impliqués dans la réponse inflammatoire à un AVC, telles que les molécules d’adhésion qui permettent l’entrée de cellules immunitaires dans le cerveau. Les modalités d’imagerie utilisées pour ces développement méthodologiques seront les mêmes que celles qui peuvent être utilisées chez l’humain : imagerie par résonance magnétique (IRM) et scanner X. Le développement de telles techniques d’imagerie ouvrirait la voie à un suivi non-invasif des cellules et des récepteurs de l’inflammation, qui pourrait être répété dans le temps. Le but à plus long terme est de transférer ces méthodes chez l’humain, pour une meilleure prise en charge des patients présentant un AVC.

Bénéfices attendus

L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la réaction inflammatoire associée ainsi que le devenir des cellules thérapeutiques, dans des modèles rongeurs (rats et souris) plus simples à mettre en oeuvre et à standardiser que le modèle classique qui procède via une occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer les approches thérapeutiques visant à moduler l’inflammation. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’humain puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.

Procédures

L’infusion locale du LPS (solution de lipopolysaccharide, molécule d’origine bactérienne provoquant une inflammation) induisant la neuroinflammation ou du peptide vasoconstricteur spécifique (rétrécissant le diamètre des vaisseaux sanguins) mimant l’ischémie cérébrale nécessite une injection stéréotaxique. Le modèle d’AVC transitoire nécessite l’introduction d’un filament par la carotide. Ces chirurgies, permettant de réaliser ces différents modèles d'AVC, sont réalisées sous anesthésie générale et dure au maximum une heure. Chaque animal subit une seule chirurgie de durée maximale d'une heure. Certains animaux recevront les cellules thérapeutiques par voie intracérébrale et subiront pour cela une deuxième chirurgie sous anesthésie générale deux semaines après la réalisation du modèle. Cette seconde chirurgie dure au maximum une heure.

Impact sur les animaux

Suite à cette chirurgie permettant de réaliser ces différents modèles, une perte de poids minime (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser des analyses post-mortem (imagerie ex vivo, microscopie).

Remplacement

Les agents de contraste seront d’abord testés dans des modèles in-vitro : les cellules thérapeutiques sont marquées avec les nanoparticules par incubation puis placée dans un tube Eppendorf et imagées en IRM et en imagerie X. Cela permettra de réaliser une première sélection des agents de contraste d’intérêt. Néanmoins le contraste va dépendre également du microenvironnement (inflammatoire) et de la métabolisation des agents de contraste in-vivo : il nous apparaît donc indispensable de tester les cellules marquées avec les meilleurs agents de contraste (4 au maximum) chez l’animal vivant. Les cerveaux des animaux des cinq procédures seront prélevés pour l’imagerie post-mortem à l’aide de techniques innovantes basées sur les rayons X (scanner spectral à comptage de photon, imagerie de contraste de phase, de champ sombre et du k-edge avec le rayonnement synchrotron). Ces imageries ex-vivo viendront apporter des informations précieuses avant le développement in-vivo de ces nouvelles approches. Par ailleurs, les images issues de ces expérimentations seront mises en ligne à disposition de la communauté de manière anonyme sur une plateforme collaborative, afin de pouvoir être exploitées plus largement.

Réduction

L’avantage de l’imagerie in-vivo est qu’elle permet des études sur l’animal vivant plutôt que d’avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographique de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) seront typiquement utilisés pour ce projet à caractère exploratoire. Si certaines conditions expérimentales ne fournissent pas un signal suffisant pour être détecté (problème de sensibilité), alors l’inclusion sera stoppée. Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus que les cerveaux pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Le modèle animal d’inflammation cérébrale focale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que le modèle d’AVC et il est bien approprié pour les études d’imagerie. Il crée une lésion cortico-striatale qui occasionne des troubles sensori-moteurs mineurs et transitoires du côté contralatéral à la lésion (faiblesse des pattes, perte de sensibilité des vibrisses). Néanmoins les animaux continuent de s’alimenter normalement (récupération du poids pré-opératoire dans les 3 jours qui suivent la chirurgie, pas de perte de poids en comparaison avec les animaux sains à plus long terme) et à avoir une activité normale. Dans un second temps, nous allons évaluer si les modèles d’injection intracérébrale de peptide vasoconstricteur et de LPS peuvent nous fournir des informations pertinentes du point de vue de l’imagerie et donc se substituer aux modèles d’AVC, car ils ont l’avantage de limiter le handicap et la mortalité des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), une thermorégulation continue, et une hydratation sous-cutanée. Une grille dédiée au codage des expressions faciales spécifique à un modèle animal (souris ou rat) permet d’identifier les signes de la souffrance post-opératoire afin de la traiter. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal pour faciliter leur hydratation, en plus de la nourriture et boisson habituelles. Les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’agressivité constatée). L’évaluation de l’état des animaux est réalisé une heure après la chirurgie et pendant une semaine suivant la chirurgie. Un score de l’état de l’animal est déterminé à l’aide d’une grille de score inspirée des études de raffinement de la procédure post-opératoire d’une chirurgie stéréotaxique, qui permet une évaluation de l’état de l’animal et l’identification des points limites.

Choix des espèces

Les rats sont utilisés car l’imagerie cérébrale de cette espèce a une meilleure résolution en comparaison avec celui de la souris, en raison de la plus grosse taille de cerveau. Nous allons travailler avec des rats Sprague Dawley chez qui le modèle de LPS est bien maîtrisé par notre équipe. Les souris sont utilisées en raison en raison du coût des certaines particules d'oxyde de fer (marquées à la rhodamine fluorescente) et du coût des anticorps (pour la fonctionnalisation des particules d’oxyde de Fer). Les souris utilisées pour cette étude seront des souris C57Bl6 car notre équipe a une expérience extensive de l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVC. Des souris Swiss pourront être utilisées afin de faciliter la pose d'un cathéter veineux. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte et le poids sera suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste. Rats : 250-300 g à T0 et souris : 25-30 g à T0.

840 souris et 630 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des gestes techniques répétés jusqu'à deux fois par jour pendant six à huit semaines, gavages, injections dans le péritoine, sous la peau et dans la veine caudale, prélèvements au sinus rétro-orbital, à la veine submandibulaire, à l'aorte abdominale et par ponction intracardiaque, avec les incidents que le porteur énumère lui-même, fausse route, perçage de l'œsophage, injection dans le cæcum ou la vessie, hémorragie nasopharyngée, lésion de la cornée. Ces séances ne produisent aucune connaissance et répondent à l'exigence réglementaire de formation continue du personnel d'une société de recherche préclinique. Le porteur indique que les premières séances d'apprentissage peuvent se faire sur des animaux morts, puis conclut que l'animal vivant est "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques, la force et les réactions de celui qui est manipulé.

Objectifs

L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures faiblement invasives et invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Dans notre société, chaque technicien doit maitriser les techniques d’administration et de prélèvement utilisées, chez le rat et la souris. L’objectif de ce projet est de répondre à l’exigence règlementaire concernant la formation continue et le maintien des compétences du personnel. Ce projet vise à améliorer les pratiques expérimentales, à assurer la qualité scientifique et le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les gestes techniques de type administration et prélèvement, chez le rat et la souris. L’apprentissage et le maintien des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal.

Procédures

Les gestes techniques traités dans ce projet se pratiquent sur rats et /ou souris, vigiles ou anesthésiés, avec une solution physiologique ou neutre n’engendrant pas d’effet indésirable. • Les administrations par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée sont réalisées sur animaux vigiles, une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines, au maximum. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 10 sec de contention. • Les administrations par voie intraveineuse sont réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés, en contention dans un tube, après désinfection de l’organe caudale, une à deux fois par semaine, pendant 3 à 4 semaines, au maximum. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 30 sec de contention. • Les prélèvements au sinus rétro orbital ou à la veine submandibulaire sont réalisés sur animaux anesthésiés, en respectant les limites de volume, de nombre (trois maximum) et de temps de récupération ; soit 7,5% du volume sanguin circulant maximum une fois par semaine ou 10% du volume sanguin circulant maximum une fois toutes les deux semaines ou 15% du volume sanguin circulant maximum une fois toutes les quatre semaines ou 20% du volume sanguin circulant pour un prélèvement terminal. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 20 sec de contention. • Les prélèvements sanguins à l’aorte abdominale sont réalisés uniquement chez le rat sous anesthésie générale, avec une couverture analgésique de type buprénorphine. Ce geste technique dure environ 1 minute. • Les prélèvements par ponction intracardiaque sont réalisés chez le rat et la souris sous anesthésie générale et nécessite environ 20 sec de contention.

Impact sur les animaux

Les nuisances décrites ci-dessous représentent des cas extrêmes et rares qui sont évités par la réalisation d’un bon tutorat et d’un apprentissage progressif. • Administrations par voie orale : fausse-route, perçage de l’œsophage • Administrations par voie intrapéritonéale : passage dans la vessie, injection dans le caecum • Administrations par voie intraveineuse : lésions cutanées possibles en cas d‘injection en dehors de la veine. • Prélèvements sanguins au sinus rétro orbitaire ou à la veine submandibulaire : hémorragie dans les voies naso/oropharyngée si réalisés à trop grande profondeur, lésion de la cornée en cas de frottement avec la pipette. Afin de limiter le nombre d’animaux inclus, ils pourront être utilisés à plusieurs reprises, au maximum 2 gestes par jour pendant 6 à 8 semaines sous réserve de ne pas présenter d’altération de leur bien-être. Ces manipulations répétées peuvent engendrer un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures.

Remplacement

Avant toute manipulation des animaux, le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Si nécessaire, les premières séances d’apprentissage et d’entraînement sont réalisées sur des animaux morts. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci.

Réduction

Nous utilisons en priorité des animaux surnuméraires des études, des animaux issus de nos élevages non entrés en expérimentation plutôt que des animaux achetés à cette fin, chez des fournisseurs agréés. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus, les gestes techniques décrits ci-dessous sont réalisés plusieurs fois sur les mêmes animaux dans le respect des limites maximales recommandées par le GIRCOR et des temps de récupération adaptés entre chaque geste. • Administrations par voie orale et intrapéritonéales: maximum 2 par jour pendant 8 semaines • Administrations par voie intraveineuse : maximum 2 par semaine pendant 8 semaines • Prélèvements sanguins : maximum 1 par semaine pendant 4 semaines

Raffinement

Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée avant toutes manipulations des animaux. La majorité des gestes techniques sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress liés à la réalisation de ces gestes. Certains types de prélèvements sanguins sont réalisés sous couverture analgésique. L’état clinique des animaux est évalué quotidiennement par les personnes impliquées dans ces formations ou maintien des compétences (tuteurs, soignant, etc.). Un carnet de santé, traçant précisément tous les gestes réalisés, le cas échéant les signes cliniques observés ainsi que les soins apportés, est mis en place. L’atteinte des points limites conduit à la mise en place de complément au bien-être ou à la mise à mort des animaux concernés. La taille des aiguilles et des cathéters et sondes est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces utilisées pour mener à bien nos programmes de recherche précliniques. A ce jour, de par leurs similarités physiologiques avec l’homme, ces deux espèces de rongeurs sont les plus adaptées pour évaluer les propriétés pharmacologiques de molécules d’intérêt et d’en connaître les risques de toxicité avant les premiers essais chez l'homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car les études réalisées au sein de notre établissement le sont sur des individus adultes.

Deux heures de chirurgie pour fixer un support sur le crâne, jusqu'à quarante séances d'IRM en contention sur six à huit mois, une prise de sang par semaine pendant deux mois : 64 souris et 64 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains reçoivent en plus une injection de virus fluorescent dans le cerveau pendant l'opération. Le projet est présenté comme une amélioration du bien-être des animaux non-humains, puisqu'il vise un berceau d'IRM plus confortable que les barres d'oreilles habituelles, et les prises de sang hebdomadaires dosent l'hormone du stress. Tous les rongeurs sont tués à la fin pour chercher dans leur cerveau les marqueurs moléculaires de ce même stress.

Objectifs

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie très courante. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet d’obtenir des évaluations non invasives de l’activation cérébrale rendant ainsi possible un suivi à long-terme. Le développement de cette technique chez le rongeur, avec le but d’établir une cartographie fonctionnelle de leurs fonctions cognitives, permettra d’établir un lien avec la recherche humaine. Pour cela, il est nécessaire d’effectuer les mêmes modalités d’imagerie et dans les mêmes conditions physiologiques chez les rongeurs et dans l’espèce humaine. Jusqu’à présent, les contraintes liées à l’IRMf notamment en terme d’immobilité, ont conduit essentiellement à la réalisation de protocoles sur rongeurs anesthésiés. Cependant, l'utilisation d'anesthésiques pendant l'IRMf empêche toute investigation sur les modalités de traitement des informations par le cerveau de façon consciente . La réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente donc un intérêt majeur. Nous souhaitons construire un tout nouveau berceau IRM qui sera utilisé dans un protocole d’habituation pour l'adaptation des rongeurs à l'environnement du scanner, améliorant ainsi le bien-être animal et permettant d’obtenir des résultats non biaisés par un état de stress et limitant le nombre de rongeurs nécessaires par étude car induisant une diminution des variabilités inter individus. Ce nouveau berceau sera jugé sur l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Les animaux seront maintenus à l’intérieur du berceau à l’aide d’un système de fixation implanté sur le dessus du crâne et évitant donc l’utilisation de la contention par des barres d’oreilles. De plus, l’innovation majeure de notre berceau sera la présence d’un tapis roulant placé dans le berceau qui permettra aux rongeurs de marcher à l’intérieur de l’IRM lors des sessions, ce qui aura pour effet de limiter leur niveau de stress. Une fois l’animal mis en confiance avec son environnement, il augmentera alors ses périodes d’inactivité pendant lesquelles les acquisitions IRM pourront avoir lieu.

Bénéfices attendus

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie fonctionnelle des fonctions cognitives complexes et donc essentiel pour ensuite établir un lien translationnel entre la recherche animal et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…). L’intérêt de notre projet est donc de pouvoir réaliser des enregistrements en IRMf tout en améliorant le bien-être animal afin de réaliser des expériences plus fiables.

Procédures

Ce projet consiste à développer une technique fiable et appropriée d’IRM fonctionnelle chez le rongeur éveillé à l’aide d’un berceau innovant et d’un protocole d’habituation adapté. Pour pallier aux contraintes liées à l’IRMf en terme d’immobilité, les rongeurs devront être soumis à une procédure chirurgicale de courte durée (2h) afin de positionner un système de fixation. Lors de cette intervention, certains animaux recevront une injection (5min) de virus fluorescent au niveau des structures cérébrales. Cela permettra de mesurer lors des acquisitions IRM l’activité neuronale au niveau des structures ciblées. Ces acquisitions IRM auront une durée maximum de 2h en fonction du comportement de l’animal, avec un maximum de 2 séances par semaine (une période d’une semaine entière sera laissée à l’animal pour récupérer entre deux séances consécutives). L’objectif sera de pouvoir acquérir des données sur une période de 6 à 8 mois avec un maximum de 40 sessions sur cette période. En début de procédure, pendant une période de 2 mois, en plus des phases d’étude IRMf, les animaux auront des prélèvements sanguins réguliers (5min, 1 fois par semaine) afin de contrôler leur taux de corticostérone dans le sang (également appelée l’hormone du stress), et des tests de comportements visant à évaluer l’anxiété et la socialisation des animaux seront également réalisés chaque semaine (2 tests de 10min) pour compléter les résultats obtenus avec l’ensemble des données physiologiques.

Impact sur les animaux

Les chirurgies de mise en place des systèmes de fixation et d’injection de virus pourront entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. La présence d’un dispositif chirurgical intracérébrale pérenne pourra induire une gêne chez l’animal. Les premières sessions d’habituation pourront stresser les animaux induisant une modification du comportement. L’immobilisation par contention des animaux pourra induire un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins effectués chaque semaine pourront induire un stress chez les animaux.

Devenir

La suite du projet prévoit des analyses histologiques du cerveau afin d’étudier certains marqueurs moléculaires pouvant être lié à l’état de stress des animaux. Les animaux seront donc euthanasiés afin de conserver le cerveau dans un état le plus proche possible de son état physiologique.

Remplacement

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technologie d’imagerie médicale aujourd’hui très développée et répandue. Une de ces applications, appelée IRM fonctionnelle (IRMf), permet de visualiser, de manière indirecte, l’activité cérébrale. L’IRMf est un outil performant pouvant être utilisée sur un grand nombre d’animaux, ce qui en fait un pont majeur vers la recherche humaine. Le développement de cette technique chez le rongeur afin de pouvoir dresser une cartographie des fonctions cognitives complexes est donc essentiel pour ensuite établir un lien direct entre la recherche animale et humaine. Cela nécessite que les acquisitions se déroulent dans les mêmes conditions à la fois chez l’homme et chez l’animal pour qu’une comparaison puisse se faire. Les acquisitions IRMf chez l’homme se font chez des patients éveillés, et c’est pourquoi la réalisation d'études chez des animaux non anesthésiés présente un intérêt majeur pour la comparaison des données. De plus, les quelques exemples d’IRMf de rongeurs éveillés sont réalisés dans des conditions très stressantes pour l’animal (fixés par des barres d’oreilles, maintenus immobiles…), l’intérêt de notre projet est donc d’accéder à ces données tout en améliorant le bien-être animal afin d’obtenir des expériences fiables.

Réduction

Nous avons calculé le nombre de rongeurs à utiliser dans chaque groupe avec un logiciel de statistique et en s’appuyant sur des expériences antérieures similaires d’évaluation du niveau de stress lors d’acquisitions IRM sur rongeurs éveillés. Nous arrivons à 49 rongeurs par groupe. D’après notre expérience, nous savons que chaque rongeur a besoin d’un calendrier différent pour l’entraînement et que certains ne seront jamais en mesure de réaliser des acquisitions IRM éveillés dans de bonne condition, sans stress. Cette proportion d’animaux non entraînables est estimée à 30%. Nous souhaitons pouvoir mettre au point ce protocole à la fois chez la souris et chez le rat. De plus, le but étant de développer un protocole général qui sera utilisé par tout projet ultérieur, il va donc être nécessaire de faire des tests avec les deux sexes. Nous arrivons donc à un total de 128 animaux pour ce projet. Ce nombre pourra être diminué en analysant en continu les données enregistrées. Chaque rongeur étant acheté au fur et à mesure, il n’y aura donc pas d’animaux inutilisés.

Raffinement

Les critères qui seront les plus importants pour cette étude seront l’amélioration du confort des animaux lors des acquisitions IRMf et la diminution de leur niveau de stress. Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et recevront un analgésique ainsi que des injections d’anesthétique locales afin d’éviter toutes douleurs. Pour le suivi post chirurgie d’implantation des posts de fixation, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés afin de s’assurer que l’état de santé des animaux ne se dégrade pas. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, et des soins adaptés seront mis en place en fonction de son état avec administration d’analgésique pour pallier à cette souffrance. Si un des points limites est atteint alors l’animal sera sortie d'expérimentation.

Choix des espèces

Les résultats précliniques de l'IRMf sur les rongeurs (que ce soit les souris ou les rats) ont été vérifiés à plusieurs reprises chez l'homme, ce qui en fait un bon modèle pour tester des médicaments ou étudier des hypothèses sur le fonctionnement du cerveau. En outre, les scanners IRM précliniques ont de petites cavités, ce qui permet d'utiliser uniquement de petits animaux, et conviennent à l'IRMf sur les rongeurs. Enfin, nous utiliserons des rongeurs adultes mâles et femelles, car l'étude que nous voulons réaliser ne nécessite pas de rongeurs jeunes ou très jeunes. Nous n'utiliserons donc, que des rongeurs entre 2 mois et un an et demi.

Dépilés à la crème jusqu'à dix fois, immunisés jusqu'à douze fois, piqués jusqu'à sept fois pour des prises de sang, 1 500 rats et 750 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le but est de produire des anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d'un seul animal, à la demande de partenaires industriels qui commandent les cibles. Les animaux dont la réponse immunitaire reste faible sont tués sans attendre, les autres partent vivants chez le client, qui prélève ensuite le sang, la rate, les ganglions et la moelle osseuse. Aucun calcul statistique n'a fixé les effectifs, le porteur indiquant s'être entendu avec ses partenaires sur trois à dix animaux par cible.

Objectifs

L’objectif de ce projet est la création d’une grande diversité d’anticorps monoclonaux et polyclonaux à partir d’un seul animal. Pour cela, un antigène (sous forme d’ADN ou de peptide/protéine) est administré à des rongeurs, afin que le système immunitaire produise des anticorps multiples. Le sang (contenant les cellules lymphatiques) et les organes (ganglions lymphatiques, la rate et la moelle osseuse) de ces animaux seront collectés pour récupérer ces anticorps. Les antigènes en question seront des récepteurs cellulaires humains ciblés et permettront de développer de nouveaux candidats médicaments. La découverte et le développement de ces anticorps appropriés à l'action très spécifique est donc indispensables dans le traitement de maladies infectieuses et des cancers ainsi que dans le diagnostic de ces maladies.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'obtention d'outils thérapeutiques afin de traiter des pathologies telles que les cancers, les maladies inflammatoires et neurologiques notamment. Ils constituent donc des solutions thérapeutiques majeures.

Procédures

Les animaux seront soumis aux dépilations (jusqu'à 10), aux immunisations (jusqu'à 12) et aux prélèvements sanguins (juqu'à 7). Chaque intervention dure environs 3 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la douleur des administrations/injections/prélèvements sanguins, la douleur aux niveaux des sites d'administrations/injections (irritations, légères réactions inflammatoires), et le stress causé au moment de la dépilation (crème dépilatoire), des immunisations, des prélèvements de sang et de la contention aux moments de ces interventions.

Devenir

Les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort. Si aucune réponse immunitaire significative ne peut être détectée chez un animal, l’immunisation est arrêtée et l’animal est mis à mort. Par contre si la réponse immunitaire est présente, les animaux sont expédiés a notre partenaire pour collecter les Anticorps.

Remplacement

La bibliographie montre que le remplacement des anticorps d’origine animale par des anticorps synthétiques a été initié depuis plusieurs années dans différents domaines mais que, dans l’état actuel de la technologie, il reste des situations dans lesquelles soit les anticorps synthétiques restent inadaptés donc inutilisables (anticorps dirigés contres des protéines dénaturées, anticorps anti-peptides), soit l’évolution vers l’utilisation d’anticorps d’origine non animale en production sera un processus de longue durée et les obstacles techniques subsistent (anticorps à usage thérapeutique ou diagnostic). La production d’anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques de l'antigène, nécessite l'interaction complexe de toutes les cellules (surtout des cellules B) et d’organes lymphatiques impliqués dans le système immunitaire d'un organisme vivant mammifère. Le développement d’une grande diversité d’anticorps par leurs séquences n'est pas possible en l'état actuel de la recherche, tant par les techniques de culture cellulaire que par l'utilisation d'organes isolés, raison pour laquelle l'immunisation d'organismes entiers (souris et rats) est nécessaire. Les dernières découvertes oncologiques ont montré que des facteurs individuels dans les voies de signalisation cellulaire humaines qui jouent un rôle central dans le développement du cancer (ou d'autres maladies importantes) sont donc appropriés comme "cibles" de nouveaux médicaments pour combattre ces maladies. Les anticorps conviennent particulièrement bien comme "candidats médicaments", car ils se caractérisent généralement par une spécificité d'action très élevée et une action sélective par rapport à la cible (moins d'effets secondaires), contrairement à de nombreux autres candidats médicaments (par ex. par voie chimique) qui ont des effets secondaires importants, car ils agissent de manière très peu spécifique. C'est pourquoi la découverte et le développement d'anticorps appropriés et très spécifiques sont indispensables pour de meilleures mesures thérapeutiques contre des maladies telles que le cancer.

Réduction

Nous réalisons ce protocole à la demande de nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux pour atteindre leurs objectifs scientifique. Aucune approche statistique n'a été réalisée. Le nombre d'animaux utilisés par projet d'immunisation varie entre 3 et 10 animaux par immunogène ; le nombre d'animaux utilisés dépend de l'antigène et de l'espèce animale à immuniser. Afin d'obtenir une diversité suffisamment élevée des anticorps à développer, 3 à 10 animaux sont immunisés par groupe et par cible, en fonction de la cible et de l'espèce. Une fois l'immunisation effectuée, les cellules lymphatiques (provenant des organes cibles pertinents pour les cellules immunitaires comme la rate, les ganglions lymphatiques et la moelle osseuse) sont prélevées sur les animaux immunisés. Il n'y a pas de groupe d'animaux de contrôle par essai/antigène cible. Les sérums pré-immunitaires des mêmes animaux immunisés servent de contrôle dans les essais. De plus, pour une bonne campagne d'immunisation pour le criblage des cellules B, il est important de prélever les organes des animaux le plus frais possible et de les traiter directement après le prélèvement. Une cryoconservation des organes lymphatiques ou de leurs cellules après le prélèvement serait réalisable, mais serait également responsable d’une très grande perte de matériel cellulaire, en raison de la mort des cellules due au processus de congélation et de décongélation, ce qui nécessiterait l’utilisation de plus d’animaux immunisés pour avoir la quantité d’anticorps voulu. C’est pour cette raison, que les animaux immunisés sont transportés vivants jusque chez notre client, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour une campagne d'immunisation.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant de l'enrichissement (bâtons de bois et matériel de nidification) et une surveillance est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation. Les contentions, épilations, immunisations et prélèvements sanguins sont réalisés par un personnel formé et expérimenté. En cas d'inflammation (au niveau des sites d'administrations/injections), une injection sous-cutanée d'analgésie sera réalisée, elle pourra etre répétée 24 h après si nécessaire.

Choix des espèces

Les animaux à immuniser doivent être des mammifères possédant une réponse immunitaire humorale (anticorps sécrétés par les cellules lymphocytaires B). Pour qu'une immunisation avec un antigène cible humain s'accompagne d'une réponse immunitaire significative de l'espèce immunisée, il est nécessaire que l'homologie de l'antigène cible entre l'animal et l'homme soit suffisamment différente pour que l'antigène cible soit reconnu comme "étranger" chez l'animal et que celui-ci produise des anticorps spécifiques à l'antigène cible. C'est le cas chez le rat et la souris qui produise des anticorps de bonne qualité. Les animaux seront tous utilisés au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Les animaux utilisés auront au minimum 6 semaines d’âge et maximum 20 semaines (au démarrage du protocole). A cet intervalle d'âge, les animaux présentent une réponse immunitaire particulièrement bien développée et réagissent avec une diversité aussi grande que possible de différents anticorps contre un antigène. Une grande diversité de séquences d'anticorps différentes est importante pour le développement d'anticorps candidats, car l'objectif est de reconnaître le plus grand nombre possible d'épitopes et de liaisons à l'antigène avec différentes affinités. A partir de l'âge d'environ 20-25 semaines, la réactivité et la diversité peuvent diminuer.