Souris
Validation d’un candidat médicament dans le traitement d’une maladie neurogénétique rare
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour vérifier si un candidat médicament déjà testé contre une autre maladie neurodégénérative agit aussi sur une maladie neurogénétique rare, 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles portent les symptômes de la maladie, démarche irrégulière, tremblements, difficultés respiratoires et perte de poids continue, et reçoivent le traitement par gavage, par injection sous la peau ou par une mini-pompe implantée chirurgicalement pendant quatre semaines, avec deux prélèvements de sang à la queue et cinq tests comportementaux que le porteur ne nomme pas. Les cerveaux sont prélevés après une mise à mort par exsanguination sous anesthésie. Seuls des mâles sont utilisés, la variabilité des symptômes chez les femelles étant jugée trop grande, et les souris qui se dégradent jusqu'aux points limites annoncés, poils hérissés, prostration, isolement, sont mises à mort avant la fin.
Objectifs
Le projet de recherche vise à développer un médicament dans le traitement d’une maladie neurogénétique rare avec symptômes moteurs et mentaux sévères. Ce candidat médicament a déjà montré des résultats positifs dans le traitement d’une autre maladie neurodégénérative et ce projet a pour objectif de voir si, sur la base des mêmes mécanismes d’action, ce médicament démontre les mêmes effets innovants sur une autre maladie aux atteintes sévères similaires.
Bénéfices attendus
Les résultats du projet permettront de, premièrement, valider que l’administration du médicament possède un intérêt thérapeutique dans un modèle de souris de cette maladie génétique et deuxièmement, d’évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes, ou les ralentir. Ces résultats permettront le développement clinique du médicament ciblant les symptômes de cette maladie avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.
Procédures
Une partie des animaux sera traitée par voie orale (
Impact sur les animaux
Le modèle animal de cette maladie présente des symptômes moteurs et mentaux qui s’aggravent progressivement avec l’âge. Les animaux présentent notamment une démarche irrégulière, des tremblements, des difficultés respiratoires et une perte de poids constante, progressive et indépendante de la prise alimentaire. La pose de mini-pompe par chirurgie peut entrainer une inflammation légère et transitoire.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux. Ces derniers serviront à réaliser des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre le mécanisme d’action du traitement et de démontrer que les symptômes de la maladie sont atténués voire résorbés par le traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement avec notre molécule sur l’amélioration et l’apparition des symptômes de la maladie. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 3 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisée que si l’expérience 1 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2 et 3 ne seront pas réalisées. L’étude ne sera réalisée que sur les mâles à cause d’une trop grande variabilité des symptômes chez les femelles.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste. Une habituation aux tests de comportement sera réalisée avant chaque test et des mini-pompes seront implantées sous la peau afin de délivrer la molécule quotidiennement sans déranger l’animal. Ces mini-pompes seront implantées sous anesthésie et analgésie générales, les animaux seront sur un tapis chauffant et auront du gel hydratant sur les yeux tout au long de la chirurgie (15 minutes maximum) afin de ne pas assécher leurs yeux. De plus les cages seront supplémentées en nourriture gélifiée afin de limiter l’effort que l’animal doit fournir pour se nourrir quand il vieillit.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement améliore les symptômes voire retarde leur apparition, notre étude sera réalisée sur des souris adultes présentant les symptômes de la maladie.
Validation thérapeutique de la Fluoroéthylnormémantine chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un peptide amyloïde inoculé dans le ventricule cérébral au cours d'une chirurgie de quinze minutes, puis un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie juste avant la mise à mort: 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées pour prélever cerveau, sang et liquide céphalo-rachidien. Le projet compare la fluoroéthylnormémantine à la mémantine, dont le porteur rappelle qu'elle a été déremboursée en France pour manque d'efficacité et effets secondaires. Dix souris par groupe et par sexe suffisent selon lui, les deux tests de mémoire portant sur les mêmes lots d'animaux. Ces tests, qu'il décrit comme une source de stress léger à modéré et qui ne dépassent pas dix minutes, ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les traitements disponibles aujourd’hui pour traiter la maladie d’Alzheimer (MA) sont essentiellement symptomatiques. C’est le cas de la mémantine mais malheureusement aujourd'hui déremboursé en France, à cause de son manque d'efficacité et ses nombreux effets secondaires. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes afin de mettre au point des molécules similaires plus efficaces. C’est le cas de la Fluoroéthylnormémantine (FENM) qui s'est avéré être un neuroprotecteur plus efficace à dose égale que la Mémantine. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques de ce traitement dans la Maladie d’Alzheimer. Ce projet a donc pour but de mettre en avant l’efficacité de cette molécule en comparaison de la mémantine chez des souris modèle de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de révéler un effet positif de la FENM sur les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et ainsi de faire progresser le développement pré-clinique d'un traitement plus efficace que celui utilisé aujourd'hui pour les patients atteints de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux auront une chirurgie permettant l’inoculation du peptide amyloïde à l’origine des symptômes de la maladie d’Alzheimer. Cette procédure chirurgicale d’une durée maximale de 15 min se fera sous anesthésie générale. Les animaux suivront ensuite des test comportementaux ne dépassant pas 10 minutes afin de tester leurs capacités de mémoire. Enfin avant la mise à mort de ces animaux un prélèvement de liquide céphalo rachidien sera réalisé sous anesthésie générale, cette chirurgie ne dépasse pas 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie de sévérité modérée permettant l'inoculation du peptide amyloïde dans le ventricule cérébral afin d'induire les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Cette procédure chirurgicale pourra engendrer du stress chez l'animal et un certain inconfort au moment du réveil. Les 2 tests comportementaux réalisés dans ce projet seront une source de stress léger à modéré.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter les tissus et fluides (cerveau, sang, liquide céphalo-rachidien) pour analyse et ainsi déterminer l’impact du traitement sur les marqueurs de la maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours «in vivo » pour mimer les symptômes pathologiques de la MA et rechercher des biomarqueurs associés.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux à 10 par groupe et par sexe. Les 2 tests comportementaux sont effectués sur les mêmes lots de souris pour limiter le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés selon les normes de bien-être en vigueur (5 individus par cage, présence d’enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis. Une grille de scoring permettra le suivi des animaux et la définition des points limites. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 5 minutes par souris avant le début des expériences. Une attention particulière sera portée aux souris lors des chirurgies réalisées sous anesthésie générale avec utilisation d'un analgésique.
Choix des espèces
Afin de refléter les symptômes de la MA, la souris reste à ce jour un des modèles se rapprochant au plus près de l'homme et dont les capacités de mémoire peuvent être étudiées en laboratoire. Les expériences débuteront sur des animaux adultes âgés de 6 semaines car la maladie se développe chez l'adulte.
Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 3/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
12812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant 30 semaines et des injections intrapéritonéales deux fois par semaine sur la même durée. S'y ajoutent une chirurgie de pose d'implant d'œstrogène, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines dans les deux flancs, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue au sixième jour de vie et des transports entre cinq établissements. Le porteur signale un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons lors des gavages, des douleurs dès que la tumeur atteint un certain volume, des démangeaisons et des difficultés à s'alimenter et à s'abreuver. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restant en vie pour l'accouplement sauf les mâles immunodéficients, et le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des syndromes d'hypercroissance et l'identification potentielle de nouveaux traitements.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.
Nouvelle thérapie ciblant les voies de la résolution de l’inflammation dans des modèles inflammatoires murins d’arthrite
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La douleur dure jusqu'à la mise à mort de l'animal, sauf si un point limite est atteint plus tôt, pour l'un des quatre modèles d'arthrite de ce projet. 1092 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'inflammation est déclenchée par une injection de collagène dans la queue, dans l'articulation du genou ou dans la voûte plantaire, suivie selon le porteur de boiterie, de gonflement des articulations, de prostration et de difficultés à marcher, avec des traitements injectés trois fois par semaine et des prises de sang hebdomadaires sur animal vigile. Le projet teste deux molécules censées relancer la résolution de l'inflammation sans immunodéprimer les patients, bénéfice annoncé pour des personnes en échec thérapeutique quand les atteintes infligées aux souris sont, elles, immédiates et certaines.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chronique ont aujourd’hui une incidence en constante augmentation notamment dans les pays industrialisés. Ces maladies chroniques peuvent être systémiques et toucher tout l’organisme comme la polyarthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque ou alors elles peuvent être localisées à un seul organe comme la maladie de Crohn ou le diabète de type I. Ces inflammations chroniques entraînent de nombreux dommages tel que la formation de lésions, une réparation tissulaire inefficace voire la destruction de l’organe dans les formes les plus sévères. Les traitements actuels, tel que les molécules inhibitrices du TNFa (molécule inflammatoire), ont pour objectif d’empêcher l’initiation de l’inflammation de se mettre en place et ainsi limiter l’inflammation exacerbée chez ces patients. Seulement, l’effet de ces molécules n’est pas spécifique à la pathologie et elles sont associées à de nombreux effets secondaires tel que des nausées/vomissement, de la fatigue ainsi qu’une immunodépression du système immunitaire rendant les patients très fragiles aux infections. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires et pour cela les approches sont plus spécifiques des cellules de l'immunité. De nouveaux récepteurs à la surface des cellules immunitaire ont été identifiés comme jouant un rôle dans la modulation de leur fonction inflammatoire. Nous aimerions tester différentes molécules capables d’activer un de ces récepteurs et analyser les effets engendrés par cette activation dans différents modèles animaux de maladies inflammatoires. Ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles précliniques, c’est pourquoi nous voulons tester ces thérapies chez la souris. Le nombre d’animaux utilisés sera de 1092 souris pour combiner un nombre réduit d’animaux avec une pertinence statistique.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels utilisés contre la polyarthrite rhumatoïde sont des traitements 1) limitant la douleur du patient avec notamment des corticoïdes ou des anti-inflammatoires associés à 2) un traitement de fond modulant le système immunitaire (immunosuppresseur ou immunomodulateur). Ces traitements entrainent néanmoins de nombreux effets secondaires tels que des vomissements/nausées, de la fatigue, des maux de tête ... Les immunomodulateurs, quant à eux, induisent une immunodépression du patient le rendant plus sensible aux infections du quotidien. De plus, et malheureusement, il a été démontré que dans 50% des cas une inefficacité du traitement est observée un an après la première injection. Il est donc primordial de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Nous avons donc développé de nouvelles molécules ciblant les récepteurs de la résolution de l’inflammation. Ces molécules ne modifient pas l’initiation de l’inflammation et permettraient donc aux patients de ne plus être immunodéprimés et de pouvoir répondre à tout type d’attaque extérieure puisque leur système immunitaire serait totalement fonctionnel. Chez l’animal nous espérons pouvoir activer la phase de récupération dans ces différents modèles avec notamment une diminution des signes cliniques et une meilleure survie. Si ces études in vivo sont bénéfiques pour l’animal nous envisageons de pouvoir débuter un essai clinique chez l’humain afin de traiter les patients n’ayant plus de possibilité thérapeutique et de leur proposer une nouvelle stratégie.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs type d'injection : intra-péritonéal, intra-articulaire (genou), intradermique, voûte plantaire ou sous-cutanée. Ces injections seront effectuées sous anesthésie et analgésique. Des prélèvements sanguins au niveaux de la veine mandibulaire pourront être effectués sur animaux vigiles (1 fois par semaine maximum). Pour finir les traitements seront injectés en intra-péritonéale sur animaux vigiles (3 fois par semaine)
Impact sur les animaux
Modèle 1 : les animaux subiront une injection en intra-dermale dans la queue de collagène II, engendrant une douleur rapide le temps que le produit diffuse dans l’organisme. Par la suite les animaux commenceront à montrer des signes cliniques de la pathologie avec notamment une perte de poids, le gonflement des articulations et des difficultés à marcher. Modèle 2 : lors de l’induction de la pathologie les animaux recevront une injection dans l’articulation cela entrainant une douleur légère de courte durée (lors de la piqûre). Par la suite les animaux commenceront à montrer des signes cliniques (boiterie, prostration) provoquant de la douleur chez l’animal et ceci jusqu’a l'euthanisie de l'animal sauf si les points limites sont atteints avant. Modèle 3 : une injection dans l’articulation du genou sera faite entrainant une douleur légère et rapide. Rapidement des signes cliniques seront visible (boiterie, difficulté à poser la patte …) provoquant de la douleur chez l’animal. Modèle 4 : une injection dans la voûte plantaire sera effectuée entrainant une légère douleur lors de l’injection. Rapidement (dès 2h) des signes cliniques vont apparaitre de type gonflement et boiterie entrainant de la douleur.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d'intérêts pourront être prélevés pour compléter les analyses.
Remplacement
Avant l’utilisation chez l’animal, nous sélectionnerons préalablement nos molécules par différents tests in vitro notamment d’affinité et d’avidité pour le récepteur mais aussi d’efficacité sur des cellules humaines. Cela nous permettra de réduire le nombre d’animaux puisque seulement 2 molécules seront étudiées dans nos modèles
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit autant que possible. En effet les différents axes définis plus haut ainsi que les 2 études pilotes permettent de réduire l’utilisation de l’animal puisque l’étude principale ne sera exécutée que sur l’étude pilote ayant montré une induction optimale et un effet délétère minimal sur l'animal. En amont nous avons étudié par un test statistique le nombre d'animaux nécessaire afin d'observer une différence significative dans nos expériences. Basé sur un test de distribution normale d'échantillons nous avons déterminé un nombre d'animaux de n=22 animaux/groupe nécessaire pour obtenir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité dans nos expériences
Raffinement
Les animaux auront une phase d’acclimatation de plusieurs jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress. En amont de l’expérience le protocole sera entièrement planifié afin d’éviter du stress à l’animal et les points limites seront définis afin d’anticiper toute souffrance. Les animaux montrant des signes de douleurs (prostration, poils hérissé, isolation, boiterie) lors de l’expérience recevront des anti-douleurs 3 fois par jour puis dans l’eau de biberon pour la nuit. Les animaux ne seront pas maintenus au-delà des délais décrits pour chaque modèle, limitant leur utilisation si cela n’est pas nécessaire. L’animal sera maintenu en groupe, avec des frisottis pour se camoufler ainsi que des dômes ou des tunnels. Si un animal montre de l’agressivité il sera isolé afin de préserver les autres animaux et mis dans une cage avec des enrichissements de type : dôme ou tunnel, frisottis, coton
Choix des espèces
Afin d'étudier le rôle des différentes cibles in vivo dans des modèles expérimentaux d'inflammations induit par des molécules chimiques, nous utiliserons différentes lignées chez la souris décrite pour déclencher ce type d'inflammation. Les souris utilisées auront entre 6 et 10 semaines car l’inflammation générée par les molécules chimiques utilisées dans les différents modèles est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse inflammatoire.
Etude de l’activité expiratoire chez des modèles murins du syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Mutées sur un gène qui rend non fonctionnels les neurones sensibles au dioxyde de carbone, les souris de ce projet présentent une hypoventilation marquée et aucune réponse à l'hypercapnie, atteintes qui peuvent selon le porteur causer leur mort avant l'âge adulte. 2472 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Une biopsie de la queue est prélevée entre 7 et 10 jours de vie pour génotypage, la ventilation est mesurée une heure en enceinte fermée, des nouveau-nées sont anesthésiées puis tuées pour isoler leur système nerveux central, et des adultes reçoivent des électrodes dans les muscles respiratoires avant un challenge hypercapnique de dix minutes ou une stimulation des nerfs sciatiques répétée deux fois. Toutes sont tuées après le dernier enregistrement pour prélèvements, ou lorsqu'elles atteignent un âge limite pour la reproduction.
Objectifs
Le syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale est une pathologie associée à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Il se caractérise par une ventilation insuffisante pendant le sommeil, et dans les cas les plus sévères également pendant l’éveil. Cette hypoventilation est associée à une diminution voire à l’absence de la réponse à l’hypercapnie (trop de CO2/protons). Ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment et dans les cas les plus graves 24h/24h. La mutation d’un gène est à l’origine de ce syndrome, la protéine issue de ce gène muté présente une mauvaise conformation la rendant non fonctionnelle, les cellules nerveuses exprimant cette protéine ne fonctionnent pas correctement. Ces cellules sont dans une structure de l’encéphale qui est impliquée à la fois dans la réponse à l’hypercapnie mais également dans la genèse de l’activité expiratoire. Notre projet a pour objectif de déterminer s’il existe une défaillance de l’expiration dans le syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale, chez un modèle de souris mutantes et de déterminer si elle peut être atténuée par un agent pharmacologique capable de corriger ou de potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie. Une première approche expérimentale sera utilisée pour enregistrer la respiration des souris nouveau-nées et adultes de façon non invasive. Elle permettra d’identifier la présence précoce du déficit expiratoire. Une seconde approche expérimentale permettra d’étudier à la fois la commande centrale inspiratoire et la commande centrale expiratoire. Ces deux approches permettront d’identifier l’origine de ce déficit expiratoire. Chez les souris adultes, nous évaluerons dans des situations différentes, qui stimulent la ventilation, si les muscles expiratoires sont mobilisés de façon identique chez les souris. In fine, les données obtenues devraient permettre d’identifier le déficit expiratoire comme un marqueur physiologique du syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale.
Bénéfices attendus
Notre étude pourrait révéler un nouveau biomarqueur de l'atteinte centrale rencontrée dans le syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale, une maladie très rare (prévalence 1/550000), le coût sociétal a été éstimé à 10 millions sur la durée de vie d’un patient par l’ancienne présidente de l’association des familles du syndrome d’Ondine. Si tel est le cas, ce résultat devrait guider les cliniciens vers la recherche d'une anomalie génétique chez tout patient présentant ce schéma respiratoire à l'effort sans explication d'origine périphérique, un point important cliniquement au regard des patients qui ne sont diagnostiqués que tardivement dans des conditions de fonction pulmonaire limitée ou suite à la découverte d'un cas de mutation dans leur descendance. Il est également à noter que le test génétique utilisé pour documenter les mutations liées à la maladie peut nécessiter du temps et l'implication de laboratoires spécifiques et peut donc ne pas être disponible dans certaines institutions. La recherche de défauts de recrutement expiratoire dans ces conditions pourrait être une solution pour poser le diagnostic.
Procédures
Un rapide prélèvement au niveau de la queue est réalisé entre 7 et 10 jours de vie pour génotypage. Des souriceaux et des souris adultes seront utilisés pour la mesure des variables ventilatoires qui sera réalisée de façon non invasive pendant 60min (1 fois, et nécessite une habituation de 10 jours minimum chez l’adulte) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. Des souris nouveau-nées sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central afin de mesurer l’activité de la commande respiratoire. Des souris adultes sous anesthésie chimique et analgésie chimique auront des électrodes insérées au niveau des muscles respiratoires. Ces souris seront exposées à un challenge hypercapnique de 10 minutes et l’activité des muscles respiratoires sera enregistrée. Des souris adultes sous anesthésie chimique et analgésie chimique auront des électrodes insérées au niveau des muscles respiratoires et des électrodes de stimulations seront placées au niveau des nerfs sciatiques des membres postérieurs. Sous anesthésie, les nerfs qui contrôlent l’activité des muscles des pattes postérieures seront stimulés pendant 10 minutes afin de mimer une activité physique, et l’activité des muscles respiratoires sera enregistrée. Ce challenge est répété 2 fois avec un intervalle de 20 minutes. Tous les animaux sont euthanasiés après le dernier enregistrement en vue des prélèvements.
Impact sur les animaux
La séparation des souris nouveau-nées et juvéniles de leur mère pourra engendrer un stress. Le prélèvement au niveau de la queue pour génotypage est un stress. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. L’anesthésie pourra entrainer un stress, ainsi qu’une détresse respiratoire chez les souris utilisées dans ce projet, connues pour présenter une sensibilité exacerbées aux anesthésiques. La contention et l’administration orale est une source de stress pour l’animal qui sera limité par une habituation à la contention et l’utilisation de sonde de gavage en matière souple (palstique). L’instabilité respiratoire suite à la mise en place des électrodes indiquera un état de stress. Les dommages attendus sont au minimum une altération de la fonction respiratoire avec une hypoventilation marquée et une absence de réponse à l’hypercapnie. Il pourrait y avoir une atteinte de la prise alimentaire, avec une prise de masse plus lente chez une des lignées de souris mutantes par rapport aux souris congénères sauvages. Ces dommages attendus pourraient être à l’origine d’une mort prématurée avant que les souris n’atteignent l’âge adulte.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires à l’étude post mortem ou lorsqu’ils ont atteints un âge limite pour la reproduction.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. L’utilisation de culture de cellules musculaires ne permet pas de mesurer les volumes expiratoires ou l’activité expiratoire. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande respiratoire et au volumes inspiratoires et expiratoires dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total de souris impliquées est de 2472. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont stabulées en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température, l’hygrométrie et le cycle d’éclairage sont monitorés. Le milieu est enrichi : lanières de papier Kraft et maisons/tunnel en carton. Les souris sont hébergées avec leurs congénères, 6 par cage maximum. Leur isolement est évité au maximum. Certaines pourront être isolées (seul mâle d’une portée, agression entre congénères, …). Elles auront alors un double enrichissement, vérifié par la structure chargée du bien-être animal. Les souris seront habituées pendant 10 jours aux enceintes de mesure non invasive de la ventilation pour diminuer les épisodes de respiration accélérée et les mouvements des souris. Sous anesthésie, une surveillance accrue des souris est assurée et l’expérience arrêtée en cas de détection d’une détresse respiratoire. Si défaillance, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes à raison d’une goutte à peine, les animaux cicatrisent sans problème. Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés après le prélèvement pour génotypage pour vérifier qu’ils soient bien regroupés sous leur mère et qu’ils s’alimentent (présence de lait dans l’estomac).Pour l’ensemble du projet, un suivi quotidien des animaux est assuré et des points limites précis ont été définis en fonction des actes mis en oeuvre pendant les procédures.
Choix des espèces
Les rongeurs (sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’hypoventilation alvéolaire centrale congénitale n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène sur des neurones impliquées dans la sensibilité au dioxyde de carbone. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire à plusieurs âges dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes et sauvages ; étude de la commande centrale respiratoire; étude de la ventilation de façon non invasive chez des souris mutantes et sauvages nouveau-nées et adultes chez animal vigil ; études de l’activité des muscles expiratoires chez des souris adultes mutantes et sauvages sous anesthésie.
Distribution cérébrale d’agents thérapeutiques après exérèse tumorale subtotale : étude sur un modèle de fenêtre crânienne de glioblastome opéré. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
Un morceau de crâne remplacé par une fine lame de verre laissée en place jusqu'à la mort de l'animal, puis huit points d'observation en microscopie après une injection unique: 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au terme du suivi ou dès l'atteinte d'un point limite. Chaque souris reçoit d'abord une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau, puis, trois semaines plus tard, une seconde chirurgie pour retirer la tumeur, avec jusqu'à cinq séances d'imagerie par bioluminescence entretemps et une injection intrapéritonéale de luciférine avant chacune. Le projet vise à décrire la cicatrisation cérébrale après exérèse et la distribution de cinq molécules fluorescentes, le porteur relevant que la plupart des études in vivo omettent cette chirurgie pourtant systématique chez les patients. Les souris utilisées sont nues et immunodéficientes, ce qui évite le rejet des cellules tumorales humaines greffées, et elles sont hébergées seules après la pose de la fenêtre crânienne.
Objectifs
La chirurgie correspond au premier traitement des patients atteints de tumeurs cérébrales, même si elle est le plus souvent imparfaite et laisse systématiquement quelques cellules tumorales qui doivent être traitées par des thérapies complémentaires (radiothérapie et chimiothérapie). Etrangement, la plupart des études in vivo chez l'animal n'incluent pas cette chirurgie. Ainsi, les conséquences de l'opération, telles que la cicatrisation du tissu cérébral après l'opération, sont mal connues et rarement prises en compte chez l'animal. Or, la chirurgie impacte forcément l'efficacité des traitements complémentaires (tels que les chimiothérapies) délivrés par voie intraveineuse après l'opération. Pour les recherches qui tentent de développer des thérapies innovantes incluant des agents de chimiothérapie, il paraît pertinent et nécessaire de mieux prendre en considération la situation post-opératoire. C'est pourquoi dans ce projet, nous proposons d'étudier par microscopie de fluorescence les modifications du tissu cérébral survenant après l'extraction de la tumeur et leurs conséquences. Notamment, nous souhaitons : 1-étudier la structure et la perméabilité des vaisseaux sanguins cérébraux lors de la "cicatrisation" après chirurgie ; 2-étudier la reprise/recroissance de la tumeur à partir des cellules tumorales laissées après chirurgie ; 3-évaluer l'impact sur la distribution intracérébrale de molécules fluorescentes administrées par voie intraveineuse. Nous prévoyons de travailler avec 5 molécules fluorescentes de taille variable qui seront administrées par voie intraveineuse et nous comparerons comment elles se répartissent dans les vaisseaux sanguins cérébraux, dans les cellules tumorales restantes et dans le cerveau sain. Les méthodes mises en œuvre dans ce projet et utilisées dans des projets précédents, sont parfaitement maitrisées. Le projet se déroulera sur 2 établissements distincts (Etablissement Utilisateur 1 : hébergement, chirurgies, injection d'agents fluorescents, imagerie de fluorescence, ; Etablissement Utilisateur 2 : imagerie par production et émission de lumière)
Bénéfices attendus
L'efficacité des thérapies anticancéreuses (agents de chimiothérapie, thérapies ciblées, ...) administrées par voie orale ou intraveineuse, est directement dépendante de la quantité d'agent thérapeutique capable d'atteindre les cellules tumorales dans le cerveau. La chirurgie, qui vise à ôter la tumeur, n'est jamais complète et laisse toujours quelques cellules tumorales à l'origine d'une reprise de la tumeur. Ce sont ces cellules "restantes" que ciblent les chimiothérapies complémentaires : il faut donc que les médicaments injectés par voie intraveineuse soient capables de les atteindre pour les détruire. Dans ce contexte, ce projet permettra de mieux comprendre la "cicatrisation" post-opératoire, et de décrire la distribution des agents de chimiothérapie, administrés après chirurgie, en fonction de leur taille. Ces éléments de connaissance sont indispensables pour nos travaux futurs qui visent à développer et optimiser de nouvelles thérapies pour les tumeurs cérébrales: ces données ouvriront des pistes de réflexion et fourniront des arguments solides concernant le "meilleur timing" pour l'administration de substances actives après chirurgie.
Procédures
Pour chaque souris, nous réaliserons une greffe de tumeur par injection de cellules tumorales dans le cerveau (1ère chirurgie d'environ 30 minutes) puis environ 3 semaines après, la tumeur formée sera ôtée par chirurgie (2ème chirurgie d'environ 30 minutes). La deuxième chirurgie nécessite d'ôter une partie de l'os du crâne (= appelée volet osseux pour permettre d'accéder à la tumeur) et en fin de chirurgie, l'os manquant sera remplacé par une lame de verre très fine pour permettre les observations du cerveau en microscopie de fluorescence. La fenêtre en verre restera positionnée jusqu'à la mise à mort des animaux. Les animaux feront l'objet de plusieurs analyses en imagerie : entre la 1ère et la 2ème chirurgie, des imageries basées sur la lumière émise par les cellules tumorales appelée bioluminescence (environ 10 minutes, répétées maximum 5 fois sur 3 semaines) nécessiteront l'injection intrapéritonéale d'un produit de contraste (appelé luciférine) avant chaque acquisition ; après la 2ème chirurgie, des molécules fluorescentes seront injectées par voie intraveineuses (1 injection 1 fois) et un suivi par microscopie sera réalisé à différents temps (avant injection, 5 min, 1h, 4h, 24h, 48h, 72h et 168h après injection puis 1 à 2 fois / semaine pour une partie des animaux)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue correspond au développement d'une tumeur cérébrale qui peut induire des symptômes cliniques. Mais, l'expérience montre que l'intervention chirurgicale suffisamment anticipée (environ 3 semaines après la greffe de cellules tumorales) permet de lever ces symptômes. Les chirurgies et l'imagerie par émission de lumière (bioluminescence) se feront sous anesthésie chimique. Nous privilégierons l'anesthésie gazeuse lors des imageries en microscopie de fluorescence. L'imagerie par bioluminescence nécessite un transport des animaux dont les conditions ont été optimisées lors de projets précédents afin de réduire l'inconfort et le stress des souris. Le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée par les expérimentations diurnes sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Les injections en intraveineuse, effectuées dans la veine de la queue à l'aide d'aiguilles très fines, sont parfaitement maitrisées, ce qui permet d'éviter les risques d'extravasation notamment lors des injections d'agent anticancéreux.
Devenir
La fin de l'expérimentation correspond soit à un temps de prélèvement des échantillons, soit à l'atteinte d'un point limite, ce qui se traduit par la mise à mort pour tous les animaux.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte pas possible puisque la chirurgie des tumeurs cérébrales et l'analyse de ses conséquences, notamment sur le devenir d'agents thérapeutiques, ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Grâce au suivi par imagerie, nous sommes en mesure d'évaluer les événements au cours du temps. A ce stade, nous ne pouvons pas prédire si des différences faibles, modérées, ou fortes entre les différents lots et/ou au cours du temps seront observées. C'est pourquoi, nous prévoyons un maximum de 10 animaux / lot mais les expérimentations seront conduites par palier. Ainsi, pour l'étape 1, une appréciation intermédiaire des effets au bout de 4 animaux par lot (étape 1a) permettra d'ajuster la démarche en poursuivant uniquement pour les lots/les temps d'analyses/les paramètres les plus pertinents (étape 1b) selon un principe go/no go ("go" si une différence perçue doit être confirmée / "no go" si on ne constate aucune différence ou si une différence très évidente apparaît). L'étape 2 comparant la biodistribution et les effets des formes libre ou encapsulée d'agent anticancéreux ne sera conduite que si elle reste pertinente au regard des résultats de l'étape 1. Parmi les différents paramètres (longueur et ramification du réseau vasculaire, intensité de fluorescence proportion de surface fluorescente, etc…) obtenus à partir des analyses d'images de fluorescence acquises au cours du temps, ceux qui paraitront les plus pertinents feront l'objet d'une comparaison statistique.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, pendant l'hébergement, au moment des chirurgies et des imageries, et lors du transport entre les 2 établissements utilisateurs. Hébergement à 5 souris / cage jusqu'à la pose de la fenêtre crânienne puis hébergement individuel pour garantir le bien-être optimal des souris ; température et hygrométrie contrôlées, eau et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger. Pour prévenir la douleur liée aux interventions chirurgicales et au stress engendré par la contention, les animaux seront anesthésiés. Chirurgies : anesthésie locale et analgésie pré-, per-, et post-opératoire. Protection des yeux par du gel ophtalmique. Température de l'animal maintenue par tapis chauffant. Micro-saignements stoppés à l'aide de cotons hémostatiques. Au réveil : Maintien au chaud dans une cage propre ; administration d'eau sucrée et accès à quelques croquettes humidifiées placées directement dans la cage pour faciliter la réhydratation et la récupération. Après chirurgie : nettoyage quotidien de la zone incisée. Observation quotidienne du comportement naturel et face à l'expérimentateur pour évaluer la douleur et le stress ; mesure quotidienne du poids ; alimentation, hydratation, motricité et coordination. Quel que soit le groupe, la mise à mort sera pratiquée dès atteinte des points limites définis (perte de poids et problème de motricité essentiellement). Transport : à pied entre les 2 établissements d'expérimentation dans une cage à couvercle filtrant. Les cages seront placées dans un sac isotherme pour les isoler de l'environnement extérieur, et selon la température extérieure, des ‘bouillottes’ préalablement chauffées pourront être disposées sous la cage pour éviter des variations de température liées aux conditions climatiques.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibiltié et de leur facilité de manipulation. Les souris nue sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines : du fait de leur immunodéficience il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Nous utiliserons des souris femelles et mâles, puisque les paramètres à étudier sont a priori indépendants du sexe.
Effet de l’inhibition de CD146 endothélial dans un modèle murin du syndrome cardio-rénal de type 3 (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ischémie-reperfusion rénale d'environ 45 minutes sous anesthésie, six injections intraveineuses d'anticorps sur trois semaines, une biopsie de 2 mm pour génotypage, des échocardiographies hebdomadaires pendant quatre semaines, des prélèvements sanguins et urinaires à cinq dates, des passages en cage métabolique et un transport de douze heures entre deux établissements. Le porteur affirme qu'aucune alternative à l'animal n'existe dans la littérature pour étudier ce syndrome qui touche à la fois le cœur et le rein, et que la protéine visée deviendrait une cible thérapeutique si son hypothèse se vérifie. L'effectif se déduit d'un calcul de puissance fixant dix souris par groupe, auquel s'ajoutent 3 % de mortalité chirurgicale attendue, et une perte de poids d'environ 10 % est prévue dans les deux jours suivant l'ischémie.
Objectifs
Nous étudions la survenue et l’évolution d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale. Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d’une première protéine nommée P1 dans cette atteinte cardiaque aigüe ; en effet, lorsque P1 est augmentée dans l’organisme, il y a augmentation de l’inflammation et de la fibrose dans le myocarde. Néanmoins, lorsque P1 est génétiquement ou pharmacologiquement diminué, l’inflammation et la fibrose sont également moindres. Nos travaux ont également montré que cette protéine P1 interagissait avec une deuxième protéine (P2) et que cette interaction favorisait la sécrétion de cytokines (protéines inflammatoires). Il semblerait donc que cette protéine P2 ait également un rôle important dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Notre projet a donc pour but d’étudier l’inhibition de cette protéine P2 afin de voir si nous réduisons l’inflammation et la fibrose cardiaque suite à une atteinte rénale aigüe. Cette protéine P2 est retrouvée dans la membrane des cellules des vaisseaux sanguins mais elle peut également se détacher de la membrane et se présenter sous forme soluble pour se retrouver dans la circulation sanguine. Nous essaierons donc, dans une première procédure, de bloquer génétiquement l’expression de P2 grâce à une molécule T qui se fixe directement dans les cellules des vaisseaux sanguins, et dans une seconde procédure de bloquer la forme soluble de P2 grâce à un anticorps. Ensuite nous procéderons à une atteinte rénale aigue sur les souris et nous observerons l’apparition et l’évolution de la dysfonction cardiaque. Si notre hypothèse s’avère exacte, la protéine P2 deviendrait alors une potentielle cible thérapeutique dans cette pathologie cardio rénale. Ces travaux de recherche se dérouleront dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de déterminer l'intérêt de la protéine P2 dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Si nos hypothèses s'avèrent exactes, nous pourrions considérer cette molécule comme une cible thérapeutique potentielle pour cette pathologie.
Procédures
Les animaux subiront différents types d'injections : - Injections intraveineuses pour l'anticorps (2 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 6 injections au total ; une injection dure 1min), elles seront effectuées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique avant les chirurgies d'ischémie-reperfusion rénale ou contrôles (durée de la chirurgie : environ 45min pour les ischémies et 15 min pour les contrôles), avant chaque échocardiographie prévues toutes les semaines durant 4 semaines (une échocardiographie dure environ 15min par souris) ainsi qu'avant chaque prélèvement sanguin (un prélèvement dure 1min), ces interventions seront menées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales de la molécule de délétion génétique durant 3 jours à raison d'une injection par jour, elles seront effectuées au sein de l'EU2. Les animaux subiront également des prélèvements : -biopsies d'environ 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1, une biopsie dure 30 secondes. Ces prélèvements seront réalisés dans l'EU2. - sanguins à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. - urinaires à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 48h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. Pour les prélèvements urinaires, les souris ne resteront pas plus de 2h dans les cages métaboliques. Après chacun des prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera injectée à chacune des souris pour les aider à récuperer. Tous ces prélèvements se dérouleront dans l'EU1.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des biopsies de 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1. La douleur sera légère mais de courte durée. Les animaux subiront une ischémie reperfusion rénale qui pourrait engendrer une douleur. Une perte de poids d’environ 10% est attendue dans les 2 jours suite à cette intervention. De plus, ils subiront différents types d'injections : injections intraveineuses pour l'anticorps, intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique. Bien que ces injections ne soient pas douloureuses, elles pourraient tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de leur répétition. Le transport de l’établissement 1 vers l’établissement 2 pourrait également être une source de stress. Les souris subiront également des prélèvements sanguins et urinaires à différents temps, ce qui pourrait engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.
Remplacement
Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le cœur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire est calculé au vu des différences obtenues lors de nos précédents travaux afin d'obtenir une différence de 20% entre les groupes contrôle et ischémie, soit 10 souris par groupe sachant que la mortalité imputable à la chirurgie est estimée à 3%. Le calcul a été obtenu en utilisant un logiciel de puissance statistique, prenant en compte les différences observées, la puissance de comparaison et la mortalité imputable au modèle.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux en provenance de l’établissement secondaire. Le transfert sera effectué par un transporteur agréé et durera 12h. Un relevé de température de l’environnement sera fourni pour vérifier les bonnes conditions de transport. Les animaux déjà blessés, stressés ou malades au sein de l’établissement secondaire ne seront pas transférés. Une administration d’analgésique en sous-cutanée, en prémédication (45min avant l'opération) puis une anesthésie en intra-péritonéale seront effectuées pour toutes les opérations chirurgicales. Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des animaux avant la chirurgie pour éviter l'asséchement de leurs yeux. La prise en charge de la douleur post-opératoire durera tout l'après-midi (les opérations étant effectuées le matin) et une injection d'analgésie en sous-cutanée sera effectuée 6h après la fin de l’intervention. Une surveillance accrue (6h post chirurgie) sera réalisée après la chirurgie pour vérifier la bonne cicatrisation des animaux. Si toutefois des douleurs apparaissaient, une deuxième dose d’analgésique serait administrée avec ajout de nourriture gélifiée dans la cage. Nous utiliserons une anesthésie locale pour les prélèvements sanguins rétro-orbitaires et les injections intraveineuses. En cas de complications impossibles à traiter, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d'analyser l'effet d'une absence/surexpression d'un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour nos procédures expérimentales auront un fond génétique très utilisé dans la littérature pour étudier la pathologie qui nous intéresse. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 mois pour caractériser au mieux le syndrome cardio-rénal tel qu'il existe chez l'Homme adulte. De plus, ce stade permet aux animaux une récupération optimale après les chirurgies d'ischémie reperfusion rénale.
Restaurer les atteintes mnésiques dans les gliopathies auto-immunes chez la souris adulte
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mini-pompe osmotique diffusant des anticorps de patients leur est implantée sous la peau du dos au cours d'une chirurgie d'une heure trente, sans anti-inflammatoire possible puisque les maladies étudiées sont neuroinflammatoires. Suivent trois tests comportementaux étalés sur 37 jours, dont sept jours d'apprentissage à retrouver une plateforme cachée dans une piscine remplie d'un liquide opaque et un conditionnement contextuel en chambre, les mâles étant hébergés seuls, ce qui supprime selon le porteur le blottissement et le toilettage entre congénères. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni in silico ne permet d'étudier l'effet de ces anticorps sur la mémoire et que seuls des animaux vivants le permettent.
Objectifs
Les maladies de la neuromyélite optique (NMOSD) et de la MOGAD sont des maladies neurologiques auto-immunes très invalidantes qui détruisent certaines cellules du cerveau. Ce n’est que récemment que des études cliniques ont mis en évidence des atteintes en dehors du nerf optique et de la moelle épinière, notamment des atteintes de l’hippocampe dans le cerveau qui est une région responsable de la mémoire, et des troubles de la mémoire. Ces troubles sont encore peu étudiés dans ces deux maladies alors que cela représente un réel handicap chez les patients. Une étude préliminaire utilisant des anticorps de patients ayant la NMOSD (appelés NMO-IgG) a démontré que les NMO-IgG impactaient l‘activité des neurones de l’hippocampe suggérant un mécanisme concernant l’origine des troubles de mémoire chez ces patients. Les effets de substances pharmacologiques suggèrent qu’il est possible de combattre les effets délétères des anticorps de ces maladies sur la mémoire. L’objectif est de tester l’impact sur la mémoire spatiale des auto-anticorps NMO-IgG et MOG-IgG (anticorps de patients ayant la MOGAD) chez la souris. Il s’agira dans un premier temps d’évaluer si les souris développent des troubles de la mémoire liés à la présence de ces anticorps par la réalisation d’expériences testant la mémoire spatiale, une mémoire dépendante de l’hippocampe. Si tel est le cas, des substances pharmacologiques seront utilisées dans un second temps afin de déterminer si elles bloquent les troubles de la mémoire. Ce projet permettra d’une part de déterminer si les anticorps de ces maladies induisent des troubles de la mémoire, et d’autre part d’offrir de nouvelles solutions thérapeutiques ciblées de ces atteintes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra pour la 1ère fois d’identifier l’impact des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG sur la mémoire. Cette étude permettra de caractériser les troubles de la mémoire, si ce sont des troubles de l’apprentissage ou des troubles de la consolidation de la mémoire, dans la NMOSD et la MOGAD. Ce projet permettra également d’analyser l’impact des anticorps sur différents types cellulaires dans l’hippocampe. Il permettra ainsi d’établir un lien entre auto-immunité, astrocyte et myéline étant des types de cellules présentes dans l’hippocampe et impliquées dans la mémoire. Enfin grâce à l’utilisation de produits pharmacologiques visant à rétablir les troubles de la mémoire, ce projet est une approche pré-clinique qui permettra d’offrir des pistes thérapeutiques dans le traitement de ces troubles chez les patients ayant la NMOSD et la MOGAD.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule procédure chirurgicale avec implantation d'une mini-pompe osmotique, l'intervention durant 1h30 au maximum. L'intervention chirurgicale est suivie par une phase de récupération d'environ 5 jours. Par la suite, ils passeront 3 tests comportementaux étalés sur une durée de 37 jours. Le premier test qui durera 30 minutes permet d’évaluer l’état de stress de la souris. Pour le second test, la souris qui est posée dans une piscine avec un liquide opaque et thermostaté doit pendant 7 jours apprendre à se rappeler de l’emplacement d’une plateforme cachée. Un jour et un mois après apprentissage, les capacités de rappel de l’emplacement de la plateforme seront testées. Le dernier test consiste à placer la souris pendant 6 minutes dans une chambre de conditionnement où elle pourra associer un évènement au contexte dans lequel elle est (la chambre). Un jour et un mois après, la souris est replacée dans le même contexte (la chambre) pour tester les performances de sa mémoire associative. Ces deux derniers tests permettent d’évaluer l’apprentissage et la consolidation de la mémoire spatiale.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut induire des effets secondaires indésirables : perte de poids, douleur, stress pendant quelques jours. Les souris seront implantées avec une mini-pompe pouvant représenter une gêne et de l’inconfort pour les souris. La réalisation d‘injections peut engendrer du stress. Cela peut mener à des infections chez la souris tout comme la présence de points de suture. Les tests comportementaux peuvent également induire de l’inconfort (nouvel environnement), un certain degré de stress et de la fatigue (tests répétés). L’hébergement spécifique des mâles induit chez les souris des interactions sociales minimisées et une absence de contact physique positif qui empêche le blottissement, le toilettage et le réchauffement des souris entre elles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et d'analyser les altérations morphologiques et cellulaires.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle cellulaire ou in silico ne peut permettre d’étudier les conséquences cognitives des anticorps NMO-IgG et MOG-IgG. L’étude préliminaire ex vivo, bien qu’elle permette l’étude de mécanismes relatifs aux processus de mémoire, n’est pas suffisante pour démontrer un potentiel effet des anticorps sur des troubles de mémoire. L’étude physiopathologique de ces deux maladies, et donc l’effet d’anticorps sur la mémoire via des tests comportementaux, ne peut être effectuée que grâce à l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été établi à 15. Les prédictions statistiques se basent sur les résultats de plusieurs études comportementales menées chez la souris où le nombre d’individu requis pour observer des différences dans des tâches de mémoire où le comportement est subtil est de 15 avec une puissance statistique fiable, mais aussi sur l’évaluation d’un article. Dans cet article utilisant la même méthodologie que ce projet (diffusion d’anticorps humain de patients via une mini-pompe osmotique chez des souris de même souche), les résultats montrent qu’il faut au moins 15 souris par groupe pour atteindre une bonne puissance statistique. Deux études pilotes seront réalisées en amont des deux études comportementales pour permettre de valider la méthodologie. Il est important de noter que la deuxième étude pilote et l’étude comportementale sur la consolidation ne seront réalisées que si des différences statistiquement significatives sont obtenues lors de l'étude comportementale sur l’apprentissage. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, les souris ayant subi les tâches comportementales serviront également aux analyses du cerveau afin de corréler sur un même animal les performances de mémoire et les atteintes morphologiques.
Raffinement
Les animaux seront habitués à leur utilisateur et seront hébergés par petit groupe dans les cages ce qui permettra de réduire leur niveau de stress. Les cages seront enrichies par l’introduction de morceaux de carton, batônnets en bois à ronger, de la litière ainsi qu’une roue et un igloo. Les souris auront un accès permanent à l’eau et à la nourriture. Lors de la chirurgie, du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux. Une infiltration d’anesthésique sera faite en amont sur la zone d’incision. La cicatrisation sera facilitée en appliquant une crème cicatrisante sur la cicatrice. Un antiseptique sera appliqué sur la peau au niveau du champ opératoire et en post-opératoire sur la cicatrice pour éviter les infections. La mini-pompe osmotique sera placée sous la peau au niveau du dos et sur le côté pour ne pas gêner l’animal dans ses déplacements. L’emploi d’une mini-pompe osmotique a été privilégiée pour éviter des injections intracérébrales répétées aux souris. Le ciment dentaire utilisé pour fixer la canule sur le crâne sera limé si nécessaire pour éviter toute aspérité qui pourrait blesser la face interne de la peau de l’animal. Les maladies étudiées étant neuroinflammatoires, l’emploi de traitements anti-inflammatoires n’est pas envisageable. 8h après la chirurgie le temps que la première dose d’anti-douleur ait fait effet, les souris recevront une seconde injection en sous-cutané. Les souris feront l’objet d’un suivi journalier post chirurgie jusqu’à la fin de la procédure à l’aide d’une grille d’évaluation basée sur un système de scorage permettant l’évaluation de la douleur, du comportement, de la cicatrisation, du poids et leur prise alimentaire et de leur agressivité à la manipulation. Un score trop élevé sur l’ensemble des catégories ou l’atteinte d’un point limite dans une des catégories conduira à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car elle possède une organisation anatomique et un réseau limbique similaire à l’homme avec un hippocampe très développé. Depuis 50 ans, la souris est considéré comme un des meilleurs modèles expérimentaux pour l’étude de la mémoire. Depuis 15 ans la plupart des études dans ce domaine sont effectuées sur ce modèle. Une étude pilote a montré que les anticorps des patients NMOSD et MOGAD reconnaissent leur cible chez la souris. Enfin, les souris présentent l’intérêt de permettre l’utilisation facile de souris de modèles transgéniques. Les souris seront utilisées à un stade jeune adulte, soit à 8 semaines. A cet âge les souris ont atteint leur taille définitive facilitant l’implantation des mini-pompes osmotiques. De plus, l’étude sur laquelle les hypothèses statistiques se basent utilise des souris âgées de 8 semaines.
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur l’épilepsie des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris génétiquement modifiées pour développer une forme de maladie d'Alzheimer présentent déjà, entre 3 et 5 mois, des activités épileptiques. 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques de leur cerveau. Après une chirurgie de 90 minutes au plus pour poser des électrodes, chacune est isolée 15 jours sous enregistrement continu de son activité cérébrale, pendant que trois antidépresseurs, selon les groupes, sont mélangés à son eau de boisson durant 10 jours. Le porteur indique que certains antidépresseurs pourraient provoquer des crises d'épilepsie sévères et une mortalité précoce, et qualifie d'"indispensable" l'isolement pendant les enregistrements. Le bénéfice pour les patients reste au conditionnel : le projet "pourrait, à long terme", aider à limiter leur épilepsie, écrit-il.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzeihmer (MA) et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les activités épileptiques présentes chez nos souris. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrement continu de l’activité cérébrale par électroencéphalographie. Compte tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains anti-dépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur l’activité épileptique dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de limiter la survenue de l’épilepsie chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs exacerbent les activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres antidépresseurs ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes activités. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la maladie d’Alzheimer (MA) en évitant de majorer leur épilepsie.
Procédures
Les animaux anesthésiés et analgésiés auront une chirurgie (d'une durée maximale de 90 minutes) pour la pose d’électrodes afin de réaliser des électro-encéphalogrammes. Les encéphalogrammes des animaux seront réalisés en continu pendant 15 jours. Les anti-dépresseurs seront administrés par voie orale en les mélangeant à l’eau de boisson durant 10 jours.
Impact sur les animaux
La chirurgie est susceptible d’induire une douleur modérée au stade post opératoire durant 24-48 heures. L’isolement des animaux au cours des enregistrements électrophysiologiques durera 15 jours : ceci peut induire un stress modéré. Cet isolement est indispensable à la conduite des enregistrements. Habituellement, les évènements épileptiques des souris modèles de la MA sont essentiellement des pointes isolées qui surviennent pendant le sommeil et ne sont pas associées à une modification comportementale. Mais l’administration chronique de certains antidépresseurs pourraient exacerber ces activités épileptiques et provoquer des crises d'épilepsie sévères et ainsi provoquer une mortalité précoce des souris. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Le génotypage des animaux pourra entrainer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour récuperer leurs cerveaux en vue d'analyses histologiques.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer les effets des antidépresseurs couramment utilisés en clinique sur l’épilepsie dans la maladie d’Alzheimer (MA). L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n=12) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de l’activité épileptique des souris modèles de la MA, de sorte à avoir une puissance statistique suffisante pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (4 différents traitements) et intragroupes (comparaisons entre chacun des 10 jours de traitement à la baseline).
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris (handling) avant le début des enregistrements. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Si une altération de l’état est observée, une grille de scoring sera utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les critères évalués sont : l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration altérée), le comportement (posture, locomotion, isolement, réaction à la manipulation), le poids (pesée une fois par semaine puis quotidienne en cas de perte de poids). Pour ce dernier, le poids en fin de chirurgie sert de référence pour calculer le pourcentage de perte (pour prendre en compte le poids du connecteur). Nous avons identifié deux situations pour lesquelles une attention particulière sera portée aux souris : d’une part, la chirurgie (pose des électrodes d’éléctroencéphalographie (EEG) et période post opératoire) qui pourrait provoquer de la douleur ou de la souffrance ou l'angoisse et, d’autre part, l’isolement lors des enregistrements EEG, qui pourrait affecter le bien-être des animaux. Pour les chirurgies (acte avec réveil), les animaux seront d’abord anesthésiés puis analgésiés 15 minutes avant le début de la chirurgie. Une injection d'anti-inflammatoires sera réalisée en fin de chirurgie et le lendemain pour éviter d’éventuelles douleurs post opératoires. Pendant les deux semaines qui suivront la chirurgie, les animaux seront inspectés tous les jours. Les animaux doivent rester isolés les uns des autres lors des enregistrements électrophysiologiques pour éviter qu’ils ne rongent les câbles les uns des autres et pour éviter qu’ils ne perturbent le sommeil de leurs congénères. Or, il a été montré qu’un isolement peut provoquer une souffrance de l’animal et des modifications neurologiques si l’isolement dure plusieurs semaines (les isolements durent 5 semaines dans la plupart des études sur le sujet). Une attention particulière a donc été portée à la réduction du nombre de jours d’isolement (15 jours). La procédure s’achèvera ainsi par la mise à mort les animaux dès que les enregistrements seront terminés.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer. Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur l’épilepsie dans la MA. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 3 et 5 mois. A cet âge, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer mais présentent déjà des activités épileptiques qui ne progressent pas avec l’âge.
Etude du sommeil dans un modèle murin de la dystrophie myotonique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Après l'implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes qui enregistrent l'activité du cerveau et des muscles, des souris passent deux semaines isolées chacune dans un baril individuel, une semaine puis un mois après l'opération. 45 souris transgéniques et témoins vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour contrôler une seconde fois leur génotype et prélever leur cerveau. L'objectif est de décrire le sommeil de souris porteuses du gène humain muté de la dystrophie myotonique de type 1, une maladie où les patients souffrent souvent de somnolence pendant la journée. Le porteur affirme que la chirurgie "ne devrait pas induire d'effets indésirables", et prévoit pourtant un anti-inflammatoire et une surveillance de la cicatrisation autour de l'implant. Quant aux analyses moléculaires prévues sur les cerveaux, il écrit qu'elles "seront déterminées après l'analyse des résultats", sans en dire davantage.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1, prévalence : 1/8000) est une maladie génétique qui affecte presque tous les organes, comme le cœur et les autres muscles, mais aussi le cerveau. Il en résulte des troubles neurologiques qui ont un impact délétère sur les patients DM1 et leurs familles. Outre des symptômes cognitifs handicapants tels qu'une déficience intellectuelle sévère dans la forme congénitale, on retrouve chez les patients DM1 des altérations motrices, des changements de la perception de l’espace, un déficit attentionnel, de la fatigue intellectuelle et quelques cas d'épilepsies. Une somnolence excessive pendant la journée est également un symptôme fréquent. Initialement focalisée sur le muscle, la recherche sur DM1 dispose de peu de données sur la pathologie cérébrale et les mécanismes à l'origine des troubles neurologiques, comme l'altération de la qualité du sommeil, ont été très peu ou pas étudiés à ce jour. Notre but est de caractériser, dans le modèle murin de la pathologie, les modifications du sommeil.
Bénéfices attendus
La description très détaillée du cycle veille-sommeil au travers du modèle murin DMSXL apporteront des informations inédites sur la pathologie DM1. Nous pensons que les résultats obtenus aideront à la prise en charge de la maladie afin d'améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Les 45 souris auront une implantation chirurgicale, sous anesthésie générale, d'électrodes pour les mesures de l'activité électroencéphalographiques (EEG) et électromyographiques (EMG), chaque implantation durera au maximum une heure (en moyenne 45 minutes). Les souris seront placées en chambres d’enregistrement pour deux sessions d’une semaine d’enregistrement : une semaine après l’implantation chirurgicale et un mois après.
Impact sur les animaux
Outre l’injection intrapéritonéale de l’anesthésique qui pourra générer un léger stress, la chirurgie pratiquée ne devrait pas induire d’effets indésirables. L’effet indésirable attendu durant les phases d’enregistrement sera uniquement dû à l’isolement des animaux dans des barils individuels (les souris seront isolées deux fois 7 jours).
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de revérifier leur génotype. De plus, les cerveaux seront également prélevés pour des études ex vivo de biologie moléculaire, qui seront déterminées après l'analyse des résultats sur la qualité du sommeil.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro d’études du sommeil. L’étude du cycle veille-sommeil n'est possible que sur un animal entier, vigile et se comportant normalement.
Réduction
45 animaux au maximum devraient être utilisés. Nous prévoyons d’utiliser 12 animaux par groupe (souris transgéniques et contrôles). L’obtention des données qualitatives et quantitatives sera analysée par des tests classiquement utilisés dans l’étude du sommeil sur ces effectifs. Si les 12 premières souris d'un groupe donnent des résultats de qualité, on n’utilisera pas les 3 souris supplémentaires de ce même groupe.
Raffinement
Des mesures appropriées seront prises pour suivre la pathologie (surveillance de la pousse des dents qui seront coupées si elles deviennent trop longues), pour minimiser le stress et mal-être individuel (hébergement enrichi et en groupe avant la chirurgie pour éviter un isolement social), pour gérer la douleur avant, pendant et après la chirurgie (médications par un anti-inflammatoire, surveillance de la cicatrisation au niveau de l’implant d’électrodes), et pour limiter l’isolement pendant les phases d’enregistrement électroencéphalographique avec des cages individuelles en espace ouvert pour empêcher que les congénères ne dégradent les implants et permettre aux animaux de se voir et sentir leurs odeurs.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie permettent d'étudier les mécanismes physiopathologiques. De plus, chez la souris adulte, l’anatomie, les réseaux neuronaux et la neurophysiologie sont maintenant bien caractérisés et de nombreux tests ont été développés pour mesurer le sommeil dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Le modèle souris possède enfin les grands principes d’organisation anatomique conservés chez l’homme et les souris ont une taille cérébrale qui permet d’étudier les oscillations locales de l'hippocampe ciblé dans notre projet. L'étude sera réalisée sur des souris âgées de 2 mois (plus précisément 8 semaines) afin d'être à un âge 1/ où le phénotype DM1 est bien établi et 2/ compatible avec l'implantation aisée des électrodes pour la mesure du sommeil.
Explorer l’influence de l’âge dans les traitements contre le cancer : immunothérapie et radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
1720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune recevant une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans la babine, une irradiation sous anesthésie, puis six injections d'anticorps en deux semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les tumeurs implantées dans la babine gênent l'alimentation, celles greffées sous la peau provoquent une gêne liée à la croissance tumorale et une perte de poids. Une partie du protocole consiste à prélever le sang de souris jeunes sous anesthésie et sans réveil pour le transfuser à des souris de 15 à 18 mois, afin de voir si cela modifie leur réponse au traitement combiné. L'amélioration attendue du taux de guérison chez les patients âgés reste annoncée au futur, quand les greffes, l'irradiation et la mise à mort sont, elles, déjà programmées.
Objectifs
Le nombre de personnes âgées diagnostiquées avec un cancer ne cesse d'augmenter chaque année avec l'augmentation de l'espérance de vie. L’efficacité de certaines immunothérapies cempêchant l'inactivation du système immunitaire par la tumeur, combinée avec la radiothérapie est très prometteuse chez le patient âgé comme chez le patient jeune. Toutefois, il a été observé une baisse de certains types de cellules immunitaires chez le patient âgé comparé au patient jeune, ce qui peut impacter la réponse au traitement. Le patient âgé répond donc moins bien aux traitements comparé au patient jeune. Beaucoup d'articles ont été publiés, décrivant les nouvelles stratégies d'immunothérapies pour combattre le cancer mais peu traitent des effets du vieillissement, de l’immunité tumorale et de la radiothérapie. Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du vieillissement sur la réponse à l'immunothérapie combinée à la radiothérapie dans le cancer du côlon et de la sphère oto-rhino-laryngologique.
Bénéfices attendus
L'étude de l'impact du vieillissement sur la réponse à la radiothérapie combinée à l'immunothérapie, nous apportera des informations primordiales pour améliorer/rétablir l’immunité anti tumorale chez le sujet âgé. Cette approche permettra ainsi d’améliorer le traitement chez le patient âgé et augmenter le taux de guérison. La mise en évidence de différence de populations immunitaires entre le sujet âgé et le sujet jeune se font par des analyses de la tumeur et du sang circulant via des tests biologiques poussés.
Procédures
Pour chaque intervention, il y aura une injection des cellules tumorales en sous cutané ou en orthotopique sous anesthésie locale (durée 10 secondes). De plus, concernant les traitements des souris, elles seront irradiées sous anesthésie (durée: 10 minutes) puis traitées 3 fois par semaine avec un anticorps en intrapéritonéale durant deux semaines (durée de l'injection 10 secondes). Cette injection se fera sous anesthésie locale afin d’éviter une souffrance chez l’animal. Lors de la procédure concernant l’étude du microenvironnement, nous prélèverons la tumeur après euthanasie de la souris. Concernant la dernière procédure, qui va étudier l’impact d’une transfusion de sang de souris jeunes chez des souris âgées sur le traitement combiné radiothérapie/immunothérapie, ceci se fera par une seule transfusion sanguine avant le traitement de la radiothérapie et de l’immunothérapie. Nous allons prélever du sang aux souris jeunes sous anesthésie générale et sans réveil (durée maximale 10 minutes), puis injecterons ce sang dans les souris âgées sous anesthésie locale (durée 2 minutes maximum)
Impact sur les animaux
Les nuisances qui pourront survenir lors de greffes sous-cutanées sont une gène légère du fait de la croissance tumorale ainsi qu’une perte de poids légère qui peut éventuellement être causée par les traitements Les nuisances qui pourront survenir lors des greffes dans la babine seront une gène modérée à s'alimenter et éventuellement une perte de poids légère due à la localisation de la tumeur.
Devenir
Les snaimaux seront euthanasiés pour études et examen sur tissus et sang post-mortem.
Remplacement
Le recours à des modèles animaux est indispensable pour étudier les effets des combinaisons thérapeutiques dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et qui permet donc l’interaction des cellules tumorales avec le stroma (dont les cellules immunitaires sous dépendance de médiateurs type cytokines ou cellules provenant du reste de l'organisme). Cela est indispensable dans le contexte de la radiothérapie (par exemple: les effets que les cellules irradiées pourraient exercer sur des cellules non irradiées à proximité ou à distance par exemple). Il n’existe pas de modèles in vitro permettant une telle étude, ni de méthodes in silico. Le projet nécessite donc d’être mené sur un organisme vivant disposant d’un système immunitaire complet, en interaction avec tout le reste de l'organisme.
Réduction
Nous avons choisi d'utiliser le modèle du cancer du colon et le modèle orthotopique de cancer otorhinolaryngologique pour lesquels il y a beaucoup de données dans la littérature ainsi que dans notre laboratoire concernant la réponse à la radiothérapie et l'immunothérapie. Ceci nous permettra de réduire les conditions expérimentales (dose d'irradiation et d'immunomodulateurs) et donc le nombre d'animaux nécessaires pour tester nos hypothèses. De plus nous nous sommes basés sur des analyses statistiques précises pour déterminer le nombre nécessaire d'animaux par procédure et pour le projet.
Raffinement
Le développement de la tumeur sera suivi 3 fois par semaine par la mesure du volume tumoral grâce à un pied à coulisse et par imagerie du petit animal. Les souris seront pesées 3 fois par semaine. Un examen clinique quotidien sera effectué. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des nids en carton ainsi que du papier afin de diminuer leur angoisse. Des compléments alimentaires riches en énergie et facilement accessibles, ainsi que des médicaments analgésiques seront utilisés en cas de besoin.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie. Elles ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les souris seront âgées de 7 ou 8 semaines, un âge où la souris est suffisamment mature, représenteront les souris jeunes, et il s’agit de l’âge plus largement utilisé dans les études en cancérologie. Les souris âgées seront âgées entre 15 et 18 mois. Cela nous assure que le système immunitaire entre les souris jeunes et les souris âgées est bien différent, ce qui est primordial pour ce projet.
Identification de défauts cérébraux par imagerie médicale dans des modèles de souris d’une maladie génétique affectant les vaisseaux sanguins
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trois injections quotidiennes pour déclencher la modification génétique, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un agent de contraste dans la veine de la queue: 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les organes. Chaque séance dure environ une heure et intervient au premier puis au sixième jour après la première injection. Le projet porte sur les malformations vasculaires cérébrales d'une maladie génétique héréditaire dont ces souris reproduisent les mutations, avec l'espoir déclaré d'améliorer le diagnostic des atteintes cérébrales chez les patients. Ni la maladie étudiée ni la substance injectée ne sont nommées, et le porteur affirme que les souris ne présentent aucun signe visible de stress ou de souffrance, sans perte de poids ni modification de comportement.
Objectifs
Nous étudions une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Il s’agit d’une maladie génétique dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Très peu d’études sont réalisées sur le cerveau et pourtant dans cet organe, des mauvaises connexions entre les artères et les veines peuvent apparaître chez les patients mais les problèmes du système vasculaire du cerveau, et les répercussions que cela peut avoir sur les cellules nerveuses ne sont pas bien décrits. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Nous allons dans ce projet étudier les effets de la perte de ces acteurs sur les vaisseaux sanguins cérébraux par imagerie médicale. Cette technique nous permet de connaître de nombreux paramètres vasculaires et de voir les désorganisations des vaisseaux sanguins dans les souris malades. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le diagnostic des problèmes cérébraux des patients atteints de cette maladie.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins dans un organe encore très peu étudié, le cerveau avec une technique d’imagerie qui n’a encore jamais été utilisée sur ce type de souris. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique et les patients atteints de cette maladie ont parfois des problèmes de malformations vasculaires cérébrales. L’imagerie médicale apportera de nouvelles données d’imagerie qui auront un intérêt direct dans le diagnostic des atteintes cérébrales des patients.
Procédures
Des injections sont prévues pour induire la modification génétique mimant celle des patients (1 injection par jour pendant 3 jours). Deux imageries médicales maximum sont ensuite réalisées sur chaque animal au premier et au 6ème jour après cette première injection. Pour procéder à l’imagerie médicale, les animaux sont anesthésiés et un agent de contraste est injecté dans la veine de la queue. Chaque imagerie dure environ 1h.
Impact sur les animaux
Les injections induisent une douleur de quelques secondes lors de la piqûre. L'imagerie medicale nécessite une anesthésie générale le temps de l’examen. Les souris ne présentent pas de signes visibles de stress ou de souffrance, notamment aucune perte de poids ou modification de comportement n’ont été observées à l'âge où les expériences sont réalisées.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.
Remplacement
Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules composant les vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent aux malformations vasculaires cérébrales, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel statistique, ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires permettant de faire les tests statistiques nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Dix souris par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les changements de litière, de biberon et l’apport d’alimentation sont pris en charge par les zootechniciens de façon quotidienne, y compris les week-end. Les cages contiennent des petites maisons et du matériel de nidification changé régulièrement comme dispositif d’enrichissement. Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. L’imagerie médicale est réalisée sous anesthésie générale, avec un enregistrement des paramètres vitaux des souris (respiration rythme cardiaque). Pendant toute l’expérience, une échelle de cotation de douleur basées sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. En cas de signe de douleur, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques semblables aux mutations portées par les patients atteints de cette maladie. Elles constituent donc le meilleur modèle de la pathologie pour mieux comprendre les mécanismes de développement de cette pathologie et mieux développer des traitements. Les symptômes de cette maladie apparaissent à l’adolescence, nous allons étudier les phénotypes vasculaires à l’âge jeune adulte uniquement.