Souris
étude du rôle des mécanismes moléculaires et facteurs hormonaux liés aux troubles locomoteurs chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Deux injections dans le canal rachidien à quatre semaines d'intervalle, une pompe osmotique implantée sous la peau, des enregistrements musculaires sous anesthésie et des biopsies de queue : 7 046 souris vont être utilisées, dont 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie porte une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, avec la perte des neurones moteurs et la dégradation musculaire qui l'accompagnent. Le porteur écrit pourtant qu'aucun effet indésirable n'a été décrit chez les animaux qui seront utilisés, tout en signalant par ailleurs une mobilité altérée liée au modèle. Chaque souris est mise à mort pour prélever sa moelle épinière et ses muscles.
Objectifs
Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine du déclin locomoteur dans le contexte du vieillissement et des maladies neurodégénératives. La découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques, en lien avec le mécanisme chargé de la dégradation de composants intercellulaires et les neurones, pourrait permettre de prévenir/traiter le déclin de nos fonctions locomotrices lié à l'âge et des maladies associées aux problèmes moteurs. Ces travaux de recherche devraient permettre de tester l’efficacité de ces thérapies. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes impliqués dans le vieillissement et les maladies dégénératives. D'un point de vue biomédical, il pourrait conduire à l'identification de nouvelles stragégies thérapeutiques pour prévenir et/ou traiter le déclin lié à l'âge ou les maladies neurodégénératives, ce qui constitue actuellement un défi prioritaire pour les systèmes de santé du monde entier. Enfin, d’un point de vue thérapeutique, cette étude pourrait conduire à l’identification de cibles thérapeutiques dans le traitement de ces troubles.
Procédures
Les interventions subies par les animaux sont: - Deux injections intrathécales (10 minutes sous anesthésie par intrapéritonéal et sous analgésique en pré (30 minutes avant le début de la procédure) chirurgie puis 24 et 48 heures plus tard) espacées de 4 semaines. Pose d'une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie et sous analgésie (en pré (30 minutes avant le début de la procédure) chirurgie puis 24 et 48 heures plus tard). Des tests de locomotion seront effectués, ainsi qu’un enregistrement musculaire sous anesthésie par voie intrapéritonéale. Au total, les souris recevront un maximum de 3 injections intrapéritonéal (durée totale de 15 secondes). Ces interventions seront fait dans l'établissement utilisateur 1. De plus, des biopsies de la queue seront effectuées dans l'établissement utilisateur 2 pour génotyper les souris.
Impact sur les animaux
Mobilité altérée liée au modèle sclérose latérale amyotrophique. Injection intrapéritonéale: peut causer une douleur légère due à la piqûre. Chirurgies (injections intrathécales ou pose de pompe osmotique): peut provoquer du stress dû à l'anesthésie et au dessèchement des yeux. Aucun effet indésirable n'a été décrit chez les animaux qui seront utilisés. La biopsie peut provoquer une douleur légère.
Devenir
Chaque animal sera mis à mort afin de prélever des tissus pour l'analyse moléculaire (moelle épinière et muscle).
Remplacement
La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude, car elle présente des similarités physiologiques avec les pathologies humaines. Il n'existe pas de modèle in vitro.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. De plus nous avons déterminé le nombre de souris par groupe en fonction de données de la littérature et grâce à l'utilisation d'un outil statistique.
Raffinement
Les souris bénéficieront de coton, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour notre étude sur les problèmes de locomotion dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique (SLA). Ce modèle, créé en modifiant un gène spécifique, reproduit bien les troubles moteurs observés dans cette maladie. Il permet d’étudier à la fois les formes familiales et non familiales de la SLA, et simule la perte des cellules nerveuses responsables du mouvement, ce qui conduit à une dégradation des muscles. Ce modèle nous aide aussi à étudier comment certains processus biologiques, comme le fonctionnement des cellules, influencent la locomotion à différents stades de vieillissement. Le projet consiste à utiliser des souris âgées de 3 mois et de 16 mois, soumises à des tests pour observer leurs comportements. Ces deux âges ont été choisis pour représenter les stades jeunes et âgés des souris, ce qui permettra de comparer leurs capacités de mouvement et de mieux comprendre comment le vieillissement affecte ces fonctions. À 3 mois, les souris sont en pleine forme physique, tandis qu’à 16 mois, des signes de déclin moteur liés à l’âge commencent à apparaître. Parallèlement, des souris porteuses d’une mutation génétique associée à la SLA (sclérose latérale amyotrophique) seront utilisées à 10 jours et à 3 mois. À 10 jours, l'objectif est de vérifier leur génotype pour déterminer si elles portent ou non la mutation génétique. À 3 mois, les premières altérations motrices liées à la SLA commencent à se manifester, ce qui permet de suivre l’évolution de la maladie au fur et à mesure.
Etude du rôle de l’enzyme Alox15 sur la fonction endothéliale lymphatique EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Injectées cinq jours de suite dans l'abdomen pour bloquer l'enzyme Alox15, 440 souris femelles subissent ensuite soit une greffe de cellules tumorales, soit une chirurgie destinée à provoquer un lymphœdème de la patte. Vient une lymphographie sous anesthésie générale, avec injection dans la patte saine et dans la patte gonflée, puis observation des vaisseaux au stéréomicroscope. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se déroulent dans deux établissements, entre lesquels les souris sont transportées. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les tissus, le porteur affirmant que l'inflammation chronique et la croissance tumorale ne sont modélisables par aucune approche sans animaux.
Objectifs
Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalement implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.
Procédures
Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15- lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De meme, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet
Réduction
Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme Alox15 a ete generee seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de Alox15 de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines.
Traitement avec de nouvelles molécules inhibitrices sur des modèles de souris xénogreffées avec des cellules leucémiques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Immunodéficientes par construction, donc incapables de rejeter les cellules leucémiques humaines qu'on leur transplante, 288 souris vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules prélevées chez des patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique, développent le cancer dans leur moelle osseuse, leur sang et leur rate, puis subissent quatre injections de molécules inhibitrices et un prélèvement de sang à 35 jours, le tout à l'état vigile. Elles sont toutes tuées, en fin de procédure ou à l'atteinte des points limites, pour prélever la moelle et la rate et y doser les cellules leucémiques. Le porteur écrit que le remplacement par des méthodes sans animaux "n'est plus possible à ce stade" du projet, les molécules ayant déjà été testées sur des cellules de patients.
Objectifs
La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) est un cancer du sang. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. Malgré les améliorations du traitement des LAL, les taux de rechute restent élevés (de l’ordre de 25%). Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Dans ce projet, nous transplantations des cellules leucémiques issues de patients dans des souris immunodéficients qui vont développer le cancer afin d’étudier l’effet thérapeutique de nouvelles molécules inhibitrices du cancer.
Bénéfices attendus
En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémies, nous avons identifié de nouveaux composés qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs efficacités, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne donc la découverte de nouvelles molécules inhibitrices et donc de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Leucémies Aiguës Lymphoblastiques.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques. Une seule injection est prévue par souris, durée de 5 minutes par injection. Après la transplantation, des injections des molécules inhibitrices se feront sur animaux vigiles. Quatre injections par souris sont prévues, durée par injection de 5 minutes. Trente-cinq jours après la transplantation, un prélèvement de sang sur animaux vigiles est prévu. Un seul prélèvement par souris, durée du prélèvement de 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des cancers (leucémies), avec une multiplication proliférative des cellules leucémiques lymphoblastiques dans la moelle osseuse, le sang et la rate des animaux. Les injections et prélèvements sur animaux vigiles engendreront du stress et de la douleur au point de piqure.
Devenir
La mise à mort sera effectuée sur les animaux soit en fin de procédure, soit lorsque des points limites auront été atteints. Les animaux seront tous mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever des tissus (les moelles osseuses et les rates) afin de doser la présence des cellules leucémiques.
Remplacement
Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les anticorps et les immunoliposomes que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives ; sur des cellules primaires isolées de patients, ainsi que sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que ces molécules qui vont être étudiées in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.
Réduction
Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche par : la limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les courbes de survie, nous utiliserons des groupes de 7 souris, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris.
Raffinement
Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. Comme il s’agit d’animaux immunodéficients, un couvercle filtrant sera placé sur toutes les cages. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours après 35 jours). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.
Choix des espèces
Pour qu’un nouveau traitement puisse être étudié en thérapie clinique, il est nécessaire de mener des études précliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes. Quelques semaines après l’injection, les cellules leucémiques humaines sont présentes dans la moelle osseuse et la rate des souris qui constituent un modèle d’étude reproduisant la physiopathologie de cette maladie. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin. L’hématopoïèse et la leucémogenèse des souris (mus musculus) est celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules leucémiques.
Etude du rôle de l’enzyme Alox15 sur la fonction endothéliale lymphatique EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
Transportées entre deux établissements selon une charte de transport, 440 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections intrapéritonéales à l'état vigile pour éteindre un gène, puis une greffe de cellules tumorales ou une chirurgie provoquant un lymphœdème, avant une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elles sont tuées sans réveil. L'objet est de comprendre pourquoi les lipides produits par l'enzyme ALOX15 manquent chez les patientes qui développent un lymphœdème après un cancer du sein. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement" pour ces processus, la réduction se limitant à n'utiliser que des femelles.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.
Procédures
Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15-lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car l'invalidation génique de l’enzyme Alox15 a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant à une invalidation de Alox15 de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Impact de l’exposition périnatale à un régime occidental et de nanoparticules de plastique sur la fonction de barrière et la susceptibilité de la muqueuse intestinale à développer des pathologies chroniques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des gavages, des injections sous-cutanées et des prélèvements de sang, chez des femelles gestantes puis allaitantes exposées à un régime riche en graisses et en sucres et à des nanoparticules de polystyrène. 2 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit de mesurer si cette exposition périnatale fragilise la barrière intestinale et favorise allergies alimentaires, maladies inflammatoires de l'intestin et désordres métaboliques. Le porteur écarte les analgésiques et les anti-inflammatoires, qui "risquent d'interférer" avec l'expérimentation, et décrit les atteintes en une ligne, du stress lié aux gavages et une douleur due aux colites, pour 768 souris classées en souffrance sévère.
Objectifs
Les plastiques sont utilisés dans une multitude d’emballages alimentaires et leur production mondiale atteint plus de 450 millions de tonnes par an et, moins de 10 % des plastiques sont recyclés, ce qui augmente leur rejet dans l’environnement et conduit à une distribution omniprésente de débris plastiques dans l’environnement. Les plastiques persistent longtemps dans l'environnement où, soumis au climat, ils se fragmentent en particules de nanoplastique (NPL). Ainsi, les populations humaines sont exposées au NPL dans leur vie quotidienne avec des effets inconnus sur la santé. Le polystyrène représente plus d’un tiers de la contamination plastique de l’environnement. Il est largement utilisé dans les emballages alimentaires mais son processus de recyclage a été reporté à 2030 en France. Parallèlement à l’augmentation de la production et de l’utilisation des plastiques, le nombre de patients atteints de maladies non transmissibles (MNT) ne cesse d’augmenter dans le monde. Parmi ces MNT, les réactions alimentaires indésirables (RAI) et les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Les MNT sont multifactorielles impliquant des facteurs génétiques et environnementaux. L’alimentation humaine est un facteur environnemental majeur des MNT, qui a été radicalement modifié au cours des dernières décennies. L'objectif de ce projet est d'étudier tout risque pour la sécurité alimentaire, lié à la dissémination des NPL dans l'environnement et à leur transfert dans l'alimentation (emballages alimentaires…) associés à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre (régime occidental). En effet, le régime occidental pourrait exacerber la diffusion du NPL et avoir des conséquences délétères, comme cela a été démontré pour le polystyrène (PS) sur le métabolisme lipidique du poisson zèbre. En fonction des résultats obtenus, nous étudierons les mécanismes impliqués en nous focalisant sur le microbiote et la perméabilité intestinale.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de comprendre l'impact d'une exposition périnatale à une alimentation occidentale couplée à des nanoparticules de plastique vieillies sur le développement et l'homéostasie de la fonction de barrière de la muqueuse intestinale chez le jeune et l'adulte. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de définir l'impact d'une exposition à un régime occidental couplée à des nanoparticules de plastique sur la susceptibilité de la muqueuse intestinale à développer (1) une intolérance ou une allergie orale à certain antigène alimentaire comme l’ovalbumine (2) des inflammations ou (3) un désordre métabolique. Ce projet permettra donc de définir les liens de causalités entre certains composants de l’environnement et le développement de l’intolérance ou l'allergie alimentaire, des MICI ou un désordre métabolique ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Une meilleure compréhension de ces maladies permettra alors une meilleure prise en charge thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis a des gavages (1 maximum par procédures). Des injections sous cutanées (2 maximum par procédures) et des prélèvements sanguins. chacun de ces actes prend moins d'une minute.
Impact sur les animaux
stress suite aux gavages/administrations/prélèvements, la douleur est due aux colites
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le développement d'intolérance ou d'allergie alimentaire, des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ou de désordres métaboliques chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeu de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins mimant les pathologies humaines sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une relevance physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques concernant les intolérances/allergies alimentaires, les MICI et les désordres métaboliques. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Les données obtenus dans les différents groupes seront coomparées statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 dans des cages de portoirs ventilés , avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Elles ont une maison en plastique et des fibres de carton comme enrichissement. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Des analgésiques, des antalgiques ou des anti-inflammatoires risquent d'interférer avec le cours de notre expérimentation. Nous avons mis en place des critères d'arrêt appliqués selon un arbre décisionnel permettant de mettre fin a d'eventuelles souffrances par euthanasie des souris. Un suivi quotidien est assuré par les membres de la SBEA (Structure en Charge du Bien-Etre Animal) pour apprécier leur etat general.
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (intolérances/allergies alimentaires, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) et les désordres métaboliques). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, les procédures d'intolérance alimentaire (IA) et de MICI utilisées dans ce projet ont été validées que chez la souris. Pour l'expostion périnatale, nous utiliserons des femelles gestantes et allaitantes. Ces souris femelles seront exposées au régime occidental pendant toute la gestation et l'allaitement (sevrage J21). Ces femelles seront également gavaées une fois par jour du 10ieme jour de gestation jusqu'au sevrage des nouveau-nés (J 21). Puis nous étudierons l'impact d'une exposition périnatale au plastique sur: l'homéostasie de la fonction de barriere de la muqueuse intestinale. La mise en place de tolérance orale La susceptibilité et l'aggravation de la colite Le métabolisme du glucose
Impact neurobiologique du contrôle sur l’environnement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour l'étude de leur tissu cérébral, sauf 168 d'entre elles qui pourront être proposées à l'adoption ou réutilisées ailleurs, 695 souris vont être utilisées dans ce projet, 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur accès à l'eau est contrôlé pendant seize semaines, jusqu'à 63 sessions de test, et une partie reçoit des implants de fibres optiques posés au cours d'une chirurgie stéréotaxique pouvant durer cinq heures. De petits jets d'air aversifs sont dirigés près de leurs yeux pendant le conditionnement, et les souris implantées sont hébergées seules pour éviter que leurs congénères n'abîment le matériel. Le porteur qualifie ces jets d'air de "peu voire non douloureux" et présente le contrôle hydrique comme "la seule approche" permettant d'obtenir entre 100 et 300 essais par session.
Objectifs
Le système nerveux peut être envisagé comme un système de contrôle permettant à l’organisme d’adapter constamment ses actions de façon à atteindre ou à rester dans les états les plus avantageux de son environnement. Cependant, différents environnement ou contextes sont plus ou moins contrôlables et on sait qu’une exposition préalable à des contextes contrôlables favorise des stratégies comportementales proactives dans une variété de tâches cognitives, tandis que le manque de contrôle perçu sur les événements, en particulier ceux qui sont stressants, constitue un prédicteur potentiel de troubles psychiatriques prévalents associés à comportements réactifs et habituels, tels que la dépression, l'anxiété, le stress post-traumatique ou les troubles obsessionnelscompulsifs. Ce projet vise à comprendre la manière dont le cerveau du rongeur estime la contrôlabilité de son environnement et, en aval, les mécanismes impliqués dans les adaptations (ou dysfonctions) comportementales associées. Au plan neurobiologique, il s’intéresse principalement au système sérotoninergique, au système dopaminergique et à certains de leurs partenaires pré- et post-synaptiques. L’hypothèse centrale du projet est que les neurones de la 5-HT dans le noyau dorsal du raphé (DRN) diffusent des signaux liés à la contrôlabilité qui régulent à leur tour les activités neurales sous-tendant l'apprentissage, la prédiction et la sélection d'actions dans le cerveau. Plus généralement, l’ambition de ce projet est de démontrer qu’un cadre théorique et computationnel innovant centré sur un principe d’inférence causale permet d’appréhender la diversité des signaux monoaminergiques et leur impact fonctionnel à différentes échelles de temps.
Bénéfices attendus
Au plan scientifique, ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques et les principes computationnels qui fondent les comportements adaptatifs chez les mammifères. Plus spécifiquement, il vise à montrer comment deux systèmes monoaminergiques (dopamine et sérotonine) sont influencés par des variables environnementales de second ordre (i.e., contrôlabilité et prédictibilité) et comment les signaux qu’il transmettent à de larges territoires cérébraux permettent en retour de coordonner les changements de régime et d’état (physiologiques et comportementaux) vis-à-vis de ces variables. Par exemple, il devrait permettre de comprendre comment l’exposition à des environnements incontrôlables tend à promouvoir une certaine passivité visà-vis des stresseurs et une moindre propension à engager des comportements dirigés vers des buts. Le volet sérotoninergique de ces travaux est particulièrement important car les théories proposées pour rendre compte des activités neuronales et des fonctions cognitives associées à ce système neuromodulateur ont été largement remises en question ces dernières années. L’hypothèse de travail sous-jacente du présent projet est que les modèles théoriques existants —focalisé presqu’exclusivement sur l’apprentissage par renforcement— n’opèrent pas au bon niveau d’abstraction pour comprendre la dynamique fonctionnelle du système sérotoninergique ni pour saisir la nature de ses interactions avec le reste du cerveau (dont le système dopaminergique).
Procédures
Dans le cadre de cette étude, un accès à l’eau contrôlé pourra durer jusque 16 semaines (jusque 63 sessions test), durant lesquelles les besoins hydriques seront satisfaits dans l’appareillage comportemental permettant d’étudier les mécanismes d’apprentissage et de prise de décision. L’impact physiologique sera strictement surveillé. Certains lots d’animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées de substances pharmacologiques (maximum de 7 injections sur 21 jours) ou à un traitement par voie orale (jusqu'à 8 semaines) par inhibiteurs de recapture de la sérotonine. Les deux dernières procédures requiéront des chirurgies stéréotaxiques sous anesthésie complète, permettant l'implantation permanente de fibres optiques pour mesurer ou de manipuler l'activité cérébrale au cours des tests comportementaux (jusque 13 semaines). La grande majorité de ces implantations se fera en une seule intervention d’une durée inférieure à 5h. Une minorité se fera en deux fois (première intervention inférieur à 5h, seconde intervention inférieur à 2h). Aucun prélèvement ne sera effectué sur animal vigile (hors indication vétérinaire si nécessaire). Une chirurgie terminale sous anesthésie sera effectuée en vue du prélèvement du cerveau. Aucune des lignées de souris transgéniques utilisées ne présente de phénotype délétère. De même, le profil des substances administrées durant les soins (analgésiques, anesthésiques, hypnotiques) ou durant les expériences (inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine, agonistes ou antagonistes des récepteurs sérotoninergiques) est bien caractérisé dans la littérature et n’est pas connu pour entrainer de nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux. Cependant, la plupart des protocoles prévus par ce projet implique un niveau de nuisance faible ou modéré pour les animaux principalement lié (i) aux chirurgies stéréotaxiques, (ii) à la restriction hydrique et (iii) à certains stimuli ou méthodes employés au cours des expériences comportementales. Celles-ci sont décrites brièvement ci-dessous et plus en détails dans la section associée à chaque procédure.
Impact sur les animaux
A. Toutes les procédures impliquent un accès à l'eau contrôlé peuvent s’accompagner d’une perte de poids encadrée. Il s'agit de la seule approche permettant d’obtenir un nombre d’essais par session suffisant pour permettre de modéliser les l’apprentissages et de prise de décision (typiquement, entre 100 et 300 par session) dans les expériences de conditionnement instrumental. Les animaux soumis à ce contrôle pourront avoir accès à une supplémentation manuelle les jours non travaillés. En outre, de petits jets d'air (air puff) légèrement aversifs pourront être administrés au cours des expériences de conditionnement, de manière à étudier la manière dont le système sérotoninergique contribue à moduler l'apprentissage dans un contexte comprenant la possibilité de telles stimulations. B. Tous les animaux inclus dans les procédures de pharmacologie aigue ou ayant reçu un implant cérébral feront l’objet d’injections sous-cutanées ou intrapéritonéales (en fonction de la substance injectée) visant soit à traiter la douleur soit à étudier l’impact comportemental ou neurophysiologique de substances agissant sur le système sérotoninergique qui peuvent causer une douleur transitoire et un léger stress dû à la contention. C. Les chirurgies stéréotaxiques nécessaires pour l’implantation de fibres optiques ou d’électrodes entraineront une douleur au niveau du scalp (liée à l’incision) résolue durant les 3 à 5 jours suivants (contrôlée par l’administration d’analgésiques). D. Les animaux implantés avec une fibre ou une lentille pour manipuler ou mesurer les activités cérébrales seront hébergés individuellement pour éviter l’endommagement des implants par leurs congénères. Certains animaux non-implantés seront également hébergé individuellement pour permettre de caractériser l’impact de l’hébergement individuel sur l’apprentissage en condition contrôlable ou incontrôlable, ainsi que l’impact (positif) d’un enrichissement interactif dans les cages. L’hébergement individuel peut en effet induire un profil comportemental de type anxieux, dépressif ou anhédonique chez certains individus.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour permettre d'étudier le tissu cérébral à l'issue de chaque procédure, sauf les animaux n'ayant subi aucun traitement pharmacologique et qui pourront donc être proposés à l'adoption ou réemployés à d'autres fins scientifiques.
Remplacement
Les méthodes utilisées nécessitent l’utilisation de modèle murin, notamment pour les évaluations comportementales et les enregistrements neuronaux qui ne peut être remplacées par une autre approche ex vivo pour répondre aux objectifs du projet. Le principe central du projet est en effet d’établir chez le rongeur des liens robustes entre structure et fonction qui ne peuvent être établis chez l’être humain (techniques invasives). Ceci étant dit, ce projet possède également une composante expérimentale chez l'être humain (non décrite ici), l'objectif final étant d'informer et contraindre une théorie de la fonction sérotoninergiques adossé à une théorie computationnelle qui soit applicables aux deux espèces. Grâce à cette approche translationnelle, les modèles mathématiques et statistiques utilisés pour rendre compte du comportement murin auront été largement développés sur la base d'expériences purement comportementales effectuées chez l'être humain, ce qui constitue une stratégie de remplacement efficace.
Réduction
Notre stratégie de réduction s’appuie sur trois piliers principaux : (i) utilisation d’animaux mâles et femelles pour les expériences, (ii) utilisation des individus n’exprimant pas les transgènes d’intérêt comme individus contrôles, (iii) utilisation de design expérimentaux mixtes (facteurs intra- et inter-sujets) et de modèles computationnels pour maximiser l’information apportée par chaque individu Il est difficile de déterminer le nombre exact d'animaux qui seront in fine nécessaires, compte tenu du caractère novateur des paradigmes comportementaux, de la nature multivariée des enregistrements dans des zones encore peu explorées, du conditionnement de certaines expériences aux résultats des précédentes (un autre levier de réduction), et de certains des outils utilisés de conception récente (micro-endoscopie et biosenseurs notamment). Les lots décrits pour chaque procédure sont donc : (i) basés sur des effectifs fréquemment rencontrés dans la littérature pour les expériences pilotes et (ii) estimés grâce à un calcul de puissance statistique s’appuyant sur les expériences pilotes pour les expériences principales. L’acquisition de données pourra en outre être interrompue dès lors que l’information collectée permettra de conclure quant à la validation ou à la réfutation d’une hypothèse donnée. Les lots proposés donnent donc la limite haute du nombre d’animaux qui pourront être utilisés dans ce projet, mais nous nous efforcerons de ne pas tester plus d’animaux que nécessaire en évaluant le niveau d’évidence obtenu au fur et à mesure. Enfin, les animaux produits dans le cadre de ce projet mais non inclus dans les procédures (pour cause de génotype incompatible ou d'excédent) seront proposés aux autres équipes de recherche habilitées de l'institut. Le nombre total d’animaux prévus tient compte du taux d’échec expérimental (entrainement, chirurgies) s’élevant au maximum à 20% des effectifs, ainsi que des expériences pilotes nécessaires pour optimiser le nombre d’animaux inclus dans chaque expérience.
Raffinement
Dans le cadre du projet proposé, pour chaque mesure expérimentale, des points limites sont établis pour éviter la souffrance et garantir le bien-être de l’animal. Les animaux ont accès à de l'enrichissement (abri, matière pour faire un nid, grille, voire tunnel ou roue). Ils pourront également avoir accès à des éléments interactifs offrant ou non un contrôle sur des stimuli affectivement neutres de l’environnement. La nourriture est toujours fournie ad libitum. Notre protocole de contrôle hydrique est basé sur un important travail d’optimisation et de raffinement préalable, qui permet de maximiser le nombre de récompenses obtenues par les animaux dans les appareils de test tout en minimisant la perte de poids associés. Ainsi, les récompenses liquides délivrées au cours des tests comportementaux pourront contenir une faible concentration de glucose afin de maximiser l’engagement des animaux (et donc la quantité totale d’eau absorbée au cours des expériences), tandis qu'une supplémentation est offerte lors des jours non travaillés. Concernant les procédures impliquant une exposition à des stimuli aversifs, nous utiliserons prioritairement de petites bouffées d’air proches des yeux. Ces jets d’air sont généralement considérés comme peu voire non douloureux. Un accès facilité à l’alimentation après chaque intervention est proposé avec hydrogel, croquettes en fond de cage et poudre de croquettes humidifiées (points limites). Pour réduire le stress des animaux, des séances d’habituations sont systématiquement prévues au manipulateur, à la salle d’expérimentation et aux appareillages utilisés. Un accès facilité à l’alimentation après chaque intervention est proposé avec hydrogel, croquettes en fond de cage et poudre de croquettes humidifiées (points limites). Pour réduire le stress des animaux, des séances d’habituations sont systématiquement prévues au manipulateur, à la salle d’expérimentation et aux appareillages utilisés. Enfin, les souris qui devront être hébergées individuellement bénéficieront d'enrichissement supplémentaire et les contacts sensoriels seront maintenus autant que possible (grandes cages divisées en deux par une cloison à trous, cages transparentes et proches les unes des autres).
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l'étude des systèmes monoaminergiques, leur implication dans l'apprentissage et la prise de décision, ainsi que la modulation des deux premiers par des facteurs environnementaux et affectifs. Des organismes-modèles plus simples tels que la mouche ou le poisson-zèbre sont inadéquats compte tenu de la relative complexité des protocoles comportementaux et des différences génétiques, physiologiques et anatomiques trop marquées en ce qui concerne le système sérotoninergique et ses partenaires. Des lignées de souris transgéniques permettent d'exprimer efficacement des protéines telles que les opsines, indicateurs calciques ou les biosenseurs dans des populations neuronales génétiquement définies (par exemple, lignées SERT-Cre ou DAT-Cre). En outre, les mécanismes de synthèse, de signalisation et de dégradation des systèmes monoaminergiques sont hautement conservés entre la souris et l'être humain. Les protocoles de "résignation acquise" ont par ailleurs montré que les souris comme les humains sont sensibles au contrôle environnemental et que ce contrôle module leurs stratégies d'adaptation ultérieures. Enfin, la miniaturisation et la précision croissante des appareillages comportementaux permettent aujourd'hui d'étudier des fonctions cognitives autrefois testées chez les primates, telles que la prédiction ou l'inférence. Ces résultats constituent d'importants repères pour le projet actuel et font du rongeur le meilleur modèle possible pour ce projet. Les animaux utilisés dans les procédures seront de jeunes adultes entre 12 et 52 semaines (3 à 12 mois), les procédures d'habituation et d'entrainement aux tâches comportementales pouvant être relativement longues. Enfin, l'inclusion d'animaux dans cette fourchette d'âge relativement large devrait permettre de réduire le nombre d'animaux générés pour le projet.
Etude de l’amélioration de la cicatrisation des plaies cutanées de compressions dans le modèle murin diabétique et non diabétique suite à un traitement par des biomatériaux innovants
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Pour tester des biomatériaux censés accélérer la cicatrisation des escarres, 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue diabétique par un régime riche en graisses et en sucres, puis le dos est dépilé et un pli de peau est pincé entre des aimants, une à trois fois, pour provoquer une plaie de compression. Suivent un débridement, la pose du biomatériau, des pansements, des photographies et, pour un groupe, six prélèvements de sang à la queue. Chaque souris est isolée jusqu'à sept jours le temps que la croûte se forme, et le porteur indique que les animaux ne montrent plus de signes de souffrance après quatre jours, selon un score relevé quotidiennement la première semaine.
Objectifs
Objectif du projet : Étudier l’amélioration de la vitesse et de la qualité de cicatrisation des plaies de compression chez des souris diabétiques et non diabétiques, grâce à un traitement par biomatériaux. Les ulcères de pression (escarres) : On estime que 2,5 % de la population américaine souffre de plaies chroniques de type escarres, elles augmentent la morbidité et la mortalité chez les personnes âgées ainsi que les personnes à mobilité réduite. Les patients diabétiques sont d’avantage touchés puisque le diabète entraine une atteinte des nerfs inhibant la sensation de douleur et de la microcirculation ce qui empêche la cicatrisation des plaies de pression. Les traitements actuels des plaies de compression, qui peuvent durer des mois, se basent sur des pansements humides, toutefois les échecs thérapeutiques sont fréquents et les plaies non cicatrisées présentent un risque infectieux élevé. Nous évaluerons l’efficacité des biomatériaux dans des modèles de souris diabétiques et non diabétiques. Les plaies seront induites à l’aide d’aimants qui viendront pincer un pli de peau du dos, une méthode qui reflète les conditions humaines de pression. Nous testerons des biomatériaux innovants, tels que des matrices de collagènes, pour accélérer la cicatrisation des plaies de compression chez la souris. L’ingénierie tissulaire utilise ces biomatériaux pour offrir aux cellules de la peau un environnement à coloniser et ainsi combler la plaie. Différents biomatériaux seront testés pour démontrer leur efficacité dans la cicatrisation des plaies.
Bénéfices attendus
La demande de traitements pour les plaies chroniques connaît une forte augmentation, par conséquent, le besoin de solutions thérapeutiques innovantes, efficaces et accessibles est en nette croissance, en raison du vieillissement de la population et de l'augmentation des comorbidités. Le bénéfice à long terme de l’utilisation de biomatériaux pour le traitement des plaies cutanées de pression se situe dans la prise en charge précoce de ces patients, et une approche préventive, ces solutions permettront de diminuer la douleur, la gravité et la durée des traitements, tout en réduisant les coûts pour les systèmes de santé.
Procédures
Les souris seront anesthésiées pour les manipulations suivantes : 1 dépilation du dos, 1 ou 3 poses d'aimant selon le protocole pour induire la plaie de compression, 1 débridement et mise en place du biomatériau de traitement, soins et prise de photos de la plaie. Un groupe recevera une injection de glucose suivi de 6 prélèvements de sang à la queue sous anesthésie générale. Pour les groupes suivants, un seul prélèvement de sang à la queue sera réalisé sous anesthésie générale afin de mesurer la glycémie. Chaque anesthésie (gazeuse) sera d’environ 10minutes.
Impact sur les animaux
Les procédures impliquant les souris engendrent diverses nuisances. Le stress thermique est causé par la dépilation du dos, tandis que la douleur résulte des plaies de compression, du débridement. Après la chirurgie, la perte de mobilité peut entraîner des difficultés à atteindre la nourriture et l’eau. La peur et la détresse apparaissent lors des manipulations fréquentes pour les pesées, les soins ou les changements de pansements. Les pansements et plaies exposent les animaux à des risques d’arrachage du pansement et au léchage de la plaie, pour cette raison les souris seront isolées maximum 7 jours.
Devenir
La procédure et les prélèvements biologiques nécessitent que tous les animaux soient mis à mort
Remplacement
Avant d’être testés sur des animaux, les biomatériaux sont d'abord évalués sur des cellules de peau humaine cultivées en laboratoire (fibroblastes). Cela permet de choisir les meilleures formulations en fonction de plusieurs critères comme la compatibilité chimique, la survie et la croissance des cellules, ou la production de matrice extracellulaire. Des alternatives en laboratoire, comme les modèles 2D et 3D, existent pour simuler la cicatrisation, mais ils ne recréent pas toutes les interactions complexes des tissus humains. Par exemple, les modèles 3D, qui utilisent du collagène et des cellules, imitent mieux la peau, mais restent incomplets. D'autres méthodes, comme la culture d'organes, conservent mieux les structures cellulaires sur le long terme, mais elles sont coûteuses et ne reflètent pas l’ensemble des interactions du corps. L’ingénierie tissulaire explore de nouvelles approches, mais il est difficile d’obtenir des résultats proches des conditions réelles, surtout pour des maladies complexes comme le diabète, où des inflammations chroniques et des problèmes de vaisseaux sanguins compliquent les choses. Pour ce projet, on utilise une souris de laboratoire spécifique, bien adaptée à un régime qui induit l’obésité et le diabète, et elle a une physiologie vasculaire proche de celle des humains. Cela permet d’étudier les effets de la maladie sur la cicatrisation avec un minimum d’animaux, tout en obtenant des résultats fiables.
Réduction
La procédure de mise au point du protocole d’induction des plaies de compression comporte un nombre deux fois moins important de souris par groupe. En effet le recueil de données qualitatives (et donc sans réalisation de statistique) sera suffisant pour valider le protocole en utilisant comme critère de validation la durée de fermeture complète de la plaie qui doit être supérieure à 12 jours. Nous comparerons également les résultats chez les mâles et les femelles mais nous n’attendons pas de différences. Pour cette mise au point, nous allons avancer étape par étape avec dans un premier temps la réalisation des 4 premiers groupes qui sont les groupes pour lesquels l’induction de la plaie est faite sur 1 jour, ce qui est le protocole idéal pour limiter les manipulations sur la souris. Si ce protocole sur une journée ne permet pas d’obtenir des plaies de compressions, ou que les plaies se referment en moins de 12 jours chez la souris non diabétique, nous testerons alors les 4 groupes suivants avec un protocole d’induction des plaies sur 3 jours. Cette stratégie en deux étapes permet de diminuer le nombre d’animaux utilisé si la première condition nous donne les résultats désirés.
Raffinement
Les souris recevront une dose d’analgésique 30 minutes avant l'induction de la plaie par les aimants, le débridement de la plaie, puis d’une deuxième injection entre 6-8h après l’acte chirurgical et une fois par jour pendant 48h. Les actes douloureux étant tous réalisés sous anesthésie gazeuse. A partir du jour de la dépilation les souris seront scorées chaque jour pendant 7 jours. Une injection sous cutané de buprénorphine sera réalisée si nécessaire. Après ces 7 jours les souris seront monitorées les lundis, mercredis et vendredis. D’expérience, après 4 jours, les souris ne montrent plus de signes de souffrance. Les animaux seront isolés 7 jours, le temps de la formation de la croute, de ce fait l’enrichissement standard de la cage sera doublé avec la présence de plusieurs cachettes (dômes, rouleaux) et de matériel de nidification.
Choix des espèces
Au cours de ce protocole, nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 8 semaines connues pour développer un diabète de type 2 à la suite d’un régime riche en glucides et en lipides. Les souris seront utilisées à 8 semaines pour avoir des animaux sexuellement matures.
Rôle de la myéline dans la capacité à s’orienter dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux injections d'une molécule bloquant la myélinisation à 10 et 12 jours après la naissance, un prélèvement de l'extrémité de la queue pour le génotypage, puis des tests d'orientation dans un labyrinthe et des séances de nage d'une minute. 2 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 242 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 780 un niveau léger. Ces 1 780 souris ne passent aucun test de comportement : elles sont utilisées pour le maintien des lignées et des analyses complémentaires, et celles nées sans le génotype recherché sont tuées. Le porteur écrit que "le nombre d'animaux utilisés est optimisé", alors que neuf souris sur dix de ce projet sont mobilisées hors des expériences de comportement elles-mêmes.
Objectifs
La myélinisation joue un rôle clé dans le fonctionnement des circuits neuronaux du cerveau. Nous souhaitons utiliser un modèle murin permettant d’inhiber la myélinisation pendant la période critique du développement. Notre intérêt est focalisé sur le circuit de navigation spatiale et a pour objectif de comprendre comment l'absence de la myéline affecte son fonctionnement.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à déterminer le rôle de la myéline au niveau comportemental, physiologique et cellulaire. Il permettra de clarifier le rôle de la myéline dans la navigation spatiale au cours du développement. De plus, chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, des troubles cognitifs sont associés à des lésions de régions cérébrales impliquées dans l'intégration multisensorielle. Parmi ces troubles cognitifs, on note l’apparition précoce de déficits d’orientation dans l’espace chez la moitié des patients. Cette pathologie qui touche 110000 personnes en France est la première cause de handicap non-traumatique chez l'adulte jeune. Nos travaux pourront apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques des déficits cognitifs dans la sclérose en plaques.
Procédures
Les animaux seront identifiés génétiquement par prélèvement distal de la queue (durée inférieure à 2 minutes par animal, réalisé en une seule fois). Ils recevront deux injections d'une molécule permettant de mettre en place le modèle, soit à 10 et 12 jours post-nataux, soit à 16 et 18 jours post-nataux (durée inférieure à deux minutes par injection par animal). Nous effectuerons des tests de comportement qui sont des tests d'orientation et de mémoire à court terme. Il s’agit d’un premier test de déplacement, 1 jour pendant 10 minutes, puis lors de deux autres jours, un test d'orientation dans un labyrinthe avec deux essais par jour de 8 minutes. Puis, les jours suivants, un autre type de test avec une première séquence de 5 jours consécutifs avec 4 essais de 1 minute par jour et un dernier test 3 jours après le dernier essai, et d’une deuxième séquence similaire de 5 jours d’essai pour renforcer l’apprentissage. D’autres animaux auront une séquence de 4 jours consécutifs avec deux essais quotidiens de deux minutes et un test le lendemain pour évaluer l’apprentissage. Une partie des animaux sera euthanasiée par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses. Une autre partie des animaux sera euthanasiée par une méthode réglementaire car ils ne présenteront pas le génotype d'intéret pour ce projet.
Impact sur les animaux
Nous effectuerons une injection intrapéritonéale d'une molécule permettant de mettre en place le modèle. L’administration de cette molécule n’affecte pas la viabilité des souris. Les animaux peuvent perdre un peu de poids après la première injection. Elle peut entrainer une douleur mais aussi un hématome. Il faudra vérifier la zone de l'injection intrapéritonéale sur les jours suivants l’injection. Nous effectuerons des tests de comportement qui sont des tests d'orientation dans l'espace et de mémoire à court terme, générant un stress temporaire chez les animaux. L‘eau est maintenue à une température comprise entre 20-22 degrés mais les souris peuvent être en légère hypothermie en sortant. Les tests comportementaux sont imposés à la souris, elle doit nager une minute et peut se refroidir un peu. Une légère et brève douleur peut se produire au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage .
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin des tests de comportement pour l'analyse de tissus post mortem. Les animaux utilisés pour le maintien de la lignée sont maintenus en vie pour la reproduction, puis ils seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien en accouplement. Les animaux issus des croisements qui ne présentent pas le génotype d'intérêt pour le projet seront euthanasiés.
Remplacement
Nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris) car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne permet aujourd'hui d'étudier les mécanismes de mise en place des circuits d'orientation dans l'espace au cours du développement. De plus, la souris présente une homologie importante avec l’Homme.
Réduction
Nous prévoyons une étude pilote en comportement sur un nombre limité d’animaux (22 animaux non transgénique) pour valider l’analyse des trajectoires grâce à un nouvel algorithme. L'étude de 10 groupes de 22 animaux permettra ensuite d'obtenir des résultats statistiquement significatifs en comportement. Le nombre d'animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques fiables et exploitables. Ainsi dans ce projet nous prévoyons un total de 2022 souris dont 242 réalisant les tests de comportement et 1780 pour maintien des lignées mais également pour des analyses complémentaires en immunohistologie, en microscopie électronique et en électrophysiologie qui nous permettront de répondre à notre question scientifique.
Raffinement
Les souris sont séchées avec une serviette de bain après chaque passage dans la piscine avant d’être replacées dans leur cage d’hébergement, sous lampe chauffante. Les animaux sont hébergés en groupe dans l’animalerie agréée (avec leur mère et leur portée avant sevrage, puis à 6 maximum par cage après sevrage), en milieu ventilé, avec une température de 22 plus ou moins 2 degrés, avec cycle diurne/nocturne de 12h. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Les animaux sont examinés quotidiennement par les zootechniciens, toute anomalie est signalée, l’équipe est rapidement informée pour une prise en charge optimale de l’animal. L’hébergement animal est en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Au moins un enrichissement par cage (pad de coton pour réaliser un nid) est fourni. Si une douleur devait persister malgré la prise en charge par la structure chargée du bien être animal/vétérinaire, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. Si au cours de l’expérimentation, l’animal présente de grosses difficultés à se déplacer ou se relever pour se nourrir, apparaît un amaigrissement de plus de 15 pour cent du poids mesuré avant l’expérimentation ou un comportement indiquant une souffrance, l’animal sera euthanasié. Dans les expériences avec injection de la molécule permettant de mettre en place le modèle, certaines souris perdent du poids pendant une période pouvant aller jusqu'à dix jours, mais retrouvent leur poids par la suite. Les souris seront surveillées par pesée avant injection de la molécule et quotidiennement ensuite.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix car son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proches de celles de l’Homme. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées et correspondent donc à notre étude qui se base sur un support génétique impliqué dans le développement de la myéline. De plus il s’agit d’un modèle inductible, qui permet de contrôler l’arrêt de la myélinisation au cours du développement des souriceaux. Ensuite entre 5 et 9 semaines, les tests comportementaux seront réalisés car le développement du système nerveux sera suffisant pour réaliser ces tests. La myélinisation axonale n'est pas uniforme mais progresse après la naissance de la partie caudale à la partie rostrale du cerveau avec une progression comparable de l'efficacité de la communication neuronale. Cette myélinisation progressive n'a pas encore été clairement liée à l'ontogenèse de l’orientation spatiale. Nous pensons que le déficit de myéline dans les voies thalamo-cortico-presubiculaires devraient retarder l'émergence d'une orientation spatiale précise. Le patrimoine génétique des animaux sera identifié avec un prélèvement de l’extrémité de la queue réalisé à l’âge de 7 à 10 jours.
Etude in vivo de l’innocuité d’un système innovant d’encapsulation pour la libération de biomolécules dans le cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Sept anesthésies en trente-cinq jours, après une chirurgie stéréotaxique du crâne d'une trentaine de minutes : 120 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des particules microscopiques sont déposées dans leur cerveau, puis suivies par imagerie à J+1, 3, 7, 14, 21, 28 et 35 pour vérifier qu'elles ne l'abîment pas. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés, tout en signalant une douleur légère possible, un risque d'infection au niveau des sutures et une perte de poids temporaire. Le choix de la souris tient d'abord à la commodité, sa petite taille facilitant l'hébergement et les appareils de bioimagerie lui étant adaptés en priorité.
Objectifs
Le projet scientifique dans lequel s'insère la demande d'autorisation consiste à développer une nouvelle approche pour la libération contrôlée de médicaments dans le cerveau. Pour cela, nous utilisons des particules microscopiques qui contiennent les médicaments souhaités et qui peuvent les libérer à la demande, sous l'action d'une lumière délivrée à une couleur précise. L'objectif du présent projet est d'étudier le devenir des particules lorsqu'elles sont injectées dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Dans un premier temps, la mise au point de notre système permettra à plusieurs équipes de recherche en neurosciences de tester leurs hypothèses de recherche avec une approche pharmacologique nouvelle, plus ciblée que les outils disponibles aujourd'hui. Dans un second temps, ce projet rentrera dans le cadre d'une recherche translationnelle, pour que cette approche pharmacologique soit utilisée pour améliorer la prise en charge thérapeutique de certaines pathologies dont l'origine dans le cerveau est localisée, comme certaines épilepsies, les glioblastomes, les accidents vasculaires cérébraux, ou encore la maladie de Parkinson.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chirurgies stéréotaxiques sous anesthésie une fois dans leur vie, pour le dépôt de particules dans le cerveau. Ensuite, les animaux subiront de brèves anesthésies (moins de 10 min) pour des séances de bioimagerie, à J+1, 3, 7, 14, 21, 28 et 35 jours après la chirurgie. Enfin, les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des analyses post-mortem. Pour chaque animal, la procédure chirurgicale dure environ 30 min entre le moment où ils sont endormis et le moment où ils se réveillent. Chaque animal ne subira qu'une chirurgie.
Impact sur les animaux
Les chirurgies stéréotaxiques (dépôt de particules dans le cerveau) présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opérationcar elle peut entraîner en postopératoire une douleur légère ou un risque d'infection au niveau des sutures ainsi qu’une légère perte de poids temporaire. Cependant, nous avons maintenant plusieurs années de recul et nous n'avons jamais observé d'effet indésirable chez les animaux injectés avec les particules, que ce soit sur leur comportement, ou sur leur tissu cérébral.
Devenir
Tous les animaux suivront la même procédure, afin de quantifier le devenir des particules déposées dans le cerveau, jusqu'à 35 jours après injection.
Remplacement
Le projet scientifique global prévoit un grand nombre d'expériences utilisant des modèles de culture cellulaire, et ce précisémment en vue de remplacer les modèles animaux. De plus, de nombreuses expériences ont déjà été réalisées en solution ou dans des gels d'agarose, afin de caractériser notre technologie. Cependant, la biocompatibilité des particules pour le cerveau ne peut être vérifiée que chez l'animal entier, d'où la présente demande d'autorisation.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes, évitant la répétition des expériences. La présente demande concerne un suivi longitudinal des animaux injectés avec les particules d'encapsulation, précisément pour réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, nous appliquerons les conditions d'hébergement optimales pour les souris, ainsi que les points limites et les points d'arrêts précoces et adaptés, tels que définis par la structure Bien-Etre Animale de l'établissement utilisateur. Ainsi, les animaux seront hébergés par 5 avec présence de différents enrichissements et une surveillance quotidienne sera réalisée (comportement général, disponibilité en eau et nourriture). En cas de nécessité, les soins à apporter seront réalisés rapidement, avec sollicitation des vétérinaires du site si besoin. Pour les chirurgies stéréotaxiques, les soins pré- et pos-opératoires seront appliqués et notifiés. Tout au long du projet, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie seront mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés. Si un animal atteint les points limites, des soins lui seront prodigués et si son état ne s'améliore pas, il sera euthanasié dans les 48h au plus tard.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille, ils peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. C'est aussi le modèle le plus couramment utilisé pour les études qui se rapprochent du présent projet. De plus, les appareils utilisés pour la bioimagerie sont adaptés à la souris en priorité. Nous utiliserons des animaux adultes entre 8 semaines et 8 mois, car les chirurgies stéréotaxiques sont mieux maitrisées chez l'adulte. En effet, les atlas stéréotaxiques servant à la précision de la chirurgie sont issus d'animaux adultes.
L’étude de l’activation des lymphocytes B du ganglion afférant chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des injections dans le sinus rétro-orbital et dans le coussinet plantaire sous anesthésie générale, des prélèvements de sang à la veine submandibulaire, puis une chirurgie suivie d'une imagerie du ganglion pouvant durer quatre heures. 832 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 112 un niveau modéré. L'objectif déclaré est de comprendre comment les cellules dendritiques transmettent un antigène aux lymphocytes B, une question fondamentale dont le porteur espère des retombées en vaccination et en immunothérapie. Sur la réduction, il annonce des "lots d'un nombre réduit d'animaux mais suffisant" sans donner un seul chiffre justifiant les 832 souris.
Objectifs
Les lymphocytes B circulent dans le sang et les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglion) à la recherche de leur antigène spécifique qui entraîne leur activation. L’activation des lymphocytes B est l’étape initiale de la réponse immune humorale de l'hôte qui se déroule dans la rate ou le ganglion lymphatique, aboutissant à la production d’anticorps spécifiques de l'antigène associé au pathogène lors de l'infection. Le rôle des cellules dendritiques qui sont les sentinelles de notre système immunitaire dans le transport et le transfert de l'antigène nécessaire à l'activation de ces lymphocytes B producteurs d'anticorps demeure encore peu élucidé. De plus, le rôle respectif des sous-populations de cellules dendritiques résidentes du ganglion lymphatique dans l'activation B ainsi que la visualisation in vivo par imagerie du transfert de l'antigène restent encore à étudier. Ce projet comprend 3 objectifs : 1. Etudier le rôle des sous-populations de cellules dendritiques du ganglion dans l’activation lymphocytaire B. 2. Analyser la réponse anticorps induite in vivo après immunisation de souris par injection en périphérie de cellules dendritiques-antigène. 3. Visualiser le transfert de l’antigène par les cellules dendritiques vers les cellules B par imagerie intravitale chez la souris.
Bénéfices attendus
Le rôle des cellules dendritiques dans l'activation des lymphocytes T est bien établi. En revanche, le rôle de ces cellules dans le transfert de l'antigène pour l'activation directe des lymphocytes B demeure encore mal compris. Ainsi, les résultats obtenus dans ce projet devront contribuer à une meilleure compréhension fondamentale de la présentation de l'antigène et sa délivrance par les cellules dendritiques aux lymphocytes B pour conduire à leur activation jusqu'à une possible production d'anticorps. Ces résultats pourraient aussi ouvrir des perspectives pour de nouvelles stratégies innovantes de vaccination et d'immunothérapie pour la prévention et/ou le traitement des infections et de maladies auto-immunes.
Procédures
- 2 Prélèvements de sang à la veine submandibulaire (durée 1-2 min) pour les animaux soumis aux procédures 1 et 2, - 2 Injections par voie intraveineuse dans le sinus rétro-orbital de souris sous anesthésie générale (durée 1-2 min) pour les animaux soumis aux procédures 2 et 3, - 2 Injections par voie sous-cutanée dans le coussinet plantaire de souris sous anesthésie générale (durée 1-2 min) pour les animaux soumis aux procédures 2 et 3, - Anesthésie générale et chirurgie sous analgésie (durée 15 min) pour les animaux soumis à la procédure 3, - Imagerie au niveau du ganglion afférant drainant sur animal sous anesthésie génerale (durée 5min-4h) pour les animaux soumis à la procédure 3.
Impact sur les animaux
Une douleur légère voir un stress peuvent être dus au prélèvement de sang au niveau de la veine submandibulaire. Un stress léger peut être généré pour la mise sous anesthésie générale. Une douleur peut être provoquée suite aux injections sous cutanées et intraveineuses. Les injections sous cutanées peuvent aussi induire une inflammation légère et locale (avec rougeur). Un stress et une douleur modérée, peuvent aussi être provoqués aussi par la chirurgie et l'imagerie intravitale.
Devenir
- Une mise à mort de tous les animaux. Les souris seront mises à mort après atteinte de points limites ou de manière programmée pour prélèvements d'organes et de tissus ou la fin de la période de suivi pour l'expérimentation.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de comprendre le déroulement et le déveolppement de la réponse immune humorale B suite à l'activation des lymphocytes B par leur antigène in vitro en raison de diverses interactions cellulaires qui sont hautement dynamiques et observables uniquement in vivo au sein de la structure tridimentionnelle du ganglion lymphatique chez la souris.
Réduction
Nous utiliserons des lots d’un nombre réduit d’animaux mais suffisant pour une des analyse statistique fiable. Chaque expérience indépendante comportera au moins un groupe témoin d'animaux et un groupe test et les différences entre les souris test et les témoins seront analysées par des tests statistiques adaptés. Les approches in vitro ont déjà été effectuées afin de valider les hypothèses de travail que nous souhaitons confirmer si possible in vivo dans le cadre de ce présent projet.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté et d'un milieu enrichi. Ce protcole inclut des points limites qui seront définis et évalués à l'aide d'une grille de score qui est mise en place. Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée.
Choix des espèces
L’utilisation de souris est justifiée d’une part par la complexité de la réponse immunitaire humorale in vivo dans le ganglion lymphatique des vertébrés, qui ne peut être reproduite par des approches alternatives in vitro ou ex vivo. D’autre part, les modèles animaux comme la souris offrent la possibilité d’investiguer des cibles spécifiques in vivo à l’aide d’animaux génétiquement modifiés, ce qui permet d'approcher ou d'élucider de plus près les mécanismes impliqués. Le génotypage par prélèvement de sang sera effectué sur des animaux adultes âgés d'au moins de 4 semaines dans la procédure 1. Les animaux utilisés dans les procédures 2 et 3 seront adultes âgés entre 8 et 12 semaines.
Evaluation de l’efficacité et du mode d’action d’un composé d’intérêt thérapeutique chez un modèle souris d’inflammation colique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent 21 gavages, dont 8 de placebo pendant une phase d'habituation, et boivent pendant huit jours une eau additionnée d'un agent chimique qui déclenche une colite, avec diarrhées, sang dans les selles et douleurs abdominales. Hébergées seules alors que le porteur reconnaît que ce sont des animaux sociaux, elles sont utilisées pour évaluer deux candidats médicaments d'une "société cliente" contre la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Il écrit que le recours à "l'animal entier" reste une étape "nécessaire" à la constitution du dossier d'autorisation des essais cliniques.
Objectifs
Le présent projet vise à tester l'efficacité de deux composés d'intérêt thérapeutique (administrés seuls ou en combinaison) en développement préclinique et visant à traiter les inflammations chroniques de l'intestin (maladie de Crohn ou rectocolite hémorragique). Les données obtenues devraient permettre à la société cliente de détailler l’efficacité et les mécanismes d’action de leur composé et de permettre, dans l'hypothèse d'effets bénéfiques, de poursuivre le développement de ces composés en clinique humaine.
Bénéfices attendus
La présente étude devrait permettre de mettre en évidence une efficacité de deux candidats médicaments en développement à diminuer la colite, et apporter une confirmation de leur mode d'action. Dans ce cadre, les composés X et Y seront testés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourrait, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les souris recevront 21 administrations par gavage (8 administrations de placébo pendant la phase d'habituation au traitement puis 13 administrations dans la phase de traitement elle-même; Durée < 1 minute). Hormis pour les 10 souris du groupe expérimental contrôle du modèle de colite, les animaux seront exposés à un composé chimique induisant une inflammation du colon via leur eau de boisson pendant 8 jours. Les souris seront pesées deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant les 13 jours de traitement (durée des pesées < 1 minute). Enfin, à l'issue de l'étude, les souris seront anesthésiées et mises à mort après anesthésie (Durée: 5 min).
Impact sur les animaux
Le modèle employé est un modèle de colite induite par l'administration par l’eau de boisson d'un agent chimique irritant dosé de façon à induire une colite modérée chez la souris. Dans ce cadre, les souris présentent des épisodes de diarrhée, avec une possible présence de sang dans les selles et des douleurs abdominales. L'ensemble des administrations par voie orales (8 administrations de véhicule suivies de 13 administrations de véhicule, ou des candidats médicaments administrés seuls ou combinés) et les pesées quotidiennes à l'état vigile peuvent être source de stress ou de douleurs. Par ailleurs, l'hébergement individuel représente également une nuisance pour les souris qui sont des animaux sociaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur l’inflammation colique. En effet, les inflammations chroniques de l'intestin possèdent une étiologie complexe, impliquant des mécanismes inflammatoires et immunologiques. Bien que des modèles in vitro aient été utilisés afin de réaliser les premières preuves de concept de l’efficacité du composé X, le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire à la constitution d'une demande d'autorisation afin de réaliser les études cliniques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats obtenus lors de nombreuses études antérieures menées par le laboratoire. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et compte tenu de l'hétérogénéité du modèle employé. Un total de 70 souris sera utilisé, divisé en 1 groupe de 10 souris (groupe contrôle du modèle) et 4 autres groupes de 15 animaux chacun. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 10 animaux puisqu'il ne présente pas de colite, réduisant la variabilité des mesures réalisées. Une analyse statistique sera réalisée.
Raffinement
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un agent irritant chez la souris qui est un modèle particulièrement bien caractérisé dans la littérature. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress induit aux animaux (périodes d’acclimatation et d’habituation des animaux aux procédures d’administration) et à établir des points limites appropriés. En cas d'atteinte de scores de souffrance animale spécifiques, une administration d'analgésique sera employée pour s'affranchir de toute douleur induite aux animaux. Les animaux seront hébergés individuellement mais conserveront des contacts visuels et olfactifs entre congénères et une enrichissement renforcé de leur environnement sera mis en place sous forme de briquette de bois spéciales pour rongeurs, de dômes en cartons et de papier de nidification.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un agent irritant chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 7 semaines d'âge et les traitements débuterons à 9 semaine d'âge. Cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.
Evaluation des effets d’un traitement innovant au niveau des muscles squelettiques pendant un choc endotoxémique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Pour tester si une molécule limite la fuite de plasma hors des vaisseaux pendant un choc septique, 12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Six reçoivent le traitement, six un placebo, après une injection intrapéritonéale d'un produit pro-inflammatoire qui fait chuter la pression artérielle et peut aller jusqu'à l'insuffisance circulatoire avec troubles de la conscience. Le protocole s'arrête à 24 heures, délai que le porteur présente comme une limitation des effets secondaires, et une IRM d'une heure sous anesthésie clôture l'expérience. Il décrit cet examen comme "parfaitement atraumatique", tout en attendant une possible détresse respiratoire au moment de l'endormissement.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60 pourcents, soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, une équipe de recherche Française a identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible thérapeutique spécifique, cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept in vivo que la modulation de l’activité de cette molécule permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Les muscles squelettiques étant des tissus richement vascularisés, la fuite capillaire y est cliniquement importante. L’imagerie médicale étant une technique non-invasive et atraumatique de référence dans l’étude du tissu musculaire, l’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet protecteur de ce médicament candidate sur le muscle squelettique dans le contexte du sepsis.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Tous les animaux (12) auront des injections intrapéritonéales (geste rapide de quelques secondes chez une animal vigile) d'une substance pro-inflammatoire et d'un placebo (6) ou du traitement à évaluer (6). Les injections seront réalisées par un personnel formé à cette technique. Après 24 heures, les acquisitions images par résonnance magnétique (IRM) d’une durée d’environ une heure, se feront sous anesthésie légère pour obtenir l'immobilité pendant environ une heure, mais sont parfaitement atraumatiques et n'induisent pas de souffrance par elles-mêmes.
Impact sur les animaux
L’induction d’un syndrome de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection d’un produit pro-inflammatoire en intra-péritonéal. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer le syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS), en particulier chez la souris. L’injection entraine une baisse de pression artérielle, pouvant aller jusqu'à une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience. Le présent protocole limite donc la durée à 24 heures maximum, en rapport avec la question scientifique posée et afin de limiter les effets secondaires induits. Concernant l’IRM, les modalités utilisées dans ce projet seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité. Les principales nuisances qui sont attendues peuvent être une détresse respiratoire au moment de l’anesthésie. De plus le monitorage de la température corporelle est réalisé couplé à un matelas thermostaté afin de maintenir la normothermie de la souris durant l'examen.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus afin de pouvoir faire une confrontation anatomo-pathologique avec les images in vivo.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et le peptide d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
L’IRM permet d’acquérir des données multiparamétriques dans un système expérimental complexe, tel l’animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par IRM autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Enfin par son caractère atraumatique, l’IRM offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effet nocif pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Les hypothèses du calcul du nombre de sujets nécessaires se basent sur les données préalables acquises lors de la mise au point du modèle. L’effet étudié (choc endotoxémique) touche tous les individus exposés et la différence entre individus exposés et contrôles est très nette, ce qui permet de faire un calcul de puissance a priori. Le nombre total d’individu nécessaire pour tirer une conclusion est de 12 individus. Les sous-groupes d’animaux sont ainsi au minimum de 6 individus. Des tests statistiques étayeront l’interprétation fiable des résultats avant de tirer des conclusions.
Raffinement
L’IRM répond enfin au 3ème R de la règle des 3R, Raffinement, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques au niveau électronique qui permettent d’atteindre des résolutions en préclinique environ 3000 fois supérieures à celles obtenues sur les aimants cliniques de pointe. De plus, le raffinement avant expérimentation s’applique aussi à l’hébergement des animaux en groupes dans des cages à usage unique sur des portoirs ventilés et en enrichissant l’environnement à l’aide de papier absorbant et de tubes en carton pour la fabrication de nids. La phase d'induction du sepsis sera couverte systématiquement par une analgésie et la survaillance du comportement et de l'état général des souirs permettr a de définir des points limites qui justifieraient une euthanisie prématurée. De plus, toutes les expérimentations IRM se feront sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress pendant l’examen. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant et la fréquence respiratoire est contrôlée en permanence pendant toute la durée de l’examen à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement en accord avec la législation en vigueur par du personnel compétent afin de s’assurer du bon état de santé de ces derniers.
Choix des espèces
Le choc septique constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable importante dans le monde. En recherche fondamentale, on peut mimer certains aspects du choc septique, en particulier la perméabilité des vaisseaux sanguins qui augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Les souris miment bien cette réponse, mais la tolèrent mieux que l’homme. La souris d’âge adulte jeune représente ainsi un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire induite sans entrainer une surmortalité. Le présent projet a été mis en place chez la souris et a déjà reçu une autorisation par le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. L’évaluation par IRM in vivo vient en complétement à des tests faits sur ce même modèle avec une vision d’applicabilité en clinique humaine.