Souris

Choisies pour leur faible variabilité, de même fond génétique, même âge et même poids, 68 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de paclitaxel ou d'oxaliplatine, deux anticancéreux neurotoxiques, une partie subissant en plus un gavage quotidien pendant huit jours et trois prélèvements sanguins par voie intraveineuse sur animal vigile contentionné. Toutes passent trois tests comportementaux nommés, un de sensibilité tactile et deux de sensibilité thermique, tous les trois jours pendant environ quatorze jours. Elles sont ensuite toutes tuées pour prélever peau, nerf et ganglions spinaux, le porteur précisant que les animaux montrant fatigue, troubles moteurs ou signes de souffrance sont retirés du protocole avant l'analyse.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hématotoxicité. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlures, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces neuropathies induites par la chimiothérapie constitue un enjeu de santé publique. Au cours d’un projet précédent, il a été mis en évidence que le récepteur à la cholécystokinine de type 2 (CCK2R) était exprimé par le système nerveux sensitif périphérique et que son blocage par un antagoniste industriel spécifique de CCK2R, prévenait le dévelopment de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin. La vincristine est un agent anticancéreux indiqué notamment dans la prise en charge des cancers hématologiques. L’objectif de ce nouveau projet est d’évaluer l’influence d’un traitement par cette molécule sur la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez des souris. Le paclitaxel est un agent anticancéreux notamment indiqué dans la prise en charge des cancers du sein et des poumons, et l’oxaliplatine dans la prise en charge des cancers colorectaux. La vincristine, le paclitaxel et l’oxaliplatine sont trois agents anticancéreux représentatifs de trois classes de chimiothérapie particulièrement neurotoxiques. Chacune de ces molécules présente un mécanisme d’action cytotoxique différent contre les cellules cancéreuses, ainsi que des mécanismes de neurotoxicité spécifiques. Nous souhaitons vérifier si l’effet préventif de ce bloqueur de CCK2R observé dans le modèle de neuropathie induite par la vincristine, se produit également dans le cadre des neuropathies induites par le paclitaxel et l’oxaliplatine.

Bénéfices attendus

Particulièrement présent dans le système gastro-intestinal et dans le système nerveux central, le récepteur CCK2R est impliqué dans la satiété, l’anxiété et la douleur. Dans un modèle précédant, la vincristine induit une hypersensibilité tactile et une dégénérescence des nerfs sensitifs, deux phénomènes totalement prévenus par l’administration du bloqueur de CCK2R. Nous supposons que cette molécule pourrait également présenter des effets préventifs (analgésique et neuroprotecteur) sur deux autres modèles de neuropathies chimio-induite, le paclitaxel, et l’oxaliplatine. La molécule d'intérêt fait aujourd’hui l’objet de plusieurs essais cliniques et présente un bon profil de sécurité. Ainsi, la mise en évidence d’un effet neuroprotecteur dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur les neuropathies induites par la chimiothérapie.

Procédures

L'ensemble des animaux recevra des injections intrapéritonéales répétées tous les deux jours ou tous les trois jours pendant une période de 6 jours. Une partie d'entre eux recevront également le traitement par voie orale tous les jours pendant 8 jours, par gavage. Une partie des animaux subiront en plus trois prélèvements sanguins en intraveineux chacun à 7 jours d’intervalle, sur animal vigile contentionné. L'ensemble des animaux sera soumis à trois tests comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours environ.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales tous les deux jours ou tous les trois jours pendant 6 jours (maximun 4 injections par animal) induiront une douleur légèreet un stress de courte durée . Au cours de l'administration du traitement par voie orale, les animaux pourront ressentir un stress lié à la préhension, le gavage peut être associé à un risque de fausse route. Les prélèvements sanguins peuvent être source de stress lié à la manipulation et la contention. Le prélèvement induira une douleur légère de courte durée. Le volume sanguin prélevé n'aura pas d'impact sur l'état général et le bien être de l'animal. Au cours des trois tests comportementaux, les animaux seront isolés de leurs congénères sur une période de courte durée ; ces tests produiront un stress le temps de la manipulation. Les tests comportementaux, évaluant la sensibilité tactile ou thermique, génèreront une gêne au moment du stimulus (de l'ordre d'une seconde). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi deux modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet du traitement sur des neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 8 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 56 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus nerveux (peau, nerf et ganglions spinaux) seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur des cadavres. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si des signes de souffrance et/ou de toxicité sont observés, alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés au traitement et/ou au paclitaxel ou à l’oxaliplatine doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux Ctrl pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Sept injections et neuf prélèvements sanguins sous anesthésie par animal, sur des souris chez qui une tumeur mammaire est déclenchée : 166 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La pousse tumorale peut provoquer une gêne ou une douleur locale, les injections intrapéritonéales, intraveineuses et sous-cutanées une douleur au point d'injection. L'objectif déclaré est d'identifier les cellules immunitaires qui éliminent les cellules en cours de transformation tumorale, que le porteur présente comme une piste de prévention des cancers et des rechutes. Parmi les animaux tués figurent les mâles reproducteurs et les souriceaux au "génotype non relevant car inutilisés", et le point limite est évoqué comme un "volume tumoral trop important" sans que le seuil soit donné.

Objectifs

Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer chez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité lié à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. Au cours des dernières années, certaines thérapies ciblant le système immunitaire ont déjà démontré des efficacités thérapeutiques sans précédent dans certains types de cancer (mélanome, cancer du poumon). Cependant, à l’heure actuelle, seulement un faible nombre de patients répondent à ces immunothérapies innovantes. Ainsi, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant les cellules du système immunitaire des patientes atteintes de cancer du sein reste primordiale. Notre projet a pour objectif de déterminer, en utilisant un modèle de tumeur spontanée mammaire chez la souris, les acteurs du système immunitaire qui pourraient être impliqués dans l'élimination des cellules qui sont en train de se transformer en cellules tumorales.

Bénéfices attendus

La compréhens ion des mécanismes impliqués dans la détection précoce et l’élimination, par les cellules du système immunitaire, des cellules en transformation tumorale devrait permettre de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques représentant une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.

Procédures

- Pousse tumorale suite à l'induction du phénotype dommageable. - Injections (x7, 2min) ; -Prelèvements de sang, x9, 5min incluant l'anésthésie

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, et/ou une douleur locale. Les injections par voies IP, IV et SC peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer un stress causé par l’anesthésie générale et une douleur locale.

Devenir

A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort pour les raison suivantes : - Les mâles reproducteurs ainsi que les souriceaux issus des accouplements avec un génotype non relevant car inutilisés; - afin de réaliser des analyses de biologie ex vivo sur les tissus mammaires au cours de la progression tumorale, les animaux seront mis à mort avant prélèvement des tissus pour éviter toute souffrance. - atteinte d'un point limite (par exemple volume tumoral trop important...).

Remplacement

À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détections des cellules en transformation tumorale par le système immunitaire.

Réduction

Grâce à des données de la littérature, issues d'expériences pilotes sur un faible nombre d'animaux, ou de par notre exeprience, le nombre de souris a été déterminé au minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 166 souris sera utilisé dans ce projet.

Raffinement

Certaines procédures (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable,un anti-douleur sera administré.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser l’infiltrat immunitaire au cours du développement tumoral. De plus nous avons pour objectif d’effectuer une analyse détaillée du microenvironnement tumoral ; les outils que nous souhaitons utiliser ne sont disponible que chez la souris.

Des femelles gestantes sont opérées trente minutes pour injecter de l'ADN modifié dans leurs embryons, et une partie des souriceaux qui en naissent reçoit ensuite une injection intrapéritonéale. 834 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des cerveaux. Le projet exprime chez ces embryons des versions mutées de récepteurs NMDA identifiées chez des patients porteurs d'un syndrome de type autistique, afin d'en observer l'effet sur le développement cortical. Le RNT résume les nuisances à la chirurgie de la mère et à la douleur d'une piqûre, sans rien dire des effets attendus de ces mutations sur les souriceaux ni de la répartition des 834 animaux entre gestantes et petits.

Objectifs

Plus de 1 % des enfants naissent avec des troubles du développement du cerveau, comme l'autisme ou un retard de développement. Grâce au séquençage complet de l'ADN, on a fait d'importants progrès dans le diagnostic de ces troubles. Récemment, on a découvert que certains gènes liés aux récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le fonctionnement du cerveau, peuvent présenter des variations génétiques. Ces récepteurs, codés par les gènes appelés GRIN1, GRIN2A, et GRIN2B, sont importants pour la communication entre les cellules nerveuses. Des mutations dans ces gènes, notamment dans la partie des récepteurs qui organise leur position à la surface des neurones, peuvent entraîner un retard de développement. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment ces récepteurs NMDA fonctionnent dans le développement du cerveau et quelles sont les conséquences des mutations observées chez certains patients.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de caractériser des pathologies GRIN et de tester le potentiel thérapeutique de médicaments existants ou nouvelles molécules. Les pathologies GRIN sont un groupe de troubles neurologiques rares causés par des mutations dans les gènes GRIN (GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, etc.). Ces gènes jouent un rôle crucial dans le fonctionnement des récepteurs NMDA, qui sont des protéines essentielles à la communication entre les cellules nerveuses du cerveau. Les mutations dans ces gènes peuvent perturber cette communication, entraînant des problèmes de développement et de fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes de pathologies GRIN peuvent présenter une variété de symptômes, tels que des retards de développement, des difficultés d'apprentissage, des problèmes moteurs, des crises d'épilepsie, et parfois des traits associés à l'autisme.

Procédures

Afin d’étudier le rôle de l’organisation des récepteurs NMDA dans le développement, nous mettrons en œuvre des approches chirurgicales pour injecter des préparations d'ADN modifiées dans les embryons (durée 30min) d'une femelle gestante permettant de visualiser les neurones et manipuler l’expression ou l’organisation des neurones corticaux afin de permettre une étude anatomique du développement cérébrale. Nous pourrons également caractériser l’impact de l’expression des sous unités du récepteur NMDA possédant une mutation identifiée chez un patient présentant un syndrome de type autistique sur le développement neuronal. Sur un nombre limité de souriceau, nous injecterons une molécule par voie intraperitonéale (durée 5min) pour induire des outils précedement electroporés. Pour cette étude, des souris gestantes et des souriceaux issus de ces souris gestantes mâles et femelles seront nécessaires. Nous analyserons les progénitures mâles et femelles en même temps pour exclure des effets sexes spécifiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances majeures que peuvent subir les souris sont liés principalement à la chirurgie de la femelle gestante et pour les souris une douleur correspondant à une injection intrapéritonéale, via une seringue.

Devenir

A l'issu de la procédure les animaux sont mise à mort pour réaliser une analyse des cerveaux.

Remplacement

La validation des outils utilisé pour l'expérimentation in vivo sera réalisé in vitro soit sur des cellules hétérogogues et des neurones en culture, ce qui nous permet de remplacer un nombre important d'animaux juste qui aurait dû être utilisé pour valider nos outils. Toutefois les modèles animaux sont essentiels pour comprendre le développement car ils permettent de reproduire de manière plus fidèle et complète les processus biologiques complexes qui se déroulent dans un organisme vivant. Contrairement aux modèles cellulaires, les modèles animaux permettent l'étude des interactions dynamiques entre différents systèmes et organes au sein d'un environnement biologique entier. Grâce aux modèles animaux, il est possible de suivre l'évolution des cellules dans un contexte global, d'étudier des fonctions physiologiques complexes, et de comprendre comment des gènes spécifiques influencent le développement global d'un organisme. Les modèles cellulaires, bien que très utiles pour des études ciblées et mécanistiques, présentent des limitations importantes. Ils ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment en ce qui concerne les interactions multicellulaires. Les cellules cultivées en laboratoire peuvent se comporter différemment de celles dans un organisme vivant, ce qui peut limiter la transposabilité des résultats. De plus, les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler le développement complet d'un organisme, rendant difficile l'étude des processus qui nécessitent l'intégration de multiples signaux provenant de différents tissus et systèmes.

Réduction

L'utilisation de neurones en culture nous permet de faire un pre-screening des mutations GRIN. En l'absence de conséquences fonctionnelles sur nos tests in vitro, nous ne procèderons pas à des tests in vivo. Les femelles gestantes seront fournis par Janvier. Si cela représente une surcharge financière, cela a l'avantage d'éviter d'avoir un pool de mâles et de femelles dédiés à la reproduction et d'éviter également de produire des souris surnuméraires. L'exportation de cette compétence à l'avantage de laisser à notre fournisseur Janvier d'optimiser cette production à l'échelle de plusieurs clients. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Les souris gestantes en provenance de chez notre fournisseur seront acclimatés au moins 24h avant la chirurgie. Les femelles gestantes issues de chez Janvier ainsi que les animaux qui naitront, vivront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, de ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les bébés resteront avec leurs mères pendant toute la phase expérimentale. Les solutions injectées chez les bébés seront maintenus à 37°C et la procédure d'injection sera la plus courte possible pour réduire l'éloignement de la mère.

Choix des espèces

La distribution cellulaire et la maturation du cerveau est similaire entre la souris et l'homme. De plus, les mécanismes qui contrôlent le développement cérébrale ont été largement étudiés chez la souris, ce qui permet de pouvoir comparer nos résultats à ceux déjà publiés dans la littérature scientifique et d'utiliser les résultats que nous avons d'ores et déjà obtenu lors de la caractérisation de ce modèle. Nous travaillerons donc sur plusieurs stades de développement : au stade embryonnaire, mais aussi le jour de la naissance et 7, 14 et 21 jours après la naissance.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de prostate humaine, passent au scanner puis sous radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant la croissance de la tumeur, avec des injections intrapéritonéales et rétro-orbitaires avant la mise à mort. Le but est de mesurer la réponse des vaisseaux tumoraux et l'oxygénation du tissu, données recueillies post mortem. Le porteur justifie l'espèce en indiquant que la souris est "le plus petit animal répertorié" sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne tout en autorisant une greffe tumorale suivie deux semaines.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans différents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. En effet, lors de la radiothérapie conventionnelle, l'oxygénation tumorale augmente dans les premières semaines de traitement. L'oxygène présent facilite des réactions physicochimiques qui augmentent la destruction des cellules tumorales. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en termes d'oxygénation du tissu tumoral. Le nombre de vaisseaux, la fraction d'aire hypoxique (sans oxygène) et le pourcentage de vaisseaux perfusés seront déterminés post-mortem. La taille des tumeurs sera également suivie. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).

Poids, comportement et aspect du poil servent de points limites déclenchant la mise à mort anticipée. 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. Chaque animal peut recevoir un implant d'œstrogène posé sous anesthésie, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins, cinq gavages au tamoxifène, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des gavages quotidiens pendant jusqu'à trente semaines, plus une ligature vasculaire. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.