Souris

Le choc, la détresse cardio-respiratoire et les troubles de la thermorégulation servent ici de critères de point limite, et une partie des animaux les atteindra assez tôt pour être tuée avant terme. 4 440 souris et 4 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 2 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 6 220 un niveau sévère. Un cathéter veineux leur est posé sous anesthésie, puis vient un gavage d'un agent toxique pour le foie deux à trois fois par semaine pendant dix semaines pour installer une cirrhose, avant une injection qui déclenche la défaillance hépatique aiguë. Le porteur écrit vouloir "reproduire une gravité qui sera jugée sévère" tout en maintenant les animaux dans un état qu'il estime acceptable, et renvoie au conditionnel les solutions thérapeutiques qu'il espère proposer aux patients.

Objectifs

La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui survient de manière aiguë, chez des patients qui souffrent d'une maladie hépatique chronique qui peut avoir différentes origines (virales,métabolique, ou médicamenteuse). La défaillance aigue généralement en raison d'un événement précipitant, et qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes Elle survient chez environ 30% des patients hospitalisés atteints de cirrhose et est associée à un taux de mortalité à 28 jours qui varie entre 20% et 70% selon le grade de l’ACLF. L'objectif de ce projet est d'instrumentaliser des voies veineuses chez le rongeur et de les utiliser dans nos modèles pré établis pour évaluer l'efficacité de produits nouveaux. Nous sommes effectivement contraints à effctuer des administrations soit en bolus unique, en admnistration répétées ou perfusions lentes, des composés que nous étudions. Les modèles intrumentés par un cathéter posé en voie veineuse ( dits cathétérisés) seront employés dans des modèles que nous avons déjà développés (modèles d'infammation aigue au LPS, de stress oxydatif à l'acétaminophène ou au pyrazole, ou d'alcoolisation massive produisant une translocation bactérienne ) sur des animaux sains,ou dejà atteints d'une maladie hépatique. dans le traitement des patients qui subissent cet évènement aigu.

Bénéfices attendus

Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second épisode d’ACLF Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme). A ces bénéfices attendus lors du déroulement de nos projets, nous avons ajouté la voie veineuse d’administration des composé étudiés qui reflète davantage la situation majoritairement vécue en clinique humaine

Procédures

Selon les procédures concernées, les gestes techniques pratiqués pourront être un peu différents : • Pour les opérations chirurgicales de pose du cathéter, les animaux seront anesthésiés au masque (anesthésie volatile au gaz) et ils recevront successivement : • 1 injection unique avant l’opération d’un médicament anti-douleur (=analgésique) • 1 injection de solution physiologique qui prévient la déshydratation fréquente lors de la chirurgie • 1 aspersion locale de médicament anti-douleur à l’emplacement de l’incision. • 3 injections par jour d’un médicament anti-douleur au cours des 3 jours qui suivent l’opération. • Pour les phases d’induction de la cirrhose hépatique Les animaux qui recevront par gavages un agent chimique toxique pour le foie (2 fois par semaine à 2mL/kg pour les rats et 3 fois par semaine pour les souris), pendant 10 semaines successives. Chaque manipulation de l’animal dure environ 15 secondes. Les animaux subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie volatile (prélèvement intermédiaire et final ; la durée totale de chaque prélèvement dure environ 2 minutes. • Pour la phase de déclenchement de la défaillance hépatique Les animaux recevront une injection intrapéritonéale à 5mL/kg pour les rats et 10mL/kg pour les souris. Durée du geste y compris contention est de15 secondes • Pour les études pharmacocinétiques Les animaux subiront des micro-prélèvements intermédiaires au niveau du cathéter sans introduction d’aiguille en conditions vigiles au nombre de 6 pour les rats et 3 pour les souris. Durée y compris la contention de l’animal 15 secondes Les animaux subiront des prélèvements terminaux sous anesthésie gazeuse. Durée y compris l’anesthésie : 2 minutes

Impact sur les animaux

La défaillance hépatique aigue du patient cirrhotique représente un évènement grave, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris ou le rat présente manifestement des signes cliniques d’inconfort. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car il est indispensable de recueillir les organes en vue d'analyses d'expression de gènes ( transcriptomique) , ou de proteine ( histologie)

Remplacement

La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.

Réduction

La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être pertinents. Nous écartons les paramètres peu représentatifs et peu discriminants statistiquement qui nécessiteraient des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". Des approches statistiques permettent d'affiner les effectifs et donc de réduire les nombres d'animaux.

Raffinement

Les rats sont hébergés par paires ou trios, les souris peuvent être gardées en groupes sociaux plus importants (5 ou 6 par cage). L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.

Choix des espèces

La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les espèces employées à ce stade de la recherche sont les rongeurs qui sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, et constituent modèles et des moyens vivants de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de la pathologie étudiée. Les méthodes chirurgicales de pose de cathéters chez les souris et rats sont parfaitement décrites et idéalement adaptées à l'utilisation de ces espèces dans ce projet. Les rats sont de jeunes adultes de 6 à 7 semaines d’âge, les souris sont-elles âgées de 8 à 10 semaines , elle ont alors un poids qui permettent une manipulation plus aisée ( environ 25gr)

Infectées par Mycobacterium tuberculosis par voie intranasale ou intraveineuse, puis gavées ou injectées cinq à sept jours par semaine pendant trois à huit semaines, ces souris peuvent aussi recevoir un second agent pathogène. 6 704 souris vont être utilisées, 5 028 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 676 un niveau sévère. Le porteur affirme que la surveillance biquotidienne permet "l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort", tout en jugeant "indispensable" d'observer chez les souris infectées par Plasmodium au moins deux signes de neuropaludisme, ataxie, hémiplégie ou tétraplégie, spasmes, coma. Toutes sont tuées par dislocation cervicale en fin d'expérience, pour le prélèvement d'organes.

Objectifs

Le projet présente trois objectifs distincts: - étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose. - évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. - étudier l'évolution de la co-infection (par un agent pathogène secondaire) dans un modèle de souris infectée de manière latente par M. tuberculosis.

Bénéfices attendus

Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,3 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2023 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19. Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent à identifier de nouveaux composés à visée thérapeutique efficaces sur les souches multiresistantes et à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec les mycobactéries, afin de comprendre tous les mécanismes responsables de l’infection, mais également de caractériser et étudier l'impact d'une co-infection chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.

Procédures

Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage (durée d'intervention : 1 minute) ou voie intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale - durée d'intervention : 2 minute) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale (durée d'intervention : 3 minute) ou intranasale (durée d'intervention : 1 minute) peut également être utilisée 3 à 5 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes est réalisée par voie intranasale (durée d'intervention : 1 minute) sous anesthésie ou par voie intraveineuse (durée d'intervention : 2 minute), intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou sous cutanée (durée d'intervention : 1 minute) sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis (ou BCG) (durée d'intervention : 1 minute), puis (ii) un des autres pathogènes étudiés (durée d'intervention : 1 minute).

Impact sur les animaux

Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés. Des points limites basés sur l’apparence et le comportement des souris sont observés quotidiennement, afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques est utilisée et le « score de douleur » permet de déterminer le niveau de souffrance de l’animal. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) sont euthanasiés. Dans cette procédure, la perte de poids constitue le point limite majeur pris en compte. L’évolution du poids est suivie au minimum 2 fois par semaine. Une perte de poids > 20%, seule, entraine l’euthanasie de la souris. La prostration est également un des indicateurs de douleur pertinent dans le cas d’infection de certaines souris transgéniques. Lors de l'infection par Plasmodium, la mise à mort fait suite à l'observation de deux symptômes caractéristiques du neuropaludisme : ataxie, hémi ou tétraplégie, spasmes, coma pour les souris infectées par Plasmodium berghei ANKA. Aussi, il est indispensable pour l'étude du neuropaludisme d'observer au moins ces deux signes cliniques, la pathologie étant cérébrale et ne pouvant être diagnostiquée que par ces signes. Néanmoins, l'apparition de ces signes cliniques étant dans une fenêtre connue (6 à 10 jours après infection), les animaux seront surveillés toutes les demi-journées, permettant l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort.

Devenir

Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.

Remplacement

Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire.

Réduction

Les expériences sont répétées en triplicate sur 4 animaux par groupe expérimental. Les résultats sont analysés statistiquement avec le test de Student. Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires.

Raffinement

De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées au moment des différentes administrations invasives. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues. Le cas échéant les souris sont préalablement anesthésiées: - à l’aide d’une solution d’isoflurane (2%) par la voie aérosol. Les souris sont placées par série de 4 dans une boite d'induction étanche en plexiglas avec joint (L21,8*l12,8*H12,9 (3,6 l)) pendant environ 5 à 10 minutes où elles respirent les vapeurs d’isoflurane. La durée d'anesthésie est d'environ 1 minute. - par injection intrapéritonéale d'une solution contenant 1 mg/ml de Xylazine (Rompun®) ou Diazépam et 10 mg/ml de Kétamine (Clorketam 1000-Vétoquinol®), préparée en PBS. 50 à 100 μl de ce mélange est administré pour 10 g de souris (soit 5 à 10 mg/kg de Xylazine et 80 à 100 mg/kg de Kétamine). La durée d'anesthésie est d'environ 20 minutes.

Choix des espèces

1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.

Pour tester si l'inhibition de modulateurs de l'autophagie prévient le sepsis, 2 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 810 d'entre elles et sévère pour 1 620. Chaque animal subit une ligature et ponction du cæcum, une chirurgie d'environ vingt minutes qui déclenche une infection généralisée, puis reçoit quatre ou cinq injections, une mesure de pression artérielle et une échocardiographie sous anesthésie. Le porteur énumère les atteintes attendues du sepsis, dysfonction d'organes, hypotension, altération de la coagulation et de la thermorégulation, et prévoit une chirurgie terminale pour une partie des souris. Il annonce un score de sepsis murin pour fixer les points limites avant que l'animal ne se retrouve en sepsis sévère, alors que 1 620 souris sont déjà déclarées en souffrance sévère.

Objectifs

La septicémie est la complication la plus grave des infections. Elle peut survenir de manière imprévisible lors de n'importe quelle infection bactérienne ou virale. Le sepsis se développe en raison d'une dysrégulation des défenses de l'organisme contre l'infection, entrainant le plus souvent un excès d'inflammation qui, à son tour, perturbe le fonctionnement des différents organes (https solidaires-sante.gouv.fr). Nous avons démontré, in vitro et in vivo, que des modulateurs de l'autophagie (processus naturel que les cellules de notre corps utilisent pour nettoyer et recycler leurs composants endommages ou inutiles), libérés par les cellules et les organes, sont impliqués dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. L'inhibition de ces modulateurs, chez la souris, induit la perte de poids et réduit l'apport alimentaire. Nous avons également démontré que la neutralisation de ces modulateurs induit l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l'objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de ces modulateurs de l'autophagie peut prévenir la septicémie chez un modèle murin approprie, la ligature et ponction du caecum (CLP).

Bénéfices attendus

Chaque année, le sepsis frappe près de 50 millions de personnes à travers le monde, affectant plus de 40% d'entre elles qui sont des enfants de moins de 5 ans. Bien que le sepsis impacte de manière significative les nations pauvres et émergentes, il demeure également l'une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, avec la particularité que la majorité de ces tragédies pourrait être évitée. En Europe, le sepsis est estimé causer près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France. Ce projet revêt une importance cruciale, car il vise à valider une nouvelle stratégie thérapeutique contre le sepsis dans un modèle préclinique exhaustif, reproduisant fidèlement l'évolution clinique de la maladie. En parallèle, il offrira une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des mécanismes physiopathologiques liés au sepsis, qui demeurent insuffisamment caractérisés jusqu'à présent.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (CLP; durée environ 20 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Tous les animaux recevront des injections sous-cutanées (quelques secondes). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, sous cutanée ou intra-veineuse. Selon les procédures chaque animal recevra soit 5 ou 4 injections (quelques secondes). L'injection intraveineuse sera effectuée en plaçant l'animal dans un dispositif de contention et la procédure durera moins d'une minute. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes. Les trois dernières techniques décrites sont des procédures « légères » au cours desquelles les animaux sont soumis à un stress minimal de courte durée. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie d’une durée de 20 minutes et seront euthanasiés sans réveil. Les prélèvements seront effectués après l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Des infections pourraient se produire au niveau des sites des injections. Les souris qui seront soumises aux injections subiront un stress lié à la contention de courte durée. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (CLP) qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie. Les nuisances/effets indésirables induits par le sepsis peuvent être : Inflammation systémique, dysfonction d'organes, altération de la coagulation, hypotension, altération de la barrière intestinale ; dysfonction immunitaire et l’altération de la thermorégulation. Les sites des injections ou le site d'incision chirurgicale pourraient s’infecter. Il pourrait y avoir une mauvaise cicatrisation de la plaie chirurgicale. Une dessiccation des tissus et un inconfort pourraient être observés. L'anesthésie peut entraîner différents effets indésirables comme une dépression respiratoire, une hypothermie, et des troubles du réveil.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Le sepsis est le résultat d'une réponse immunitaire incontrolée à une infection. Cette situation découle d'une série d'événements complexes, comprenant l'activation des cellules immunitaires et la libération de cytokines, l'activation des voies de coagulation, ainsi qu'un dysfonctionnement endothélial, qui ensemble contribuent à la défaillance d'organes. Actuellement, il est impossible de reproduire de manière fidèle en laboratoire la complexité et les conséquences du sepsis. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux vivants demeure impérative pour étudier cette pathologie.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2430 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés afin d’avoir une interprétation fiable des résultats. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés régulièrement afin de respecter leur bien-être. Le comportement général des animaux sera suivi. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Le MSS ou score de sepsis murin sera utilisé pour évaluer l'état clinique des souris atteintes d'un sepsis. Nous nous baserons sur ce score pour définir nos point limites avant que l’animal se retrouve dans un état de sepsis sévère. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Nous utiliserons des souris immunocompétentes. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

La paralysie part de la queue et remonte le long de la moelle épinière, et le porteur limite la procédure à trente jours pour cette raison. 660 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 570 en sévère, toutes tuées pour analyse. Elles reçoivent des injections sous-cutanées et intraveineuses sous anesthésie gazeuse pour induire une sclérose en plaques, ou des cellules tumorales injectées sur chaque flanc suivies de quatre injections de traitement, avec une mesure quotidienne des tumeurs et une mise à mort au vingt-et-unième jour parce que le modèle devient létal au-delà de trente jours. L'objectif déclaré est d'identifier deux régulateurs de l'éducation des lymphocytes T, avec un bénéfice renvoyé au conditionnel face à une immunothérapie qui, selon le porteur, n'est efficace que chez 20 % des patients.

Objectifs

Les lymphocytes T sont un sous-type de globules blancs qui combattent les virus, les bactéries ou encore les cancers. Ces lymphocytes sont éduqués à ne pas reconnaître nos propres tissus comme des éléments étrangers dans un organe du système immunitaire appelé le thymus. Des dérégulations dans leur éducation peuvent conduire à des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques ou le diabète de type 1, mais également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. Dans le thymus, les cellules épithéliales médullaires thymiques, appelées mTEC, sont critiques à l’éducation des lymphocytes T. L’identification de régulateurs de l'éducation des lymphocytes T constitue un défi majeur pour améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et les cancers. Dans ce contexte, notre équipe a identifié deux nouveaux régulateurs associés au développement de la sclérose en plaques. Nous avons alors émis l’hypothèse que ces facteurs pourraient contribuer à l’éducation des lymphocytes T. Notre projet visera à 1) caractériser le rôle de ces facteurs dans la protection contre des pathologies auto immunes à l’aide d’un modèle murin de sclérose en plaques ; 2) analyser l’impact de ces facteurs sur l'éducation des lymphocytes T et 3) déterminer l’impact de la déficience de ces facteurs sur la réponse antitumorale. En résumé, l’ensemble de ces travaux de recherche permettra de mettre en évidence la fonction de ces nouveaux facteurs clé dans la protection contre des maladies auto-immunes et l’éradication des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les maladies auto-immunes touchent 5 à 10% de la population mondiale. Cependant, face à la complexité de ces maladies, il n’existe actuellement aucun traitement permettant de guérir les patients atteints. Par ailleurs, un défaut d’éducation des lymphocytes T peut également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. La stratégie actuelle utilisée pour booster la réponse des lymphocytes T contre la tumeur est basée sur l’utilisation d’anticorps : l’immunothérapie. Cependant, elle n’est efficace que chez seulement 20% des patients. Identifier les régulateurs de l'éducation des lymphocytes T pourrait constituer une nouvelle stratégie pour améliorer l’éradication des tumeurs et la protection contre les maladies auto-immunes. Ce projet pourrait démontrer que ces régulateurs sont critiques dans la lutte contre des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques et à plus long terme pourrait orienter les médecins vers des tests génétiques plus précis pour un meilleur diagnostic. De plus, ces régulateurs pourraient être impliqués dans l’efficacité de la réponse anti tumorale dans des contextes de tumeurs comme le mélanome ou le fibrosarcome. Notre approche de ciblage de ces régulateurs en combinaison avec une immunothérapie basée sur l’utilisation d’anticorps devrait améliorer l’efficacité des agents thérapeutiques pour améliorer la réponse anti tumorale.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse générale combinée a une injection sous cutanée d’analgésique (3 minutes par animal). Pour le protocole de sclérose en plaque, ces souris recevront en plus deux injections intraveineuse (3 minutes par animal) sous anesthésie gazeuse générale. Pour les deux types de tumeurs, les souris recevront sur chaque flanc des cellules tumorales par injection sous-cutanée sous anesthésie gazeuse générale (2 injections simultanées, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les souris recevront également 4 injections intra-péritonéales de traitement anti-tumoral (30 secondes par injection). Les tumeurs seront mesurées tous les jours post-injection sous anesthésie gazeuse générale (2 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale légère par anesthésie gazeuse générale minimisant le stress, l'inconfort et la douleur liés à ces injections. Concernant le modèle de sclérose en plaque, la maladie peut générer des nuisances importantes caractérisées par la paralysie progressive de l’animal en commençant par la queue et remontant le long de la moelle épinière. Pour limiter la durée de souffrance des animaux, ces derniers seront suivis quotidiennement et la procédure n’excèdera pas les 30 jours. Concernant le modèle de sclérose en plaques ainsi que l’immunisation, l’injection sous-cutanée peut éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée attentivement de manière quotidienne. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés. Concernant les modèles de cancer, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort, une douleur prolongée. Ce modèle pouvant être létal au-delà de 30 jours, les souris seront suivies, mises à mort et analysées à un temps de 21 jours dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress lié à la manipulation, une perte de poids, une gêne à la mobilité, une douleur.

Devenir

Les animaux d'intérêt générés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.

Remplacement

A ce jour, aucune alternative non animale ne permet d’étudier la tolérance immunitaire et les cellules épithéliales thymiques. De plus, cette étude prend place dans un contexte pathologique, à savoir les pathologies auto-immunes et le cancer dans notre cas. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.

Réduction

Nous essaierons autant que possible de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Le choix du nombre animaux est réalisé en prenant en considération la variabilité interindividuelle, la variabilité de réponse au traitement antitumoral et la variabilité de prise et de pousse des cellules tumorales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 à 5 animaux par groupe, selon les procédures, seront utilisées avec un total de trois expériences indépendantes. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers.

Raffinement

Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Du coton pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. Les animaleries bénéficient d'une température régulée à 21°C, d'une hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur par lignée sauf pour l’étape de randomisation dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse générale avant chaque injection et mesure. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne dès le début des procédures expérimentales afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation, à l’apparition de signes de douleurs des analgésiques seront administrés. En cas de faiblesse pouvant altérer la prise alimentaire ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Dans le cas du modèle de sclérose en plaques, les souris seront suivies quotidiennement et l’avancement de la pathologie sera mesuré à l’aide d’une grille constatant le niveau de paralysie de l’animal pouvant induire une augmentation de la surveillance à deux fois par jour.

Choix des espèces

L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés. La génétique de la souris est bien connue et étudiée depuis longtemps. De plus, la souris est le modèle de base pour étudier le système immunitaire et en particulier le thymus. Ce modèle animal couramment utilisé permet grâce à des techniques d’ingénierie génétique de cibler un gène précis dans un type cellulaire spécifique afin d’étudier sa fonction. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, correspondant à un stade développemental de jeune adulte. A ce stade, le thymus des souris est pleinement développé et atteint sa taille et sa fonctionnalité maximale.