Souris

Des cellules cancéreuses injectées dans le tibia sous anesthésie, puis huit semaines d'injections intrapéritonéales jusqu'à deux fois par semaine. 252 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit ne prévoir aucun effet secondaire particulier, et décrit dans le même paragraphe une lyse osseuse avec boitement, une perte de poids surveillée jusqu'à 15 % et des difficultés respiratoires liées aux métastases qui déclenchent une mise à mort immédiate. La mise à mort finale sert à recueillir les tissus, étape qu'il qualifie d'"essentielle" à la fiabilité des conclusions.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus courante chez les enfants, les adolescents et les jeunes adultes. Malheureusement, les traitements actuels ne sont pas toujours efficaces, et 40 % des patients ne peuvent pas être guéris. Notre objectif est d'étudier le rôle d'une protéine dans ce cancer, en voyant notamment comment elle influence la réponse du système immunitaire contre la tumeur. Nos premières recherches, réalisées à l'aide d'analyses informatiques et sur des cellules en laboratoire, montrent que cette protéine pourrait avoir des effets anti-cancer. Ce projet est essentiel pour comprendre si cette protéine peut ralentir la progression de l'ostéosarcome en stimulant le système immunitaire, et si elle pourrait devenir une nouvelle cible de traitement pour améliorer les chances de survie des jeunes atteints de ce cancer.

Bénéfices attendus

Les ostéosarcomes restent des cancers compliqués à soigner. Les traitements actuels sont agressifs (chimiothérapie lourde, amputation) et largement inefficaces dans de nombreux cas. Nous avons absolument besoin de mieux comprendre la biologie de ces cancers pour mieux soigner les enfants et les jeunes qui en sont atteints. Notre projet s’inscrit dans cette perspective et permettra de définir la pertinence de cibler une protéine -dont le rôle n’a pas été décrit jusqu’ici dans cette pathologie- dans la mise en place d’immunothérapies.

Procédures

1 : Injection sous la peau d’antidouleur avant la greffe (durée : 30 secondes/animal) 2 : Injection des cellules dans le tibia des souris sous anesthésie (durée 1min/animal) 3 : Injection en intrapéritonéale 1x/sem (pendant 8 semaines maximum) pour rendre la tumeur visible en imagerie (durée 30 sec/animal) 4 : injection en intrapéritonéale 2x/sem (pendant 8 semaines maximum) d’un traitement de chimiothérapie (durée: 30 sec/animal)

Impact sur les animaux

Nous utilisons uniquement des doses de traitement sans toxicité attendue et ne prévoyons pas d’effets secondaires particuliers. Cependant, des effets temporaires peuvent survenir, comme une légère inflammation pendant 2 à 3 jours après l'injection de cellules dans la jambe, parfois accompagnée d’un boitement lié à une lyse osseuse. Les injections peuvent également entraîner des réactions locales, comme des rougeurs ou des gonflements, et l’anesthésie peut provoquer des troubles passagers, tels qu’une baisse de température ou une respiration ralentie. La perte de poids des animaux sera suivie de près, avec une limite fixée à 15 % par rapport à leur poids initial. Si des difficultés respiratoires apparaissent en lien avec des métastases, les animaux seront observés et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance. Enfin, les manipulations régulières, comme les pesées ou les déplacements, provoqueront un stress modéré

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de recueillir les données nécessaires à l’analyse des résultats et de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cette étape est essentielle pour garantir la fiabilité et la précision des conclusions.

Remplacement

Le microenvironnement de la tumeur étant très complexe, il n’existe pas de méthode en laboratoire, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires. De plus, on ne peut pas étudier la propagation des cellules cancéreuses dans le corps avec nos méthodes en laboratoire.

Réduction

Nous utiliserons différents types de tests statistiques en fonction des comparaisons que nous voulons faire. Selon ce que montrent les recherches et notre propre expérience, nous pensons que 90 % des greffes vont réussir. En général, nous avons besoin d'au moins 14 animaux par groupe pour être sûrs que les résultats statistiques montrent une différence significative entre les groupes.

Raffinement

Toute intervention d’injection intratibiale sera faite sous anesthésie générale. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux, une surveillance adaptée des animaux, une pesée bi-hebdomadaire et une observation minimum 3 fois par semaine permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal, le plus souvent observée par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera un antalgique sans influence sur le système immunitaire. Après l’intervention, les animaux sont remis dans leur cage d’origine et auront une surveillance accrue.

Choix des espèces

Nous avons développé un modèle d'ostéosarcome en injectant des cellules cancéreuses dans le tibia de souris. Étant donné que ces cellules proviennent également de souris, ce modèle reproduit le développement de la tumeur dans un organisme doté d’un système immunitaire complet, ce qui est crucial pour comprendre la réaction du corps face à la tumeur. Ce modèle nous permet également d'observer la propagation du cancer vers les poumons. Nous choisissons des souris de 5 semaines, car l'ostéosarcome étant un cancer pédiatrique, cet âge reflète au mieux la réalité de la maladie chez l’homme.

100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leur microbiote intestinal est d'abord éliminé par quatre gavages d'une solution purgative à vingt minutes d'intervalle, ce qui provoque des diarrhées, puis remplacé par un microbiote humain administré en trois gavages espacés de trois jours, avant des injections d'anticancéreux et d'antibiotique dans l'abdomen. Elles passent huit jours isolées, cage par cage, pour éviter que les bactéries ne circulent entre elles. Le porteur écrit qu'un placement auprès d'une association de protection animale ne semble pas approprié vu l'état de santé de l'animal, et que le recours aux souris est "indispensable" faute de méthode reproduisant un microbiote humain in vitro.

Objectifs

Le traitement des cancers solides consiste fréquemment en l’utilisation de médicaments cytotoxiques (chimiothérapies) lesquels ciblent l’ADN des cellules cancéreuses, dont la prolifération est rapide. Les très nombreuses bactéries du microbiote digestif du patient sont des cellules à prolifération rapide et il a récemment été montré qu’elles sont aussi la cible des médicaments cytotoxiques. L’altération de l’ADN bactérien par les molécules antimitotiques strese les bactéries et favorise l’émergence de mutants in vitro. Dans le tube digestif des patients traités par anticancéreux, ces mutants résistants pourraient être ensuite sélectionnés par un traitement antibiotique (très fréquemment prescrite en traitement des complications infectieuses en cours de chimiothérapie), et ainsi augmenter le risque d'infections nosocomiales à bactéries résistantes aux antibiotiques, plus difficiles à traiter. Les résultats obtenus jusqu’à présent résultaient d’expérimentations in vitro, qui confrontaient une molécule anticancéreuse à une seule espèce bactérienne, ne tenant compte ni de la composition en nutriments du système digestif, ni de la complexité du microbiote digestif. Il est en effet établi que la communauté bactérienne digestive (composée d’environ 500 espèces) protège de la colonisation par les bactéries résistantes en raison de compétition pour les nutriments chez des individus sains. Dans ce projet, nous souhaitons de manière inédite mesurer l’influence d’un traitement par des molécules anticancéreuses connues pour stresser les bactéries sur l’émergence de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques dans le microbiote digestif d’un modèle murin de microbiote humanisé par greffe fécale. Nous souhaitons ainsi démontrer que les traitements anticancéreux favorisent l'apparition de bactéries commensales résistantes aux antibiotiques (objectif principal). Nous explorerons aussi les mécanismes sous-jacents à cette émergence, en mesurant les modifications de la composition et des fonctions biologiques des microbiotes soumis à des doses thérapeutiques d’anticancéreux (objectif secondaire).

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le modèle murin et combinées à celles d’une étude clinique qui sera réalisée en parallèle, permettront de générer de nouvelles hypothèses d’optimisation des stratégies thérapeutiques des cancers chez l’Homme.

Procédures

Tous les animaux auront les interventions suivantes : gavage (4 fois avec une solution purgative à 20 min d’intervalle, 3 gavages de greffon, à 3 jours d’intervalle, durée de gavage < 1 min) ; injections intra-péritonéales (1 fois l’anticancéreux/sérum physiologique, 3 fois l’antibiotique, durée d’injection < 10 s).

Impact sur les animaux

Des nuisances d'intensités légères dues aux injections intra-péritonéales des chimiothérapies/sérum physiologique et de l’antibiotique ainsi que des douleurs au niveau des points d’injection peuvent être attendues. Par ailleurs, même si l’expérience montre que l’injection de molécules anticancéreuses est bien tolérée par les souris, des effets indésirables liés à l’administration d’agents cytotoxiques ne peuvent pas être exclus (nuisances modérées). Le mode d’élimination du microbiote naturel de la souris par une solution purgative (préalable à l’installation du microbiote humain) risque de causer des diarrhées ainsi qu’un inconfort de courte durée (< 30 min) et le gavage oro-gastrique peut induire du stress responsable d’une augmentation de la morbidité et mortalité des souris (évèvements rares, nuisances modérées). Les implantations de microbiote humain ne présentent a priori aucune implication pathologique pour les animaux. En effet, l'introduction d'un microbiote particulier n'induira pas le développement de maladies. Cependant les souris seront étroitement surveillées par un vétérinaire en cas de survenue de diarrhées (nuisance modérée).

Devenir

Les animaux seront mis à mort car il ne sera pas possible de réutiliser ces animaux pour une autre expérimentation en raison de l’administration d’anticancéreux notamment. Un placement de l’animal auprès d’une association de protection animale ne semble pas non plus appropriée en raison de l’état de santé de l’animal qui ne peut être garanti à l’issue de l’expérimentation.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable un microbiote intestinal humain in vitro d’autant plus qu’une partie du microbiote est constitué de bactéries viables mais non cultivables. Les modèles les plus fiables requièrent l’humanisation, partielle et temporaire, du microbiote d’animaux. Actuellement, il est impossible de ne pas recourir à des modèles animaux. Le recours aux souris est donc indispensable pour ce projet qui utilisera le minimum de souris nécessaire en respectant le plus possible le bien-être animal.

Réduction

Cette étude comportera des petits groupes animaux (n=10) pour pouvoir faire des tests statistiques validant les résultats. Un support en biostatistique est apporté par un expert de la spécialité, afin d’optimiser les méthodes expérimentales. L’utilisation de 10 souris par lot permet de lisser les variations interindividuelles. Les souris utilisées pour l’étude pilote des points limites pourront entrer dans les statistiques finales, réduisant ainsi le nombre de souris par lot dans l’étude principale.

Raffinement

L'hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignées de souris. La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), et maintien des animaux en groupes de 5 afin d’éviter le stress de l’isolement jusqu’à l’administration des antibiotiques (J8). Ensuite les souris devront impérativement être hébergées individuellement pour éviter les contaminations croisées par les bactéries du microbiote digestif (objet de l’étude). Nous limiterons l’hébergement individuel à 8 jours (entre J6 et J14) pour réduire l’inconfort des souris. Pendant cette période, les animaux garderont un contact visuel et olfatif avec leurs congénères et l’enrichissement dans leur cage sera augmenté et varié. Les conditions d’hébergement seront optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (dômes, coton, netlets), En rapprochant les cages au maximum, nous nous assurerons que les animaux puissent communiquer. Les Souris pourront voir leurs congénères (cages transparentes) et les sentir (pas de couvercle filtrants). L’enrichissement sera renforcé (tubes en Plexiglas, billes de bois à ronger). La durée maximale de leur vie solitaire sera de 8 jours (J6 à J14). Une surveillance attentive est assurée quotidiennement, y compris les week-ends et les jours fériés. Une intervention immédiate et appropriée sera entreprise dès l'apparition de tout signe de détresse selon les scores des points limites fixes dans la procedure.

Choix des espèces

En plus des avantages pratiques liés à l’élevage ainsi qu’à l’expérimentation sur ce modèle animal parmi toutes les possibilités qu’offre l’expérimentation animale, la Souris est celui le plus utilisé dans les études sur le microbiote intestinal en général et plus particulièrement sur la greffe de microbiote fécal. En utilisant des souris, nous pouvons bénéficier des retours d’expérience d’autres équipes et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés pour la mise au point des protocoles. De plus, les résultats obtenus pourront être comparés aux études précédentes et permettre une analyse plus fine. Le protocole que nous allons suivre utilise des souris adultes de 8 semaines. Nous n’avons pas de raison de modifier ce paramètre dans notre étude.

Jusqu'à vingt séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse par animal, une injection de cellules cancéreuses dans l'oreille, l'ablation de cette oreille si la tumeur grossit trop vite, puis une injection dans la rate. 724 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, y compris celles dont la tumeur régresse. Les métastases hépatiques attendues peuvent provoquer douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et perte de poids, et chaque animal reçoit en plus une injection de médicament tous les deux jours pendant quatre à huit semaines. Le choix de la souris est justifié par un contexte immunitaire complet et par des molécules cibles que le porteur décrit comme conservées à 100 % chez l'humain, les animaux étant utilisés à six ou sept semaines pour limiter les variations physiologiques.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur qui se développe à partir de cellules épidermiques appelées mélanocytes. Bien qu’il ne représente qu’environ 1% des cancers cutanés, le mélanome est responsable de 75% des décès dus aux cancers de la peau. L’agressivité du mélanome est liée à son très fort potentiel métastatique et à la capacité de ces cellules cancéreuses à proliférer dans les organes vitaux, notamment le foie. Il est donc crucial de comprendre quels sont les mécanismes qui gouvernent le développement des métastases, pour envisager des traitements qui bloqueront ou ralentiront la progression tumorale dans les organes vitaux. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous avons mis en place une méthode qui nous a permis d’identifier des gènes impliqués dans le développement des métastases pulmonaires et nous souhaitons maintenant étendre cette méthode aux métastases hépatiques. Les mélanomes utilisent des signaux produits localement dans chaque organe pour stimuler leur croissance. Empêcher les mélanomes de percevoir ces signaux, devrait en théorie prévenir leur croissance. Dans le but de tester cette hypothèse, nous avons mis au point un système qui permet d’éteindre individuellement l’expression d’une sélection de gènes impliqués dans la réception des signaux stimulant la croissance des mélanomes. Grace à cette méthode, nous avons pu déterminer quels sont les récepteurs qui sont responsables de la croissance des mélanomes dans les poumons. Nous souhaitons maintenant étendre notre étude au foie car le mélanome conduit fréquemment à des métastases dans cet organe. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome ainsi que la réponse anti-tumorale. Le modèle cellulaire choisi récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique chez les souris . Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur pourra être administré et un enrichisement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Pour réduire le nombre d'animaux, une étude statistique préliminaire a été réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’implication des gènes étudiés dans la croissance des métastases de mélanomes. Il permettra d’identifier précisément quels récepteurs sont utilisés lors de la colonisation spécifique du foie. Ces gènes ont un potentiel thérapeutique formidable puisqu’environ 40% des médicaments sur le marché sont des agonistes ou antagonistes de ces récepteurs. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé (stade 2 à 4) mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.

Procédures

Injection de cellules dans l'oreille 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Procedure chirurgicale d'ablation de l'oreille (uniquement si la tumeur atteint un certain volume avant l'apparition des métastases) sous anesthésie gazeuse, une seule fois, durée maximale 30 min. Injection de cellules 1 par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Injection de cellules en dans la rate : 1 par souris sous anesthésie générale, durée maximale 20 min. Injection de médicaments : 1 fois tous les deux jours après anesthésie locale (Lidocaïne) pendant 4 à 8 semaines (en fonction des résultats). Anesthésie gazeuse pour imagerie, durée maximale 20 min, 1 à deux fois par semaine pendant au maximum 10 semaines soit 20 séances maximum, durée maximale des procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux auront des nuisances légères dues aux injections sous anesthésie locale ou générale dans le derme (flanc (anesthésie locale), ou oreille (anesthésie générale)) ou dans la rate (anesthésie générale). Avant l'anesthésie, une analgésie adaptée sera administrée. L'excision d'une oreille sous anesthésie générale avec analgésie pourra entraîner une gêne et un handicap modérés. La croissance de tumeurs dans le derme peu entraîner une gêne physique et des douleurs modérées. La croissance de tumeur dans la rate peut entraîner des symtômes de douleur abdominale modérée. L'apparition de métastases hépatiques peut entraîner des symptômes de gravité modérée: douleur abdominale, fatigue, perte d'appétit et éventuellement perte de poids.

Devenir

Tous les animaux ayant reçu une injection de cellules seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils développeront tous potentiellement des tumeurs et des métastases. Pour les animaux pour lesquels on observerait une régression tumorale, ils seront aussi euthanasiés car on ne peut pas éliminer la possibilité d'une reprise de la tumeur et/ou une progression lente. Tous les animaux ayant été utilisés pour la procédure de détermination de la dose maximale d'antagonistes seront aussi euthanasiés pour analyses post-mortem sur tissus et organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme entier (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Enfin, notre projet offre une opportunité thérapeutique qui justifie la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire permet d'établir le nombre d'animaux nécessaire par groupe pour les étapes de validation des gènes d'intérêt et l'étude de leur effets sur la croissance primaire et pour l'étude des effets des antagonistes. De même, seuls les gènes d'intérêt validés seront étudiés par la suite. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses d'antagonistes seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. De même, une période de wash out sera observée entre l'injection de deux doses lors de l'évaluation de la dose maximale tolérée , ce qui permettra de réduire le nombre total d'animaux.

Raffinement

Les animaux sont observés tous les jours par le personnel de l'équipe de recherche. De plus, les animaux sont observés et pesés deux à trois fois par semaine par les expérimentateurs confirmés responsables du projet. Un score de contrainte est établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines. Des points limites pour traitement ou arrêt ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront anesthésiées lors des différentes procédures. Si des métastases hépatiques se développent, nos méthodes de suivi (palpation abdominale et luminescence) nous permettront d'arrêter le procédure à un stade de gravité modérée.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser le modèle de la souris pour étudier les mécanismes de développement de métastases de mélanome. L'utilisation de ce modèle nous permet d'être dans un contexte immunitaire complet. Ce modèle nous a déjà permis d'identifier des molécules impliquées dans la croissance métastatique du mélanome dans les poumons. D'une part, le modèle cellulaire choisis récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique. D'autre part, les molécules identifiées chez les souris sont 100% conservés chez l'homme. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines, jeunes adultes. En effet, le développement de la souris entraîne des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression des gènes étudiés et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris à un jeune âge.

42 souris vont être utilisées, toutes tuées à sept ou quatorze jours pour prélever les zones en cicatrisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux incisions de 2 mm sous anesthésie, l'une dans le dos, l'autre dans le palais, puis passe deux jours seule en cage, un isolement que le porteur reconnaît stressant pour un animal social. Les applications annoncées, au bénéfice de personnes brûlées ou porteuses de séquelles faciales, sont renvoyées au moyen terme, l'objet immédiat restant de comparer la cicatrisation du palais et celle de la peau. Sur le remplacement, le porteur écrit que la cicatrisation est "trop compliquée pour être reproduite en laboratoire" et qu'il faut donc l'étudier chez l'animal.

Objectifs

La gencive, muqueuse qui entoure les dents et recouvre l’os sous-jacent, est composée principalement de populations cellulaires appelées fibroblastes gingivaux (GF). Parmi ces populations, se trouvent des cellules souches gingivales (GSC) capable de se renouveler et de se transformer en différents types cellulaires. De plus, le tissu dont elles sont issues présente une cicatrisation complête, ne laissant aucune trace et se démarque par cette propriété des autres tissus conjonctifs de recouvrement (notamment de la peau). Les GSC, facilement recueillies chez les patients adultes, peuvent s'adapter à différents environnements du corps et influencer le système immunitaire, ce qui en font un outil de choix pour la thérapie cellulaire. De plus, la biopsie indolore n’entraine ni cicatrice ni problème fonctionnel. Ces cellules, qui seraient dérivées des crêtes neurales, sont utilisées avec succès en dermatologie et en cardiologie. Ce projet cherche à comprendre comment ces cellules participent à la guérison cutanée et comment les utiliser en thérapie. Elles seront ainsi triées selon leur origine embryonnaire et leur contribution dans la cicatrisation sera étudiée. Des modèles de souris transgéniques seront utilisés pour suivre ces cellules et comprendre leur répartition dans différents tissus. Ces recherches pourraient ouvrir de nouvelles voies pour la reconstruction des tissus après des blessures graves ou des maladies.

Bénéfices attendus

Des travaux préliminaires sur ces modèles de souris transgéniques ont permis de faire une différence sur l’origine embryologique des cellules constituant la tête, de celles à l'origine du reste du corps. Ainsi notre idée serait de montrer que l'origine particulière des fibroblastes de la gencive est la raison essentielle de la cicatrisation complête et sans traces, dans la bouche. Pour cela, nous utiliserions ces modèles de souris transgéniques afin de déterminer la distribution des cellules selon leurs origines dans les tissus qui cicatrisent parfaitement, le palais, versus un référentiel moins performant, la peau. Le projet de recherche ici présenté a pour objectif de décrire les implications du fibroblaste gingival et des cellules souches associées pendant la cicatrisation complète et quasi parfaite. Les résultats de ces recherches permettront de mieux appréhender l’utilisation des fibroblastes gingivaux dans la réparation tissulaire par thérapies cellulaires. Nous espérons aussi pouvoir identifier des molécules responsables de cette régénération. Les applications à moyens termes pourraient profiter aux personnes présentant des traumatismes faciaux avec des séquelles cutanées ou patients présentant des brûlures importantes.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour la chirurgie. Deux incisions cutanées de 2mm seront réalisées. L'une se situera dans le dos, l'autre dans le palais. Nous estimons réaliser l’ensemble de ces gestes en moins de 5 minutes pour chaque animal. Ces incisions seront réalisées sur la totalité des animaux, soit 42 souris. Un traitement analgésique de plusieurs jours sera systématiquement mis en place pour anticiper l’apparition de douleurs post opératoires possibles. Du fait d'une aggressivité possible et reconnus chez les souris après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle durant 2 jours. Les souris seront euthanasiées et les prélévements seront réalisés à 7 et 14 jours

Impact sur les animaux

A l’âge adulte, les animaux subiront un acte de chirurgie rapide impliquant deux biopsies (punch). Cet acte pourra induire des contraintes liées à l’anesthésie elle-même (stress thermique, risque de détresse respiratoire, etc.) et pourra induire une douleur post-opératoire malgré la prise en charge de la douleur associé à la cicatrisation (irritation, inflammation, etc...). De plus, la plaie créée dans le palais, ainsi que la gêne qu’elle occasionne, pourrait entraîner une perte de poids. Enfin, afin d’éviter des comportements agressifs après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement durant 2 jours ce qui impliquera un stress social pour ces animaux sociaux.

Devenir

Aux différents temps défini post-chirurgie, nous allons récupérer les zones en cicatrisation (après 7 jours de maintien) ou cicatrisées (après 14 jours de maintien) pour effectuer les analyses nécessaires afin de répondre à la question scientifique. L’euthanasie des animaux est donc de ce fait inévitable.

Remplacement

La cicatrisation est un processus complexe qui se déroule en plusieurs phases : inflammation, formation de nouveaux vaisseaux sanguins (angiogénèse) et mobilisation de cellules spécifiques. Ce processus est trop compliqué pour être reproduit en laboratoire. Pour comprendre le rôle des fibroblastes (des cellules importantes pour la cicatrisation), il faut étudier ce processus chez l'animal. Cela permet d'observer toutes les cellules et les étapes impliquées dans la cicatrisation de manière naturelle.

Réduction

À la fin de cette étude, nous analyserons les échantillons de deux manières différentes. D'abord, une analyse qualitative en histologie examinera les sites prélevés aux jours 7 et 14 sur les deux lignées transgéniques. Ensuite, une analyse quantitative aux jours 7 et 14 également, mais qui ne portera que sur l'une des deux lignées. Étant donné que le marquage fluorescent ne modifie pas l'expression génique des cellules, nous ne prévoyons pas de différences entre les résultats des deux lignées. Par une approche statistique appropriée à notre étude, nous avons déterminé la taille des groupes nous permettant d’avoir une force statistique adéquate tout en respectant les considérations éthiques en matière de nombre d'animaux. Ainsi, il nous faut comparer 7 échantillons de palais à 7 échantillons de dos pour les deux temps d’arrêt et les deux types d’approches. De plus, comparer les deux sites chirurgicaux chez le même animal renforce la validité statistique de l'étude tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. L'étude portera sur un total de 42 animaux.

Raffinement

L’ensemble de la procédure sera réalisé sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique pré et post opératoire durant une surveillance accrue de deux jours. Les deux actes chirurgicaux seront réalisés sur un temps court inférieur à 5 min. L’hébergement se fera en cages individuelles avec enrichissements (maisonnette ou tunnel plus radeau) durant 2 jours maximum et les cages positionnées côte à côte pour que les animaux se voient. Les conditions de stabulations seront conforment à la réglementation. Exceptionnellement, la litière sera faite de carrées de cellulose, moins agressif pour les plaies. Les animaux recevront en plus un régime alimentaire sous forme de gel nutritif ainsi que de l'eau par abreuvement automatique. Des points limites ont été définis sur le poids des animaux qui sera mesuré quotidiennement jusqu'à 14 jours (semaine et week-end). Un traitement analgésique sera lancé si une perte inférieure à 20 pour 100 du poids de l’animal est observée. Au delà de cette valeur, l’animal sera euthanasié pour limiter sa souffrance. La mise en évidence de signes de contamination de la plaie ou de signes cliniques observés au cours du suivi sera prise en compte (apparence, posture, appétit, poids corporel, respiration, plaie) pour l’arrêt de l’expérimentation et l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

La souris possède des similarités morphologiques avec son homologue humain, elle représente donc le modèle le plus adapté pour réaliser des plaies. De plus, dans les limites de la réglementation, ce modèle facilite l'utilisation d'un nombre suffisant d'échantillons pour permettre la collecte de données statistiquement significatives. Enfin, par rapport au rat, la disponibilité des modèles génétiquement modifiés est moins restrictive. Les outils biologiques pour l'exploration des échantillons sont plus facilement utilisables sur cette espèce. Les souris utilisées seront des souris adultes ayant terminé leur croissance. C’est la raison pour laquelle nous avons choisi des animaux âgés de 3 mois. De part la difficulté à avoir assez d’animaux double mutants, nous utiliserons les souris des deux sexes. Nous essayerons de répartir au maximum les deux sexes aux deux temps d’arrets (après 7 jours et 14 jours de maintien) et que cette répartition soit similaire pour les deux lignées.

1 019 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir douze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, douze à seize jours d'isolement pour la mesure du métabolisme et jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et commencent par une chirurgie cérébrale de vingt minutes sous anesthésie générale, suivie d'injections dans l'abdomen. Certaines lignées développent à partir de neuf mois des problèmes musculaires ou une paralysie, que le porteur présente comme une caractéristique de la lignée. Toutes sont tuées pour prélever cerveau, muscle, tissu gras et foie, la question posée étant de relier le dérèglement du métabolisme à la maladie d'Alzheimer.

Objectifs

Les maladies liées à l'âge constituent l'un des principaux défis des sociétés modernes, à mesure que l'espérance de vie augmente. C’est notamment le cas des maladies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer, la plus répandue dans le monde. Malgré des avancées importantes, les mécanismes pathologiques de la maladie d’Alzheimer restent mal compris et les options thérapeutiques insatisfaisantes. De nombreux éléments suggèrent que la maladie d’Alzheimer n'est pas seulement caractérisée par un dysfonctionnement neurologique mais également par des troubles métaboliques. Un dysfonctionnement métabolique est un trouble du corps qui perturbe la manière dont il transforme les aliments en énergie, pouvant mener à des maladies telles que le diabète ou l'obésité. Ce projet vise à comprendre comment la dérégulation du métabolisme est liée aux maladies neurodégénératives. Pour atteindre cet objectif, nous allons caractériser l'impact du dysfonctionnement métabolique sur la progression de la neurodégénérescence chez des modèles animaux de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Nous étudierons également la régulation du métabolisme au cours de la progression de la neurodégénérescence chez ces modèles. Afin de prendre en compte des facteurs liés au sexe et au stade de développement de la maladie, l’étude sera menée sur des mâles et des femelles, et sur des groupes ayant deux âges différents. Enfin, nous proposons de valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la maladie par imagerie. Le projet se déroulera dans 2 Établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de mieux comprendre l’implication du contrôle métabolique sur les mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence et vice-versa. À plus longue-terme, nous espérons que ces connaissances aideront à révéler de nouvelles perspectives thérapeutiques, ciblé sur l’amélioration de la fonction métabolique, pour prévenir ou ralentir le déclin cognitif liée à la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. Enfin, nous espérons valider une nouvelle méthode pour suivre la progression de la neurodégénérescence par imagerie, ce qui pourra réduire significativement le nombre d’animaux utilisés dans la recherche préclinique à l’avenir.

Procédures

- Chirurgie sous anesthésie générale et analgésie afin d’injecter des composés dans le cerveaux (durée: 20 minutes) - Détermination du poids, da composition corporelle et de la fonction métabolique sur souris vigile (durée : 4 jours). - Isolement des souris pour l’étude individuelle de la fonction métabolique (durée: 12 a 16 jours). - injection péritonéale sur la souris vigile (1-3 injections par souris ; durée : 30 secondes). - Prélèvement de sang sur animaux vigiles, par incision du bout de la queue. Fréquence : 12 fois par souris, reparti en 6 fois à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h ; et 6 fois une semaine après, à l’intervalle de 15 ou 30 minutes pendant 2h. - Imagerie de la souris sous anesthésie générale (4-12 fois par souris, 1 fois / semaine sur 1 ou 3 mois; durée : 3 minutes). L’étape de chirurgie se déroulera dans l’établissement EU1 puis, les analyses de la fonction métabolique et l’imagerie se feront dans l’établissement EU2. Les deux établissements sont attenants.

Impact sur les animaux

- Douleur locale transitoire après injection et en post-opératoire ; - Après la chirurgie, il est possible que certains animaux développent une infection, présentent des problèmes de cicatrisation, ainsi qu'une perte de poids ou du stress. - le transport des animaux du fournisseur vers l’animalerie et d’une animalerie à l’autre peut induire du stress. - Stress ou anxiété à cause de l’isolement pour la mesure de la fonction métabolique chez les souris en isolement - Certains animaux plus âgés (à partir de 9 mois) appartenant à l'une des lignées de souris utilisées peuvent développer des problèmes musculaires ou une paralysie, caractéristiques de cette lignée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour le prélèvement de tissus (cerveau, muscle, tissu gras, foie) pour analyse des molécules clés dans la régulation du métabolisme et des protéines pathologiques liées au processus de neurodégénérescence.

Remplacement

L’utilisation d'un modèle animal est indispensable pour étudier le métabolisme énergétique. Des expériences sur cellules ont déjà été réalisées et ont validé notre hippothèse sur l’effet inhibiteur des facteurs pathologiques sur la fonction métabolique et sur l’activité des cellules neuronales. Pour continuer notre étude, nous avons maintenant besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée du métabolisme en lien avec la progression des maladies neurodégénératives. Cela ne peut se faire que sur l’animal vigile. La souris représente un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques et des maladies neurodégénératives, car les modèles utilisés ont été générés chez la souris.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Les mesures de la fonction métabolique et d’imagerie de bioluminescence sont effectuées sur plusieurs jours sur le même animal, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Plusieurs mesures spécifiques seront prises pour minimiser les nuisances causées aux animaux, telles que : - anesthésie et analgésie pour limiter la douleur; - des mesures spécifiques pour éviter l'hypothermie; - des mesures spécifiques pour diminuer le stress et l’angoisse des souris pendant le transport des animaux entre les deux établissements; - les animaux sont hébergés groupés (sauf si une nécessité d’individualisation se présente), dans un milieu avec enrichissement approprié, et avec de la nourriture et d'eau ad-libitum; - Tout au long de la procédure, les souris seront observées quotidiennement conjointement par les soigneurs et/ou les expérimentateurs; - application de points limites stricts et spécifiques au projet; - Ce projet privilégie les techniques non invasives d'analyse métabolique globale et d'imagerie.

Choix des espèces

L’espèce Mus Musculus a été choisie car plusieurs modèles de souris présentant des caractéristiques similaires à celles des patients atteints de maladies neurodégénératives ont été développés et validés. De plus, la souris représente un modèle de choix pour l'étude de la fonction métabolique car la régulation métabolique est similaire entre la souris et l’homme, permettant ainsi une extrapolation des résultats obtenus. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes (dans le contexte des maladies métaboliques et neurodégénératives) sur la souris est un atout majeur dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, lorsque leurs comportements alimentaires et locomoteurs, ainsi que leur masse, sont stables. Les souris seront utilisées à l’âge de 3, 6 et jusqu’à 9 mois. Ce choix se justifie par le fait qu’à l’âge de 3 mois les souris transgéniques sont à un stade précoce de la maladie, tandis que à 6 mois et 9 mois les troubles de mémoire et d’apprentissage sont bien documenté dans la littérature.