Souris
Prélèvements de tissus pour la caractérisation de souris génétiquement modifiés en recherche thématique, avec ou sans phénotype dommageable.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris hébergées est immunodéprimée, donc fragilisée face aux infections, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable tout en affirmant que leur bien-être n'en est pas affecté tant que l'hébergement reste adapté. 25 960 souris génétiquement modifiées vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en un prélèvement de moins de deux millimètres de queue ou d'oreille, réalisé une fois sur des souris vigiles au moment du sevrage, avec un second prélèvement possible entre cinq et douze semaines si le génotypage échoue. Ces souris passent ensuite en utilisation continue dans d'autres projets, et l'effectif déclaré est calé sur les statistiques des années précédentes, avec une marge prévue pour les projets des cinq prochaines années.
Objectifs
Notre établissement utilisateur élève des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, l'immunologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées caractérisées de phénotype dommageable pour certains projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou de surveiller le maintien du statut sanitaire SPF dans le cas des sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travaillant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).
Procédures
Prélèvement de queue (
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les animaux immunodéprimés sont nécessaires pour des projets de recherche en immunooncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Nous sommes en cours d'expertise pour développer des méthodes de génotypage moins invasives. Concernant les animaux utilisés comme sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, cela nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à moyen ou long terme, nous encourageons l'arrêt de l'élevage de cette dernière associé à une méthode de conservation autre (cryopréservation...).
Raffinement
La biopsie de queue ou la biopsie à l’oreille sont réalisées lors du baguage sur des animaux vigiles. Ces méthodes sont éprouvées, précises, rapides (quelques secondes), standardisées et réalisées par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée.
Choix des espèces
Nous avons majoritairement des élevages de souris. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
développement d’un modèle d’obstruction de la veine principale du foie par un caillot sanguin chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
495 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées trois ou sept jours après l'intervention pour l'analyse de leurs tissus. Chacune subit une chirurgie d'une heure au plus sous anesthésie, au cours de laquelle la veine principale du foie est partiellement ligaturée pour provoquer un caillot, avec un risque de saignement, d'infection bactérienne et d'hypertension du foie. Une seconde opération, terminale, permet le prélèvement de sang avant la mise à mort. Le projet vise à mettre au point ce modèle de thrombose porte pour l'étude des syndromes myéloprolifératifs, et le porteur affirme que l'étude des types cellulaires en jeu ne peut avoir lieu qu'au sein d'un organisme vivant, ce qui rend selon lui l'utilisation des animaux non-humains "nécessaire".
Objectifs
Les syndromes myéloprolifératifs sont des maladies où la moelle osseuse produit trop de cellules sanguines. Cette surproduction est souvent causée par une mutation génétique. Environ 30 pourcent des personnes atteintes développent des caillots sanguins, qui peuvent être dangereux. Comprendre comment ces caillots se forment est important pour créer de meilleurs traitements. Une étude pense que certaines cellules, comme les plaquettes, jouent un rôle clé dans ce processus. L'objectif est de créer un modèle pour étudier ces caillots et trouver des traitements plus efficaces.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations permettront de développer et de normaliser un modèle de formation d'un caillot sanguin de la veine principale du foie chez la souris et de mieux comprendre de quelle façon la mutation génétique identifiée agit sur le développement de la maladie. A plus long terme, cela permettra également de mettre au point des stratégies thérapeutiques plus efficaces que ceux proposées par la médecine actuelle. De plus, il s'agira d'un nouveau modèle expérimental qui pourra être repris par l'ensemble de la communauté scientifique au service de futurs projets.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie d’une durée d’1h maximum qui va permettre un rétrécissement de la veine du foie par le biais d'une ligature partielle (sténose). Les animaux subiront auparavant un prélèvement veineux de quelques secondes sur animal endormi et certains animaux auront un traitement pharmacologique pour diminuer l'apparition des caillots qui sera administré 24h avant la chirurgie par voie intraveineuse en moins de 10 min. Un guide et du fil de suture seront momentanément en contact avec la veine porte. Il s'agit d'autant de gestes à risques pouvant être à l'origine d'une infection bactérienne. A la fin de l'experience, le sang sera prélevé après une deuxième intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut entrainer une douleur et une irritation post-opératoire au niveau de la cicatrice pourra également se faire ressentir. Un risque de saignement peut avoir lieu chez certaines souris. Cette procédure inclue également un prélèvement sanguin sous anesthésie et qui peut être associé à un risque exceptionnel de lésion occulaire. Un guide et du fil de suture seront momentanément en contact avec la veine porte. Il s'agit d'autant de gestes à risques pouvant être à l'origine d'une infection bactérienne. La formation d'un caillot peut entrainer une hypertension au niveau du foie.
Devenir
3, ou 7 jours après la sténose selon le groupe expérimental, les animaux seront systématiquement euthanasiés sous anesthésie, une fois le prélèvement de sang terminé pour pouvoir faire l’analyse des tissus et du plasma.
Remplacement
L'étude du rôle de différents types cellulaires dans l'apparition de maladie du sang associée à la formation d'un caillot ne peut avoir lieu qu'au sein d'un organisme vivant pour des raisons de complexité physiologique. L'utilisation des animaux est donc nécessaire dans la réalisation de ces travaux.
Réduction
Dans un premier temps, nous allons mettre au point la procédure uniquement sur des souris controles afin de déterminer les conditions optimales pour la formation d'un caillot sanguin tout en limitant les souffrances engendrées aux souris. Ces conditions seront alors appliquées sur les souris génétiquement modifiées. Le nombre d'animaux par groupe a été défini pour obtenir des résultats exploitables avec le minimum d'animaux.
Raffinement
Chaque étape de la procédure sera effectuée par du personnel qualifié. La douleur post-opératoire est traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur en plus de l'anesthésie gazeuse. Un tapis chauffant sera utilisé pendant les opérations, et les animaux seront réveillés sous lampe chauffante dans une cage de réveil avec du papier absorbant à la place de la sciure. Pour prévenir la souffrance, les animaux seront soumis à un suivi post-opératoire avec une grille de score, durant lequel ils seront observés et pesés quotidiennement. Si un point limite était atteint, l'animal serait endormi et euthanasié sans délai.
Choix des espèces
La souris possède de nombreuses similitude avec l'Homme, notamment son système vasculaire, immunologique et cellulaire. Ces similarités en font un bon modèle pour grand nombre de pathologies humaines. Les souris utilisées auront entre 8 et 12 semaines . C'est à cet âge que le modèle de souris mutées a été validé.
Développements méthodologiques en IRM chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 150
Prélevés en priorité parmi les animaux surnuméraires d'élevage, ceux dont le génotype ou le phénotype ne correspond à aucun besoin et qui sont de toute façon destinés à la mise à mort, 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils passent un examen d'IRM de une à trois heures sous narcose ou anesthésie, avec le cas échéant une injection de produit de contraste et des mesures de glycémie. Le porteur reconnaît qu'un réveil en cours d'examen ou un stress thermique ne peuvent pas être exclus, et indique que les souris et les rats sont tués à l'issue de la procédure. La finalité déclarée est l'amélioration de l'"offre de prestations" de la plateforme d'imagerie, et la rubrique consacrée à la réduction se limite à une phrase, sans justifier l'effectif de 300 animaux non-humains.
Objectifs
Notre plateforme de recherche est spécialisée dans l’imagerie préclinique (IRM) et la spectroscopie (SRM) par résonance magnétique. Les projets menés sur cette plateforme concernent des thématiques en biologie et en santé comme par exemple la cancérologie, la nutrition, les maladies neurodégénratives, la compréhension de pathologies ou encore la validation de nouveaux traitements. Pour améliorer son offre de prestations aux équipes de recherche et aux entreprises, la plateforme est amenée à développer en collaboartion avec les équipes support et utilsatrices, de nouvelles méthodes et de nouveaux protocoles d’IRM et de SRM. Ces développements méthodologiques sont toujours réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in-vivo cette fois-ci, ces nouvelles méthodes sur un nombre limité d'animaux. L’objectif de la présente demande n’est pas de se substituer au dépôt d’une demande d'autorisation de projet spécifique.
Bénéfices attendus
Proposer des outils d'imagerie opérationnels en utilsant en prioprité des animaux surnuméraires destinés à être mis à mort, en vue d'étdues plus spécifiques.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'un examen d'IRM d'une durée comprise entre 1h et 3h. Les interventions prévues sur les animaux concernent la narcose (isofurane), l'anesthesie et le cas échéant, l'injection intraveineuse ou intrapéritonéal d'un produit de contraste, ou encore de solution saline (NaCl) ou de glucose, ainsi que des mesures de glycémie réalisées sous anesthésie ou narcose avec analgésie locale.
Impact sur les animaux
Malgré les efforts de raffinement (cf. 3.3.6.2) on ne peut exclure, (i) un stress thermqiue dû à l'anesthésie et/ou la narcose ou à certaines séquences d'imagerie (ii) le réveil de l'animal en cours d’examen ou (iii) un stress lors de l'installation de l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure. Dans le plupart des cas, des organes pourrant être prélevés à l'issu de la procédure.
Remplacement
Dans la plupart des projets menés par la plate-forme, less développements méthodologiques sont réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in vivo ces nouvelles méthodes et protocoles sur un nombre limité d'animaux afin d'optimiser ces nouvelles méthodes aux conditions expérimentales réelles (configuration matérielle nécessaire, posiiton de l'animal, suivi physiologique spécfique, synchronisation aux mouvements respiratiores ou cardiaques).
Réduction
Dans le mesure du possible, les animaux utilsés seront des animaux d’élevage destinés à la mise à mort (car génotype ou phénotype non cibles).
Raffinement
Pendant l'examen, une attention particulière est donnée au maintien de la températrue corporelle des animaux. De plus du gel ophtalmique est utilsé systèmatiquement. Les animaux bénéficient d'un enrichissement social et physique dans la zone d'hébergement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une recherche systématique de points limites. Tous les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec une analgésie ad’hoc.
Choix des espèces
L'IRM de la platefrome est conçue principalemant pour l'imagerie pré-clinique. Le rat et la souris sont les espèces préférentielles des utilsateurs. Le stade de développement sera adapté en fonction du besoin méthodologique, ou en fonction des animaux disponibles si le stade de développement n'a pas d'influence sur le besoin méthodologique..
Rôle du thalamus médian dans la synchronisation des aires corticales pendant le sommeil profond chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie de trois à six heures pour implanter dans le crâne des dispositifs d'enregistrement et de stimulation, puis le port d'un implant de trois grammes: 250 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite manipulées chaque jour pendant dix à trente jours, environ trente minutes par jour, pour des tâches de mémoire et d'association. Le porteur écrit que ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable, ce qui selon lui "suggère qu'elles ne souffrent pas de la présence du transgène", et présente la complexité de ses chirurgies comme un raffinement puisqu'elle produit davantage de données par animal. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont 1- d’élucider les mécanismes qui permettent la synchronisation des activités neuronales entre des aires cérébrales distantes pendant le sommeil profond et 2- de déterminer l’importance de cette synchronisation dans la consolidation de la mémoire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentales sont 1- découvrir une nouvelle région cible pour le traitement des troubles du sommeil profond, 2- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la mémoire. 30% de la population européenne est en déficit chronique de sommeil et ceci a de nombreuses conséquences sociales et économiques. Le manque de sommeil est en effet associé à une augmentation des risques d’accidents, mais aussi a un risque accru de souffrir de nombreuses pathologies comme la dépression, l’anxiété, l’obésité, etc. D’autre part la majorité des troubles psychiatriques et des maladies neuro-dégénératives sont associées à des sommeils détériorés qui amplifieraient les symptômes. De plus en plus d’études suggèrent que le sommeil pourrait jouer un rôle important dans l’étiologie de ces pathologies. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie consistant en l'implantation d'équipements d'enregisterment et de stimulation miniaturisés. La chirugie d'implantation dure 3-6 heures. Une fois la chirurgie effectuée, les animaux seront hébergés en groupe et libres de leurs mouvements. Les animaux font ensuite des tests comportementaux consistant en des apprentissages de mémoire et d'association stimulus-action nécessitant leur manipulation quotidienne pendant 10 à 30 jours à raison d'environ 30 minutes par jour.
Impact sur les animaux
Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soit un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale. Le niveau de douleur de cette procédure est modéré et sera atténué par un analgésique pré-opératoire et des analgésiques pendant les 5 jours post-opératoires. La déshydratation pendant la chirurgie sera prévenue par injection de saline. Après les 5 jours post-opératoires, les animaux seront progressivement habitués à être restreint de leur mouvement pendant une brève période dans la main de l’expérimentateur. Une fois les animaux habitués à la contention, leur implant sera connecté au système d’enregistrement (caméra et/ou préamplificateur). Le poids total de l’implant + équipement est d'environ 3 g. Ce poids peut occasionner une gêne pour l’animal ainsi qu’un stress les premiers jours. Pour limiter cela, les animaux seront habitués sur 2-8 jours au port des équipements pendant des périodes de plus en plus longues 2-5 fois par jour. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés en groupe. Néanmoins, il est possible que le stress induit par la chirurgie ou la contention rende les animaux agressifs entre eux. Une manipulation très progressive sera effectuée afin de limiter au maximum les situations où les animaux devraient être séparés. Néanmoins, en cas d’agression, les animaux seront hébergés dans des cages larges avec une grille séparant deux compartiments qui permettent d’héberger deux animaux dans un environnement contigu tout en empêchant les agressions.
Devenir
A l'issue de ce protocole expérimental, les souris seront euthanasiées. En effet, il est essentiel de prélever leur cerveau afin d'effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude du comportement de la souris pendant une tâche d’apprentissage mnésique et enregistrement de la synchronisation des aires corticales. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, je combinerai les techniques d’imagerie chez l’animal libre de ses mouvements et les enregistrements électrophysiologiques ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux et d’obtenir des données encore plus riches puisque combinant deux techniques de pointe sur le même animal. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, j’ai donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de souris transgéniques. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. La souris possède une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. La diversité des modèles génétiques existants chez la souris permet tout un panel de manipulation de l’activité neuronal dans des types cellulaires donnés. Mon étude vise à déterminer comment différents types de cellules sont impliqués dans la synchronisation des oscillations. L’utilisation de souris transgéniques spécifiques permettra de répondre à ces questions. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgie seront effectuées entre 8 et 20 semaines et les enregistrements entre 10 et 35 semaines. En effet, ce projet vise à étudier les oscillations chez des animaux adultes non âgés.
Caractérisation du comportement de tétée chez le nouveau-né de la souris modèle du syndrome de Prader-Willi et rôle de l’ocytocine dans ce comportement.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés séparés de leur mère jusqu'à quatre heures, stimulés au pinceau puis au laser infrarouge au niveau du tronc cérébral: 708 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour des analyses post-mortem. Les mères reçoivent des injections intrapéritonéales d'anesthésique et se voient retirer une partie de leur portée. Le projet cherche à comprendre pourquoi les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi tètent mal et comment l'ocytocine rétablit la tétée, un essai clinique de phase 3 étant déjà en cours chez des bébés. Trente femelles sont réutilisées pour quatre à cinq portées avant d'être tuées, et 312 autres souris sont utilisées pour la reproduction de huit lignées puis tuées vers l'âge de six mois.
Objectifs
Ce projet porte sur la compréhension de mécanismes physiopathologiques impliqués dans la tétée chez des souris modèles d’une maladie rare (le syndrome de Prader-Willi) et le rôle d’une hormone qui restaure une activité de tétée normale. En effet, il a été montré qu’il y a un dysfonctionnement de l’activité de tétée chez les souris modèles d’une maladie rare, tout comme cela a été observé chez les bébés Prader-Willi et que l’administration de l’hormone étudiée rétablie une tétée normale chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques (PhaseI/II) chez des enfants atteints du syndrome de Prader-Willi, il résulte une amélioration (voire normalisation) de l’activité de succion. Toutefois le mécanisme d’action de cette hormone dans l’activité de tétée n’a jamais été investigué Les études associées à ce projet permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi, d’étudier comment l’hormone étudiée restaure une tétée normale chez ces souriceaux et quelles régions du cerveau sont activées, et donc d’argumenter l’intérêt d’utiliser cette hormone et définir les conditions optimales pour traiter les bébés Prader-Willi. Ce projet comprend 6 procédures. Au total, 708 souris, dont 678 issues de 164 croisements que nous effectuerons et 30 femelles provenant d'un fournisseur agréé, seront expérimentées.
Bénéfices attendus
Les bébés Prader-Willi présentent dans plus de 95% de cas un déficit de l’activité de tétée qui nécessite une intubation de quelques semaines. Cette intubation peut avoir des conséquences sur le développement et le comportement de ces enfants. Nos études précliniques ont montré que l’administration sous-cutanée d’une hormone (une seule administration à la naissance), permet de restaurer une activité normale de tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi et une amélioration dans le comportement cognitif et social de ces souris plus tardivement. A partir de ces études précliniques, une étude clinique de phase I/II a été mené chez des bébés Prader-Willi montrant une normalisation de la tétée chez ces bébés; une étude clinique en phase 3 est en cours. Il s’agit ici d’un projet qui est focalisé sur la tétée pour comprendre quelles sont les altérations mécaniques ou sensorielles qui empêchent les souriceaux modèles du Syndrome de Prader-Willi de téter normalement et comment une administration de l’hormone étudiée agit sur le plan fonctionnel (sensoriel ou moteur) et sur l’activité neuronale du cerveau pour rétablir une tétée normale chez ces souriceaux. Ce projet amènera : 1) une compréhension des mécanismes fonctionnels et cellulaires du déficit de la tétée dans un modèle du syndrome de Prader-Willi et par extension chez les bébés Prader-Willi ; 2) de mieux comprendre, en général, les mécanismes sous-jacents à l’activité de tétée qui est très peu étudiée ; 3) d’élucider comment l’administration de l’hormone étudiée corrige ce déficit; 4) plus généralement elle nous révèlera le rôle du de tout un système hormonal dans la tétée et cela nous permettra d’envisager d’élargir le traitement à des bébés qui présentent un déficit de tétée à la naissance (soit 10% des nouveau-nés). Les résultats attendus permettront donc de comprendre et de proposer un traitement approprié (en connaissance de cause) du déficit de tétée chez les bébés Prader-Willi mais aussi dans d’autres pathologies qui présentent un déficit de tétée. Cet aspect translationnel est vraiment très important.
Procédures
Sur les mères, les interventions sont : Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes. La séparation avec une partie de leurs nouveau-nés pour quelques heures (même si une partie des nouveau-nés restent avec elles). Sur les nouveau-nés, les interventions sont : Les injections sous cutanée sur les nouveau-nés. L’isolement de la portée de souriceaux de leur mère pendant 4 heures maximum. La manipulation des souriceaux pendant le test de saisie de tétine, La stimulation tactile des nouveau-nés à l’aide d’un pinceau. La stimulation externe (au niveau du tronc cérébral) de nouveau-nés à l’aide d’un laser Infra-rouge (peu énergétique) faite sur animaux non contraints Sur les souris génétiquement modifiées lors du maintien de lignée : caudectomie ; tatouage Il n'y a aucune procédure chirurgicale dans cette DAP. Un prélèvement de queue sera effectué sur animaux vigiles dans le cadre du génotypage si le génotypage ne fonctionne pas à partir d’une touffe de poils prélevée sur l’individu (des mises au point sont en cours) mais concernera au grand maximum 312 souris.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère douloureux. Malgré le temps très court de cette nuisance (
Devenir
Pour l’ensemble des animaux expérimentés en Procédures 1, 2, 4, 5 la mise à mort est justifiée par des analyses post-mortem sur des tissus prélevés. Procédure 3: 30 femelles réutilisées qui, après une première portée, seront utilisées deux fois dans notre étude et pourront aussi être utilisées comme génitrices 2 fois supplémentaires. Après 4 à 5 portées, les femelles seront euthanasiées. Procédure 6: 312 souris seront utilisées comme géniteurs (rices). Il s’agit du maintien de 8 lignées sur 4 ans et d’animaux qui seront géniteurs pour produire les animaux qui seront expérimentés. Ces animaux seront euthanasiés à l’âge adulte vers 6 mois.
Remplacement
Ce projet porte sur la physiologie et physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans le syndrome de Prader-Willi, qui est notre sujet d’étude. Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur le modèle de souris génétiquement modifié (qui mime ce déficit de tétée) et nous prenons en compte les analyses faites en parallèle sur les bébés Prader-Willi afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients.
Réduction
L'utilisation de souris qui sont identiques sur le plan génétique (ici une souche particulière de souris de laboratoire) permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour les tests de comportement depuis plus de 10 ans montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe, dans le test de saisie de tétine, pour valider la démarche statistique. En ce qui concerne les expériences pour étudier l’anatomie du cerveau ou l’activité électrique de neurones, nous utiliserons 6 animaux par condition. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, dépourvu de pathogènes spécifiques. La température et l’hygrométrie sont contrôlées, avec un cycle de lumière de 12h. Les cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Les souris sont entre 2 et 4 par cage, mais pas isolées ou exceptionnellement mais moins de 48 heures. La douleur/souffrance des animaux adultes et souriceaux est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes) en suivant la Grille de Score. Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie pourront être isolés de leur mère pendant 20min à 1h. Pendant le temps de séparation de leur mère, les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux au jour de la naissance et lors du tatouage des animaux de la procédure 6, un analgésique sera appliqué sur la peau pour diminuer la sensation de douleur.
Choix des espèces
L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude évalue des paramètres de comportement de tétée ainsi que l’anatomie du cerveau. Il est donc nécessaire d’étudier des mammifères, en particulier des modèles de souris de la maladies rare qui nous intéresse mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles de souris génétiquement modifiés. A ce jour, la souris est donc le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les stades choisis sont le jour de la naissance car le déficit de tétée observé chez les bébés Prader-Willi démarre à la naissance (tout comme dans le modèle souris étudié) et des souris femelles adultes, mères des nouveau-nés étudiés, sont aussi expérimentées.
Etude de l’activité cérébrale par photométrie chez la souris atteinte de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Les 420 souris subissent une chirurgie de 40 minutes pour implanter une fibre optique dans le cerveau, et la douleur chronique est provoquée sous anesthésie par une lésion de nerf (SNI) ou une injection de CFA, avec une douleur modérée et des troubles anxiodépressifs annoncés pendant environ six semaines ou une semaine selon la méthode. Élevées sur place, ces souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau et, selon le porteur, "afin de leur éviter toute souffrance inutile". Pendant 4 à 11 semaines, elles passent des séances de photométrie d'environ trois heures et des tests de comportement deux jours par semaine, pour repérer quelles régions du cerveau s'activent sous une stimulation mécanique ou thermique selon que la douleur vient d'un nerf lésé ou d'une inflammation. Le texte ne nomme pas ces tests de douleur, et annonce un prélèvement du cerveau pour analyser "l'expression virale" sans qu'aucune injection de virus figure parmi les procédures.
Objectifs
Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.
Procédures
Tous les animaux (n=420) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
La chirurgie SNI entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection de CFA entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h.
Devenir
Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.
Choix des espèces
Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature
Rôle des voies de réponse aux défauts de l’homéostasie protéique dans la réponse aux traitements de chimiothérapie dans des modèles murins de cancers MSI (Instabilité des MicroSatellites)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue, une partie sans même être analysée puisqu'elle ne sert qu'à l'entretien de la lignée, 384 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent spontanément des lymphomes et des adénocarcinomes intestinaux dans leur première année de vie, avec grossissement de la rate, du thymus et du foie, occlusions intestinales et amaigrissement. Elles reçoivent jusqu'à quarante injections intrapéritonéales sur huit mois, vigiles, et alternent chaque mois deux semaines de régime gras et deux semaines de régime standard, cette alternance servant à faire apparaître plus souvent le type de tumeur étudié. Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et conclut qu'il est "nécessaire" de travailler in vivo.
Objectifs
Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Dans ce type de tumeurs, nous avons rapporté l’effet d’une mutation dans un gène codant pour une protéine dont le rôle est de protéger la cellule d’agressions et stress. La mutation de ce gène présente dans 25 pourcents des tumeurs des patients atteint de cancer MSI, affaiblis la cellule tumorale, tandis que son absence est associée à une résistance des tumeurs aux traitements de chimiothérapie. Avec ce projet nous voulons trouver une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer MSI qui présente une mutation dans ce gène et qui donc est résistante à la chimiothérapie. Nous espérons expliquer comment les cellules tumorales utilisent cette protéine pour se défendre des dommages induits par les agents de chimiothérapie. Dans ce projet, nous testerons l'hypothèse selon laquelle la perte de fonction de la protéine influence la sensibilité des cellules tumorales aux chimiothérapies via la modulation de l'activité métabolique de la cellule. D’un point de vue fondamentale ce projet vise à améliorer nos connaissances des mécanismes de résistance à la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. D’un point de vue clinique ce projet ouvre à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de cancers coliques de type MSI.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale et clinique, le rôle du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie des patients atteints de cancers coliques de type MSI (pour Microsatellites instables). Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Des préliminaires montrent que dans environs 75 pourcents de ces types de tumeurs, le métabolisme et la protéostasie c’est-à-dire la biogenèse, le repliement, le trafic et la dégradation des protéines, seraient associé à une mauvaise réponse au traitement de chimiothérapie et ceci via une protéine spécifique que nous étudions ici. Les résultats que nous obtiendrons ouvriront à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour ce type de cancer
Procédures
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Les animaux recevront différents traitements par injections intrapéritonéales sur animal vigile à raison de 5 injections par mois pendant maximum 8 mois (soit 40 injections maximum). Dès l’apparition de signes évocateurs du développement d’une tumeur, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions qui se manifeste généralement par une prise de volume au niveau abdominale/cou. Pour l’adénocarcinome intestinal, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales qui se manifeste généralement par un amaigrissement. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). L’administration des différents traitements par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale (lymphome et adénocarcinome) avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
La mise en œuvre de ce projet n’est aujourd’hui possible que grâce à l’obtention préalable de données in vitro. A ce stade de nos recherches, il est important tester notre hypothèse sur un modèle in vivo afin d’ouvrir à terme une nouvelle piste thérapeutique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle molécule et l’implication du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie, il est nécessaire de travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.
Réduction
Le projet impliquera un total de 384 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. En effet, en se basant sur les données de la littérature nous avons choisi de mettre en une étude séquentielle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps, un premier lot d’animaux sera inclus pour définir la concentration optimale des traitements. Dans un second temps, nous évaluerons l’impact de ces traitements à leur concentration optimale sur nos modèles transgéniques. Cette stratégie permettant de réduire significativement le nombre d’animaux impliqués. De plus, l’utilisation de la stratégie du riche en gras de manière alterné permet d’accroitre la fréquence du développement de l’un des types de tumeur qui nous intéresse, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris. Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Nous utiliserons différents tests statistiques pour l’interprétation fiable de nos résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les animaux impliqués dans la mise au point des traitements seront des animaux commerciaux utilisées à partir de 8 semaines de vie. Nous avons choisi cet âge pour tester la toxicité du traitement sur des animaux relativement jeunes afin d’envisager pour la dose un traitement préventif si besoin. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément rentreront dans le protocole de traitements à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour pouvoir bien supporter le traitement de chimiothérapie. De plus, grâce à notre expérience de ces modèles, nous savons que l’âge moyenne d’apparition des signes cliniques liés au développement de la pathologie est de 180 jours, ainsi la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement curatif ainsi que préventif.
Etude des causes précoces des problèmes de communication à l’intérieur de la cellule dans le foie chez la souris obèse diabétique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour chercher les causes précoces du foie gras chez la souris obèse et diabétique, 2 838 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Toutes subissent un prélèvement d'oreille pour le génotypage, mais 288 seulement passent les tests métaboliques, avec sept prélèvements de sang à la queue, une injection de glucose, un jeûne de six heures puis un jeûne de douze heures et neuf jours de régime obésogène. Le porteur écrit que le jeûne de douze heures provoque une hypoglycémie et une baisse d'activité qui conduisent les souris à rester dans leur nid. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, des tests chez l'être humain si les hypothèses se confirment chez la souris, pour 2 550 souris élevées et tuées sans passer aucun test métabolique.
Objectifs
L'obésité et le diabète de type 2 sont des problèmes de santé majeurs, souvent causés par une glycémie élevée, une résistance à l'insuline et un foie gras. La communication de structures à l'intérieur des cellules perturbe le métabolisme des sucres et des graisses, ce qui contribue à l'hyperglycémie. Chez les souris, cette défaillance de communication apparaît rapidement après seulement une semaine de suralimentation, avant même que les problèmes métaboliques ne se manifestent, suggérant qu'elle joue un rôle causal. Les mécanismes précis restent inconnus. Ce projet de recherche va permettre d’identifier les mécanismes de l’apparition du foie gras en utilisant des approches a large échelled dans un modèle de souris génétiquement modifié. L'objectif ultime est de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour restaurer la communication dans la cellule, traiter les troubles métaboliques du foie et rétablir un bon contrôle de la glycémie chez les personnes obèses et diabétiques de type 2.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet de recherche est de découvrir un nouveau mécanisme qui contrôle la glycémie et de trouver des moyens de prévenir et/ou traiter le diabète de type 2. Si ces idées sont confirmées chez la souris, des tests chez l'homme seront effectués.
Procédures
- Prélèvement d’un bout d’oreille pour le génotypage (2838 souris vigiles – 1 fois – quelques secondes). - Périodes de jeûne : avant le test métabolique pour mesurer la sensiblité au glucose un jeûne de 6 heures sera réalisés (1 fois par souris sur 288 souris vigiles), un jeûne de 12 heures sera réalisé à la fin de l’étude pour mesurer la glycémie à jeun (1 fois par souris sur 288 souris vigiles). - Prélèvements sanguins : prélèvements à la queue d’une goutte de sang sur des souris vigiles pour mesurer la glycémie (7 fois par souris, sans contention, durée 30 sec, souris vigiles, 288 souris) + 1 prélèvement avant la mise à mort sous anesthésie (1min) (288 souris). - Injections : 1 injection de glucose sur des animaux vigiles, durant environ 30 secondes avec la contention (288 souris). - Régime alimentaire : Une alimentation obésogène pendant 9 jours (288 souris).
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les souris pourraient subir les effets suivants : - Douleur transitoire au moment du prélèvement du bout d’oreille (1mm). - Effets du jeûne : Une sensation de faim et une hypoglycémie après 12h de jeûne, pouvant causer du stress et une baisse d'activité, les conduisant à rester dans leur nid. - Douleur transitoire au moment des prélèvements de sang pour la glycémie - Douleur transitoire à l’injection : Une légère douleur au point d'injection du glucose.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt pour répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Ce projet vise à compléter les données obtenues en laboratoire sur des cellules de foie. Ce projet permet d’aller plus loin en démontrant la régulation de ces nouveaux mécanismes à l’intérieur des cellules dans le foie après un repas, essentielle pour un contrôle optimal de la glycémie. Il s'agit donc d'une étude de physiologie intégrée, pour laquelle il n'existe pas d'alternative non animale.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, le nombre de souris est calculé avec précision pour offrir la puissance statistique nécessaire à l'interprétation des résultats. Étant donné la variabilité des paramètres mesurés entre les souris, un minimum de 18 souris par groupe est requis. Dans un souci de réduction nous utiliserons les souris mâles et les souris femelles. Réduction du nombre d'accouplements et ralentissement de la production lorsque les animaux ne sont pas nécessaires pour les expériences.
Raffinement
- Avoir une phase d’acclimatation pour habituer les animaux à la présence de l’expérimentateur (odeurs, voix, etc) pour diminuer leur stress face aux humains. - Les injections seront réalisées par une personne expérimentée afin de limiter la durée des gestes et ainsi le stress de l’animal. - Les volumes d’injection ont été réduits au maximum. - Une anesthésie sera réalisée pour les gestes douloureux. - La prise de poids et la prise alimentaire des souris seront contrôlées. - Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces seront définis afin de mettre à mort tout animal le nécessitant et éviter toute souffrance des animaux. - Surveillance rapprochée (5 fois par semaine) par les expérimentateurs durant l'expérience.
Choix des espèces
Le modèle souris est utilisé car leur physiologie est similaire à celle de l’homme pour le contrôle de la glycémie. Des souris de 8 semaines à 6 mois seront utilisées pour le maintien de la lignée. Des souris âgées de 5 semaines sont utilisées car quand il s’agit de les nourrir avec une alimentation obésogène, les effets métaboliques sont plus marqués si débutée rapidement après le sevrage.
Etude du rôle des récepteurs nucléaires orphelins au cours du développement préimplantatoire murin
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Toutes tuées pour que leurs embryons soient prélevés, 1 747 souris femelles vont être utilisées dans une procédure déclarée d'un niveau de souffrance léger. La superovulation leur est provoquée par deux injections intrapéritonéales d'hormones à quarante-huit heures d'intervalle, de façon à porter à vingt ou trente le nombre d'embryons prélevés sur chaque femelle. Le porteur écrit que ces injections sont "dénuées de tout effet nocif" tout en reconnaissant une douleur, un inconfort et un stress de courte durée. Il indique que ses travaux antérieurs sur cellules souches embryonnaires ne récapitulent pas la ségrégation des lignages dans l'embryon et qu'il doit désormais tester ses conclusions directement sur des animaux.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de clarifier les rôles joués par une classe de facteurs capables de contrôler l’expression de gènes, dans le développement de l’embryon de souris. Après la fécondation, les embryons de mammifères doivent générer rapidement tous les types de cellules nécessaires pour s'implanter dans l'utérus et se développer. Ce processus dépend de la mise en route de l’expression de gènes (en anglais: zygotic genome activation, abrévié ZGA), et sur la réinitialisation de l'état de l'ADN hérité des parents. Cette opération est nécessaire pour effacer l’origine parentale de l’ADN au début de la vie et comprend la nécessité de réparer et d'étendre les extrémités des molécules d'ADN, dans des régions connues sous le nom de télomères. Les récepteurs nucléaires ont été impliqués dans ce processus, mais il reste à prouver qu’ils ont un rôle essentiel. Une fois la ZGA achevée et après les deux premières divisions cellulaires, des cellules différenciées émergent et vont donner naissance au trophectoderme, qui formera une partie du placenta, l'endoderme primitif, qui contribue au sac vitellin, et l'épiblaste, qui génère tous les tissus constituant le corps adulte. Ce potentiel immense de l’épiblaste est qualifié de pluripotence. Nos travaux antérieurs in vitro sur des cellules embryonnaires souches, lignées cellulaires issues de l’embryon qui conservent le même potentiel immense de différenciation, ont montré que deux récepteurs nucléaires, sont ensemble indispensables au maintien de la pluripotence. Il est donc important de comprendre si l'acquisition de la pluripotence repose aussi dans le contexte du développement embryonnaire naturel sur l'activité de cette classe de gènes. Bien que les résultats publiés sur l’inactivation des gènes de récepteurs nucléaires ne montrent pas d’effet sur les premiers jours du développement, nous pensons que l'importance de ces gènes a été masquée par la capacité de l’embryon à compenser l’absence de l’un des gènes par un autre gène de la famille. En utilisant de souris génétiquement modifiées nous allons définir le rôle synergique de plusieurs récepteurs nucléaires dans la réinitialisation et l’activation du génome, la spécification de différents types cellulaires embryonnaires, et en particulier dans l’acquisition de la pluripotence. L'objectif principal de ce projet est donc de générer de nouvelles connaissances scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre le rôle d'une classe importante de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, dans la coordination des premiers jours du développement embryonnaire, qui aboutit à la formation entre autres d’une population de cellules capable de donner naissance à tous les types de cellules constituant le corps adulte. L’embryon permet d’obtenir des cellules qui peuvent être cultivées et maintenues en laboratoire in-vitro: les cellules souches embryonnaires, ou « ESCs ». Comme les cellules de l’embryon préimplantatoire, les ESCs sont aussi pluripotentes et capables de générer de nombreux types cellulaires. Cette propriété remarquable suscite beaucoup d’espoir dans le domaine médical dans le cadre de thérapies de remplacement cellulaire. Une des retombées de nos travaux sur les embryons est d’identifier les conditions permettant de dériver des modèles cellulaires de type ESCs, mais plus immatures et donc possédant des potentialités accrues de différenciation. Ainsi, en plus de générer des connaissances de base pour mieux comprendre le développement embryonnaire de la souris, mais également d’autres mammifères, nos résultats pourraient faire progresser de manière significative notre capacité à utiliser les ESCs dans la clinique.
Procédures
Nous utiliserons la superovulation, une technique basée sur 2 injections consécutives d'hormones par voie intrapéritonéale, nécessitant l'immobilisation de l'animal pendant moins d’une minute, à 48 heures d'intervalle.
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux seront dues à deux injections d’hormones dans l’abdomen. Ces injections sont dénuées de tout effet nocif dans les conditions d’utilisation prévues. Néanmoins, elles peuvent entrainer une douleur, inconfort et stress de sévérité légère de courte durée sans impact sur la santé ou le bien-être animal.
Devenir
Toutes les femelles seront mis à mort pour prélever des embryons.
Remplacement
Nos travaux antérieurs ont largement utilisé les cellules en culture (ESCs) et ont permis d’identifier une classe de gènes, les récepteurs nucléaires orphelins, qui pourraient être impliqués dans les processus de différenciation cellulaire. Bien que l'étude in vitro des lignées de cellules pluripotentes présente un intérêt indéniable, ce modèle de différenciation ne récapitule pas complètement les mécanismes qui contrôlent la ségrégation des différents lignages embryonnaires, et les résultats obtenus en culture doivent être vérifiés et développés dans le contexte du développement naturel. C'est précisément pour ces raisons que nous devrons maintenant tester directement sur des animaux les conclusions de nos études précédentes.
Réduction
Notre travail est basé sur la comparaison entre des embryons témoins et des embryons porteurs de mutations dans différents gènes. Pour réduire le nombre de souris femelles utilisées, nous avons : • optimisé les croisements, de sorte que chaque femelle produit à la fois les embryons témoins et des embryons porteurs des mutations étudiées, dans les proportions désirées. • Nous prévoyons aussi d'utiliser la superovulation, une technique permettant d'obtenir, à partir de chaque femelle 20-30 embryons. Nous chercherons également à utiliser le moins d'embryons possible pour chacune des approches expérimentales : • Nous devrons évaluer l'expression des gènes dans les embryons et la capacité de l'ADN à être lié et modifié par des facteurs régulant le développement. Pour ces techniques basées sur le séquençage ADN, les exemples existants dans la littérature font souvent état de l'utilisation de centaines d'embryons par échantillon. Nos données préliminaires suggèrent que des données informatives sont obtenus à partir d'embryons uniques, bien que le bruit de fond et les effets de lot soient dans ce cas substantiels. Des améliorations techniques ont été implémentée, pour maximiser la reproductibilité, permettant l'utilisation de seulement 5 embryons par condition, répétée en 5 expériences indépendantes. • Nous devrons également visualiser par microscopie la présence et la localisation des facteurs contrôlant la spécification et la prolifération de chaque type cellulaire de l’embryon précoce, ainsi que suivre les extrémités des molécules d'ADN présentes dans chaque cellule, les télomères, et les protéines actives à ces régions. Nous utiliserons aussi la microscopie pour mesurer les niveaux d'expression génique globaux, et ceux de gènes spécifiques. Pour analyser chacun de ces facteurs/gènes par microscopie, entre 5 et 10 embryons sont nécessaires, et les analyses doivent être répétées au moins 3 fois. Néanmoins, 3 marqueurs peuvent souvent être analysés sur chaque embryon en même temps. Nous veillerons donc à coupler la détection de plusieurs marqueurs par embryon, et nous analyserons le moins de marqueurs possible, tout en obtenant des résultats informatifs. Enfin, des modèles de culture cellulaire pourront nous aider à établir des priorités ou d'éliminer certaines sections expérimentales tout au long de l'exécution du projet.
Raffinement
Les souris concernées par cette demande sont les femelles donneuses d’embryons, sur lesquelles deux injections intrapéritonéales seront réalisées. Bien que ces injections ne soient pas dommageables, tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, nous veillerons à ce que les animaux n'assistent pas aux injections d'autres individus, pour ne pas provoquer de stress avant la procédure. Nous immobiliserons les animaux avec précaution, et après qu'il se soient adaptés à la manipulation par l’expérimentateur.
Choix des espèces
La souris est un mammifère de petite taille à reproduction rapide qui partage 99% d’homologie avec le génome humain, d’où son intérêt majeur en recherche fondamentale sur le développement. En plus, des souris génétiquement modifiées existent déjà pour les gènes étudiés. Les souris femelles donneuses d’embryons sont des souris âgées de 3 à 12 semaines : la stimulation hormonale est efficace pour induire l’ovulation sur cette tranche d’âge.
Etude des mécanismes pro-arythmiques liés à une mutation responsable d’une maladie cardiaque héréditaire, la CPVT, lors de la réponse au stress dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un bruit de sèche-cheveux de quinze secondes répété cinq fois sert à provoquer un stress émotionnel chez des souris porteuses d'un capteur cardiaque implanté sous la peau. 90 souris vont être utilisées, 50 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 40 d'un niveau léger, toutes tuées pour prélever leur cœur. Après quarante minutes d'anesthésie pour l'implantation et une semaine de repos, elles enchaînent cinq protocoles de stress, dont un exercice physique d'une demi-heure et trois injections intrapéritonéales sur animal conscient, l'inconfort lié aux sutures étant annoncé pour quatre semaines. Le porteur retient la souris parce que son cœur compte quatre cavités comme celui de l'être humain et parce que les arythmies apparaissent entre quatre et six mois chez les lignées génétiquement modifiées reproduisant cette maladie cardiaque héréditaire.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, les troubles du rythme sont une cause importante de mort subite. Ces troubles du rythme adviennent lors de conditions pathologiques telles que l’insuffisance cardiaque ou suite à des maladies génétiques par mutation d’une protéine impliquée dans le rythme cardiaque. Lors d’un stress aigu, les catécholamines naturellement produites par l’organisme entrainent une accélération du rythme cardiaque et une augmentation du débit de sang. Dans certaines maladies génétiques comme la CPVT (tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique), des mutations altèrent cette réponse au stress, causant des défaillances cardiaques allant parfois jusqu’à la mort subite. Dans les cellules cardiaques, le calcium constitue un élément essentiel à la régulation de la fréquence cardiaque. La CPVT est causée par une mutation d’un canal cardiaque pour le calcium, RYR2. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes impliqués dans les arythmies cardiaques en situation de stress sur des modèles de souris génétiquement modifiées qui miment cette maladie. Nous étudierons ainsi la réponse au stress de ces souris. Les souris mâles et femelles seront étudiées distinctement dans ce projet afin de déceler des différences potentielles basées sur le sexe.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons mieux comprendre les mécanismes de régulation du canal au calcium RYR2 en réponse à un stress dans un contexte physiologique mais aussi dans un contexte pathologique. A court terme, il s’agit de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie et à moyen terme, cela pourrait permettre de développer RYR2 comme une nouvelle cible thérapeutique. En effet, environ un tiers des patients atteints de tachycardie ventriculaire polymorphe catécholergique ne sont pas correctement pris en charge par les traitements actuels.
Procédures
Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les animaux sont placés sous anesthésie générale pendant environ 40 minutes pour permettre l’implantation sous-cutanée d’un capteur électrocardiogramme. Les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Après implantation de ces capteurs les animaux ont une période de repos d’une semaine. On évaluera ensuite la réponse au stress par l'enregistrement du rythme cardiaque, lors de 5 protocoles successifs. La réponse au stress sera provoquée par un exercice physique (environ 30 minutes), puis des injections intrapéritonéales de substances pharmacologiques (3 protocoles différents donc 3 injections différentes ; durée d’effet moins d’une heure) sur animal conscient et par des épisodes de nuisances sonores de courte durée (bruit de sèche-cheveux, 15 secondes, répétées 5 fois). D’autres animaux seront étudiés par échocardiographie, sous anesthésie générale. C’est une technique d’étude non invasive, qui dure environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Afin d'enregistrer le rythme cardiaque, les animaux sont sujets à une implantation sous cutanée de capteurs. Cela peut entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La durée de cette nuisance est de 4 semaines (1 semaine de repos après implantation et 1 semaine de protocole expérimental puis échelonnement des euthanasies). Les protocoles expérimentaux pendant l'enregistrement du rythme cardiaque induisent un stress chez l'animal qui est nécessaire à l’expérience (stress pharmacologique par injection intrapéritonéale unique, stress émotionnel par nuisance sonore de courte durée).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de collecter le cœur. Cela nous permettra d’étudier l’expression et l’activité de notre protéine mutée d’intérêt. Ces études permettront une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans notre domaine d’étude.
Remplacement
Au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système d’étude in vitro ne permet actuellement d’analyser la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Ainsi le recours à des modèles animaux reste impératif. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. De plus, notre étude porte sur la réponse du cœur (et ses défauts) en fonction du stress, en conditions physiologique et pathologique, il est donc indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme ; les modélisations par ordinateur ne sont pas suffisantes pour mimer une telle complexité. Il est donc nécessaire pour l’évaluation de la fonction cardiaque d’utiliser un mammifère entier adulte afin de s’approcher le plus possible des mécanismes physiopathologiques humains. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés.
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables, pour chaque objectif du projet. De plus, au sein d'une procédure expérimentale, les lots de souris sont soumis à diverses techniques d’études afin de réduire le nombre d’animaux utilisés et maximiser le recueil de données sur les mêmes animaux. Afin d’utiliser au mieux les animaux à notre disposition issus des croisements de lignées, mâles et femelles seront étudiés. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire et des études sur tissus ou cellules isolés seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les interventions chirurgicales se font sous anesthésie générale et les animaux reçoivent une analgésie pré- et post-opératoire. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants : apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie.
Choix des espèces
La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un rongeur possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De ce fait, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. De plus, il a été démontré que nos protéines d’intérêt retrouvées chez l’être humain ont des fonctions similaires chez la souris. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Des souris adultes âgées de plus de 4 mois seront utilisées car les maladies cardiaques se déclarent essentiellement à l’âge adulte et il a été montré que dans les modèles CPVT de souris, les arythmies surviennent majoritairement entre 4 et 6 mois.
Elevage de souris génétiquement altérées immunodéficientes dans un contexte de recherche en cancérologie.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de cette lignée naissent dépourvues de système immunitaire fonctionnel, ce qui les rend vulnérables aux agents pathogènes courants comme aux germes commensaux, et impose une vie entière derrière des barrières stériles, avec eau acidifiée et cages autoclavées. 10 100 souris vont être élevées ainsi, dans une procédure déclarée d'un niveau de souffrance léger, l'unique geste décrit étant le changement hebdomadaire de cage à la pince. Le porteur signale chez les animaux plus âgés des queues enroulées, des têtes inclinées et des boiteries du train arrière, à une fréquence qu'il estime supérieure à 0,5 %. Cette production continue alimente des projets de cancérologie où ces souris facilitent la prise de greffes tumorales, leur devenir se réglant alors dans ces autres autorisations.
Objectifs
Les cancers sont une cause majeure de décès, derrière les maladies cardio-vasculaires.Ils représentent environ 13% de la mortalité mondiale. La croissance tumorale et la dissémination métastatique sont des processus très complexes et dynamiques dont les mécanismes ne sont pas encore compris dans leur entièreté. La recherche préclinique sur modèles animaux est aujourd’hui une étape indispensable pour améliorer notre compréhension de ces maladies et pour évaluer l’innocuité et l’efficacité des nouvelles thérapies. L’implantation orthotopique de cellules ou de tissus tumoraux permet de reproduire le plus fidèlement possible les mécanismes intervenant en pathologie humaine afin de pouvoir prédire l’efficacité clinique des nouvelles molécules anticancéreuses. A cette fin, notre plateforme d'élevage et d'expérimentation animale assure la production de souches de souris immunodéprimées (dont la souche NSG : NOD-SCID Gamma) qui facilitent la prise tumorale. Aussi, ce projet vise à décrire les procéssus de production et de soins apportés à l'élevage de cette souche de souris immunodéprimée impliquées dans les projets de recherche nécéssitant l'utilisation d'animaux de laboratoire et autorisées par le Ministère de l'Enseignement Supérieur.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes impliqués dans l'initiation au développement du cancer jusqu’à sa dissémination sous forme plus agressive (métastatique) permet d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et visent à développer des approches innovantes ciblant les altérations de la cellule cancéreuse ou de son environnement dans le but de progresser vers de nouveaux traitements.
Procédures
Change hebdomadaire de cage au moyen de pince stérile
Impact sur les animaux
Les souris NSG sont gravement immunodéficientes et sensibles à l'infection par un large éventail d'agents pathogènes normaux, d'agents pathogènes opportunistes et d'organismes commensaux.
Devenir
L'élevage des souris NSG permettra d'inclure les souris produites en continue dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement des cancers et de trouver de nouvelles pistes de thérapie.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir produire les souris NSG inclus dans les demandes d'autorisation de projet. Les besoins de production seront analysés tous les trimestres afin d'ajuster le nombre d'animaux au calendrier des procédures en cours d'exécution.
Raffinement
Les souris NSG sont gravement immunodéficientes et sensibles à l'infection par un large éventail d'agents pathogènes normaux, d'agents pathogènes opportunistes et d'organismes commensaux. Le maintien de souris NSG sans agents pathogènes est possible et réalisable par la mise en œuvre de pratiques de barrière strictes et d'une technique aseptique, pour garantir l'état de santé des souches NSG • Tous les aliments, eau, litière et cages entrant dans la pièce doivent être autoclavés ou stérilisés d'une manière ou d'une autre. • Microisolateur ou pressurisé en cage ventilé individuellement (PIV) est recommandé • L’acidification de l’eau à pH 2,5 – 3,0 contribue à prévenir l’infection par les espèces de Pseudomonas • L'équipement de protection individuelle (pâtelages stériles, rotules, gants, masques et couvre-cheveux) doit être porté à tout moment pour couvrir votre peau et minimiser les risques de propagation des bactéries aux souris. • Mordre les souris avec des pinces désinfectées, et/ou avec des mains gantées qui ont été stérilisées avec de l'éthanol • Changer de cage sous une hotte à circulation laminée. Désinfectez les mains après avoir ouvert le dessus de la cage ventilée, atteindre la cage ou retirer vos mains gantées de la cagoule. Désinfecter la hotte entre les changements • Dans un environnement de barrière strict, changements bihebdomadaires sont suffisants pour maintenir des souris saines. Cependant, les installations de recherche pourraient envisager de changer de cage chaque semaine pour empêcher l'introduction de doses minimales d'organismes opportunistes ou de plantes dans l'environnement de la cage • La queue enroulée, l'inclinaison de la tête et la boiterie des membres arrière sont observées à basse fréquence. Ces affections sont très peu fréquentes (incidence de 0,01 %) chez des souris jeunes, expérimentalement ou nées. L'incidence est estimée à plus de 0,5 % chez les souris plus âgées utilisées pour l'humanisation et d'autres études.
Choix des espèces
Les animaux utilisés pour la recherche permettent d’étudier les maladies et leurs traitements sur des systèmes vivants comparables par de nombreux aspects au corps humain. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe (interactions entre les gènes et les facteurs environnementaux, mécanismes de croissance et de dissémination) et pour améliorer les stratégies préventives, diagnostiques et thérapeutique (amélioration des moyens de détection, développement de nouveaux traitements, adaptation du traitement au phénotype précis des tumeurs). Les souris reproductrices seront selectionnées à l'age de 8-10 semaines, elles seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle pour une période de 6 mois. Le sevrage et le sexage seront réalisés entre 3 et 4 semaines. Les souris impliquées dans les projets entreront dans les procédures expérimentales à l'age de 5 à 12 semaines.
Etude du dialogue entre respiration et activité neuronale 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ce premier volet d'un projet en deux parties repose sur des chirurgies d'une à six heures, jusqu'à deux par animal, pour implanter des électrodes cérébrales et une canule nasale, suivies de sessions quotidiennes d'enregistrement de deux heures pendant plusieurs mois. Les retombées annoncées concernent les apnées du sommeil et les troubles respiratoires observés dans la maladie d'Alzheimer, alors que l'objet immédiat reste de décrire comment le rythme respiratoire module l'activité des neurones. Le porteur affirme qu'il faut travailler sur des animaux vigiles, ce qui rend selon lui l'étude impossible in vitro, et que les questions posées ne peuvent pas non plus être traitées in silico.
Objectifs
La respiration est intimement liée à la physiologie du cerveau. D’une part, l’activité respiratoire est modulée par les stimuli sensoriels, par l’attention, l’état émotionnel et elle peut être affectée dans certaines pathologies du cerveau. D’autre part, la respiration impacte le fonctionnement cérébral, influençant la perception, les émotions et la cognition en général. Un grand nombre de neurones sensoriels situés dans la cavité nasale sont des mécanorécepteurs sensibles au flux d’air et transmettent le signal de respiration aux structures en aval, dont le bulbe olfactif et de nombreuses régions cérébrales. Ce signal est supposé jouer un rôle important dans la coordination des réseaux neuronaux et pourrait participer aux processus cognitifs dans les phases d’eveil mais aussi pendant le sommeil au cours duquel, entre autres, nous consolidons nos souvenirs. L’objectif général de ce projet est de comprendre la nature du dialogue entre respiration et activité neuronale et en particulier : 1- De comprendre comment la respiration, de par son activité rythmique, influence l’activité neuronale dans le système olfactif et les régions associées 2- De comprendre comment la respiration – de par son rôle dans l’oxygénation du cerveau - influence l’activité neuronale 3- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est identique dans plusieurs lignées de souris sauvages 4- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est déficient dans un modèle de maladie neurodégénérative 5- D’identifier des mécanismes de contrôle de la respiration par l’activité des neurones. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé humaine étant donné que la prévalence des apnées du sommeil dans la population et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies (y compris la maladie d’Alzheimer).
Bénéfices attendus
Notre activité cérébrale est intimement liée à la façon dont nous respirons. La respiration module le fonctionnement cérébral (émotions, attention etc) et notre état cognitif régit en retour notre comportement respiratoire. Cependant les mécanismes impliqués dans ce dialogue sont peu connus. Cette étude apportera des éléments essentiels à la compréhension de cette question. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé étant donné que de nombreuses personnes souffrent d’apnées du sommeil et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies humaines (dont la maladie d’Alzheimer).
Procédures
Les souris seront étudiées lors de l’expression de comportements naturels et spontanés, lorsqu’elles dorment, mais aussi lors de courtes sessions où leur tête devra rester fixée face à un masque à oxygène. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau et son lieu avec la respiration, les souris seront équipés d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). Les enregistrements seront réalisés au maximum une fois par jour pour une durée de 2 heures environ (1h30 pour les expériences tête fixée). Au cours de certains enregistrements, nous ferons légèrement varier le taux d’oxygène présent dans l’atmosphère de la souris (variations
Impact sur les animaux
Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. La respiration sera enregistrée via une canule placée au niveau de la cavité nasale. Ceci nécessite la réalisation de chirurgies sous anesthésie et analgésie avec un impact très limité sur l’animal. Le port des implants suite à ces chirurgies peut générer une légère gêne pour l’animal. De plus, afin de contrôler le taux d’oxygénation des souris, nous devrons les placer dans une enceinte fermée dans laquelle l’atmosphère peut être contrôlée de manière précise. Dans une autre série d’expérience, il nous faudra maintenir la tête des souris au niveau d’un masque à oxygène, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La restriction des mouvements de l’animal pendant ces deux procédures ainsi que les variations de taux d’oxygénation peuvent être légèrement désagréables pour l’animal, tout du moins avant qu’il n’y soit y habitué. Enfin, nous prévoyons d’utiliser des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui parfois présentent des crises d’épilepsie et une mortalité accrue à partir de 4.5 mois.
Devenir
L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Ceci concerne les souris dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.
Remplacement
La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements naturels, interagissent avec leurs congénères, explorent, courent ou dorment : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.
Réduction
Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est 900 souris adultes sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris pendant plusieurs sessions d’enregistrement, ceci donnant accès à un jeu de données riche. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique. Pour les expériences visant à tester l’impact de l’oxygénation sur le cerveau, avec différents taux d’oxygénation, une souris sera son propre contrôle car elle sera testée à différent taux d’oxygénation : ce qui augmentera notre puissance statistique et donc le nombre de souris nécessaires. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes.
Raffinement
Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment à la fixation de tête). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésiques et analgésiques permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Lors des sessions d’enregistrement, les souris seront étudiées alors qu’elles expriment des comportements spontanés et naturels : elles seront exposées à des stimuli sensoriels différents de leur cage d’hébergement ce qui constituera, en soi, une forme régulière d’enrichissement.
Choix des espèces
Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction complexe entre cerveau-et respiration, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’influence de la respiration sur les fonctions cognitives a été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme ce qui appuie la pertinence de ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-12 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. L’utilisation de souris >6mois sera notamment réservée aux souris APP-PS1 qui développent un phénotype pathologique uniquement à partir de 3 mois chez les femelles et 6 mois chez les mâles.