Souris
Evaluation d’une thérapie ciblée dans un modèle de tumeur du pancréas
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de quinze à vingt minutes leur greffe des cellules cancéreuses directement dans le pancréas, puis viennent des injections intrapéritonéales et intraveineuses trois fois par semaine, des pesées et un suivi hebdomadaire de la tumeur. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner une douleur modérée mais prolongée, que le développement tumoral peut provoquer des troubles métaboliques et une perte de poids au-delà de trois semaines, et que la chimiothérapie peut causer une cachexie. Il décrit une étude pilote de six souris par groupe destinée à calibrer les effectifs des expériences suivantes, et affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro.
Objectifs
On estime à environ 10.000 le nombre de nouveaux cas de cancer du pancréas en France. L'incidence dans le monde, varie entre 1 et 10 cas pour 100 000 personnes et reste globalement stable dans le temps mais en croissance dans les pays développés. D’ici 2030, il sera considéré comme le deuxième cancer le plus mortel au monde. Notre projet consiste à évaluer l’efficacité d’une thérapie dans un modèle tumoral murin du pancréas. L’objectif secondaire sera, si une efficacité est constatée, d’étudier les mécanismes d’action de notre candidat médicament. Cette étude pilote permettra de valider la maitrise du modèle de chirurgie expérimentale et de mesurer la variabilité des paramètres observer en réponse au différents traitements.
Bénéfices attendus
Le cancer du pancréas est difficile à diagnostiquer et particulièrement compliqué à traiter. Il résiste en effet à plusieurs traitements antitumoraux. Notre hypothèse est que notre cible thérapeutique joue un rôle dans le développement des tumeurs du pancréas. Nous nous basons pour cela sur des éléments d'évaluation de son expression dans une cohorte de patients atteints de ces tumeurs. Dans le cadre de notre société, nous évaluons l’effet anti-tumoral d’une thérapie ciblée seule ou en combinaison avec une chimiothérapie ou immunothérapie. Un essai clinique portant en partie sur le traitement de ces tumeurs avec notre thérapie ciblée a été initié début 2023. Les travaux présentés dans ce projet permettront une meilleure compréhension du fonctionnement du candidat médicament et de son fonctionnement en association avec des chimiothérapie et immunothérapies. Ils permettront également de mieux définir le profil des patients éligibles au traitement et susceptibles d’y répondre.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intra-péritonéales et intra-veineuses 3x/semaine lors des administrations thérapeutiques ainsi qu'une procédure chirurgicale permettant d’accéder au pancréas. Chaque souris sera soumise à des injections sous-cutanées pour l'administration d'analgésique. Chacune des injection dure moins d' 1 minute. La durée de la chirurgie est estimée à 15 et 20 minutes par animal. Les souris subiront différentes manipulations chaque semaine pour des pesées, le suivi de la croissance tumorale mais également une procédure de chirurgie de greffe de cellules cancéreuse en orthotopique dans le pancréas. Ces manipulations peuvent entrainer du stress durant le temps des contentions ainsi que pour l'anesthésie (endormissement et réveil) lors de la chirurgie.
Impact sur les animaux
L'anesthésie des animaux peut entrainer une détresse légère et une hypothermie de moins d'une 1h. La chirurgie peut entrainer une douleur modérée mais prolongée. Les piqures et contentions peuvent entrainer un stress physique et une douleur légère inférieure à 1 minute. Le développement tumoral peut à des tades tardifs (>3sem post induction) entrainer des troubles métaboliques conduisant à une perte de poids. La chimiothérapie peut entrainer une cachexiedes animaux. Aucune activité métastatique n'est décrite dans le modèle.
Devenir
L’ensemble des animaux étant soumis à la chirurgie seront mis à mort car notre projet nécessite le prélèvement d’organes pour analyse.
Remplacement
En raison de la nature complexe de nos recherches, qui visent à comprendre les interactions cellulaires au sein du pancréas et de différents organes affectés par sa dysfonction, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. Le modèle de greffe de lignées cellulaires sera utilisé en remplacement des modèles génétiquement modifiés d’origine ayant servis à l’établissement ces lignées. Cette démarche permettra une réduction du nombre de souris nécessaire à cette problématique scientifique et un raffinement avec une réduction des nuisances induites chez les animaux, liées aux troubles métaboliques retrouvés dans ces modèles.
Réduction
Nous réaliserons ici une étude pilote permettant d'évaluer la variabilité des différents modèles utilisés sur les différents paramètres observés en fonction des traitements. Ainsi un effectif de 6 souris par groupe sera retenu. Ces expériences permettront par la suite de calculer les effectifs nécessaires et suffisants à l'évaluation thérapeutique sur ces modèles. Les conditions ne montrant pas de résultats préliminaires encourageants ne seront pas refaites avec des effectifs statistiques.
Raffinement
Tout au long de notre expérience, le suivi rigoureux des animaux à l'aide d'une grille d'évaluation portant sur le poids, l'état général et le comportement. Celle-ci sera mise en place 2x/semaine les 2 semaines suivant la greffe et 3x/semaine la dernière semaine avant sacrifice. Des mesures sont mises en oeuvre en fonction des scores obtenus. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie et analgésie adaptée. Tous les gestes techniques et le suivi des animaux sont réalisées par du personnel qualifié afin de réduire au maximum le temps de manipulation et le stress des animaux. Une perte de poids et des signes de prostration sont également possibles en lien avec la pathologie induite ou après l’administration de chimiothérapie. Des mesures d'enrichissement du milieu (éléments de nidification supplémentaires) permettant un réchauffement des individus seront mises en place afin de limiter l’apparition d’hypothermies. De la nourriture semi-liquide sera mise dans la cage en cas de perte de poids >10%.
Choix des espèces
Le modèle de sourisutilisé est capable de générer des tumeurs pancréatiques dans 100 % des animaux. Il récapitule les aspects génétiques, moléculaires et micro-environnementaux liés à l’évolution de la maladie humaine. La souris immunocompétente est le modèle le plus approprié pour faire des suivis de pharmacocinétique dans le cadre de traitements avec des anticorps monoclonaux et de chimiothérapie. Par ailleurs les schémas d'administration des anticorps sont bien standardisés (voie, doses, posologies, ...) contrairement à d'autres espèces. Par conséquent, les modèles de souris immunocompétentes sont nécessaires à la réalisation de cette étude. Les souris adultes de 6 semaines ayant un système immunitaire compétent et un pancréas développé et fonctionnel seront utilisées.
Elevage des souris SOD1(G93A)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Destinées à alimenter d'autres projets autorisés, 5 210 souris porteuses d'un gène humain muté impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique naissent dans cet élevage, 2 610 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 600 un niveau léger. Chacune subit le prélèvement d'un bout de queue pour être génotypée. Ces souris développent une dégénérescence progressive des motoneurones, et le porteur écrit qu'il ne laissera pas les symptômes se développer, la plupart des animaux étant mis à mort au plus tard à soixante jours et les mâles reproducteurs à quatre-vingt-dix jours. La plupart partent vers d'autres projets autorisés, les mâles reproducteurs et celles qui n'y sont pas retenues étant tuées.
Objectifs
Il s'agit d'une procédure d'élevage de souris modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). La SLA appelée aussi Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative touchant spécifiquement des neurones, appelés motoneurones, qui innervent les muscles. La maladie se déclare à l’âge adulte, elle provoque la paralysie du patient et son issue est fatale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer plusieurs modèles murins de la SLA. Toutefois, les mécanismes conduisant à la dégénérescence spécifique des motoneurones restent inconnus. Il a toutefois été montré que la dégénérescence des motoneurones est due à des interactions complexes avec les muscles mais aussi avec plusieurs types cellulaires (neurones, cellules gliales) dans le système nerveux central. Les recherches actuelles ont pour objet 1) d'éclaircir les mécanismes conduisant à la dégénérescence des motoneurones spinaux, 2) de découvrir un traitement qui puisse ralentir l'évolution de la maladie.
Bénéfices attendus
Les animaux issus de cet élevage serviront à étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et d'essayer de découvrir un traitement destiné à ralentir les symptômes de cette maladie.
Procédures
Prélèvement d'un petit bout de queue pour génotyper les animaux.
Impact sur les animaux
Nous ne laisserons pas les symptômes de la SLA se développer. En effet, la plupart des animaux de cet élevage seront mis à mort au plus tard à l'âge de 60 jours (à ce stade les symptômes sont inexistants ou quasiment imperceptibles). Les mâles reproducteurs seront seront mis à mort au plus tard à l'âge de 90 jours où les symptômes sont légers et n'entravent pas les mouvements de l'animal.
Devenir
La plupart des animaux issus de cet élevage seront utilisés dans des projets autorisés. Seuls les mâles reproducteurs et les animaux non-utilisés dans des projets autorisés seront mis à mort.
Remplacement
La SLA est une maladie de l'adulte, or à ce stade, les motoneurones spinaux, qui sont les cellules qui dégénèrent dans cette maladie, ne peuvent pas être étudiés dans des systèmes in vitro dans lesquels ils ne survivent pas à ce stade du dévelopement (tranches de moelle épinière, moelle épinière entière ex vivo). De plus, nous savons que la dégénrescence des motoneurones dépend étroitement de leur environnement cellulaire dans la moelle épinière (circuits neuronaux spinaux, cellules gliales comme les astrocytes, les cellules microgliales et les olygodendrocytes) et des interactions que font leurs axones moteurs à la périphéries avec les cellules de Schwann et les fibres musculaires. Pour ces raisons, les études des mécanismes physiopathologiques de la SLA et aussi les effets de traitements éventuels ne peuvent se faire que sur l'animal entier.
Réduction
Cet élevage sera utilisé pour un ensemble de projets de recherche destinés à mieux comprendre les mécanismes de la SLA et découvrir un traitement potentiel pour ralentir l'évolution de la maladie chez les patients humains.
Raffinement
L'élevage est conçu pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. Les animaux seront soit utilisés, soit mis à mort avant l'apparition de symptômes susceptibles d'entraver leurs mouvements.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris dans lesquelles un gène humain muté, connu pour être impliqué dans la SLA, a été inséré par transgénèse dans le génome des souris. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones du cortex moteur, reproduisant les atteintes spinales et corticales caractéristiques de cette maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car la SLA est une pathologie qui touche les adultes.
Evaluation de nouveaux traitements dans le cancer du foie chez l’enfant
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
La souche retenue est fortement immunodéprimée, ce qui lui permet de développer les tumeurs implantées, et les animaux greffés sont des souriceaux très jeunes, choisis pour approcher l'âge des enfants atteints d'hépatoblastome. 1 100 souris vont être utilisées, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 100 un niveau léger. Des cellules tumorales leur sont implantées dans le foie après incision de la paroi ventrale, puis elles reçoivent un traitement deux fois par semaine et passent trois fois par semaine en imagerie de bioluminescence. Le porteur écrit que la majorité des nuisances n'aura pas d'effet puisque les souris sont manipulées sous anesthésie, et l'effectif de 1 100 comprend les mères, tuées elles aussi pour le prélèvement des tumeurs.
Objectifs
L’hépatoblastome est le cancer primaire du foie le plus fréquent chez l’enfant de moins de 5 ans. Le traitement de référence utilise une chimiothérapie à l’aide d’un agent anticancéreux utilisé à l’hôpital mais qui est très toxique et ne permet pas de guérir tous les enfants. L’hépatoblastome est un cancer caractérisé par des mutations bien connues mais les mécanismes biologiques responsables de son émergence après la naissance chez l’Homme restent très mal comprises. La disponibilité d’un modèle de cancer du foie chez la souris très jeune permet de mimer la maladie observée chez les enfants et d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de son apparition. Il permet également de tester l’efficacité de candidats médicaments dans un contexte physiopathologique plus en adéquation avec le très jeune âge des patients atteints de ce cancer.
Bénéfices attendus
Montrer que ces cellules d’hépatoblastomes répondent à une chimiothérapie et donc que ce modèle animal est utile pour tester de futurs médicaments. Disposer d’un modèle chez la souris très jeune qui permette d’étudier avec plus d’exactitude les mécanismes à l’origine de ce cancer pédiatrique.
Procédures
Implantation de cellules tumorales dans le foie après une incision de la peau au niveau ventral (1 seule incision et implantation, 10 minutes). Points de sutures au niveau ventral (3 points de sutures, 10 minutes). Administration de médicaments 2 fois par semaine (20 secondes par injection). Mesure de la tumeur par imagerie à bioluminescence 3 fois par semaine (10 minutes par analyse). Pesée des souris deux fois par semaine (20 secondes par pesée).
Impact sur les animaux
Les nuisances sont la manipulation des cages et des souris, l’injection de cellules et de solutions chimiques avec une aiguille, un stress lors de manipulations répétées, une légère douleur au point de piqure, une légère douleur liée au medicament injecté, une légère sensation de froid lors du nettoyage de la peau à l’alcool. Certains animaux seront traités par une solution de médicament déjà administré à des enfants hospitalisés et dont les effets sont bien connus. Cependant, comme les souris sont manipulées sous anesthésie, la majorité de ces nuisances n’aura pas d’effet sur les animaux.
Devenir
Les 1100 animaux (souris greffées et leurs mères) seront euthanasiées afin de procéder au prélèvement des tumeurs et leur analyse par des approches cellulaires, moléculaires et histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de cette souche de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent être obtenues par des modèles alternatifs d'étude en boite de culture, car ces derniers ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, la communication et la diversité d’interactions entre les cellules normales et les cellules tumorales dans un animal entier.
Réduction
Nos effectifs sont déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour des raisons de réduction, nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles.
Raffinement
Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, la douleur et l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront hébergées en animalerie, suivies quotidiennement pour détecter d’éventuels signes cliniques par du personnel qualifié. Les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie pour empêcher la douleur et le stress. Un analgésique sera utilisé 30 min avant toute opération. Les animaux sont hébergés en cages à raison de 3 mères et de 12 souriceaux par cage. Les conditions d’hébergements sont adaptées à la forte immunodépression de ces animaux : cages, nourritures et litières sont stérilisées. En cas de besoin et pour le bien-être des animaux, nous ajouterons de la nourriture humidifiée/ou du gel nutritif dans les cages ou feront des injections intrapéritonéales de sérum physiologique. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu en l’occurrence des nids de Woodwoll. En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Si pour une raison quelconque, un animal est considéré comme en souffrance, il sera traité par des analgésiques. S’il n’y a pas d’amélioration, il sera euthanasié sans attendre. Enfin, nous appliquerons les points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
1. La souche de souris choisie est largement utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié du fait de sa forte immunodépression. 2. L’expérience d’utilisation des chercheurs demandeurs. 3. Nous utiliserons des souris très jeunes pour mimer le plus justement possible le contexte de la maladie chez les enfants très jeunes.
Utilisation de nouveaux outils moléculaires visant à retarder le déclin cognitif dans un modèle de souris Alzheimer 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour tester si trois molécules candidates retardent le déclin cognitif de souris modifiées pour modéliser la maladie d'Alzheimer, 555 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique d'environ quarante-cinq minutes pour l'injection d'un virus dans le cerveau, puis des tests comportementaux quotidiens de un à huit jours, dont un conditionnement à la peur par chocs électriques d'une seconde à 0,4 mA. Le porteur qualifie cette douleur de "fugace" et affirme qu'elle n'induit "aucune douleur ni mal-être durables", alors que l'ensemble du projet est déclaré en gravité sévère. Les souris modélisant la maladie sont testées entre quatre et six mois puis entre huit et onze mois, et leur cerveau est prélevé pour vérifier la localisation de l'injection.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative, touchant environ un million de personnes en France. On estime environ 225 500 nouveaux cas diagnostiqués chaque année. A l’heure actuelle, il existe quatre traitements disponibles dont la Rivastigmine et la Mémantine. Néanmoins, ces molécules ne traitent que les symptômes de la maladie d’Alzheimer et ne permettent pas de guérir ou de stopper la progression de la maladie. Au bout de quelque années ces traitements deviennent donc inefficaces et la balance bénéfices/risques n’est plus positive dû aux effets secondaires de ces molécules (troubles digestifs, cardiovasculaire, insomnie etc.). Comprendre et traiter les mécanismes sous-jacents à la maladie d’Alzheimer est donc d’intérêt public. La maladie d’Alzheimer se caractérise par un déficit précoce de la mémoire épisodique, qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Ce type de mémoire repose en partie sur le processus de pattern separation, qui permet la discrimination de souvenirs plus ou moins similaires. Des défauts en pattern separation ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. De plus, la mémoire de travail (court terme ; ex : retenir un numéro de téléphone) est une des premières atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Ces troubles cognitifs sont associés à une dysfonction précoce du cortex et de l’hippocampe, impliqués respectivement dans la modulation de la mémoire de travail et du pattern separation. Notre équipe a récemment découvert des molécules qui améliorent le pattern separation chez la souris adulte saine, sans aucun effet délétère. Nous souhaitons maintenant tester l’effet de ces molécules dans des tests comportementaux permettant d’évaluer le pattern separation et la mémoire de travail, chez des souris transgéniques modèle pour la maladie d’Alzheimer. Les expériences seront réalisées dans 2 établissements utilisateurs différents. L’ensemble de ces analyses comportementales nous permettra de tester et valider l’effet nos molécules candidates sur l’amélioration de la mémoire dans des modèles murins sain et de vieillissement pathologique, afin de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus exprimant une de nos molécules candidates, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris contrôles. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer avec ce même virus à 4-5 mois ou 8-9 mois, nous espérons retarder l’apparition du déclin cognitif précoce (6 mois) ou retarder son évolution (10 mois). En testant 3 molécules candidates, nous espérons identifier le meilleur candidat afin de restaurer à la fois le pattern separation et la mémoire de travail affectés chez les souris modélisant la maladie d’Alzheimer. Ce projet permettra donc la mise en évidence et la caractérisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les résultats obtenus nous permettrons d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Nous souhaitons tester des molécules candidates chez la souris adultes et les utiliser ensuite chez des souris modélisant la maladie d'Alzheimer, afin de retarder le déclin cognitif. Pour se faire, nous injecterons directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus (maximum 1µl). La durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux évaluant la mémoire épisodique et la mémoire de travail. Le test de conditionnement à la peur peut générer de la douleur (faible et brève) et de la peur. Ces tests comportementaux sont d’une durée allant de 1 à 8 jours. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate injectée.
Impact sur les animaux
1) Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique pour injecter des virus dans une zone précise du cerveau, impliquée dans le pattern separation. Cette chirurgie, rapide et standardisée entraîne une douleur post-opératoire légère pendant environ 48h, qui sera suivie et contrôlée. Les virus injectés n’ont aucun effet dommageable connu ou prévisible sur l’animal. 2) L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Le test de conditionnement à la peur nécessite l’utilisation de charges électriques très brèves et de faible intensité, suffisants pour intaurer de la peur uniquement liée au contexte du test et de la douleur fugace chez l’animal, mais n’induisant aucune douleur ni mal-être durables.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou biomoléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. De plus, ce projet fait suite à un projet déjà réalisé dans le laboratoire pour lequel des données préliminaires sur animaux sains sont encourageantes. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux. Par ailleurs, nous utiliserons les mêmes animaux pour tous les tests comportementaux avec une évaluation de l’état de l’animal avant le début de chaque test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés lors des tests comportementaux, nous n’utiliserons qu’un groupe contrôle pour les tests concernant les souris modèle pour la maladie d’Alzheimer, ce qui nous permet de passer de 7 groupes de souris à 4 groupes.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Les animaux provenant de notre institut sont tous transportés entre les établissements, qui se trouvent dans le même bâtiment, sur des chariots en limitant au maximum bruits et secousses. Le transport est réalisé au moins une semaine avant le début des expérimentations pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire les biais expérimentaux liés au stress du transport. De plus, les animaux seront placés dans la salle de test 30 minutes avant le début des tests comportementaux pour les acclimater. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal (carrés de cellulose + papier kraft), surveillés régulièrement et des points limites de l’établissement et du projet suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un anesthésique gazeux pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite (e.g. administration d’un antalgique si l’animal est prostré, désinfection d’une plaie paraissant infectée, injection de glucose si l’animal perd trop de poids malgré la nourriture humide mise à disposition dans sa cage, chambre de réveil chauffée à 30°C, etc…). Nos animaux sont habitués à la manipulation 7 jours avant le début des tests comportementaux et ils sont pesés et observés tous les jours lorsqu’ils sont en test comportemental. Si une perte de poids et/ou l’animal paraît faible, froid, prostré etc., de la nourriture humidifiée est mise à disposition dans la cage. Si l’état de l’animal se dégrade, nous effectuons une injection de glucose 5% et nous demandons l’avis du vétérinaire référent. Pour réduire la peur et la douleur dans le test du conditionnement à la peur, le choc électrique est réduit à une durée (1 sec) et une intensité (0.4 mA) minimales.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. Les lignées sélectionnées pour notre projet sont déjà bien référencées et caractérisées. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier le pattern separation et la mémoire de travail chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous avons choisi d'utiliser 3 stades de développement. Pour la mise en place du test comportemental permettant d’évaluer le pattern separation, nous utiliserons des souris saines âgées de 4 à 6 mois. Les souris modèles pour la maladie d’Alzheimer seront testées au même stade ainsi qu’à un stade subséquent (8 à 11 mois). Les souris saines dans lesquelles nous évaluerons l’effet des molécules candidates sur le pattern separation seront testées à 6-10 semaines.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
Une tumeur cérébrale humaine implantée dans la boîte crânienne au cours d'une chirurgie de trente minutes, puis quatre semaines d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie et des transports en voiture entre trois établissements : 307 souris subissent ce protocole, 60 tuées sans réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Cent d'entre elles sont gardées vivantes pour la formation du personnel, les autres tuées aux points limites ou en fin de projet. L'objectif déclaré est de mettre au point un modèle pour tester la réoxygénation des tumeurs et leur sensibilisation à la radiothérapie, bénéfice que le porteur formule au conditionnel en deux lignes. Ce troisième volet reprend le même effectif de 307 souris que le volet précédent, publié le même jour, sans que la répartition entre les deux soit expliquée.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Etablissement d’un modèle d’injection intracérébroventriculaire chez le souriceau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
320 souriceaux vont être utilisés, tous tués à l'issue, 128 anesthésiés puis tués avant tout réveil et 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À deux ou trois jours de vie, chacun reçoit une injection dans les ventricules cérébraux, d'un colorant ou d'un fragment d'ADN ou d'ARN synthétique, sous anesthésie par hypothermie ou par gaz, les deux méthodes étant comparées entre elles. Une partie est suivie jusqu'à trente jours après l'injection, puis autopsiée pour prélever le cerveau, le foie et les reins. Le porteur conclut qu'il n'existe "pas de méthode alternative" pour évaluer une thérapie contre les épilepsies infantiles, au motif que des neurones en culture ne présentent pas de crise spontanée, alors que ce projet ne mesure aucun effet thérapeutique.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie des neurones dont le fonctionnement anormal entraîne des décharges électriques brusques et excessives – la crise épileptique. L’épilepsie infantile est une maladie rare mais sérieuse qui apparaît habituellement entre l’âge de 3 mois et 6 ans. Comme pour les adultes, le traitement des épilepsies chez l’enfant est principalement médicamenteux. Toutefois, plus d’un tiers des épilepsies infantiles sont résistants aux approches médicamenteuses existantes, d’où la nécessité d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques notamment pour éviter le recours à des interventions chirurgicales lourdes et risquées. Dans ce sens, de nombreux essais d'administration intra-cérébrale sont en cours, à la fois au stade préclinique et clinique, et suscitent déjà d'importants espoirs thérapeutiques à long terme. L'objectif de ce projet est de développer et valider un modèle permettant d'administrer un colorant non toxique ou une molécule thérapeutique spécifique (un fragment court d'ADN ou d'ARN synthétique) dans des zones précises du cerveau de souris nouveau-nées. Deux techniques d'anesthésie seront comparées : 1) L'anesthésie par hypothermie et 2) L'anesthésie gazeuse par inhalation. Cette comparaison vise à déterminer la méthode optimale pour anesthésier efficacement des souris nouveau-nées, minimiser la durée de l'anesthésie, l'inconfort de l'animal et le temps de séparation entre le souriceau et sa mère, tout en ciblant efficacement la zone cérébrale d'intérêt. La distribution de la substance injectée sera évaluée immédiatement après l'injection pour vérifier le succès du geste (procédure 1), et 7 jours plus tard pour s'assurer de la bonne récupération des souriceaux et comparer les 2 méthodes d’anesthésie (procédure 2). La validation du modèle sera assurée par l’évaluation d’une injection de la molécule thérapeutique avec la méthode anesthésique la plus appropriée. Les souriceaux seront suivis attentivement pendant 30 jours maximum (procédure 3). Une analyse macroscopique des organes post-mortem sera également réalisée au moment de l’euthanasie et le foie, les reins seront prélevés afin de réaliser des analyses sur ces tissus. La validation du modèle sera fonction de l’ensemble des résultats et des analyses. Le modèle établi servira in fine, au travers d’une demande ultérieure d’autorisation de projet, à évaluer l’effet thérapeutique à plus long terme d’une injection d’oligonucléotides dans le cerveau de souris épileptique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra d’informer sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité de la molécule thérapeutique au niveau du système nerveux central en développement et au niveau périphérique (ii) les modifications physiologiques induites par l’injection intracérébrale de la molécule thérapeutique (iii) le mode d’anesthésie à pratiquer sur des souriceaux afin de minimiser leur inconfort, maximiser leur survie et obtenir des résultats aussi reproductibles que possible.
Procédures
L'injection d'un colorant non toxique ou d’une molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du souriceau sera réalisée sur animal anesthésié et analgésié. L'administration sera unique et durera moins de 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront évalués avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyées d’une veille bibliographique inhérente à la molécule thérapeutique spécifique (un petit morceau d'ADN ou d'ARN synthétique) à injecter. Plus précisément, nous surveillerons l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un traumatisme et une inflammation transitoire au niveau du site d’injection, ou encore un comportement anormal de l’animal, une perte de poids.
Devenir
Devenir des souriceaux utilisés dans les 3 procédures : A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et minutieusement autopsiés. Les organes d'intérêts, dont les structures cérébrales, seront prélevés. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses ex vivo.
Remplacement
Les agents thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels présentent plusieurs limites, p.ex., l’étude de cellules neuronales en culture ne permet pas d’observer de crise épileptique spontanée ; la vascularisation cérébrale et les connexions entre neurones de différentes régions cérébrales étant absentes. De plus, ces études ne renseignent pas sur les effets d’agent thérapeutique sur un ensemble de cellules différentes, en particulier ici dans le cerveau. Le système nerveux central comme celui du nouveau-né est en perpétuel remodelage assuré par des régulations impliquant différents types cellulaires. Le développement cérébral et les mécanismes complexes de communication entre cellules ne peuvent donc être mimés par un simple modèle de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’efficacité d’une thérapie dans le traitement des épilepsies infantiles et ses effets éventuels sur le développement cérébral. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Les souriceaux des deux sexes seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une étude complémentaire pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux agents thérapeutiques, 8 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique, grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu après analyse des premiers résultats avant chaque protocole, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.
Raffinement
Les souriceaux seront stabulés avec leur mère respective. Pour les souriceaux gardés jusqu’à 30 jours après injection, une fois sevrés, ils seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement adapté n’induisant pas de stress et en veillant à séparer les mâles des femelles. Des mesures spécifiques de gestion de la douleur éventuelle occasionnée par l’injection intracérébrale seront prises pour éviter toute souffrance inutile et prolongée des animaux : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilitée d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des protocoles anesthésiques (par hypothermie ou à l’isoflurane) et analgésiques appropriés dès l’apparition de premiers signes cliniques. Une observation minutieuse des souriceaux sera effectuée durant la phase de réveil sur couverture chauffante puis lors du replacement dans la cage avec la mère. Les souriceaux seront également minutieusement observés 10min, 3h et 24h après le réveil puis 2x par semaine jusqu’à la fin des procédures. Ce score a été déterminé spécialement pour ce projet en se basant sur la littérature existante. Les souriceaux seront également pesés le jour de l’injection, puis tous les 2 jours jusqu’à 10 jours post-injection et enfin 2 fois par semaine jusqu’à 30 jours post-injection. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites à l’appui des grilles du bien-être animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère possède des organes et type cellulaires identiques à ceux de l’homme. De plus, la souris présente un patrimoine génétique et des caractéristiques comportementales, physiopathologiques et réponses tissulaires très proches de celles observables chez l'homme, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les pathologies humaines notamment celles du système nerveux. La souris étant fréquemment utilisée à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme. Par ailleurs, les structures cérébrales et nerveuses peuvent parfaitement être prélevées à partir de cet animal. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Les souriceaux seront soumis à une injection directement dans les cavités cérébrales (ventricules) du cerveau à l'âge de 2 ou 3 jours—une période critique du développement cérébral. Ce stade précoce est optimal pour cette procédure, offrant un accès facilité aux ventricules cérébraux. La procédure n°3, en particulier, permettra d’évaluer les conséquences de l'injection d'oligonucléotides sur un cerveau en pleine maturation. À un mois post-injection, le cerveau murin aura atteint environ 90% de sa taille adulte, avec la majorité des neurones déjà formés et en cours de différenciation. Cette approche permettra d'analyser l'impact global de l'intervention sur les structures et fonctions cérébrales, fournissant ainsi des données cruciales sur la sécurité potentielle de l’élément injecté dans le contexte du développement neurologique. Par ailleurs, l'utilisation de la fenêtre 2-3 jours pour les expériences, plutôt qu'un jour fixe, présente plusieurs avantages cruciaux pour l'optimisation du protocole expérimental et le respect des principes éthiques en recherche animale. Cette approche permet une gestion efficace des ressources en s'adaptant aux naissances survenant hors des horaires de travail habituels, réduisant ainsi le gaspillage d'animaux. Elle prend en compte la variabilité biologique naturelle entre les portées, permettant d'ajuster les protocoles d'anesthésie selon le poids et le développement de chaque souriceau.
NoseVac_BP ; Vaccin nasal innovant pour prévenir la colonisation de souches de Bordetella pathogènes et l’infection du tractus respiratoire supérieur chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
9 900 souris vont être utilisées pour des groupes expérimentaux de quatre à huit individus, répliqués sur trois expériences indépendantes. Chacune est anesthésiée puis infectée par instillation nasale de Bordetella pertussis, bronchiseptica ou holmesii, ou vaccinée par voie nasale ou intrapéritonéale, avant d'être tuée sept à vingt et un jours plus tard. 3 276 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 6 624 d'un niveau modéré, aucune ne pouvant être réutilisée puisque la vaccination ou l'infection modifie durablement leur réponse immunitaire. Le porteur affirme employer des souches virulentes "à des doses qui n'ont aucun effet délétère pour la souris", et reconnaît ne disposer d'aucun modèle établi pour Bordetella holmesii, dont le pouvoir pathogène reste à déterminer.
Objectifs
Les objectifs de notre projet consistent en la découverte de nouveaux facteurs bactériens impliqués respectivement dans la colonisation/maintien des bactéries dans le tractus respiratoire (nez et poumon) de la souris et pouvant potentiellement médier une protection contre un challenge avec une souche pathogène. Ainsi dans un premier temps des isolats cliniques récents de Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica et Bordetella holmesii seront testés dans un modèle murin pour déterminer leurs capacités à coloniser et persister dans le tractus respiratoire et également à disséminer dans le cadre d’une infection. Une recherche des déterminants bactériens surexprimés dans un environnement mimant le nez est en cours in vitro et in cellulo (cellules épithéliales nasales) par des études de transcriptomiques et de protéomique. Des souches bactériennes déplétées de certains de ces facteurs de virulence seront ainsi testées dans le modèle murin afin de définir le rôle de ces facteurs in vivo. Des candidats vaccins utilisant des antigènes modèles ou issus de l’étude in vitro en cours seront utilisés pour formuler des vaccins mARN, saARN (self amplifying RNA) ou protéiques. Ceux-ci seront ensuite testés chez la souris par administration nasale afin de définir les bases cellulaires et moléculaires de la réponse immune induite. Ces vaccins seront ensuite testés pour déterminer leurs pouvoirs protecteurs dans un modèle de challenge utilisant différentes souches pathogènes humaines de Bordetella.
Bénéfices attendus
Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous allons ainsi pouvoir mettre en place de nouveaux modèles de colonisation animale utilisant des souches virulentes humaines de B. pertussis, B. bronchiseptica et B. Holmesii. Il est à noter qu’il existe très peu d’études publiées à ce jour ayant étudié le comportement de Bordetella holmesii dans un modèle murin. Enfin, nous testerons des vaccins innovants à base d’ARNs ou de protéines, en cours de développement contre ces souches pathogènes. L’importance de cette étude est soulignée par l’augmentation croissante de cas de coqueluche à travers le monde. D’autre part, ce projet nous permettra de mettre en place un modèle murin pour étudier la pathogénèse de B. holmesii, considéré comme un pathogène émergent lié à des pathologies humaines respiratoires et disséminées. L’objectif final du projet est de concevoir des vaccins plus performants contre la coqueluche et mettre au point et évaluer un vaccin qui protégerait contre une infection à B. holmesii.
Procédures
les souris seront infectées sous anesthésie par une instillation nasale de la suspension bactérienne. Les souris seront vaccinées sous anesthésie par instillation ou injection des candidats vaccins par voie nasale ou intrapéritonéale respectivement.
Impact sur les animaux
Le modèle de coqueluche induit par B. pertussis ou B. bronchiseptica ne provoque pas de pathologie chez la souris aux doses que nous utilisons . Ceci a déjà été démontré par de nombreuses études dans notre laboratoire et d’autres laboratoires à travers le monde. Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons des souches virulentes de B. pertussis et B. bronchiseptica à des doses qui n'ont aucun effet délétère pour la souris car aucun dommage pulmonaire ou autre n'est observé. Il n’existe cependant pas de modèle murin pour B. holmesii et une étude exploratoire doit être menée pour déterminer la plus faible dose infectieuse permettant d’établir un modèle de colonisation/dissémination sans induire de pathologie préjudiciable chez la souris. Il n’existe aucun modèle animal pour Bordetella holmesii, cependant c’est une bactérie strictement humaine qui probablement comme Bordetella pertussis et Bordetella bronchiseptica ne mime pas parfaitement la pathologie humaine et donc induit des symptômes beaucoup plus légers dans le modèle murin. Pour les administrations par voie intranasale, nous pratiquerons au préalable une anesthésie chimique des souris. L'euthanasie se fera par dislocation cervicale ou par injection létale d’euthanasiant chimique.
Devenir
Les souris ne pourront pas etre réutilisées pour une autre étude car elles auront été soit vaccinées soit infectées ce qui engendre une réponse immunitaire empechant leur reutilisation
Remplacement
Nous appliquons la règle des 3R dans l’ensemble de nos projets. Cependant, lorsque l’on fait de la recherche en vaccinologie et pathologie, les modèles in vitro et in silico ne suffisent pas pour étudier les réponses du système immunitaire et l’établissement de l’infection chez l’hôte, et dans ces cas, les modèles animaux sont indispensables. De même, pour tester l’efficacité des vaccins à protéger contre les souches virulentes, le modèle animal reste incontournable. La tolérance locale des candidats vaccins et de leurs composants seront évaluées sur de la muqueuse nasale humaine avant l’utilisation dans le modèle murin. Ainsi l’épithélium différencié des voies respiratoires humaines sera reconstitué à l’aide d’un mélange de cellules primaires isolées à partir de 14 donneurs nasaux normaux différents. Uniquement les formulations vaccinales présentant une absence de toxicité sur les cellules seront testées chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible, le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse. Pour atteindre des valeurs statistiques satisfaisantes, 4 souris par groupe et par point de temps seront nécessaires pour les expériences de colonisation et d’immunisation, et 8 souris pour les expériences de challenge. Trois expériences identiques mais indépendantes seront réalisées pour renforcer les résultats. Pour les procédures où plusieurs groupes seront comparés, un test statistique sera réalisé. La significativité sera considérée si p < 0.05.
Raffinement
Nous definirons les doses infectieuses permettant de définir les modèles optimaux de colonisation de chaque souche bactérienne sans induire de pathologie préjudiciable chez la souris. Pour tester le pouvoir protecteur des vaccins, les animaux vaccinés ou naïfs seront infectés intranaselement par des souches virulentes. Les souris sont euthanasiées 7 jours plus tard pour B. pertussis ou B. bronchiseptica ou au maximum 21 jours plus tard pour B. holmesii dont on ne connait pas encore le pouvoir pathogène. Nous respecterons les points limites ainsi nous surveillerons régulièrement l’aspect physique des souris au cours de l'expérience, si nous observions des paramètres de souffrance nous sacrifierions les animaux immédiatement..
Choix des espèces
B. pertussis et B. bronchiseptica colonisent de façon efficace et transitoire le tractus respiratoire de la souris. Ce modèle animal nous permet donc d'étudier correctement les paramètres qui nous intéressent, à savoir la colonisation du nez et des poumons et l'induction de protection contre une souche bactérienne virulente. Pour B. holmesii le modèle murin n’est pas établi et doit être testé. D'autre part, de nombreux outils d'analyses sont disponibles dans le modèle murin pour regarder les réponses immunitaires induites, de type cellulaires, anticorps, cytokines etc... Nous utilisons des souris adultes, âgées entre 6 et 8 semaines. Notre objectif est d’étudier la colonisation du tractus respiratoire et la dissémination (pour Bordetella holmesii) des souches bactériennes et la mise en place d’une réponse immunitaire induite soit par les vaccins soit par les colonisations.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
La souche de souris retenue est choisie pour accepter l'implantation de lignées de glioblastome humain à l'intérieur de la boîte crânienne. 307 souris y sont utilisées, 60 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 59 un niveau sévère. Après une chirurgie crânienne de trente minutes, chacune passe par des séances hebdomadaires d'imagerie sous anesthésie générale pendant quatre semaines, jusqu'à deux heures par séance, la croissance de la tumeur pouvant entraîner une perte de poids marquée et des effets neurologiques. Cent souris sont gardées vivantes au terme du projet, pour la formation et le maintien des compétences du personnel.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 3 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) ) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2 (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
Gavées quotidiennement pendant toute la durée du protocole, placées en contention pour la mesure de leur composition corporelle puis isolées quarante-huit heures en calorimétrie, 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées à l'issue pour étudier la motilité de leur intestin à l'aide de capteurs isotoniques. L'objectif déclaré est d'identifier des molécules contre le diabète de type 2, un diabète que les expérimentateurs induisent eux-mêmes chez des souris saines par des régimes riches en graisses dont ils reconnaissent qu'ils peuvent altérer les fonctions hépatique et rénale. Le porteur indique que dix souris par groupe suffisent à garantir la reproductibilité, sans préciser comment ce chiffre aboutit à 1 200 animaux.
Objectifs
L'objectif central de ce projet est d'identifier et de caractériser des molécules bioactives potentielles pour la prévention et le traitement du diabète de type 2 (DT2). Le DT2 est une maladie métabolique chronique qui affecte des millions de personnes dans le monde et présente une sérieuse menace pour la santé publique. Nos recherches visent à découvrir de nouvelles molécules ou à optimiser celles déjà identifiées, qui pourraient offrir des alternatives thérapeutiques plus efficaces et plus sûres que les traitements actuels, tels que la metformine, le liraglutide, sulfamides... Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La recherche sur le diabète de type 2 (DT2) a un impact direct sur des millions de vies à travers le monde. Ce projet, en se concentrant sur l'identification de nouvelles molécules bioactives, présente plusieurs bénéfices potentiels qui pourraient considérablement améliorer la prise en charge de cette maladie grâce à de nouveaux traitements potentiellement plus efficaces : en identifiant des molécules bioactives inédites, nous pourrions découvrir des traitements qui surpassent en efficacité ceux actuellement disponibles. Ces molécules pourraient cibler la maladie sous des angles différents, offrant des thérapies plus adaptées à divers sous-groupes de patients. Notre recherche pourrait éclairer de nouvelles voies métaboliques ou biologiques associées au DT2, offrant ainsi de nouvelles cibles thérapeutiques pour le futur. Solutions naturelles et durables : Si des molécules bioactives sont identifiées à partir d'extraits naturels, cela pourrait conduire à des thérapies plus durables et éco-responsables, tout en valorisant la biodiversité et les savoirs traditionnels associés. En somme, les retombées de ce projet pourraient transformer la manière dont le DT2 est traité et compris, offrant de l'espoir à des millions de personnes et contribuant à une meilleure santé publique globale.
Procédures
Dans le cadre de notre projet sur l'identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2, voici les potentielles nuisances auxquelles les animaux pourraient être exposés : - pour tester l'efficacité de nouvelles molécules bioactives, la voie orale (gavage) est nécessaire pour cibler l'intestin. Le traitement est administré quotidiennement pendant la durée du protocole (30 secondes par gavage) et une fois pour le test oral de tolérance au glucose. De plus, les prélèvements de glycémie pendant 2 h sont effectués une seule fois en fin de protocole (10 secondes par prélèvement sanguin) pour le test de tolérance orale au glucose ou au xylose. Enfin, les animaux subissent une contention dans un espace restreint (mesure de la composition corporelle pendant 30 secondes) et l’isolement de 48h pour la mesure de la calorimétrie indirecte. Dans ce projet, la procédure 1 est entièrement réalisée au sein de l'établissement EU1. La procédure 2 est en partie réalisée au sein de l'établissement établissement EU1 et ce n'est que la dernière semaine que les animaux sont amenés dans l'établissement EU2 pour la colorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de notre projet sur l'identification de molécules bioactives pour traiter le diabète de type 2, voici les potentielles nuisances auxquelles les animaux pourraient être exposés : -Procédures : Pour tester l'efficacité de nouvelles molécules bioactives, la voie orale (gavage) est nécessaire pour cibler l'intestin. Ce geste ainsi que la contention des animaux lors du gavage peut induire du stress. De plus ,des prélèvements sang à la veine caudale des animaux sont nécessaires, ce qui pourrait causer du stress aux animaux. -Effets secondaires des molécules : Comme pour tout nouveau composé, il existe un risque d'effets secondaires inattendus qui peuvent affecter le bien-être des animaux. - Risque de maladie : L'induction du diabète de type 2 chez des animaux sains pour les besoins de la recherche pourrait affecter leur état de santé général et leur bien-être. En effet, les régimes riches en graisses peuvent induire des altérations de la fonction hépatique et rénale par exemple. - Transport des animaux : les animaux pourraient être perturbé par ce changement d'environnement.
Devenir
Les souris issues des procédures 1 ou 2 sont ensuite euthanasiées afin de d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques.
Remplacement
Pour identifier des acteurs moléculaires capables de ralentir les contractions duodénales, afin de restaurer l’activité du cerveau et à terme l’utilisation périphérique de glucose, nous avons besoin d'individus vivants sous différents régimes mimant les conditions physiopathologiques (diabète & obésité) où nos molécules pourraient avoir un effet thérapeutique. De plus notre projet implique la communication inter-organes, il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Toutefois, lorsque nous avons de nombreuses molécules à tester, nous avons développé un modèle de test d'efficacité in vitro sur cellules épithéliales intestinales afin de sélectionner un nombre limité de candidats efficaces à tester in vivo pour limiter le recours à l'expériementation animale.
Réduction
Le modèle utilisé dans ce protocole est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres métaboliques. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris sur ce modèle depuis plus de 5 ans ainsi que nos études bibliographiques minutieuses, nous permettent de limiter le nombre d’animaux. Par groupe, 10 souris sont nécessaires afin de garantir la reproductibilité des résultats tout en tenant compte de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Nous mettons mis en oeuvre diverses stratégies : - Formation et suivi des compétences de notre équipe afin de s'assurer que tous ceux qui s'occupent des animaux ou effectuent des expérimentations soient correctement formés pour le faire de manière éthique et humaine. - Hébergement enrichi : toutes les cages ont un igloo et 2 carrés de ouates pour fournir un environnement qui encourage les comportements naturels et permet aux animaux de vivre dans un environnement aussi proche que possible de leur habitat naturel. - Surveillance régulière : le bien-être et le comportement des animaux est vérifé quotidiennement (observation des animaux, de leur comportement, du pelage, de leur déplacement et comportement exploratoire, verification des croquettes et du biberon) et les souris sont pesées une à 2 fois par semaine pour vérifier que les points limite ne sont pas atteints. La surveillance et l'observation quotidienne minutieuse des animaux est effectuée avec une grille de scoring avec des critères précis et une fiche de suivi du bien-être animal à remplir par l'expérimentateur dès qu'une anomalie est observée. Les animaux sont hébergés dans une zootechnie agréée dans laquelle une structure du Suivi du Bien-Etre Animal est mis en place. Pour le transport entre les 2 établissements, une procédure décrit précisément toute la marche à suivre et les précautions à prendre pour limiter au maximum le stress des animaux. Les points limites de ce projet sont : Perte de poids atteignant 20%, altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), vocalisation, tremblements…, posture anormale (voûté ou déséquilibré pour soulager une zone douloureuse, démarche anormale, diminution des mouvements, prostration), troubles urinaires ou hyperglycémie trop importante qui engendredrait une souffrance de l'animal.
Choix des espèces
La souris réagit très bien aux régimes alimentaires déséquilibrés, modèle expérimental de référence dans l'étude du métabolisme glucidique. De plus notre équipe maîtrise l’utilisation de ces différents modèles chez la souris, nous permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux et d’assurer le suivi des souris. Stade adulte. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux.
Évaluation de l’importance du tissu adipeux médullaire dans l’homéostasie osseuse au cours de l’arthrose et la régénération après fracture dans un modèle murin transgénique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Opérées sous anesthésie en moins de quinze minutes pour installer une arthrose ou une ostéoporose, 440 souris transgéniques dépourvues de tissu adipeux subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 400 d'entre elles et léger pour les 40 autres. Leur glycémie est contrôlée tous les quinze jours par une piqûre à la queue, et une partie passe par des tests de douleur et d'activité physique, deux fois avant l'induction du modèle et deux fois après, sur animal vigile et pendant une demi-heure. Sept jours puis deux jours avant leur mise à mort, elles reçoivent deux injections intrapéritonéales. Toutes sont tuées pour prélever des tissus, une partie sans jamais être analysée puisqu'elle est mise à mort au titre de l'entretien de la lignée.
Objectifs
L’ostéoporose et l’arthrose sont deux maladies osseuses liées au vieillissement. L’ostéoporose se caractérise par une diminution de la qualité et de la quantité d’os qui entraîne un risque élevé de fracture et une faible capacité de régénération osseuse. L’arthrose inclut une disparition du cartilage et une modification de l’os sur lequel il repose. Ces dernières peuvent précéder les lésions du cartilage, suggérant que le contrôle de l’intégrité osseuse est important pour la physiologie des articulations. Un symptôme majeur des patients souffrant d'arthrose est la douleur qui est déclenchée par des changements périphériques et centraux dans les voies de la douleur. Cependant, les mécanismes impliqués dans la douleur aiguë et chronique ne sont pas encore bien compris dans l'arthrose. Le tissu adipeux de la moelle osseuse a peu été étudié jusqu’à présent et ses fonctions demeurent très mal connues. Des données récentes suggèrent qu’il contribue à réguler l’intégrité de l’os. Toutefois, son rôle dans la régénération osseuse en cas de fracture et celui dans l’arthrose n’ont jamais été investigués. Nous pensons que le tissu adipeux de la moelle osseuse pourrait jouer un rôle dans les altérations de l’os associées à l’arthrose et à la régénération osseuse après fracture. Les souris transgéniques que nous souhaitons étudier présentent une absence de tissu adipeux, notamment celui de la moelle osseuse. Nous voulons déterminer si cette absence est associée à des modifications de l’intégrité osseuses lors de l’arthrose et dans la régénération osseuse en cas de fracture. Nous voulons déterminer si l’absence d’une protéine spécifique jouant un rôle clef dans la fabrication du tissu adipeux et le stockage de lipides chez la souris est associée à des modifications de l’intégrité osseuses lors de l’arthrose et dans la régénération osseuse en cas de fracture.
Bénéfices attendus
Grâce à cette étude nous pourrons déterminer les conséquences de l’absence de tissu adipeux de la moelle osseuse sur l’homéostasie et la vascularisation osseuses au cours du vieillissement et dans deux contextes de pathologies osseuses : l’arthrose et l’ostéoporose. D’un part l'ostéoporose est la maladie osseuse la plus courante, touchant une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde. D’autre part l'arthrose est la maladie inflammatoire et dégénérative des articulations la plus courante, touchant près de 528 millions de personnes en 2019. La majorité des personnes touchées ont plus de 55 ans, et environ 60 pourcents d'entre elles sont des femmes. Par ailleurs, la lipodystrophie congénitale généralisée (absence de tissu adipeux, notamment dans la moelle osseuse) est une maladie rare, dont la prévalence est estimée à 1-10 cas pour 10 millions. Les patients qui présentent une lipodystrophie congénitale généralisée ont des problèmes osseux. Le modèle utilisé récapitule le phénotype observé chez l'homme, ce qui permettrait de poursuivre les recherches sur l’arthrose et la régénération osseuse post-fracture chez ces patients. Enfin, tester l'effet de l'absence de tissu adipeux de la moelle osseuse au cours du vieillissement ouvrirait les possibilités de traitements thérapeutiques et/ou pharmacologiques visant à moduler ce tissu chez les patients à haut risque de fracture et d’arthrose.
Procédures
Le modèle murin transgénique utilisé présentent une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), elles peuvent également développer une insulinorésistance et un diabète. Nous mettrons en œuvre deux modèles expérimentaux : un modèle d’arthrose et un modèle d’ostéoporose. Les procédures opératoires seront effectuées sous anesthésie et analgésie (pré- et post-opératoire) pour une durée inférieure à 15 minutes en incluant toute la préparation. Pour ces animaux, un suivi de la glycémie sera mis en œuvre tous les 15 jours par un prélèvement d’une goutte de sang (très faible volume) au niveau de la veine caudale (quelques secondes par animal). Nous réaliserons une évaluation de la douleur et de l’activité physique sur une partie des animaux avant l’induction des modèles d’arthrose (2 fois) et après (2 fois). Ces évaluations seront effectuées sur animal vigile non contraint pour une durée d’environ 30 minutes (temps de préparation/nettoyage compris). Les animaux recevront également deux injections intrapéritonéales d’une solution 7 jours et 2 jours avant l’euthanasie sur animal vigile (quelques secondes par animal). A l’issue de la période de maintien les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisée présentent une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), elles peuvent également développer une insulinorésistance et un diabète. La mise en œuvre des modèles d’arthrose et d’ostéoporose pourront entrainer des douleurs post-opératoires, une altération de la locomotion et une perte de poids associé. L’anesthésie nécessaire à la mise en place des modèles représente un risque de complication possible mais faible (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.). Le suivi de la glycémie au cours du temps par un prélèvement d’une goutte de sang (faible volume) de manière régulière ainsi que les injections intrapéritonéales de solution pourront entrainer une douleur et un stress de courte durée. Enfin, l’évaluation de la douleur et de l’activité physique peuvent provoquer un stress et un inconfort de courte durée.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
Un organisme vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de l’arthrose et de l’ostéoporose nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans ces pathologies complexes et multifactorielles. Notre projet se concentre sur le rôle du tissu adipeux de la moelle osseuse dans les altérations de l’os et de l’articulation au cours de ces maladies osseuses liées au vieillissement. Nous pensons qu’il joue un rôle essentiel dans le contrôle du microenvironnement osseux ce qui implique des interactions fonctionnelles étroites entre les cellules du tissue adipeux de la moelle osseuse et celles de son microenvironnement. Certains aspects de ces interactions peuvent être mimés par des co-cultures. Néanmoins dans une vision plus intégrée de ces maladies et dans un souci de comprendre leur développement et leur progression, aucun modèle cellulaire ou moléculaire actuel ne peut remplacer l’approche in vivo.
Réduction
Le projet impliquera un total de 440 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Compte-tenu que les caractéristiques du tissu adipeux de la moelle osseuse sont différentes selon le sexe, les expériences seront réalisées sur des animaux des deux sexes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, la définition des groupes/temps choisis sont basés sur les résultats d’études antérieures permettant connaître la cinétique d’apparition de l’arthrose. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress en utilisant de l’analgésie pré et post opératoire et de l’anesthésie. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Par exemple dans ce projet, le choix de la litière est adapté au modèle mis en œuvre afin que celle-ci soit la moins désagréable possible et n’augmente pas les potentiels douleurs liées au développement de l’arthrose. De même l’accès à l’alimentation sera facilité et son appétence améliorée notamment durant les phases post-opératoires. Le traitement analgésique sera prolongé au-delà de la période de couverture standard en cas de signe de douleur ou de difficulté dans les déplacements des animaux.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : Le projet est mis en œuvre sur un modèle murin transgénique présentant une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), et pouvant développer une insulinorésistance. Une telle déficience n’est disponible que chez la souris. De plus, les modèles d’arthrose et d’ostéoporose sont développés chez la souris. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Le modèle d’arthrose utilisé est le modèle expérimental le plus fréquemment utilisé pour étudier la physiopathologie de l'arthrose et l'efficacité des médicaments contre cette maladie. La chirurgie sera réalisée sur des souris de 12 semaines matures sur le plan squelettique. Le modèle d’ostéoporose sera mis en œuvre sur des souris de 6 à 7 semaines. Il permet de récapituler certains aspects du développement et de la croissance du squelette et de s’affranchir afin des problèmes associés au syndrome métabolique.
Implication du système immunitaire dans la résistance à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales destinées à déclencher des tumeurs de la prostate, puis, trois, cinq ou neuf mois plus tard, une ouverture de l'abdomen avec ou sans retrait des testicules, et enfin des injections de traitements stimulant ou bloquant les cellules natural killer jusqu'à quatre fois par semaine. Le porteur qualifie les suites opératoires de "douleurs mineures facilement prévenues" et écrit que l'étude pourra ouvrir de "nouvelles pistes thérapeutiques" contre les cancers résistants à la castration. Il affirme que la complexité des lésions précancéreuses "rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo", tout en indiquant que l'équipe étudie déjà une partie des paramètres sur des organoïdes dérivés des tumeurs.
Objectifs
Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la chirurgie et l'utilisation de traitement anti androgénique appelé castration chimique. Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence une implication forte du facteur de transcription Hif1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Ainsi nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de Hif1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires montrent un infiltrat de cellules natural killer majeur dans les souris sensibles à la castration comparé à celles qui présentent des tumeurs résistantes à la castration. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les cellules natural killer sont bloqués ou stimulés afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si les cellules natural killer permettent de rendre les tumeurs de prostate sensibles à la castration dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration.
Procédures
Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours pour induire l'apparition des tumeurs (5 minutes par souris), puis une intervention chirurgicale (castration/sham) 3, 5 ou 9 mois plus tard (30 min par souris) et les injections intra-péritonéales de traitement stimulant ou bloquant les cellules natural killer 1 à 4 fois par semaine pendant au plus 4 semaines (jusqu'à 12 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le blocage des cellules natural killer a été déjà éffectué dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'activation des cellules natural killer peut engendrer une perte de poids transitoire des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.Par ailleurs, nous utilisons des organoïdes dérivés des tumeurs pour étudier un certain nombre de paramètres, cependant l'étude du microenvironnement nécessite de se placer en condition in vivo stricte.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 3860 souris maximum.
Raffinement
On procèdera à l'anesthésie générale des souris par inhalation, et après l'induction, une analgésie en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, une injection en sous cutannée d'ant- inflamamtoire sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, une analgésie supplémentaire sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Par ailleurs, les animaux castrés (ouverture abdominale avec retrait des tesitcules) et les animaux sham (ouverture abdominale sans retrait des tesitcules) seront séparés: une cage sham versus une cage castré par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation), l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Après les injection-intrapéritonéales, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter une éventuelle infection sur les sites d'injection, et en cas d'observation de rougeur, de voussure ou de signe de douleur, les animaux seront retirés de l'étude et un avis vétérinaire sera pris. Par ailleurs, pour prévenir une éventuelle perte de poids liée aux traitements, le poids sera pris 1 fois par semaine pendant la durée de l'étude et en fonction de la différence de perte de poids observée, soit de la nourriture enrichie sera administrée aux souris, soit les animaux seront mis à mort et retirés des études.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes. A l'âge de 8 semaines, nous administrons le Tamoxifène pour induire le développement de tumeurs. Puis, 3, 5 ou 9 mois plus tard, nous débutons les expériences (castration et neutralisation des cellules NK, stimulation de ces cellules) avec les différents groupes expérimentaux et nous euthanasierons les animaux à un temps court et un temps long après les traitements.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, chacune recevant une puce électronique sous la peau avant le sevrage et une biopsie d'un fragment de queue dès deux à trois semaines d'âge. 250 d'entre elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales d'un agent chimique mutagène à quatre, cinq et six semaines, qui peut rendre stériles 70 % des mâles, les autres naissant, étant génotypées et maintenues pour l'entretien de la lignée. Toutes seront tuées dès les premiers signes biologiques de la maladie auto-immune, ce que le porteur présente comme un moyen d'éviter toute souffrance. Il annonce un effectif établi sur des études statistiques permettant d'utiliser "le moins d'animaux possible", sans expliquer comment ce calcul aboutit à 153 850 souris.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique et sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes). Toutes les interventions citées précédement seront réalisées dans un seul établissement utilisateur. Une puce électronique sera implantée à tous les animaux avant le sevrage par voie sous cutanée et des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à partir de 2-3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Ces deux interventions pourront être réalisées dans les deux établissements utilisateurs
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal. Quand des livraisons d’un établissement à l’autre seront réalisées, les animaux aptes au transport seront livrés via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux (colis comprenant alimentation, gel d'hydratation et enrichissement). Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.