Souris

Deux heures d'anesthésie générale par séance d'imagerie TEP, et jusqu'à deux transports de quarante-cinq minutes entre deux établissements : 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vecteur de thérapie génique par injection intraveineuse rétro-orbitale, geste auquel le porteur associe un risque rare d'hémorragie, d'atteinte oculaire ou d'infection, puis un radiotraceur en perfusion, puis un prélèvement de sang. Toutes sont tuées à la fin, les analyses histologiques et biochimiques d'efficacité se faisant post mortem. Le porteur utilise deux lignées génétiquement modifiées à partir de douze mois, âge auquel leur cerveau présente les lésions de la maladie d'Alzheimer, et les suit sept semaines.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique et valider un biomarqueur d’imagerie nucléaire chez deux lignées de souris génétiquement modifiées, modèles de la maladie d’Alzheimer. Ce projet se déroulera sur 2 sites (EU 1/2 et 2/2) pour l'accès au système d'imagerie spécifique et les competences liées à cette imagerie qui ne sont disponible que dans le second établissement utilisateur.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle thérapie génique pour la maladie d’Alzheimer et de valider un biomarqueur d’imagerie pour le suivi de cette pathologie chez deux modèles souris de cette pathologie. Si le projet permet de confirmer la pertinence de ce biomarqueur, celui-ci pourrait potentiellement être utilisé en clinique Humaine pour le diagnostic ou le suivi de plusieurs maladies neurodégénératives. De plus, si l’efficacité de l’une des thérapies testées est avérée cela pourrait permettre de proposer des essais cliniques chez l’Homme, et donc à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladie d’Alzheimer, pathologie pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif et qui touche près de 900 000 personnes rien qu’en France.

Procédures

Une partie des animaux recevront une injection intraveineuse (durée 5 min) sous anesthésie générale (EU1/2). Ils seront ensuite transportés entre deux établissements utilisateurs par un transporteur agréé (45 minutes maximum, 2 fois maximum). Ils réaliseront une procédure d’imagerie par tomographie par émission de positrons (EU2/2) sous anesthésie générale, (durée 2 heures) durant laquelle une injection intraveineuse d’un produit nécessaire à l’imagerie (radiotraceur) sera réalisée en perfusion pendant 2 minutes (EU2/2). Cet examen pourrait être réalisé une 2ème fois (maximum) si l’on rencontrait un problème avec le radiotraceur lors de la première imagerie. Un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux sous anesthésie générale (EU1/2, 1 fois, durée 2 minutes). Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure (EU1/2).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont (dans l’EU1 sur 2) : un risque modéré cardio-respiratoire et hypothermique durant les anesthésies; un léger stress lors des anesthésies générales; une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite aux Injections intrapéritonéales, une légère douleur liée à la piqure de l’aiguille suite aux Injections intraveineuses rétro-orbitale du vecteur viral (durée 5 mn, sous anesthésie générale). Il existe un risque rare d’hémorragie, d’atteinte oculaire ou d’infection suite à cette injection intraveineuse. enfin, une légère douleur au point de prélèvements lors de la prise de sang (durée 5mn, sous anesthésie générale) et un stress lié au transport entre les 2 établissements utilisateurs et au changement d’environnement. Dans l’EU 2 sur 2, les effets indésirables sont une légère douleur liée à l’injection intraveineuse du ligand radioactif; un risque modéré cardio-respiratoire et hypothermique durant les anesthésies. De plus, lors du réveil les animaux peuvent être désorientés et stressés. Et enfin, un stress faible de l’animal lors des contentions tout au long de nos expériences.

Devenir

Tous les animaux injectés avec la thérapie génique à évaluer et leurs contrôles seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité.

Remplacement

Le projet vise à valider une thérapie génique pour la maladie d’Alzheimer, incurable à l’heure actuelle chez l’Homme, mais aussi à valider in vivo un biomarqueur permettant de suivre ou diagnostiquer la maladie. Les modèles in vitro (modèles de cellules de neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de notre approche de thérapie génique ; elle nécessite à présent d’être validée dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent dans notre cas puisque des modèles de la maladie d’Alzheimer associés à la mutation génétique que nous voulons cibler ont été créés chez cette espèce.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en maintenant des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 20 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Nous utiliserons deux lignées de souris génétiquement modifiées mais dans un souci de réduction nous utiliserons un seul groupe contrôle de souris non génétiquement modifiées pour ces deux lignées pour l’évaluation de la thérapie génique d’intérêt. Nous prévoyons au cours du projet un nombre total maximal de 120 souris. De façon générale nos résultats seront analysés statistiquement avec les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture (adaptée à leur stade physiologie) à volonté et ils bénéficieront d’un enrichissement réglementaire. En cours de procédure une attention particulière est portée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne, la mise en place de points limites et de soins adaptés Les animaux seront hébergés en groupe, en cas d’agressivité les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge), dans ce cas, on lui rajoute une maisonnette dans sa cage en plus des enrichissements habituels. Nous incluons dans notre étape d’injection uniquement des animaux qui font plus de 20g pour une meilleure récupération des animaux à l'anesthésie et à l'intervention, avec la mise en place de gel ophtalmique et la prévention de l’hypothermie en plaçant les souris sur un tapis chauffant. Un suivi rapproché est effectué au réveil. Les transports entre les 2 établissements seront réalisés par un transporteur agrée et dans des conditions contrôlées. Une phase d'acclimatation sera respectée avant toute manipulation dans le deuxième établissement. Les injections intraveineuses et la prise de sang seront réalisées sous anesthésie pour éviter le stress des animaux. Nous injectons un sédatif avant l’euthanasie pour éviter la douleur de l’injection et obtenir une pré-sédation. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Pour notre projet, nous avons besoin d’un modèle de la pathologie afin d’étudier les effets de notre thérapie génique sur la cible d’intérêt, et pouvoir évaluer notre biomarqueur d’imagerie dans le cadre de la maladie d’Alzheimer. De nombreux modèles de souris génétiquement modifiés ont déjà été mis au point, et deux modèles d’intérêts ont été sélectionnés pour notre projet. Les animaux utilisés pour l’évaluation de notre thérapie génique et de notre biomarqueur seront utilisés à partir de l’âge de 12 mois car il s’agit de l’âge où ils présentent des signes de la pathologie (au niveau du tissus du cerveau). Ils seront ensuite suivis 7 semaines pour l’évaluation de notre approche thérapeutique.

616 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de tissus destinés à la microscopie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Adultes comme nouveau-nées, elles subissent une chirurgie d'injection intracérébrale de quinze minutes, des injections intrapéritonéales, sept jours de restriction alimentaire destinée à les motiver pendant les tâches comportementales et sept jours d'hébergement individuel. Les tests annoncés portent sur la mémoire et l'anxiété, sans que soit précisé lesquels seront employés. Le porteur affirme que la souris est "l'espèce de choix" pour étudier le système nerveux des vertébrés et que les résultats en sont "très facilement transposables à l'homme", après avoir formé son hypothèse en culture de neurones.

Objectifs

Dans ce projet, nous cherchons à comprendre le rôle de certaines protéines qui interviennent dans les mécanismes de liaison cellulaire dans le cerveau. Nous voulons comprendre comment ces protéines connectent les cellules du cerveau les unes aux autres et leur permettent de communiquer. Plus précisément, nous nous concentrons sur des protéines appelées neuroligines, ainsi que sur d'autres protéines avec lesquelles elles interagissent, tels que les récepteurs impliqués dans la communication neuronale. Des études ont montré que la modification genetique sur ces protéines sont liées à des troubles neurologiques comme l'autisme ou la schizophrénie, qui impliquent des anomalies de connexions entre cellules cérébrales. A ce jour, nous ne savons pas exactement où sont localisées ces protéines de point de vue anatomique. Dans ce projet, nous avons deux objectifs principaux : (1) Visualiser ces protéines à différents moments du développement et dans des situations où les connectivités cérébrales changent. (2) Modifier l'expression ou la fonction de ces protéines dans le cerveau de souris, soit pendant leur développement, soit à l'âge adulte, pour mieux comprendre leur rôle dans la formation et le maintien des connexions cérébrales. Pour atteindre ces objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui nous permettent de marquer ou de supprimer ces protéines dans des types spécifiques de cellules cérébrales

Bénéfices attendus

Visualisation et compréhension des mécanismes des protéines qui interviennent dans la liaison cellulaire dans le cerveau. Comprendre le rôle des proteines de liaisons impliquées dans des pathologies comme l'autisme ou la schizophrénie à différents stades de développement du cerveau.

Procédures

Les interventions sont: chirurgie d’injection Intra-cérébrale chez les souris adultes et souriceaux(15min), injection intra-péritonéal(2min), restricition caorique pour motiver l'animal durant les tâches comportementales(7 jours), comportement pour tester la memoire et le phenotype d'anxiété(10minutes par session), hebrgement indivuduel de souris adultes pendant des périodes determinées avec contact visuel et olfactif avec ces congénéres à chaque session de comportement (7 jours)

Impact sur les animaux

Les procédures post-opératoires et l'analgésie se feront en minimisant la douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/Un risque de perte de poids durant la restriction calorique, en cas de perte de poids trop importante l'animal est nourrit à volonté pendant 48H. 3/Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.

Devenir

Mise à mort pour collecter les tissus pour les études histologiques et la microscopie

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Le concept du projet a été identifié par notre équipe avec des approches in vitro de culture de neurones de souris de type sauvage comme de neurones de nos lignées transgéniques. Pour vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 jour d'age jusqu'à 60 jours d'age

Des ultrasons focalisés ouvrent temporairement la barrière qui protège le cerveau de 36 souris, le temps d'y faire entrer une molécule radioactive. Ces souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées à l'issue, pour que soient recherchées les conséquences des ultrasons et la distribution du produit dans leur cerveau. Chacune fait l'aller-retour entre deux animaleries, subit une IRM de contrôle, reçoit le traceur par voie intraveineuse et enchaîne jusqu'à huit séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur signale que l'ouverture par ultrasons peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème, écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu sur les animaux, et limite le projet aux expériences qu'il juge "absolument indispensables".

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.

Quarante-cinq minutes de chirurgie abdominale pour implanter une sonde de température, et quarante-cinq minutes de plus, pour une partie d'entre elles, pour poser une canule sur la tête : 3 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des structures cérébrales. Chacune reçoit ensuite jusqu'à trois injections espacées de deux semaines, par voie intrapéritonéale, intraveineuse rétro-orbitale, sous-cutanée, intranasale ou directement dans le cerveau, chaque injection étant suivie d'un prélèvement de sang inférieur à 20 % du volume sanguin total. L'objectif est de repérer, parmi plusieurs nanocorps issus de lamas, celui qui transporte le mieux un peptide jusqu'au cerveau, la baisse de température corporelle servant d'indicateur du passage. Le porteur écrit que le choix de Mus musculus est "indispensable" parce que les nanocorps testés reconnaissent des cibles murines.

Objectifs

Le cerveau est protégé par des barrières naturelles qui servent de filtres limitant le passage de molécules entre le sang et les tissus cérébraux. Elles rendent difficile le développement de solutions thérapeutiques telles que des anticorps ou des peptides, pour traiter les maladies du cerveau. Or, avec l’impact socio-économique de ces pathologies, il devient urgent de développer des stratégies pour franchir ces obstacles. Dans une étude précédente, nous avons trouvé qu’un anticorps de llamas, généralement appelé nanocorps, pouvait servir de cargo pour faire entrer un peptide – la neurotensine – dans le cerveau. Celui-ci serait un potentiel médicament pour l’addiction, la maladie de Parkinson et la douleur. Lorsqu’elle est directement injectée dans le cerveau, la neurotensine induit une baisse de la température corporelle. Cependant, elle reste incapable de franchir seule la barrière sang-cerveau. Au vu de nos résultats encourageants, nous aimerions continuer notre investigation en testant d’autres nanocorps que nous avons au laboratoire. Nous continuerons à utiliser la variation de la température corporelle comme paramètre pour évaluer le transport de la neurotensine vers le cerveau. Ces nanocorps que nous testerons présentent différentes propriétés et ciblent différentes protéines dans le cerveau. L’objectif est d’identifier au moins un nanocorps qui serait le plus intéressant en termes de rapidité à atteindre le cerveau et de temps qu’il passe dans cet organe.

Bénéfices attendus

Les potentiels médicaments biologiques tels que des anticorps thérapeutiques, rencontrent de grandes difficultés à entrer dans le cerveau. Nos études ont montré jusque-là que des nanocorps, 10 fois plus petits que les anticorps classiques, passent dans le cerveau. Ce projet vise à déterminer si ces nanocorps peuvent servir de cargo pour transporter des molécules d’intérêt thérapeutique dans le cerveau, en l’occurrence le transport de la neurotensine qui présente un potentiel dans le traitement de l’addiction, la douleur, la maladie de Parkinson et l’accident vasculaire cérébral. Grâce à ce projet, nous pourrions proposer de nouvelles stratégies pour franchir les obstacles que forment les barrières physiologiques du cerveau et accélérer le développement de médicament pour cet organe.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une opération chirurgicale. Une partie sera soumise à une simple opération de 45 minutes dans l’abdomen pour l’implantation d’une sonde de suivi de la température corporelle. Pendant 45 minutes supplémentaires, le reste des animaux sera soumis en plus à une chirurgie d’implantation de canule sur la tête pour l’administration des nanocorps par voie intracérébrale. Les animaux auront des injections périphériques (intrapéritonéale, intraveineuse en rétro-orbital, sous-cutanée, intranasale) ou directement dans le cerveau selon le groupe. Ces injections dureront 2 à 10 minutes sous anesthésie ou sur animal pris en contention. Elles seront répétées trois fois sur un même animal, avec un espacement d’au moins deux semaines. Des prélèvements sanguins inférieurs à 20% du volume sanguin total de l’animal d’une durée de 2-3 minutes seront réalisés sous anesthésie à la suite de chacune de ces injections, donc à un intervalle de deux semaines.

Impact sur les animaux

Sont attendus : - une douleur légère produite par l’introduction d’une aiguille au cours de l’administration des analgésiques et des nanocorps ; -des douleurs post-chirurgicales liées à la suture de la peau du ventre ; - une gêne liée à la chute de température (sensation de froid concomitante à baisse d’activité).

Devenir

L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié afin de pouvoir prélever les structures d’intérêt pour analyse.

Remplacement

Nous étudions l’entrée des nanocorps dans le cerveau à partir d’une administration hors de cet organe Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable. Le cerveau est un organe complexe dont l’accès est principalement contrôlé par la barrière sang-cerveau. Mais, d’autres potentielles voies d’entrée existent et elles ne peuvent être représentées de manière exhaustive par des modèles isolés de barrière. D’ailleurs, d’après la littérature, ces modèles ne permettent pas de prédire systématiquement cette capacité d’entrée chez l’animal.

Réduction

L’étude sera réalisée sur un total de 3750 souris (3175 souris de phénotype sauvage et 575 souris génétiquement modifiées). Dans une logique de réduction, les expérimentations sur la majeure partie de l’étude (3250 souris) seront réalisées en longitudinal afin d’utiliser un seul animal pour tester plusieurs nanocorps différents. Le nombre de sujets nécessaire par groupe est proposé à partir d'un logiciel et sont cohérents avec les tests statistiques déjà publiés pour cette procédure expérimentale. Notre précédente étude ne montre aucune différence d’entrée de nanocorps entre les sexes. Par conséquent, nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos cohortes.

Raffinement

Cette étude impliquera l’utilisation d’une lignée de souris génétiquement modifiées. Elles présentent une déficience pour le récepteur d’un neurotransmetteur cérébral, sans impacter sur leur comportement et leur bien-être. Cependant, tous les animaux de cette étude seront placés dans un milieu enrichi (bâtonnets de coton et abri en carton) avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum, sous surveillance régulière. La procédure ne débutera que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement. Tous les actes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront suivis quotidiennement après l’opération. Les injections ainsi que les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les nanocorps à tester reconnaissent des cibles murines. Afin que leur passage à travers les différentes voies possibles d’entrée soit évalué, le choix de l’espèce Mus musculus est indispensable. Les souris seront traitées à partir de 5 semaines d’âge correspondant à l’âge adulte où la formation de la barrière sang-cerveau est complétement achevée.

Une chirurgie de trente à quarante minutes déclenche l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cerveau de 60 souris adultes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent des injections sous la peau cinq jours par semaine pendant deux à quatre semaines selon les groupes, et une pesée hebdomadaire. Le peptide testé doit franchir la barrière hémato-encéphalique et bloquer l'agrégation de la protéine, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternatives" à l'expérimentation animale pour en démontrer l'efficacité et l'innocuité. Toutes sont tuées à la fin, par thoracotomie et perfusion intracardiaque destinées à fixer les tissus avant analyse.

Objectifs

La plupart des molécules destinées à la thérapie de maladies neurodégénératives qui ont une efficacité in vivo n'atteignent pas leurs cibles parce qu'elles sont incapables de traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège le cerveau chez les vertébrés et même les invertébrés. L'une des stratégies non invasives les plus prometteuses pour l'administration de médicaments au système nerveux central (SNC) est l'utilisation de peptides qui traversent la BHE. Ces peptides sont capables d'améliorer le passage des composés à travers la BHE sans en altérer l'intégrité. Ils sont économiques, chimiquement polyvalents et non immunogènes selon des résultats déjà obtenus chez la souris saine. De plus, ces peptides combinent un ciblage sélectif et spécifique. Ils sont mieux adaptés que les petites molécules, ils présentent une faible toxicité et sont moins enclins à générer des mécanismes de résistance aux médicaments administrés de façon quotidienne à long terme. La maladie de Parkinson est reconnue comme la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente. Cette pathologie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans. La prévalence de la maladie augmente avec l'âge. Le coût économique direct et indirect estimé par patient tourne autour de 100.000 euros. Les traitements existants ne sont pas curatifs et ont des effets secondaires importants. Il s'agit donc d'une pathologie qui nécessite de développer des nouvelles approches thérapeutiques. La thérapie ici proposée utilise les dernières avancées en termes d’ingénierie peptidique pour permettre une pénétrance de la BHE optimisée, et combine cela à une stratégie d’arrêt d’accumulation de la protéine alpha-synucléine qui est clé dans le développement de la maladie de Parkinson. On testera ainsi l’effet protecteur de peptides anti-agrégation d’alpha-synucléine embarqués dans une navette qui les aide à traverser le BHE et arriver au cerveau de la souris parkinsonienne après avoir été injectés sous la peau.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif pour soigner la maladie de Parkinson, les traitements non-invasifs actuels ne traitent que les symptômes et ont, à terme, des effets secondaires assez importants, menant certains patients à arrêter le traitement. C’est pour cette raison que des nouvelles thérapies non-invasives sont toujours nécessaires. Le traitement que nous proposons est un peptide thérapeutique qui bloque l’interaction entre deux protéines dérégulées dans cette pathologie, une phosphatase et une kinase, et empêche ainsi l’accumulation pathologique d’alpha-synucléine. Ceci devrait conduire à une modification significative de la progression de la maladie de Parkinson si le traitement est administré précocement après le diagnostic.

Procédures

Les souris adultes seront sujettes à une seule procédure chirurgicale (30-40min) pour induire l’accumulation d’alpha-synucléine dans le cerveau, puis à un traitement par administration du médicament 5 jours par semaine (5min/jour) pendant 2 ou 4 semaines selon les groupes expérimentaux. Les souris seront pesées toutes les semaines. Lors de d’euthanasie les animaux subiront une thoracotomie pour permettre une perfusion intracardiaque et fixation des tissus.

Impact sur les animaux

Délivrer l’alpha-synucléine dans le cerveau nécessite une chirurgie ce qui peut entrainer une douleur modérée et transitoire péri-opératoire. Le traitement par injection sous la peau journalière pendant 2 à 4 semaines peut entrainer également un stress de manipulation/contention de l’animal. Une pesée hebdomadaire sera effectuée pour contrôler la normalité de la courbe de poids tout au long de l’expérience.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés par des méthodes adaptées et validées pour la réalisation d’une analyse post mortem complète des tissus.

Remplacement

Il n’existe pas à ce jour d’alternatives à l’expérimentation animale pour faire la preuve de concept d’efficacité et sécurité de notre thérapie/peptide. Il est nécessaire de prouver une efficacité de passage de la BHE en conditions physiologiques chez le modèle animal rongeur puis une bonne distribution dans les régions ciblées dans le cerveau. De même, la démonstration de l’innocuité du traitement impose la présence d’un système immunitaire fonctionnel ce qui est absente dans les cultures cellulaires. Cela justifie donc l’utilisation des modèles murins.

Réduction

Une simulation statistique précise a été réalisée pour déterminer le nombre minimum d’animaux par groupe, nécessaire pour observer des effets significatifs compte tenu de la variabilité de la technique d’analyse prévue (histologie). Cette simulation est fondée, d’une part, sur des données obtenues dans la littérature scientifique et, d’autre part, sur les résultats que nous avons observés dans le passé lors d’expériences similaires menées dans le laboratoire.

Raffinement

Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi, fournissant une palette de stimulations cognitives et motrices pour les animaux, et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés qui vont du soutien nutritionnel adapté à l’administration de médicaments. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Le protocole d’anesthésie et d’analgésie de la procédure chirurgicale a été défini et validé par une équipe vétérinaire et est implémenté en routine dans le laboratoire avec des résultats satisfaisants. Les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation à l’arrivée dans l’animalerie, de récupération après chirurgie et d’adaptation à la manipulation pour traitement quotidien qui ont pour objectif de garantir des conditions physiologiques et d’assurer un minimum de souffrance et stress pendant le protocole. La surveillance rapprochée et la mise en place de points limites (et de points d’alerte en amont des points limites) permettent d’évaluer une perte de poids, une infection, un changement de comportement en lien avec une douleur/ nuisance liée aux interventions.

Choix des espèces

Les régions les plus touchées du cerveau des patients atteints de la maladie de Parkinson sont la substance noire, où résident les noyaux des neurones dopaminergiques, et le striatum où se trouvent leurs terminaisons. Les modèles invertébrés ne possèdent pas de striatum. Les souris envisagées dans ce projet permettent d’étudier les neurones ciblés dans leur environnement cérébral complexe. De la même façon, les peptides utilisés dans ce projet doivent traverser une BHE, ce qui est difficilement atteignable sur des cultures cellulaires. La maladie de Parkinson est une maladie qui se déclare chez l’adulte. Pour cette raison, les animaux utilisés dans le protocole seront des animaux adultes avant le début de l’induction de l’agrégation d’alpha-synucléine et du traitement pour réduire ou empêcher son agrégation. De plus, l’innocuité du traitement et l’efficacité de passage à travers la BHE nécessite une physiopathologie adulte pour augmenter la fiabilité de la prédiction des résultats chez l’homme.