Souris

Aucune des 40 souris ne sortira vivante de ce projet, le porteur jugeant qu'il n'est pas concevable de garder en vie des animaux non-humains chez qui une sclérose en plaques expérimentale a été induite. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec deux injections destinées à déclencher la maladie, puis un traitement par voie intraveineuse tous les trois jours ou par voie intranasale chaque jour pendant vingt jours, et des séances de radiologie nucléaire sous anesthésie après injection d'un composé radioactif. La paralysie induite commence par la queue avant de gagner la démarche, et le porteur indique avoir défini des points limites pour éviter les stades élevés. Pour justifier ce recours, il affirme qu'il lui "faut utiliser un organisme vivant comme une souris" afin de vérifier que ses composés se distribuent dans le système nerveux central.

Objectifs

Le projet a pour but de tester un composé pour son rôle neurorégénérateur dans un modèle murin de sclérose en plaques

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques touche aujourd'hui 120 000 personnes dont 700 enfants en France. Le bénefice sera de mettre en évidence un composé capable d'induire de la régénération neuronale testable chez les patients atteints de sclérose en plaques.

Procédures

Les animaux recevront deux injections pour induire la pathologie. Dans la première phase, la radiologie nucléaire sera utilisée sur des animaux sous anesthésie après une injection d'un composé radioactif. Dans la deuxième phase, le traitement se fera par injection intraveineuse tout les 3 jours ou intranasale tout les jours pendant 20 jours.

Impact sur les animaux

La pathologie se traduit par une induction de paralysie graduelle commencant par la queue (score clinique 1), et une démarche anormale (score 2).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car il n'est pas concevalble de garder en vie/réutiliser des animaux pour lesquels une sclérose en plaques expérimentale a été induite.

Remplacement

Il nous faut utiliser un organisme vivant comme une souris pour vérifier que nos composés sont capables de se distribuer dans le système nerveux central après injection en périphérie.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés a été défini suivant les connaissances actuellement rapportées du modèle afin d'obtenir des résultats interprétables. Seule la voie d'injection permettant une biodistribution significative du composé sera retenue pour les projets ultérieurs.

Raffinement

L'utilisation de cage digitale permettant d'enregistrer le mouvement des animaux (activité motrice non forcée) va nous permettre d'obtenir des mesures plus fines pour un stade de paralysie donné et ainsi éviter les stades élevés. Des points limites limitant la sévérité de la maladie ont été définis. La combinaison des personnels impliqués présentent toutes les compétences requises en expérimentations animales pour mener à son terme le projet. Notre stratégie de rafinement comporte l'utilisation de nourriture au sol, d'un gel évitant le dessechement des yeux lors de l'imagerie et l'anesthésie.

Choix des espèces

Le modèle murin appelé experimental autoimmune encephalitis est standard dans l'étude de la sclérose en plaques chez la souris adulte qui comporte un système immunitaire mature nécessaire à l'induction de la pathologie.

870 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de tumeur par injection sous-cutanée, puis un gavage quotidien pendant deux semaines et des injections intrapéritonéales, quotidiennes ou réparties sur la semaine selon le traitement testé, avant un prélèvement de sang sous anesthésie le jour de sa mise à mort. Le porteur reconnaît que sur les trois semaines de l'expérience, les souris porteuses de tumeurs peuvent perdre du poids et montrer des signes de souffrance, immobilité, isolement, dos voûté, poil terni. L'objet est de comparer plusieurs traitements anti-angiogéniques associés à des immunothérapies afin de "mieux les prescrire", et l'atteinte d'un point limite qui ne peut pas être soulagé conduit à tuer l'animal avant la fin du protocole.

Objectifs

La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, est nécessaire au développement tumoral. Les cellules tumorales, ainsi que les cellules du microenvironnement tumoral produisent des facteurs favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au sein de la tumeur. Mais il a été observé que ces facteurs agissaient également sur le système immunitaire de souris porteuses de tumeurs et de patients atteints de cancer, et aboutissaient au blocage de la réponse immunitaire. Or, la réponse immunitaire contre la tumeur est nécessaire à l’élimination de celle-ci. Des traitements ciblant ces facteurs sont utilisés pour traiter certains cancers. Ils réduisent non seulement les vaisseaux sanguins au niveau de la tumeur mais aident également à améliorer la réponse immunitaire contre la tumeur. Ces traitements sont associés à des immunothérapies en particulier dans le cancer du rein résultant en une augmentation des effets anti-tumoraux observés. Plusieurs traitements ciblant la formation des vaisseaux sanguins sont actuellement associés à des immunothérapies sans avoir vraiment d’argument pour privilégier l’un de ces traitements. Il est important de comprendre l’impact de ces traitements sur la réponse immunitaire pour permettre de mieux les prescrire et de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra donc à la fois de faire progresser les connaissances concernant l’interaction entre l’angiogenèse (formation des vaisseaux sanguins) et la réponse immunitaire anti-tumorale et pour les patients atteints de cancer de mieux prescrire les traitements anti-angiogéniques en association avec des immunothérapies. Cette étude pourrait également permettre de proposer de nouvelles combinaisons d’anti-angiogéniques et d’immunothérapies.

Procédures

Injection sous-cutanée 1 fois au début de la procédure sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Gavage 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Injection intrapéritonéale 1 fois par jour tous les jours sur 2 semaines ou 2 ou 3 fois par semaine selon le traitement administré sur animaux vigiles ; durée totale du geste : 1-2 min Prélèvement de sang sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (durée totale environ 10 min puis mise à mort)

Impact sur les animaux

L’injection des cellules tumorales se fait par voie sous-cutanée. L’injection par voie sous-cutanée cause un stress et une douleur légère de courte durée. Le gavage cause un stress et une douleur légère de courte durée. L’injection par voie intra-péritonéale cause un stress et une douleur légère de courte durée. Les prélèvements de sang peuvent induire des douleurs légères et transitoires. Sur la durée entière de l’expérience (3 semaines environ), les souris avec des tumeurs peuvent perdre du poids ou présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude de la réponse immunitaire.

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est complexe, les modèles in vitro ne permettent pas de le mimer fidèlement. Les modèles organoïdes ne reproduisent pour l’instant pas la complexité du microenvironnement tumoral. Il est en effet possible de faire se développer de petites sphères de cellules tumorales in vitro, mais il est très difficile de faire se développer des vaisseaux sanguins et d’y ajouter les différentes populations immunitaires. Les cellules immunitaires survivent très mal dans ces conditions. La présence de la tumeur et le développement des vaisseaux sanguins vont modifier le microenvironnement tumoral en induisant en particulier le développement de cellules immunosuppressives. C’est ce développement et l’impact des traitements anti-angiogéniques sur ces processus que nous étudierons dans ce projet, ce qui ne peut donc se faire qu’in vivo. C’est pourquoi l’expérimentation utilisant un modèle animal mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral est indispensable. En parallèle à ce projet d’expérimentation animale, des expérimentations seront réalisées à partir de prélèvements humains (sanguins ou tumoraux).

Réduction

L'implantation des cellules tumorales est mise au point. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour le suivi de la croissance tumorale. De nombreux outils sont disponibles pour analyser la réponse immunitaire chez la souris (en particulier des anticorps). D’autre part, les anti-angiogéniques utilisés dans ce protocole ont déjà été utilisés chez la souris et ont montré un impact sur la croissance tumorale. Des souris adultes à partir de 6-8 semaines seront utilisées car c’est à cet âge que le système immunitaire est complètement développé.

Pour vérifier chez la souris l'effet contre les tumeurs d'ARN thérapeutiques ciblant RBM39, observé jusqu'ici in vitro, 1 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules tumorales dans les flancs, elles subissent cinq à six séances d'imagerie de 30 minutes sous anesthésie, trois prises de sang derrière l'œil et des injections de traitement répétées trois à cinq fois, dans une veine, dans la tumeur ou dans l'abdomen. Le porteur prévoit une perte de poids, de la fatigue et une anémie liées aux tumeurs, et indique ne pas avoir encore évalué la toxicité des ARN. Il écrit que le "bien-être de l'animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences". Aucun point limite n'est décrit, et les analgésiques "pourront" être donnés "en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal".

Objectifs

Ce projet de recherche a pour but d'évaluer le potentiel antitumoral d’ARN thérapeutiques sur des modèles précliniques de cancer. Malgré de nombreuses avancées, en particulier avec l’arrivée des thérapies ciblées puis des immunothérapies, les thérapeutiques anticancéreuses actuellement disponibles restent limitées et des résistances émergent le plus souvent, nécessitant un changement de stratégie thérapeutiques. Il est donc essentiel de développer des nouveaux traitements, dont les mécanismes d’actions seraient différents des traitements actuellement utilisés, afin d’élargir le spectre des options thérapeutiques ais également de pouvoir adapter le traitement au patient et aux caractéristiques biologiques et moléculaires tumorales. Les arylsulfonamides sont une classe de drogue dont l’intérêt pour le traitement des cancers a été évalué. Nous avons récemment développé une approche thérapeutique via des ARN thérapeutiques, et avons fait la preuve de concept in vitro de leur activité antitumorale. Nous souhaitons donc avec ce projet valider nos observations in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l'utilisation d'ARN thérapeutiques pour le traitement des cancers, en particulier le cancer colorectal. A plus long terme, ce projet pourrait aboutir au développement en clinique de ces mêmes ARN thérapeutiques.

Procédures

- Greffe de cellules tumorales sous-cutanée dans les flancs : Durée 10 minutes - 1 fois par animal / Injection intrapéritonéale de luciferine pour bioluminescence : Durée 1 minute - 5 à 6 fois par animal - Anesthésie gazeuse durant l'imagerie : Durée 30 minute - 5 à 6 fois par animal / Prélèvements sanguins retroorbitaires - Durée 2 minutes - 3 fois par animal / Injection de traitements par voie IV - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intratumorale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal / Injection de traitements par voie intrapéritonéale - Durée 2 minutes - 3 à 5 fois par animal

Impact sur les animaux

La greffe de lignées cellulaires tumorales, suivi de la croissance des tumeurs, engendreront une altération de l'état général des animaux avec perte de poids, fatigue, et anémie principalement. Le traitement par indisulam pourrait engendrer certaines toxicités, même si la littérature décrit des toxicités systémiques limitées chez l'homme et la souris (rares anémies). Nous n'avons pas encore évalué la toxicité potentielle des ARN thérapeutiques, mais celle-ci sera évaluée grâce aux expériences de mise au point.

Devenir

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie. Afin de caractériser l'effet de nos traitements; nottament l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non non traités. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie sysématique de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indidspensable pour évaluer les effets antitumoraux mais également la toxicité des traitements testés.

Remplacement

Des tests sur des cellules tumorales et des cellules normales en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de nos traitements. Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action du traitement dans un organisme entier proche de l'homme, incluant des paramètres comme le développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques etc. qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.

Réduction

Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux, nous utiliserons les mêmes animaux pour évaluer à la fois la prise et la croissance tumorale, la dose des traitements et leur toxicité. Nous utiliserons également les mêmes souris pour nos contrôles positifs et négatifs dès que ce sera possible. Cette association nous permet de réduire le nombre de souris contrôles utilisées. Le nombre d’animaux par lot sera également réduit au maximum afin d’avoir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Des enrichissements (maisons rouges) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, de la nourriture humidifiée sera accessible directement dans la cage pour éviter la déshydratation des souris. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant les injections, et lors de la phase de réveil. Des injections d'analgésique pré et postopératoire pourront être réalisées en fonction de l'expérience et de la souffrance de l'animal. Un suivi attentif quotidien par du personnel compétent et formé, weekend compris, sera également mis en place. L'environnement des animaux sera enrichi par des tunnels en polycarbonate. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature pour ce type d'éxpérimentation. Nous utiliserons des lignées génétiquement modifiée immunodéprimées afin de permettre la bonne prise tumorale des xénogreffes de cellules humaines. L'utilisation d'un modèle syngénique nous permettra de valdier nos observations dans un système immunocompétent ce qui est essentiel pour envisager un dévellopement chez l'homme par la suite. Comme ce qui est classiquement décrit dans littérature pour ce type d'expérimentation, les animaux utilisés seront de 8 à 12 semaines.

Après une injection de cellules tumorales sous la peau puis d'une molécule marquée dans une veine, 280 souris immunodéficientes sont toutes tuées pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs tumeurs sont mesurées trois fois par semaine sous anesthésie gazeuse, et chaque souris subit quatre observations à travers la peau et une prise de sang, ou sept pour 40 d'entre elles. Le projet suit la distribution dans l'organisme de huit nouvelles molécules destinées au diagnostic ou au traitement de cancers du poumon, du sein et du feuillet qui enveloppe la cage thoracique. Le porteur décrit chaque injection comme "brève (30 secondes)", et prévoit ailleurs "une souffrance et/ou une nécrose occasionnée par le développement tumoral".

Objectifs

L’objectif du projet est de quantifier et d’analyser, au sein de l’organisme entier et plus spécifiquement au sein de la tumeur, la distribution de huit nouvelles molécules innovantes issues de travaux menés au laboratoire pour le diagnostic et/ou le traitement de cancers pulmonaires, de cancers du feuillet enveloppant la cage thoracique et de cancers du sein. La caractérisation de ces nouvelles molécules ou de leur distribution au sein des tissus ou d’un organisme entier est nécessaire afin de s’assurer que ces molécules, après leur administration, soient bien adressées vers les cellules cancéreuses qu’elles ciblent privilégiement.

Bénéfices attendus

Les études de distribution dans les tissus, et plus spécifiquement dans la tumeur, réalisées dans ce projet vont permettre de définir la spécificité des molécules testées pour leur cible biologique après que ces molécules auront été administrées par voie intraveineuse au sein d’un organisme entier. La validation de la distribution tumorale de ces nouvelles molécules fera de ces molécules une solution prometteuse pour le diagnostic et/ou le traitement des cancers qu’elles ciblent.

Procédures

Une seule brève (30 secondes) injection sous-cutanée de cellules tumorales sur animal anesthésié par voie gazeuse. Une seule brève (30 secondes) injection intraveineuse de molécule d’intérêt sur animal anesthésié par voie gazeuse. Des mesures de la taille des tumeurs sous-cutanées réalisées 3 fois par semaine (2 minutes) sur animal anesthésié par voie gazeuse. Quatre observations à travers la peau pendant 5 minutes sur animal anesthésié par voie gazeuse. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sous une anesthésie gazeuse, sauf pour 40 animaux du projet où 7 prélèvements d’un tout petit volume de sang (1 minute) seront réalisés sur animal anesthésié par voie gazeuse.

Impact sur les animaux

Les procédures seront réalisées chez des souris immunodéficientes qui constituent des lignées à phénotype dommageable, c’est-à-dire des lignées dans lesquelles l'état général des animaux est altéré s’ils sont exposés à des agents infectieux. Les effets indésirables attendus lors de l’étude sont une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injections, une souffrance et/ou une nécrose occasionnée par le développement tumoral, une perte de sang lors de prélèvements et un stress dû aux manipulations des animaux pendant les procédures expérimentales.

Devenir

L’étude de la biodistribution des molécules d’intérêt au sein des tissus tumoraux nécessite de prélever les organes des animaux qui doivent donc être euthanasiés. Il n’existe pas d’autre méthode d’imagerie qui permette d’étudier cette biodistribution sur des temps longs.

Remplacement

L’étude de la biodistribution des molécules au sein des tissus tumoraux nécessite de prélever les organes et il n’existe pas d’autre méthode d’imagerie qui le permette sur des temps aussi longs. La caractérisation de ces molécules au sein d’un organisme entier est donc nécessaire. De plus, nous avons opéré une pré-sélection chimique et pharmacologique in vitro de chacune des molécules innovantes analysées in vivo dans ce projet qui sont destinées au diagnostic et/ou au traitement de cancers chez l’Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux : - Chaque procédure sera réalisée sur le plus petit nombre d’animaux par groupe déterminé via l’utilisation d’une application calculant les tailles d'échantillons nécessaires. - Les procédures ont pour but d’observer la distribution des molécules au sein de la tumeur. Les résultats seront considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par sexe et par groupe. - Une seule dose des molécules testées a été sélectionnée grâce à des analyses bibliographiques et des expériences in vitro. - Nous utilisons des modèles tumoraux qui ont déjà été décrits et mis au point par nos collègues chez la souris immunodéprimée ce qui permet de ne pas réaliser de tests de développement de tumeur chez des animaux supplémentaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi comprenant des maisons et des tunnels en carton, de la paille ou du mouchoirs en papier pour leur nid, et des bâtonnets en bois à ronger. Les animaux seront hébergés au minimum 7 jours à l’animalerie avant d’entrer en procédure. Une surveillance quotidienne des animaux est assurée par des personnes habilitées et formées. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs à l’injection unique sous-cutanée de cellules tumorales et à l’injection unique intraveineuse de la molécule testée, ces deux injections seront réalisées pour chaque animal dans une pièce au calme sans passage et sous une anesthésie gazeuse. Un suivi attentif de l’évolution de la taille de la tumeur sera mené trois fois par semaine. Un suivi attentif de l’apparence de la tumeur sera aussi mené trois fois par semaine afin de déceler toute apparition d’une éventuelle nécrose. Les animaux seront observés attentivement trois fois par semaine. Des paramètres ont été définis permettant de prendre les décisions adéquates en cas de suspicion de douleur ou souffrance. Chaque animal sera sous une surveillance accrue durant les 24 heures après l’administration de la molécule afin de déceler tout comportement anormal ou tous signes éventuels de douleur ou souffrance. Tout animal présentant des signes de douleur ou souffrance sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est une espèce pertinente dans les études de biodistribution des molécules. Nous utiliserons des souris immunodéprimées, ce qui facilite l’implantation de cellules tumorales et le suivi dans la tumeur des molécules. Nous sélectionnerons des animaux adultes car les molécules testées dans ce projet sont destinées à des études cliniques chez des patients adultes.

Pour amener sur le marché une association d'un antidépresseur et d'un activateur de transporteur du chlore contre les douleurs neuropathiques, 1 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un diabète de type 1 leur est provoqué par une injection de streptozotocine, avec l'hyperglycémie et ses conséquences, soif et miction excessives, faim permanente, et une mortalité de 10 % que le porteur intègre d'avance dans son calcul d'effectif. Suivent des gavages quotidiens pendant sept jours, une goutte de sang prélevée à la queue tous les trois jours, et des tests de sensibilité mécanique par filaments et de sensibilité thermique décrits comme produisant un stimulus douloureux. L'équipe indique avoir déjà validé cette combinaison chez la souris sur un autre modèle de douleur, par ligature du nerf sciatique, et attend de la nouvelle série qu'elle "pourrait apporter une vraie alternative" aux patients diabétiques.

Objectifs

Les douleurs neuropathiques sont secondaires à une atteinte du système nerveux (central ou périphérique), c’est‐à‐dire touchant le cerveau, la moelle épinière ou les nerfs. Le besoin médical est fort dans la prise en charge des douleurs neuropathiques. L’approche thérapeutique proposée se base principalement sur l’administration en première intention de certains antiépileptiques et de certains antidépresseurs. Néanmoins, ces traitements ne sont pas efficaces pour l’ensemble des patients, ainsi les patients atteints de neuropathie diabétique sont pour la plus grande majorité dans une impasse thérapeutique et voient leur qualité de vie considérablement altérée. Le projet vise donc à amener sur le marché un nouveau traitement pour soulager les douleurs neuropathiques pour lesquelles les traitements existants présentent une efficacité très modeste et occasionnent des effets secondaires importants. Cette combinaison médicamenteuse a déjà été validée par notre équipe de recherche chez le modèle neuropathique périphérique de souris qui consiste en une ligature du nerf sciatique. Il est basé sur l’association d’un antidepresseur particulier déjà utilisée chez le patient souffrant de douleur (inhibiteur sélectif permettant l'augmentation de l'effet de la sérotonine) avec une autre molécule favorisant le transport du chlore. Cette combinaison sera administrée par voie orale chez un modèle préclinique de neuropathie diabétique chez la souris.

Bénéfices attendus

Nous avons déjà montré chez la souris atteinte de douleur neuropathique périphérique que le traitement constitué de deux molécules: un antidépresseur et un activateur des transporteurs au chlore est efficace sur les symptômes de douleur évoqués ainsi que sur l’état de bien‐être général des souris. L'objectif de cette étude est que ce traitement pourrait apporter une vraie alternative aux thérapeutiques actuelles pour un effet synergique et de longue durée limitant le nombre de prise médicamenteuse sur les types de douleurs neuropathiques comme celles induites chez le patient diabétique.

Procédures

Pour l’étude aigue, les animaux recevront : -une seule injection intrapéritonéale d’un antibiotique afin d'induire un diabète (30s) sur animal vigile. -des prélèvements sanguins (petite incision au niveau de la queue) tous les 3 jours. - des tests de sensibilité mécanique et thermique avant la mise en place du modèle et 3, 6, 9, 12 et 15 jours après l'injection. Les animaux sont testés avec les différents filaments sur les 2 pattes arrières et le comportement dure environ 10 min. Une fois le seuil d’hypersensibilité (due à l’injection de STZ) atteint, les animaux sont testés 1h30, 24h et 48h après le gavage oral lors du protocole aigu. - un seul gavage afin de donner le traitement puis tests comportementaux 1h30, 24h et 48h après celui-ci. Pour l’étude chronique, les animaux recevront : - Injection intrapéritonéale de STZ : 1 seule injection, durée 30 sec, animal vigile - Comportement : tests de douleurs mecaniques et thermiques tous les 3 jours pendant 10 min par test jusqu'à obtention du modèle puis 1h30 après le gavage, tous les jours pendant 7 jours. - Gavage : 1 fois par jour pendant 7 jours consécutifs - Prélèvement sanguin : une goutte de sang prélevée au noveau de la queue de l’animal tous les 3 jours.

Impact sur les animaux

Le modèle de la souris rendue diabétique par la streptozocine reproduit un diabète de type 1 et les symptômes habituels de douleur évoquée. L'hyperglycémie sera accompagnée d’une polydipsie, d’une polyurie et d’une polyphagie. Les animaux seront gavés, il est donc important de bien surveiller les signes cliniques de l’animal suite à l’exécution du gavage (détresse respiratoire, reflux). La glycémie sera relevée quotidiennement en prélevant une goutte de sang au niveau de la queue de l'animal. Les différents tests utilisés sont des tests produisant un stilmulus douloureux, les animaux subiront donc des effets douloureux.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de l'expérimentation

Remplacement

Seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et des mesures de la glycémie. De plus, si la perception de la douleur n’est plus remise en doute chez les organismes vertébrés, elle est sujet à débat chez les invertébrés, par exemple chez les insectes ou le nematode.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique. Ainsi, un nombre d’animaux par traitement a été fixé (1) en se référant à des publications du domaine, (2) en prenant en compte la variabilité que nous retrouvons habituellement dans le comportement d’intérêt et (3) en prenant en compte une mortalité possible de 10% due à l'injection de streptozotocine. Nous évaluons donc 14 souris par traitement et par sexe. La streptozotocine pouvant induire une mortalité de 10%, nous utilserons 15 souris par traitement et par sexe.

Raffinement

Les souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (3 à 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont l'organisation structurale du réseau neuronal a de fortes ressemblances avec celui de l'homme. De plus, l'utilisation de souris permettra d'analyser nos résultats en se basant sur les données de la littérature de façon plus pertinente. Les souris utilisées seront des souris adultes de 2 à 6 mois. Cet âge constitue une période de stabilité durant laquelle on considère que le développement est achevé et les effets liés au vieillissement est minimum.