Souris
Impact de la pré immunisation dans l’évaluation de virus oncolytiques dans des modèles murins en oncologie.
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris de ce projet sont d'abord immunisées contre le virus qu'on leur injectera ensuite, afin de vérifier que ce virus reste efficace face à leurs anticorps. 2 736 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester jusqu'à quarante virus oncolytiques. Elles portent une tumeur greffée, reçoivent jusqu'à trois injections de virus espacées de trente heures, une substance antitumorale jusqu'à cinq fois par semaine pendant trois semaines, et subissent jusqu'à dix-neuf prises de sang alors qu'elles sont éveillées. Le porteur décrit des ulcérations et des nécroses de tumeurs sur le flanc, une ascite possible et des fausses routes au gavage, et indique que ces souris ne peuvent être ni réutilisées, ni replacées, ni adoptées à cause des virus qu'elles portent.
Objectifs
Le but du projet est d’évaluer l’impact d’une pré immunisation sur l’efficacité thérapeutique de virus oncolytiques exprimant différents gènes thérapeutiques dans des modèles murins. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer leur réplication dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi limiter sa toxicité. Ce projet vise à évaluer la possibilité de la multi administration du candidat-médicament (virus oncolytique) afin de s’assurer qu’aucune résistance n’est observée lors des injections répétées qui pourraient être faites aux patients. Aussi la pré immunisation nous permet d’évaluer le comportement de nos virus aux anticorps neutralisants. Le projet ciblera toutes les indications de cancers à tumeurs solides pour lesquelles il y a un fort besoin médical en clinique humaine. Ces modèles sont classiquement utilisés in vitro et in vivo dans notre laboratoire et proviennent généralement de centre de ressources biologiques. Le projet se propose d’explorer dans les modèles murins les combinaisons de ces virus avec des agents de chimiothérapies standards ou d’immunothérapie utilisés en clinique humaine. Dans nos modèles alternatifs, nous avons démontré que nos virus oncolytiques avaient une meilleure efficacité que les traitements standards. Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons la biodistribution et l’efficacité thérapeutique avec ou sans substances à activité anti-tumorale en présence ou non de pré-immunisation. Tout au long du projet, 40 virus pourront être testés.
Bénéfices attendus
Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés pour valider les candidats les plus prometteurs issus des études alternatives cellulaires. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. Si une efficacité thérapeutique est observée même en présence d’une pré immunisation, cela indiquerait que nos virus sont peu sensibles aux anticorps neutralisants et pourraient en phase clinique être administrés en doses multiples aux patients avec un bénéfice thérapeutique augmenté.
Procédures
Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une injection de virus sur animal vigile puis implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang sur animal vigile (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 19 prélèvements). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Une fausse route peut être observée lors du gavage. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans les points limites.
Devenir
Toutes les souris inclues dans la biodistribution et l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles tumoraux et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à l’immunité, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.
Réduction
La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux). Il est prévu l’utilisation de 2736 souris pour l’évaluation de nos virus.
Raffinement
Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/innocuité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. Des précédents dossiers déposés et approuvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Durant toute l'étude, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton, tunnel de change, balançoire) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation à leur nouvel environnement et d’habituation aux gestes de deux semaines sera respectée avant de démarrer un protocole pour diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Cette habituation se fera au moins 3 fois dans la semaine : tous les gestes techniques non invasifs (sans aucune piqure ou injection) prévus lors de la procédure seront effectués (par exemple : maintien de la souris en contention manuelle, mise en boite de contention et frottement au niveau de la queue, …). Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. L’implantation des cellules, l’injection des virus et l’administration des substances à activité anti tumorale s’effectueront sur animal vigile. Une anesthésie légère est prévue lors de l’injection des cellules en intra péritonéale ainsi que dans le cas de la mesure de bioluminescence. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, un tapis chauffant sera utilisé. Le prélèvement de sang terminal se fera sous anesthésie et analgésie. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.
Choix des espèces
Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 9 semaines lors du début de la procédure (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).
Amélioration de l’efficacité de la transplantation d’îlots pancréatiques chez la souris diabétique par traitement pharmacologique de pancréas issus de donneurs d’une espèce différente.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et celles qui reçoivent une greffe peuvent subir sept prises de sang en quatre heures, à quatre reprises, et une goutte de sang prélevée à la queue deux fois par semaine pendant dix semaines. Ces souris diabétiques sont opérées de l'abdomen sous anesthésie pendant 20 à 30 minutes pour recevoir dans la veine porte du foie des îlots pancréatiques de souris, de porc ou d'origine humaine, traités par un inhibiteur de la traduction des protéines. Une partie d'entre elles a d'abord été irradiée, puis anesthésiée pour une injection intraveineuse destinée à reconstituer un système immunitaire de souris ou humain. Toutes sont tuées pour analyser leur foie. Le porteur évoque du stress, de l'"angoisse" et des douleurs liées aux contentions répétées, ainsi que des complications chirurgicales qu'il dit "rares", sans dire ce qui place ces procédures au niveau sévère.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune se manifestant par une destruction sélective des cellules du pancréas qui sécrètent l’insuline (cellules beta) par les cellules immunitaires. Cela cause une diminution de la production d’insuline menant à une hyperglycémie. À ce jour, l’injection régulière d’insuline est largement pratiquée mais peut-être limitée par le risque d’hypoglycémie, ou de maladie chronique rénale associée. Alternativement, des ilots pancréatiques qui contiennent les cellules beta peuvent être préparés à partir de pancréas de donneurs décédés et être injectés (greffés) dans la veine « porte » des patients présentant un DT1 pour pouvoir se loger dans le foie. Ce type de greffe entre personnes différentes nécessitent donc un traitement immunosuppresseur à vie du patient receveur, problème d’autant plus important pour la greffe d’ilots qui doit être reproduite 3 fois pour un même patient. Ces greffes d’ilots ont fourni des résultats cliniques spectaculaires et sont maintenant autorisées par la Haute Autorité de Santé, mais reste freinées par la rareté des donneurs, le faible nombre d’îlots que l’on peut récolter d’un pancréas et le risque de rejet lié au système immunitaire du patient. Nous avons pu démontrer que le traitement du pancréas de souris par un inhibiteur de la traduction des protéines permettait d’augmenter la qualité des ilots récupérés à partir d’un pancréas. Ainsi, dans des expériences de transplantation d’ilots pancréatiques entre souris de même souche (pour éviter le rejet de greffe), nous avons démontré que les ilots qui étaient traités avec notre molécule pendant leur préparation permettaient de traiter le diabète des souris de manière beaucoup plus efficace que des ilots préparés sans la molécule. Notre objectif dans ce nouveau projet est de démontrer l’efficacité de notre approche dans des conditions où les ilots peuvent être rejetés. Pour cela, nous préparerons des ilots pancréatiques de souris, de porc et issus de pancréas humains et nous les grefferons dans des souris diabétiques présentant un système immunitaire fonctionnel de souris ou humain (souris dites humanisées). Nous utiliserons une procédure de greffe utilisée en clinique (transplantation dans la grosse veine « porte » du foie) et des traitements immunosuppresseurs limitant le rejet. Cela nous permettra d’obtenir les dernières données nécessaires pour envisager un passage en clinique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet fourniront les bases pour transposer notre procédure de préparation d'ilots pancréatiques en clinique humaine pour le traitement du diabète de type I, ce qui permettra d'augmenter le nombre d'îlots disponible à la greffe et en plus avec une meilleure efficacité par rapport au protocoles actuels. Grâce à cela, beaucoup plus de patients présentant un diabète de type 1 pourraient recevoir ces ilots et cela pourrait même être proposé à d'autres types de patients comme ceux ayant subit une pancréatectomie.
Procédures
Les interventions sont présentées selon l’ordre chronologique. Pour la reconstitution du système immunitaire: (1) 1 irradiation (1 minute) entre 4 et 6 semaines d’âge. (2) 1 injection intraveineuse (10-15 secondes) sur animaux anesthésiés 48h après "(1)". (3) 4 prélèvements sanguins (10-15 secondes/prise) à 0, 4, 12 et 16 semaines après "(2)". Pour le transfert des îlots: (1) 2 injections intraperitonéales (5-10 secondes) à 1 semaine d’écart. (2) 1 semaine après la deuxième injection, chirurgie abdominale sur animaux anesthésiés (20-30 minutes). (3) à 2, 4, 6 et 8 semaines après la chirurgie, 7 prises de sang (goutte à la queue) sur une durée de 4 heures sur souris vigile (10-15 second par prise). (4) 4 prises de sang effectuées sur souris vigile au niveau de leur mandibule, seront réalisées dans la semaine de la chirurgie et 1, 3, 6 et 8 semaines après celle-ci (10-15 second par prise). (5) 1 goutte de sang obtenue par une piqure au niveau de la queue sur souris vigile (10-15 second par prise) 2 fois par semaine pendant 10 semaines. A noter que les prises de sang réalisée en "(3)" et "(4)" seront également utilisées pour le suivi hebdomadaire "(5)".
Impact sur les animaux
Les nuisances et complications éventuelles de la procédure incluent : (1) Stress et angoisse, voire des douleurs, liées aux contentions multiples auxquelles s’additionnent les actions d’injections et de prélèvements sanguins. (2) Des complications éventuelles peuvent survenir au cours et après la procédure chirurgicale et, notamment une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site de la greffe ou du site de l'injection. Ces complications sont rares (
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyser histologiquement le foie à fin d'évaluer la taille et la qualité des îlots greffés, ainsi que la récupération métabolique de l’animal.
Remplacement
De nombreuses études en utilisant des lignées cellulaires et des îlots primaires isolés de souris nous ont permis 1) d'établir la concentration optimale du produit pour obtenir la meilleure survie et fonctionnalité des îlots pancréatiques, 2) de démontrer la capacité de notre composé à protéger les îlots en culture des phénomènes de manque d'oxygène et 3) d'établir les mécanismes mis en jeu. Toutes ces étapes d'optimisation ont été effectuées in vitro avec un nombre très limité d'îlots par rapport aux expériences de transplantation. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’existait pour aller plus loin dans notre étude et démontrer l'efficacité de notre approche pour soigner le diabète de type 1. Ainsi, d’autres études préalables à ce projet ont permis de montrer l’efficacité de notre approche pour normaliser la glycémie de souris diabétiques quand des ilots traités par notre molécule sont greffés au niveau de la capsule rénale ou de la veine porte de souris diabétique de la même souche. Néanmoins, à cette étape du projet et comme aucune méthode alternative n'existe pour reproduire la complexité cellulaire d'un ilot pancréatique, ni pour reproduire la réponse inflammatoire multiple et spécifique du rejet de greffe au niveau de la veine porte et du foie, nous sommes obligés de déterminer maintenant in vivo 1) l'efficacité de la procédure dans un environnement ou le rejet de greffe est possible et 2) à déterminer l'efficacité de la procédure quand les ilots sont d'origine porcine ou humaine.
Réduction
Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. A noter, l'effet de notre molécule sur la qualité des ilots de porcs et humains sera évaluée in vitro avant de réaliser les expériences de greffes, pour n’utiliser que des conditions optimales de récupération fonctionnelle. Le nombre de souris utilisées dans l'étude est strictement calculé pour obtenir des résultats statistiquement concluants, tout en réduisant au maximum le nombre de souris nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 4 ou 5 selon leur poids et en milieu enrichi. Ils seront surveillés quotidiennement (comportement, apparence, signes cliniques) par le personnel animalier d'une part, et par les personnes en charge de l'expérimentation d'autre part. Toute apparition de signes de douleur tels que prostration, dos vouté, isolement et poil hérissé entrainera l’ouverture d’une fiche de score avec des points limites bien définis. Une attention particulière sera portée aux points d’injection, au suivi des souris diabétiques (poids, glycémie) et à la zone de chirurgie pour les animaux transplantés. Lors des chirurgies, les animaux sont injectés au moment de l’anesthésie avec de la solution saline pour prévenir la déshydratation et un analgésique pour prévenir au mieux les douleurs inhérentes à la procédure de chirurgie. L’ensemble de la procédure de chirurgie est réalisée sur tapis chauffant et avec un champ opératoire et une désinfection préalable et post-chirurgie avec un antiseptique.
Choix des espèces
Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude, car la complexité du système immunitaire ne peut être récapitulée in vitro. Cette étude de transplantation est essentielle pour étudier in vivo le comportement de nos ilots vis-à-vis du système immunitaire humain. Cette étape est primordiale avant de pouvoir proposer notre approche aux procédures cliniques. De plus, l’ensemble des protocoles pour cette espèce est maîtrisé par les opérateurs et les outils de suivi et d’analyses sont déjà disponibles. Les animaux entreront dans la procédure entre 6 et 8 semaines, la période la plus efficace pour l’irradiation et la reconstitution du système immunitaire. Cet âge permet aussi d'obtenir un nombre optimal d'ilots par pancréas.
Etude de l’activité neuronale in vivo sur l’animal en comportement
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une craniotomie de deux heures permet d'injecter un virus dans le cerveau puis d'y implanter une puce et une fibre optique, après une biopsie de la queue le jour de la naissance. 2 158 souris vont être utilisées, toutes tuées sous anesthésie profonde pour que leur cerveau soit analysé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte des mutations censées reproduire le retard mental, l'autisme ou la schizophrénie, une autre est exposée au THC ou au CBD avant la naissance ou juste après, l'objet étant de suivre l'activité de leurs réseaux de neurones pendant qu'elles se comportent, fibre au crâne. Le porteur annonce des tests des fonctions sociales, cognitives et émotionnelles répartis sur dix jours, dont il donne les durées à la minute sans nommer un seul de ces tests, et décrit les démangeaisons provoquées par les sutures du crâne comme un effet indésirable attendu.
Objectifs
Notre projet concerne l’étude des changements de l'organisation fonctionnelle des réseaux neuronaux dans des modèles murins de maladies neuropsychiatriques (retard mental, autisme et schizophrénie) et l’élucidation des mécanismes cellulaires de plasticité sous-jacents à cette réorganisation. La compréhension de ces mécanismes et de leur impact sur les comportements implique l'utilisation de modèles murins mutants qui reproduisent les altérations observées chez les patients souffrant de ces maladies et des modèles d’exposition in utéro ou néonatale aux cannabinoïdes qui sont les substances illicites (THC) ou légales (CBD) les plus utilisées par les femmes enceintes. Le projet incorporera l’utilisation d’animaux des deux sexes étant donné l’existence de différences sexuelles en ce qui concerne la vulnérabilité et la prévalence des troubles neuropsychiatriques et l’utilisation de cannabinoïdes à différentes périodes de la vie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance des facteurs génétiques et environnementaux dans l’émergence des maladies neuropsychiatriques. Il permettra de comprendre les mécanismes par lesquels les déficiences génétiques et les atteintes environnementales interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants de l’activité des réseaux neuronaux et du comportement. Les résultats issus de ce projet auront donc un fort impact en science fondamentale et dans le monde académique. Son caractère multidisciplinaire permettra des avancées significatives dans la compréhension de la santé mentale. A plus long terme, il serait envisageable de mener des études translationnelles pour relier les résultats des modèles animaux aux populations humaines.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) une biopsie caudale (quelques secondes), b) une chirurgie d'injection de virus et d’implantation (2 heures), c) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions sociale, cognitives et émotionnelles (à 4 âges différents selon la série suivante : Jour 1 à 3 : jour et nuit, Jour 6 : 20min, Jour 7 : 5 min, Jour 8 et 9 : 15 et 10 min, Jour 10 : 8 min). A la dernière étape du protocole expérimental, le cerveau sera prélevé post-mortem après une chirurgie terminale sous anesthésie pour analyser l’expression de différentes protéines dans les tissus.
Impact sur les animaux
Dans le cas d’animaux subissant l’ensemble d’une procédure, l’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants : - douleur légère de courte durée générée par la biopsie caudale - les douleurs post-opératoires lors du réveil post-chirurgical (craniotomie, implantation de la puce et de la fibre). Ces douleurs sont minorées par les soins post-opératoires et l’administration d’antalgiques. - le risque infectieux lié à l’intervention chirurgicale demeure extrêmement faible, car les chirurgies sont réalisées dans le strict respect des règles d’asepsie. - les démangeaisons pouvant être provoquées par les sutures de la peau du crâne - l’inconfort des animaux reliées à la fibre pendant le comportement.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux subissent une anesthésie profonde terminale pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels des défauts génétiques et les atteintes environnementales interagissent avec le sexe pour provoquer des changements durables et persistants dans l’activité des réseaux neuronaux et leur impact sur les comportements sociaux. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro n'est pas applicable pour ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés : - un même animal sera utilisé plusieurs fois pour différents tests au sein d’une même procédure et de façon longitudinale lorsque cela est possible. - nous déterminerons le nombre minimal d'animaux nécessaires pour atteindre une puissance statistique satisfaisante en utilisant préférentiellement les tests permettant de comparer deux groupes non-pairés ou plusieurs groupes de facteurs. - nous raffinerons nos pratiques d’élevage afin d’obtenir uniquement les génotypes d’intérêt. Il est essentiel de souligner que tous les animaux générés seront d’intérêt pour le projet, génotypes et sexes, et seront donc tous inclus dans les expériences.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement à différentes étapes des procédures. Stabulation : Dans les cages d’hébergement, les souris bénéficient d’enrichissement pour diminuer l’ennui, l’anxiété et favoriser le bien être : dômes cartonnés, ou tunnels en carton et/ mini-rouleaux de papier foisonnant. Outre l’enrichissement de l’environnement, cela permet de favoriser la nidification, de réduire l‘ennui, et d’augmenter le sentiment de sécurité. Suivant l’âge des animaux, la surface impartie dans la cage sera adaptée. Chirurgie : Chaque intervention invasive est effectuée sous analgésie et anesthésie. Lors de la chirurgie, les canules sont descendues et remontées très doucement pour réduire le traumatisme tissulaire. Les constantes biologiques et souffrance des animaux sont particulièrement surveillées dans les heures et jours suivant les interventions invasives afin de leur donner les soins post-opératoires nécessaires. Le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction de la situation (administration d’analgésiques, d’antalgiques ou euthanasie si l’animal n’est pas soulagé par les médications). Tests comportementaux : pour limiter le stress, les souris sont familiarisées avec la salle d'expérimentation, et sont manipulées par le même expérimentateur. La température de la salle d'expérimentation et de la chambre d’enregistrement sont maintenues constantes. Pendant l’enregistrement du comportement dans l’arène LMT, les souris ont eau et nourriture ad libitum. Les souris bénéficient d’enrichissement comprenant deux maisons et un tunnel en polycarbonate et de plusieurs cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle et diminuer l’ennui et le stress et faciliter la thermorégulation de l’animal et favoriser son bien-être.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour nos études car il présente une organisation des réseaux cérébraux et des réponses comportementales similaires à celles trouvés chez l’Humain. La souris est un modèle couramment utilisé en neurosciences, ce qui rend nos résultats pertinents pour une large communauté scientifique. Il existe également de très nombreux modèles de souris génétiquement modifiés qui reproduisent de manière très fidèle les pathologies neuropsychiatriques humaines. Une partie de nos expériences impose l’utilisation de souris modélisant le retard mental, l’autisme et de la schizophrénie. L’aspect neurodéveloppemental de notre projet, centré sur l’étude de l’activité des réseaux neuronaux et des comportements tout au long de la vie, nécessite l’utilisation de souris à différents stades postnataux : du stade périnatal jusqu’au stade adulte, ainsi que des animaux âgés.
Evaluation du risque de saignement de Fabs anti-plaquettaires dans des modèles de saignements intracérébraux et de leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de purpura thrombotique thrombocytopénique (EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 340 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 150 un niveau modéré. Un saignement est provoqué dans leur cerveau au cours d'une chirurgie de quarante-cinq minutes, suivie de cinq à dix injections, de quatre prises de sang en un mois, d'une IRM de vingt minutes et d'un transport entre deux établissements. Il s'agit de mesurer le risque hémorragique de deux anticorps antiplaquettaires et leur effet sur les micro-caillots, les cerveaux étant prélevés après la mise à mort pour quantifier le saignement. Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible" de remplacer la souris par de l'in vitro, quelques lignes après avoir indiqué que l'effet antithrombotique de ces mêmes anticorps a déjà été confirmé in vitro sur du sang humain.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans la thrombose, c’est-à-dire la formation d’un caillot, qui se développent dans une artère malade. La paroi de l’artère malade induit le recrutement de plaquettes et la formation du caillot, appelé thrombus. Ce phénomène peut aboutir à un accident vasculaire cérébral (AVC). Nous avons généré deux agents antiplaquettaires. Ils ont montré qu’ils empêchaient la formation de caillot dans un modèle in vitro. De plus, des modèles de saignement ont montré qu’ils augmentaient moins le saignement que les antiplaquettaires actuellement utilisés en clinique. Ces agents pourraient être utilisés dans le traitement des AVC. Les traitements antiplaquettaires actuels sont peu utilisés car ils présentent un risque de saignement trop important qui pourrait être fatal pour le patient. Les options thérapeutiques sont donc limitées. Les agents pourraient présenter moins de risque de saignement et donc être utilisés dans cette pathologie. Les agents pourraient également être utilisés dans le traitement du Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT). Les patients présentant cette pathologie ont des tout petits caillots dans les vaisseaux sanguins ainsi qu’une diminution des plaquettes due à leur consommation des plaquettes lors de la formation de ces caillots, conduisant à des saignements. Nos agents pourraient réduire les petits caillots sans augmenter les saignements chez les patients PTT. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer le risque de saignement des agents dans deux modèles de saignements cérébraux et leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de PTT. Les agents seront comparés à des traitements déjà utilisés en clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur 2 aspects : - AVC : les agents pourraient présenter un risque de saignement plus faible que les traitements antiplaquettaires classiques et donc représenter un nouveau traitement pour les patients présentant un AVC. - PTT : les agents pourraient réduire la formation de petits caillots chez les patients PTT sans augmenter le saignement, ce qui représenterait un nouveau traitement pour les patients PTT. Ce projet pourrait permettre à long terme de mieux traiter les patients présentant un AVC ou un PTT.
Procédures
Dans les modèles de saignements cérébraux, les animaux seront soumis à une chirurgie (45 min, EU1), à des injections (5 à 10, EU1), à des prélèvements de sang (4 sur 1 mois, EU1) et à un IRM (20 min, EU2). Dans le modèle PTT, les souris seront soumises à des injections (4, EU1) et à des prélèvements de sang (2, EU2).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur la respiration. Concernant les injections, on peut s’attendre à une douleur localisée. Le transport et les anesthésies pourront causer du stress. Le prélèvement de sang peut entrainer un saignement localisé de courte durée. On pourra observer des saignements au site d’incision lors de la chirurgie et, au réveil, on s'attend à un impact sur le comportement, l'apparence physique, la nutrition et la motricité ainsi qu’à des signes de douleur notamment au site chirurgical. Dans le modèle antigène – anticorps, on s’attend à des saignements en cas de blessure, à un impact sur le comportement et sur l’apparence physique.
Devenir
A l’issue de la procédure de saignement cérébraux et d’AVC, les animaux anesthésiés sont mis à mort afin de prélever les cerveaux pour quantifier le saignement cérébral. Dans la procédure de PTT, une grande quantité de sang est prélevée pour évaluer l’impact de nos agents sur le PTT, ce qui nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’agents dans des modèles de saignements cérébraux et de PTT. Dans les deux cas, le processus étudié est complexe et relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, pression artérielle, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus. Cependant, l’effet anti-thrombotique de nos agents a déjà été confirmé in vitro dans un modèle de perfusion de sang utilisant du sang humain de donneur sain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 20 à 45 souris/groupe pour la mise au point des modèles et à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats lors des expérimentations.
Raffinement
Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la contention d’une durée de 5 jours est prévue. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant chaque opération. • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal endormi • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local sur l’œil après les injections au niveau de l’oeil • Par injection de sérum physiologique avant les procédures chirurgicales afin d’assurer l’hydratation de l’animal. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant la forme humaine du récepteur plaquettaire ciblé, permettant d’étudier l’effet des agents sur les saignements cérébraux et dans le traitement du PTT. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.
Comprendre l’action de la toxine botulique administrée en péri-nerveux et évaluer son bénéfice dans un modèle murin de douleur neuropathique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
L'administration périnerveuse de toxine botulique est déjà en essai clinique chez des patients, et c'est son mécanisme d'action, resté inconnu, que ce projet cherche à établir chez la souris. 1 456 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses immunohistochimiques, 1 376 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 80 sous anesthésie sans réveil. Une chirurgie de dix minutes leur lèse un nerf, puis elles subissent jusqu'à vingt-trois tests d'évaluation de la douleur de dix minutes chacun, espacés de vingt-quatre heures. Le porteur écrit que chez certaines la douleur "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude", et présente les tests nociceptifs comme des épreuves sur lesquelles les souris "gardent le contrôle" en retirant la patte.
Objectifs
La douleur neuropathique est définie par comme « une douleur consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel ». En France, la prévalence de la douleur chronique est de 31,7 %, dont 6,9 % avec des caractéristiques neuropathiques. Elles restent sous diagnostiquées en général, affectant considérablement la qualité de vie des patients et engendrant des problèmes socio-économiques importants. Les recommandations françaises actuelles préconisent l’utilisation de traitements antidépresseur ou anticonvulsivant en première intention, avec cependant des réponses thérapeutiques souvent faibles et des effets indésirables notables. D’autres alternatives thérapeutiques semblent émerger et notamment la toxine botulique de type A (TBA). Récemment une nouvelle voie d’administration émergeante, l’administration périnerveuse de TBA autour du nerf impliqué dans la douleur neuropathique est aujourd’hui en essai clinique. Cependant, le mécanisme d’action de la TBA lorsqu’elle est administrée en périnerveux reste non élucidé. La TBA est normalement recaptée par des terminaisons nerveuses. Ainsi, l’objectif de ce projet vise à comprendre comment la TBA administrée au niveau du nerf est captée pour ensuite permettre une action dans les neurones, cela permettra de comprendre son mécanisme d’action dans cette application locale nouvelle. Nous évaluerons également dans notre modèle animal si l’administration de TBA en périnerveux permet de prévenir l’installation d’une douleur neuropathique ou permet son soulagement une fois cette dernière installée et quel est son mécanisme dans la cadre pathologie. Cela permettra de proposer un mécanisme et une validité afin de développer cette voie application nouvelle en clinique.
Bénéfices attendus
Nous postulons que la TBA administrée en périnerveux pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Cela laisse entrevoir une possibilité thérapeutique supplémentaire chez des patients douloureux chroniques dont l’arsenal thérapeutique actuel reste modeste. Cela pourrait apporter des preuves de concepts supplémentaires pour généraliser l'utilisation de la TBA en administration périnerveuse. De plus l’élucidation du mécanisme d’action de la TBA administrée en périnerveux pourrait également permettre révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, mais aussi d’en comprendre davantage sur la physiopathologie de la douleur neuropathique
Procédures
Chirurgie d'une durée de 10 minutes sur animal anesthésié et une injection sous anesthésie d'une durée de 5 minutes. Les animaux subiront au maximum 23 tests d'évaluation de la douleur d'une durée de 10 minutes avec un délai de 24h entre chacun. Tous les animaux subiront une chirurgie pour prélèvement terminal d'une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Chez certains animaux, il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux subiront des tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte). Un effet antidouleur de la toxine botulique A est attendu.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’action de la toxine botulique administrée en périnerveux dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. De plus, il n’existe pas d’études in vivo montrant la présence de nervi nervorum, les rares études décrivant cette structure étant faites par immunohistochimie sur tissus humain ou murin.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Les groupes expérimentaux concernant les expériences comportementales seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles. Pour les groupes expérimentaux concernant les analyses immunohistochimiques ils seront constitués au minimum de 4 animaux par groupe et au maximum de 10 selon les mises au point techniques nécessaires. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (habituation des animaux aux locaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
Etude de l’effet de gènes spécifiquement humains sur le développement des neurones et circuits neuronaux du cervelet aux échelles moléculaires et cellulaires
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Le ventre de souris gestantes est ouvert sous anesthésie pour injecter un gène humain dans le cerveau de leurs fœtus, suivi d'une électroporation de moins de quinze minutes. 910 souris vont être utilisées, mères, fœtus et nouveau-nés confondus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par une chirurgie terminale destinée à prélever le cerveau. L'objet est de savoir si treize gènes propres à l'espèce humaine modifient la forme et les connexions des neurones du cervelet, un protocole d'organoïdes cérébelleux humains existant depuis cette année mais restant, selon le porteur, à optimiser. Chez les mères, il décrit des douleurs après l'opération, une infection possible de la plaie et une rupture des points de suture qui constituerait un point limite, chez les fœtus une rare interruption de gestation, et chez les souriceaux une simple "gêne légère et momentanée".
Objectifs
L’espèce humaine présente des caractéristiques cognitives supérieures qui ont été en partie liées à l’évolution du cortex cérébral. Mais l’implication des autres régions du cerveau, comme le cervelet, reste largement inexplorée malgré son association avec les fonctions cognitives supérieures (comme le langage) et les troubles cognitifs (comme l’autisme et la dyslexie). De plus, le cervelet humain présente des caractéristiques divergentes par rapport à d’autres espèces, aux niveaux anatomique, fonctionnel et comportemental, dont les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents sont inconnus. Les mécanismes moléculaires qui participent à l’évolution des neurones et circuits neuronaux reposent en partie sur des gènes dupliqués spécifiquement humains (absents des génomes d’autres espèces) ou des gènes spécifiquement exprimés chez l’humain (expression absente chez les autres espèces). Le rôle de cette étude est d’étudier l’effet de ces innovations moléculaires sur le développement des neurones et circuits du cervelet. Nous avons une liste de 13 gènes candidats basés sur des données publiques d'expression de gènes au cours du développement dans le cervelet humain et non chez la souris et l’opossum. Pour étudier un effet fonctionnel de ces gènes, nous devons faire des expériences de gain-de-fonction dans un cervelet de Mammifère, c'est-à-dire exprimer artificiellement un gène humain pour mimer son action . Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement (=dans l'arbre des espèces animales). De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les objectifs de cette études sont : 1) d’étudier, parmi les gènes d’intérêts, lesquels sont suffisants chez la souris pour altérer la morphologie des neurones du cervelet, leur connectivité neuronale ainsi que sur la vitesse de maturation des neurones, 2) d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents pour les 3 gènes candidats dont l’effet sera le plus flagrant.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les effets de gènes spécifiquement humains dans le développement du cervelet de Mammifère. Cela permettra d’ouvrir un nouveau champ de l’évolution du système nerveux humain, en dehors du cortex cérébral. A plus long terme, les résultats pourraient mettre en évidence une sensibilité propre à notre espèce à certains troubles cognitifs (spectre autistique), moteurs (ataxie cérébelleuse) ou encore la dyslexie. Ils pourraient aussi ouvrir de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces troubles.
Procédures
Procédure 1: laparotomie sous anesthésie générale de la mère suivie d'injection ventriculaire cérébrale sur foetus suivie d'une électroporation (
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sur les animaux sont : - chez la mère : de rares problèmes post-opératoires comme des douleurs (associées à une perte de poids ou un état de prostration), l’infection de la plaie, ou une rupture des points de suture, qui constituraient un point limite. - chez le fœtus : une rare interruption de la gestation. - chez le souriceau : une gène légère et momentanée au point d'injection.
Devenir
Tous les animaux seront utilisés pour les procédures décrites.
Remplacement
Une première alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait l’utilisation d’une autre espèce de Vertébré tel que le poisson zèbre, qui possède également un cervelet. Cependant l’organisation et le développement du cervelet chez les Vertébrés non-Mammifères sont trop divergentes comparé aux Mammifères pour pouvoir interpréter nos expériences de gain de fonction. Une autre option alternative à l’approche expérimentale décrite dans ce projet serait la culture in vitro de cellules souches de souris ou humaines, suivie d’une différentiation en organoïde cérébelleux. C’est une approche qui va être établie en parallèle dans notre laboratoire, pour laquelle un protocole existe depuis cette année pour les cellules humaines mais qui reste à être optimisé. En effet, ce type de culture ne permet pas à ce jour de récapituler l’ensemble des aspects anatomiques observés dans un cervelet in vivo (connectivité neuronale). De plus, ces approches ne permettent pas d’étudier des réseaux neuronaux dans un cervelet qui est intégré à un organisme in vivo, avec des stimulations sensorielles et un contrôle moteur, qui sont clefs dans la maturation neuronale cérébelleuse. De plus, ces approches in vitro manquent d'une composante critique que sont les fibres grimpantes qui proviennent d’une autre région du tronc cérébral, l’olive inférieure.
Réduction
Ce projet nécessitera au maximum 910 souris. Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. Dans nos différentes approches, nous voulons connaître l'effets de gènes humains sur le développement des neurones. Nous commencerons pour chaque gène candidat par 2 portées. Pour les gènes montrant des résultats flagrant, nous reproduirons nos résultats pour les confirmer et les consolider statistiquement. Cette approche permet de ne pas utiliser le nombre maximal de portées pour les gènes sans effet sur le développement neuronal (résultat négatif). Pour diminuer le nombre d'animaux, nous epxrimerons à chaque fois le gène di'intérêt dans la moitié des animaux de la portée, et une condition contrôle dans l'autre moitié. Ainsi, le nombre d’animaux a été estimé au plus juste de façon à répondre aux exigences pratiques et statistiques. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, avec un nombre maximal de 5 individus par cage, dans un environnement enrichi. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages quotidien. Soins spécifiques apportés à la mère gestante pendant la chirurgie : stéréllisation du champ opératoire, analgésie sous-cutanée et anesthésie locale avant l’opération suivies par une anesthésie par inhalation. Des analgésiques sont administrés en sous-cutané les jours qui suivent l'opération et la mère gestante est hébergée seule dans une cage enrichie jusqu'à la mise bas. La température des animaux est gardée constante grâce à un tapis chauffant jusqu’au réveil. La mère gestante ne retourne sur son portoir qu’une fois réveillé. Un suivi post-opératoire rapproché est effectué pendant les premières heures suivant l'opération puis le lendemain. Soins spécifiques apportés aux souriceaux pendant leur injection : le souriceau est anesthésié. puis est réchauffé avant de retrouver sa mère. Précautions pour l'injection intraventriculaire du foetus ou souriceau : une micropipette ultra mince est utilisée pour l’injection. Chaque procédure se termine par une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.
Choix des espèces
Le cervelet a une structure conservée entre les Mammifères, c’est pourquoi nous choisissons la souris comme modèle, comme Mammifère le plus éloigné de nous phylogénétiquement. De plus il s’agit d’une espèce pour laquelle le cervelet est très caractérisé d’un point de vue cellulaire, développemental, anatomique, et fonctionnel. Les animaux seront utilisés au stade embryonnaire et aux stades postnatals, aux étapes critiques du développement des neurones et des circuits.
Caractérisation de composés innovants anticancéreux dans des modèles de cancers orthotopiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
Des cellules tumorales sont implantées chirurgicalement dans le pancréas, le sein, les ovaires, le poumon, le colon ou le foie de 4 200 souris, dont les tumeurs sont ensuite suivies deux fois par semaine par imagerie sous anesthésie gazeuse. Toutes subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une injection intraveineuse par semaine pendant quarante-neuf jours et un prélèvement de sang hebdomadaire alors qu'elles sont éveillées. Le porteur annonce un acte chirurgical de cinq à dix minutes maximum par souris, puis décrit une "anesthésie longue" génératrice de douleurs après l'opération, et affirme que des tumeurs en trois dimensions et des organoïdes ont limité la phase animale "au stricte nécessaire", pour un candidat médicament testé par an. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient analysés, ou plus tôt dès qu'un point limite est atteint.
Objectifs
Durant ces dernières décennies, la recherche médicale a réalisé d’importants progrès en matière de prévention et de traitements des cancers, associés à la diminution de la mortalité. Néanmoins, l’incidence des cancers et leur létalité restent élevées. Le développement de traitements anti-cancéreux reste donc primordial. L’objectif principal de ce projet est de tester les candidats médicaments (à raison de un candidat/ an) dans plusieurs modèles de cancers touchant différents organes. Cette implantation de lignées de cellules tumorales est réalisée directement dans l’organe cible permettant ainsi d’avoir une efficacité optimale grâce à un microenvironnement tumoral plus pertinent. Des administrations, des suivis tumoraux et des prélèvements divers sont réalisés sur les animaux tout au long des procédures expérimentales. Cette caractérisation préclinique orthotopique est primordiale afin d’identifier les meilleurs schémas de traitement et de préparer au mieux les futurs essais cliniques avec ces nouveaux candidats médicaments anticancer. Les études se porteront sur les cancers suivants : les cancers du pancréas, du sein, des ovaires, du poumon, du colon et du foie.
Bénéfices attendus
Ces études représentent une phase essentielle dans l’estimation du bénéfice/ risque des nouveaux candidats médicaments développés pour le traitement du cancer. En cas de succès, ce projet envisagera d'essayer chez l'homme de nouvelles thérapies pour guerir le cancer.
Procédures
Différents protocoles expérimentaux sont réalisés faisant intervenir des gestes chirurgicaux. Ces derniers nécessitent une anesthésie générale, durée de l'acte chirurgical entre 5 et 10 minutes maximum par souris. Les injections des candidats médicaments sont administrées par voie intraveineuse (1 fois par semaine et ce pendant 49 jours) sur souris non anesthésiées (5 à 10 secondes par injection). Des prélèvements sanguins, 1 prélèvement par souris et par semaine (10 secondes par acte) sont effectués sur souris non anesthésiées. Les injections des différents traitements (les anesthésiques, les traitements de référence) se font respectivement en sous-cutanée et en intrapéritonéale (10 secondes par manipulation). L’imagerie par bioluminescence sera réalisée afin de suivre le développement tumoral, deux fois par semaine, souris sous anesthésie gazeuse, un maximum de 15 minutes d'acquisition. Le substrat de suivi de la luminescence est réalisé par voie intrapéritonéale (10 secondes par acte).
Impact sur les animaux
Les animaux subissent une anesthésie longue et une procédure chirurgicale, ce qui peut induire un inconfort voire des douleurs post-opératoires. Lors du suivi de croissance tumorale par bioluminescence, les animaux seront anesthésiés 2 fois par semaine (entre le lundi et le vendredi) ce qui pourrait engendrer du stress chez les animaux et un inconfort lié à la manipulation. La présence de tumeurs au niveau des organes cibles peut induire un inconfort, une douleur chez les animaux. Les manipulations des souris, les prises de sang effectuées ainsi que les injections de traitements répétés (IP ou gavage) peuvent induire un inconfort, une angoisse et des douleurs chez celles-ci.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses des organes principaux.
Remplacement
Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place pour permettre de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles pertinent et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet, l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir d'un dimensionnement statistique adapté, que les différents groupes contrôles permettent de conclure sur les effets potentiels du traitement et que les aléas liés au modèle sont pris en compte. Le nombre de souris correspond au nombre minimal requis pour avoir une différence significative de réponse biologique entre les différents groupes.
Raffinement
Le bien-être des animaux est analysé et est pris en compte tout au long des protocoles expérimentaux. Les critères concernant l'apparence, la mobilité et le comportement des animaux sont détaillés. Une phase d’observation post chirurgie et un suivi quotidien post traitement des animaux sont réalisés afin d’évaluer de leur état général. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques couvrant une longue période d’action (72h) ; mise en place d’une grille unique de score, description détaillée dans tous les protocoles. Suivi des animaux via une grille d’évaluation de la souffrance prenant en compte le poids, la croissance tumorale, le comportement et l’aspect de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies. La détermination des points limites et l’utilisation d’une grille de score permettent de réduire, supprimer ou soulager au maximum l'inconfort, la douleur et l'angoisse subies par les animaux. Dès l’atteinte d’un point limite, les animaux sont mis à mort selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Les effectifs ont été calculés à partir d'un dimensionnement statistique adapté, les différents groupes contrôles permettent de conclure sur les effets potentiels du traitement. Les aléas liés au modèle tumoral greffé sont pris en compte. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule. Ces souris jeunes adultes peuvent finir leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux le transport de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie.
Formation aux techniques de transgénèses et de cryoconservation chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 500
Quatre injections dans la même journée pour une rate, dont trois sous contention, avant une chirurgie de transfert d'embryons de cinq minutes. 500 souris et 500 rats vont être utilisés ainsi, 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 300 un niveau modéré, 900 tués à l'issue et 100 remis "dans le stock" pour être réutilisés. Ces gestes servent à former des techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants aux techniques de transgenèse et de cryoconservation, à raison de cinq sessions par an pendant cinq ans. Les femelles donneuses d'ovocytes sont prépubères, trois à quatre semaines pour les souris et cinq à six pour les rates, parce qu'elles "répondent mieux aux traitements hormonaux", et les femelles opérées sont tuées faute de pouvoir être réutilisées.
Objectifs
Notre institut a pour mission de créer des lignées de rats et de souris génétiquement modifiées et de les cryoconserver pour permettre leur pérennité et leur distribution aux chercheurs. Ces lignées génétiquement modifiées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Ces rongeurs, en tant que modèle de maladies humaines, vont également permettre de tester des médicaments et de valider (ou d’invalider) des cibles thérapeutiques. Notre objectif ici, est de former les gens de la communauté scientifiques aux activités expérimentales de transgénèses et de cryoconservation sur les rats et les souris, dans les conditions optimales. Ces formations pratiques sont destinées aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants de l'institut ou d'un centre partenaire. Notre établissement envisage de réaliser 5 formations maximum par an, soit environ 100 rats et 100 souris par an sur 5 ans. Le nombre d'animaux utilisés dépend directement du type de formation souhaitée. Pour certaines techniques, une vingtaine d'animaux seront nécessaires et pour d'autres seulement 5. Ces formations pratiques auront lieu sur demande directe des collaborateurs pour la technique souhaitée parmi celles proposées.
Bénéfices attendus
Etant un institut pilote et certifié pour nos activités, nous souhaitons transmettre nos savoir-faire et connaissances en transgénèse et cryoconservation sur nos modèles animaux, partager nos expériences et aussi permettre par la formation d'améliorer le bien-être animal et le raffinement des techniques qui seront mise en œuvre par d'autres membres de la communauté scientifique sur ce sujet. Ces formations sont destinées aux techniciens, ingénieurs, chercheurs et étudiants.
Procédures
1) Dans la première procédure, il s'agit de 2 injections d'hormones réalisées à 48h d'intervalle. Les injections sont réalisées sous simple contention rapide de 5 secondes, puis l'animal est relaché dans sa cage avec ses congénères. 2) Dans la seconde procédure, les rates seulement recevront une injection, sous simple contention rapide de 5 secondes, afin de synchroniser leur cycle pour devenir mères porteuses. 4 jours plus tard, les animaux recevrons une injection d'antidouleur sous simple contention rapide de 5 secondes, puis 40 minutes plus tard, ils seront anesthésiés par une autre injection, là encore sous simple contention rapide de 5 secondes. Une fois endormis, les animaux vont subir une petite chirugie de transfert d'embryons ou de sperme. La chirurgie dure environ 5 minutes. Juste après la chirugie, pendant que les animaux dorment encore, afin de limiter le stress, elles recevront un réhydratant et un anti-infammatoire en injectable. Ainsi, une rate recevra un total de 3 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie et 4 injections au total. Pour la souris, elle recevra 2 injections en contention rapide et une dernière lorsqu'elle sera endormie. Donc 3 injections au cours de la journée d'anesthésie/chirurgie au total. Les injections et chirurgies sont pratiquées ou encadrées par du personnel compétent et donc présentent un risque très limité pour l'animal.
Impact sur les animaux
Les injections (hormones diverses, anesthésique ou antalgique) sont réalisées sous contention rapide qui peut engendrer une légère douleur et un stress de courte durée. La chirurgie, d'une durée de 10 minutes maximum va engendrer une plaie chirurgicale qui pourra être à l'origine d'une douleur ou un inconfort temporaire pour l'animal. La prise en charge de la douleur va fortement limiter ces nuisances.
Devenir
Dans le première partie, il s'agit de femelles donneuses d'ovocytes ou d'embryons. Nous avons besoin de les mettre à mort pour collecter les ovocytes / embryons pour réaliser nos expérimentations dans le cadre de la formation. Les souris n'ayant pas été accouplées peuvent être réutilisées. Ceci vise à réduire le nombre d'animaux utilisés. De même, dans la seconde procédure, les animaux non utilisés en chirurgie sont remis dans le stock pour être réutilisés. Les femelles opérées seront mises à mort car nous ne pouvons pas les réutiliser.
Remplacement
Les rongeurs, principalement les rats et les souris représentent près de 90% des animaux utilisées en expérimentation animale. Ce sont de très bons modèles expérimentaux puisqu'ils possèdent une très forte homologie avec les gènes Humains et ont un taux de reproduction rapide . Il n'y a pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour la formation à la création de lignées transgéniques et leur cryoconservation.
Réduction
L'objectif de cette saisine est de nous permettre de former les personnes désireuses de le faire aux techniques expérimentales de transgénèses et de cryoconservations chez le rat et la souris. Dans ce projet, ne seront commandés dans des établissements éleveurs que les animaux que nous n'avons pas en stock pour les besoins de la formation. Il ne sera pas acheté de mâles spécifiquement pour les besoins de formation, nous nous servirons des animaux utilisés pour nos activités de service. Les femelles seront au maximum des animaux recyclés au sein de notre animalerie. Il n'y aura que peu de commandes spécialement dédiées aux formations. Notre établissement envisage de réaliser 3 formations par an, soit environ 100 rats et 100 souris par an (soit au maximum 1.000 animaux sur la durée du projet). Le nombre d'animaux utilisés dépend directement du type de formation souhaitée (de 5 à 20 animaux). Nous n'aurons pas d'approche statistique dans cette étude car c'est un projet à visé de formation.
Raffinement
Nous souhaitons transmettre nos savoir-faire et connaissances, partager nos expériences et aussi permettre par la formation d'améliorer le bien-être animal et le raffinement des techniques qui seront mise en oeuvre par d'autres membres de la communauté scientifique sur ce sujet. La petite chirurgie s'effectue sous anesthésie et analgésie avec une compensation de la potentielle perte hydrique pour les aider à récupérer au mieux. Du gel oculaire sera placé sur les yeux des animaux anesthésiés afin de prévenir tout dommage de la cornée. Nous serons particulièrement vigilants sur la surveillance des points d'injections, l'aseptie pour la partie chirurgicale et la surveillance post opératoire des animaux pour déceler tout signe d'inconfort (prostration, dos voûté, difficultés locomotrices, expressions faciales) ou d'infection (rougeur, gonflement, supuration). Puisqu'il s'agit de formation, les animaux inconfortables seront mis à mort immédiatement pour éviter toute souffrance inutile. Les animaux sont surveillés quotidiennement à l'animalerie. De l'enrichissment sera placé dans les cages pour leur bien-être.
Choix des espèces
Les rongeurs sont de petits mammifères à reproduction rapide qui sont très largement utilisés par la communauté scientifique. Ce sont de très bons modèles expérimentaux puisqu'ils possèdent une très forte homologie avec les gènes Humains. Les rats et les souris sont utilisés dans notre laboratoire en routine pour la création et l'archivage de lignées. Les mâles proviendront tous de nos activité de service, et ne seront pas achetés spécialement pour les formations. - Les mâles vasectomisés sont utilisés à l’âge de jeunes adultes à adultes(10 semaines à 1 an) et renouvelés tous les 9 mois (souris) et 12 mois (rats). - Les mâles fertiles sont de jeunes adultes en âge de procréer (10 semaines à 1 an) pour fournir du sperme ou être mis en accouplement pour fournir des embryons à différents stades. - Les femelles utilisées pour produire les embryons/ovocytes sont prépubères (3-4 semaines pour les souris et 5-6 semaines pour les rats) car elles répondent mieux aux traitement hormonaux. (réduit le nombre de femelles donneuses utilisées) - Les mères-porteuses utilisées sont de jeunes adultes à adultes (10 semaines à 8 mois), elles doivent être en âge de procréer.
Dynamique de l’échappement à l’inactivation du chromosome X dans les cellules immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à l'issue de chaque procédure pour que leurs poumons soient prélevés, 1 156 souris vont être utilisées, 804 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 352 un niveau léger. Elles reçoivent des injections deux fois par semaine, une injection dans la trachée sous anesthésie générale et une instillation nasale, et une partie d'entre elles est irradiée pendant cinq minutes ou privée de macrophages pulmonaires. Infectées par la grippe, elles perdent du poids et voient leur température baisser, et développent une fibrose des poumons que le porteur qualifie de non létale et réversible. Sur le remplacement, il affirme que l'environnement des alvéoles pulmonaires "ne peut être reproduit in vitro", tout en annonçant développer en parallèle une culture de macrophages alvéolaires pour étudier les mêmes mécanismes.
Objectifs
La réponse immunitaire est généralement de plus forte amplitude chez les femmes comparées aux hommes. Cela les protège vis-à-vis des infections virales ou bactériennes, mais augmente également le risque de développer des pathologies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique (LES). Le récepteur toll like 7 (TLR7), codé sur le chromosome X, reconnait des ARN simple brin dérivés du soi ou de virus. Des études d’association génétiques ont identifié une mutation pour TLR7 associée à une perte de fonction conférant des formes sévères de COVID-19. L’inflammation et les réponses immunitaires sont régulées par des facteurs liés au sexe comme les hormones et les facteurs génétiques portés sur le chromosome X comme le gène TLR7. Nous avons mis en évidence que le gène TLR7 peut être exprimé en deux copies dans les cellules immunitaires femelles, ce qui leur confère un avantage fonctionnelle comparées aux cellules immunitaires de mâles. Nous avons développé des modèles génétiques rapporteur/délétère pour l’expression du gène Tlr7 chez la souris. Ces modèles nous permettent de suivre les cellules exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, et également de les éliminer de manière constitutive ou inductible. Nos objectifs scientifiques sont d’identifier précisément les cellules immunitaires exprimant Tlr7 à partir des deux chromosomes X, de caractériser leurs fonctions immunitaires à l’état basal et durant une infection par le virus influenza.
Bénéfices attendus
Les infections respiratoires par influenza ou coronavirus (comme le MERS ou SARS-CoV-2) sont plus sévères dans les individus âgés de plus de 65 ans. Il a été suggéré que les monocytes et macrophages pulmonaires ont un rôle dans la dysrégulation de la réponse immunitaire. Il existe des différences liées au sexe dans la susceptibilité au COVID-19 avec un risque de mortalité presque deux fois supérieur pour les hommes comparé aux femmes après 50 ans. Cette différence est maintenue à tous les âges. Les différences liées au sexe dans le remplacement des macrophages pulmonaires, promu par des infections récurrentes, le vieillissement ou des facteurs environnementaux peut être un mécanisme contribuant aux observations épidémiologiques. Ce biais de sexe n’ayant jamais été documenté, ce projet permettra de mettre en avant l’importance d’un double dosage des gènes codés sur le chromosome X dans la biologie des macrophages alvéolaires, en utilisant les modèles murins uniques que nous avons développés. Le double dosage des gènes codés sur le chromosome X pourrait contribuer au biais de sexe en permettant l’activation plus efficace des cellules immunitaires mais aussi en promouvant la maintenance et les fonctions d’homéostasie des macrophages alvéolaires chez les femmes.
Procédures
Les animaux recevront des injections plusieurs fois (2 /semaine sur une semaine maximum) pendant 1 minute. Une injection par voie intratrachéale sous anesthésie générale une seule fois pendant 3 minutes. L’irradiation sera faite une fois pendant 5 minutes. L’instillation nasale se fera une seule fois pendant une minute.
Impact sur les animaux
Dans le modèle de reconstitution les animaux seront irradiés ou déficients en macrophages alvéolaires. Dans le modèle d’infection à l’influenza, les souris présentent une baisse de température et une perte de poids. La fibrose pulmonaire n’est pas létale et est réversible.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés pour analyser leurs tissus, en particulier les poumons.
Remplacement
L’environnement des alvéoles pulmonaires ne peut être reproduit in vitro. La physiologie de l’infection, le recrutement des cellules ne peut s’étudier que dans un modèle in vivo. Nous nous attacherons à développer un modèle d’expansion de « macrophages alvéolaires like » in vitro afin d’étudier les mécanismes mis en jeu dans le maintien de l’inactivation de l’X ou son échappement.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience afin d'obtenir des résultats statistiquement interprétables et de faire des analyses différentes. Le nombre de lots et d’animaux par lot sont détaillés dans chaque procédure. De manière générale, nous avons estimé que 2 à 3 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante. Nous allons comparer 2 conditions.
Raffinement
Les souris sont hébergées en portoirs ventilés. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par quinzaine. Les cages seront systématiquement enrichies (coton, igloo, tunnel) pour leur permettre de faire un nid. L'angoisse des animaux sera réduite par une période d'acclimatation à l'hébergement (1semaine) mais également par une habituation à la manipulation. Un protocole est mis en place avec la structure du bien-être animal (SBEA) pour prévenir toute douleur, souffrance ou angoisse de l'animal. De plus, les procédures et le suivi de l'animal seront effectués par des personnes compétentes et formées à l'expérimentation animale. Les animaux sont surveillés tous les jours par les zootechniciens du service, en accord avec la réglementation.
Choix des espèces
Ces expérimentations ne peuvent être conduites que chez la souris car nous avons développés de nombreux modèles génétiques sur le fond C57BL/6 pour suivre et éliminer les cellules exprimant le gène Tlr7 à partir du X inactif chez les femelles. Résumé des modèles génétiques de souris reporter/deleter utilisés : lignée#1 : XmXistKOTlr7WT XpXistWTTlr7MCH modèle biaisé dans lequel le X actif est fixé. Permet de suivre l’échappement de Tlr7. lignée#2 : XTlr7mCh XTlr7YFPCre Rosa26LSL-DTA rapporteur mCherry maternel/délétion cellules YFP paternelles ou rapporteur mCherry paternel/ délétion cellules YFP maternelles. lignée#3 : XmXistKO Tlr7WT XpXistWT Tlr7tdTomato DTR (human diphteria toxin receptor): rapporteur tdTomato et expression du récepteur à la toxine diphtérique de manière à éliminer les cellules exprimant Tlr7 sur le chr X porteur de cette construction. lignée #4 : Csf2rb-/- déficiente pour la chaine béta du récepteur au GM-CSF. Ces souris n’ont pas de macrophages alvéolaires. lignée #5 : Tlr7 fate-mapping model= Femelle R26LoxStopLox-tdTomato+/- Xm = XXistKO Tlr7WT Xp = XistWT Tlr7YFPCre. Les cellules exprimant Tlr7 à partir du Xp = Xi seront marquées de manière irréversible par la tdTomato suite à l’élimination du Stop par la YFPCre.
Rôle des protéines tyrosines phosphatases Shp1 et Shp2 dans la myélofibrose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
L'objet est de tester des combinaisons de traitements ciblant deux protéines dans la myélofibrose, une maladie de la moelle osseuse. 1 082 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leur sang et leur moelle osseuse soient analysés, 512 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, 504 avec un niveau de souffrance modéré et 66 avec un niveau léger. Elles sont gavées une à deux fois par jour pendant douze semaines alors qu'elles sont éveillées, et subissent jusqu'à douze prélèvements de sang à la queue, les suivants obtenus en grattant la croûte de la ponction précédente. Le porteur indique que les souris au phénotype dommageable peuvent présenter un retard de croissance, un amaigrissement ou une alopécie, et que la baisse de plaquettes provoquée par les traitements reste sans effet, une chute bien plus forte étant selon lui "nécessaire" pour observer un saignement.
Objectifs
La dérégulation de la production mégacaryocytaire et plaquettaire causée par la présence de mutations entraîne un dérèglement dans la production des cellules de la moelle osseuse (les mégacaryocytes) mais aussi des plaquettes et des globules rouges. Les traitements utilisés en clinique permettent de soulager les symptômes mais ne préviennent pas l’apparition de la maladie. Ainsi, l’objectif est de tester des combinaisons de traitements ciblant deux protéines identifiées comme étant de nouvelles cibles thérapeutiques intéressantes.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de nouvelles cibles importantes impliquées dans le néoplasmes myéloprolifératifs (NMPs) permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des symptômes et de la myélofibrose chez les patients. En effet, à ce jour, les médicaments utilisés en clinique ont apporté de nouveaux espoirs pour le traitement des NPMs mais leurs effets ont été essentiellement bénéfiques sur les symptômes mais ne parviennent pas à prévenir la myélofibrose. Un deuxième bénéfice important est de cibler certaines cellules spécifiques. Actuellement, les traitements utilisés touchent différentes cellules. Ce projet vise à identifier des cibles bien spécifiques des mégacaryocytes, qui sont les cellules impactées dans ces pathologies. L’identification des récepteurs et voies de signalisation nous permettra de les cibler spécifiquement.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement par voie orale (gavage 1 à 2 fois par jour) sur animal vigile pendant 12 semaines maximum. Une autre procédure fait appel au prélèvement de sang à la queue de souris anesthésiée, puis par grattage de la croute pour les prélèvements suivants (12 maximum) (toujours sur souris anesthésiée). Un prélèvement de sang terminal sous anesthésie sera réalisé à la fin des 12 semaines de traitement.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont essentiellement liées au stress de contention au moment des injections ou lors des traitements par voie orale. Le prélèvement de sang à la queue pourra entrainer une douleur localisée et un saignement. Les traitements testés ont comme impact de diminuer modérément et transitoirement la quantité de plaquette, ce qui n’a pas d’impact sur l’animal (en effet, une diminution très importante de la quantité de plaquettes est nécessaire pour observer un saignement chez l’animal, ce qui n’est pas le cas ici). Le phénotype dommageable des animaux pourra entrainer des défauts physiques tels qu’un retard de croissance, amaigrissement ou une alopécie.
Devenir
En fin de projet, les animaux sont tous mis à mort pour récupérer et analyser le sang et la moelle osseuse.
Remplacement
La myélofibrose est une pathologie complexe, impliquant une cascade de réactions qu’il est difficile de reproduire in vitro. Il est nécessaire de recourir à des modèles animaux qui permettent de reproduire au plus près les caractéristiques de la pathologie humaine. Par conséquent, il est déterminant d’utiliser un modèle animal qui récapitule la myélofibrose induite par une mutation de pouvoir tester différents agents pharmacologiques sur l’évolution de la pathologie in vivo.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux sera minimisé : une même souris sera destinée à l’analyse de plusieurs paramètres, et plusieurs champs seront acquis par animal permettant de visualiser le plus d’évènements cellulaires. Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles disponibles au laboratoire. Les tests statistiques seront utilisés pour analyser les données obtenues entre les différents génotypes de souris. Pour les études in vivo, le nombre d’animaux par lot est n=18. Pour les études in vitro, le nombre d’animaux par lot est n=6, nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’une quantité suffisante de sang par condition. Le sang d’un animal ne pouvant pas être utilisé pour les 5 tests, car en quantité insuffisante par animal. Les groupes sont comparés par des tests statistiques.
Raffinement
Raffiner : Les expériences ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées maintenue au chaud tout au long de l'expérience pour éviter une hypothermie due à l'anesthésie/l’analgésie. Les souris seront préalablement habituées au gavage et à la contention. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédures. Pendant leur hébergement, un environnement calme et non stressant est privilégié avec un minimum de manipulation et la présence de frisure de papier, de coton et le carré de cellulose pour enrichir l'environnement ainsi que de la nourriture déposée au fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux publiés montrant la génération de souris génétiquement modifiées permettant de modéliser la myélofibrose humaine. C’est la seule espèce pour laquelle nous disposons du modèle dont les gènes d’intérêt sont inactivés. Nous nous baserons sur le même modèle : une lignée de souris présentant une mutation. Ces animaux seront traités avec différents agents pharmacologiques pour tester leur effet sur la numération plaquettaire et l’évolution de la maladie, afin d’évaluer leur rôle protecteur /curatif sur le compte plaquettaire et la myélofibrose.
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 12500
Hamsters dorés : 300
Gerbilles de Mongolie : 200
Administrations par voie intranasale, intratrachéale, intramusculaire, intradermique, intracérébrale, intravésicale ou par minipompe posée chirurgicalement, jeûnes pouvant durer seize heures, phase expérimentale allant jusqu'à douze mois : 25 500 rongeurs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'effectif se répartit entre 12 500 souris, 12 500 rats, 300 hamsters dorés et 200 gerbilles de Mongolie, pour une prestation de mesure de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués. La plupart seront tués pour récupérer les organes et de grands volumes de sang, 10 400 pouvant être gardés vivants et réutilisés s'ils sont restés moins d'une semaine en procédure après une administration unique. Le porteur écrit qu'un phénotype dommageable "n'affectera pas le bien-être animal", tout en précisant dans la même phrase que les animaux concernés pourraient boire davantage ou devenir obèses.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. Ce projet permettra d’une part de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide. Une seconde partie du projet aura recours à la forme radiomarquée de la molécule. Dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations de la SBEA. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc., dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, ou des paramètres métaboliques (insulinémie, glycémie) et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem. Dans le cas de l’insulinémie et de la glycémie ou d’autres paramètres métaboliques, une injection de glucose en IP ou SC ou une administration PO pourront être réalisées au préalable des prélèvements sanguins.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués peuvent être administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire, intradermique et intracérébrale sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); injection intraportale ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Les implants pourront être retirés au plus tôt une semaine plus tard (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Pour les administrations orales et oro-gastriques où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés avant et après le jeûne. Les volumes administrés et les fréquences d’administration respecteront les recommandations de la SBEA. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement. En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Dans le cas particulier d’animaux ayant subi une administration unique de produit non radioactif et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine, ils pourront être gardés en vie sur avis du vétérinaire.
Impact sur les animaux
Dans le cas de phénotypes dommageables, celui-ci n’affectera pas le bien-être animal, bien que les animaux pourraient boire plus d’eau et/ou être obèses. Il ne peut toutefois pas être exclu que les composés administrés causent de la toxicité (diarrhée, perte de poids, douleur, signes neurologiques), ce qui sera surveillée. Une douleur transitoire modérée pourrait être générée par les chirurgies. Un stress de courte durée et une douleur légère sera générée par les administrations de produit. Les mises à jeun pourraient générer un stress léger et une déshydratation légère.
Devenir
Les animaux seront la plupart du temps mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés. Les animaux ayant reçu une administration unique de composé non radioactif et étant restés en procédure moins d’une semaine pourront être gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupes seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront réalisées sur les paramètres mesurés.
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : A partir de 10% de perte du poids, les animaux seront pesés quotidiennement des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. De plus, les animaux seront réhydratés une fois par jour avec avec du Ringer Lactate. Une perte de poids de plus de 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% constituera un point limite. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance, les expérimentateurs seront formés pour reconnaître ces signes. Les poses et retraits d’implants seront réalisées sous anesthésie générale avec analgésie pré-, per- et post-opératoire. Il ne sera possible de réaliser qu’une pose et un retrait dans la vie de l’animal. Les voies intracérébrale, intrathécale et intraportale ne pourront être réalisées que maximum une fois dans la vie de l’animal. Les voies chirurgicales et poses et retraits d’implants seront réalisés par du personnel extensivement formé à la technique. Les implants (pose et retrait) ne pourront pas être combinés avec d’autres administrations nécessitant une chirurgie. A la suite de chirurgies, les animaux seront suivis quotidiennement le temps de la cicatrisation de la plaie, des soins locaux seront apportés si nécessaire. La fréquence de changement des litières sera augmentée si nécessaire et de la nourriture sera placée en fond de cage pour faciliter l’alimentation. Le comportement des animaux sera surveillé pour évaluer la nécessité de mettre en place une collerette. Les administrations IM et ID seront réalisées après administration d’un analgésique. Les administrations oro-gastriques via un dispositif de gélules ne pourront être réalisées uniquement sur des rats de plus de 150g et les animaux devront être anesthésiés. Ces administrations pourront être pratiquées à une fréquence maximale d’une fois par jour avec le matériel adapté à la taille de l’animal. De plus, un lubrifiant inerte devra être utilisé afin de faciliter le passage de la canule dans l’œsophage. Les variations de poids seront enregistrées quotidiennement à la suite des administrations oro-gastriques. Les perfusions IV de plus de 15 minutes et de 30 minutes maximum devront être réalisées sur des animaux anesthésiés.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Effet de la colonisation par un cocktail bactérien pour la prévention de la pneumonie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
3 791 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 1 380 d'entre elles et modéré pour 2 411. Elles reçoivent une ou plusieurs instillations directes dans la trachée, sous anesthésie par inhalation, et un tiers subit en plus l'administration de suspensions bactériennes ou virales par le nez ou la trachée. Le porteur décrit une perte de poids transitoire de deux à trois jours après l'infection puis un retour à la normale, et prévoit des injections de morphinique selon les scores obtenus. Les traitements sans antibiotiques qu'il espère en tirer restent au stade du souhait, tandis qu'il qualifie les modèles animaux d'"indispensables" à la compréhension des interactions entre flore pulmonaire et immunité.
Objectifs
La pneumonie est une infection des poumons qui peut être très grave et causer de nombreuses complications, voire la mort, si elle n'est pas traitée. Nous ne savons pas encore comment les bactéries présentes naturellement dans les poumons [flore bactérienne saine], et les substances qu'elles produisent, peuvent influencer la santé pulmonaire. Ce projet vise donc à : 1. Créer un modèle de souris dont les poumons sont colonisés par des bactéries bénéfiques (cocktail thérapeutique), similaires à celles que l'on trouve dans des poumons sains, et à étudier comment ces bactéries agissent. 2. Comprendre comment ce groupe de bactéries ou les substances qu'elles produisent affectent l'équilibre des autres bactéries dans les poumons et renforcent les défenses immunitaires de l'organisme.
Bénéfices attendus
Notre recherche essaye de montrer que les résultats de la pneumonie ne dépendent pas seulement des bactéries dangereuses mais aussi d'une flore bactérienne saine affaiblie dans les poumons. Nous voulons mieux comprendre quelles bonnes bactéries aident les poumons à rester en bonne santé. Avec cette étude, nous espérons découvrir des bactéries bénéfiques, des protéines et des substances utiles qui pourraient être utilisées ensemble pour prévenir ou traiter la pneumonie. L’idée est de créer des traitements qui n’utilisent pas d’antibiotiques, ce qui pourrait aider à soigner les infections respiratoires de façon plus durable et efficace.
Procédures
Tous les animaux (mis à part les naïfs) seront soumis à une ou plusieurs administrations intra-trachéales d’un cocktail bactérien ou d’un milieu de dilution sous anesthésie générale par inhalation en continu d’anesthésique volatile. Le geste de l’injection intratrachéale, en tant que tel, dure au maximum 1 minute et le réveil est presque instantané. Un tiers des animaux reçoivent également une administration de suspensions bactériennes, virales ou d’eau physiologique (PBS) par voie intranasale ou intra-trachéale sous anesthésie. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous cutanée de morphinique pourraient être réalisées. Le geste de l’injection sous cutanée ne dure au maximum que 30 secondes.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigües sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3 jours) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Pour les autres parties du projet, suite à la colonisation bactérienne en IT, les animaux pourraient présenter, au cours des 24 premières heures du protocole, une légère perte de poids. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendre pas de douleurs résiduelles ainsi que de stress supplémentaire. L’injection intratrachéale peut générer une potentielle gène consécutive au geste.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la colonisation microbienne et la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=8) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Pour les tests pour lesquels une analyse statistique n’est pas prévue ainsi que pour certains groupes témoins, le nombre d’animaux sera réduit à 3 ou 5 animaux par groupe. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnelle aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. L’état général des souris est évalué quotidiennement afin de s’assurer du bien-être de nos animaux. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la zone sera anesthésiée localement. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle.
Choix des espèces
Le modèle murin de pneumonie est un modèle bien caractérisé, reproductible, et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. Les souris ont entre 6 semaines et 14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature.