Souris

3200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau du flanc droit une injection de cellules cancéreuses puis, dans l'abdomen, une injection d'immunothérapies, et développe une tumeur qui peut gêner ses mouvements. Le porteur écrit que les effets secondaires sont rares et que le suivi est assuré au minimum trois fois par semaine, quotidiennement si l'état se dégrade. Il annonce un "réel espoir" contre le cancer en précisant que le traitement testé sert déjà chez l'humain contre le rejet de greffe du rein et a déjà fait l'objet d'un essai clinique en cancérologie.

Objectifs

Les cellules cancéreuses mettent en place des freins appelés point de contrôle (PD1, PDL-1) qui vont permettre d’inactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Des immunothérapies ont été développées pour bloquer ces freins et rétablir une réponse immunitaire efficace contre le cancer. Même si ces thérapies montrent une certaine efficacité, certains patients ne répondent pas à ces traitements et certains cancers restent largement réfractaires à ces thérapies. Notre projet de recherche fondamentale a pour but de lever la résistance aux immunothérapies ciblant le point de contrôle PD1. En effet, nous espérons identifier et réveiller une sous population de lymphocytes T freinés par les points de contrôle de la tumeur afin de rétablir une réponse immunitaire anti-tumorale efficace et donc de lever la résistance aux immunothérapies. Pour évaluer la réponse à notre traitement, nous mesurerons la croissance tumorale au cours du temps pour les différents groupes étudiés (traités ou non traités) et réaliserons une analyse des différents composants cellulaires de la tumeur après mise à mort des animaux qui ont reçu ou non les traitements.

Bénéfices attendus

La réactivation des réponses immunitaires anti-tumorales grâce aux immunothérapies a démontré des effets notables sur le traitement du cancer, mais son taux de réponse doit encore être amélioré. Nous espérons améliorer la réponse immunitaire contre le cancer en réveillant une population cellulaire essentielle dans la réponse immunitaire. Il est important de mieux comprendre le fonctionnement des immunothérapies pour les combiner et améliorer la réponse contre le cancer. Ce projet représente un énorme intérêt en immunothérapie du cancer chez l'homme puisque notre traitement est déjà utilisé dans le cadre du rejet de greffe du rein et dans le traitement des maladies auto-immunes. De plus, une étude clinique a déjà été réalisée dans le cadre du cancer chez des patients atteints de tumeurs. Notre traitement est donc facilement applicable chez l'homme et constitue donc un réel espoir dans le traitement du cancer.

Procédures

Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse Une seule injection par animal - Durée : 5 minutes Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal quelques soit le nombre d’immunothérapies qu’il reçoit. Les différentes immunothérapies seront mélangées pour ne faire qu'une seule injection - Durée : 1 minute

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage. D’éventuels effets secondaires des traitements sont rares : les immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Les expériences de croissances tumorales seront réalisées en premier. Si aucune différence entre les différents groupes n’est observée pour un ou plusieurs modèles, les expériences d’immunomonitoring ne seront pas réalisées sur ces mêmes modèles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études et quotidiennement si dégradation. Une anesthésie générale gazeuse (isoflurane 3% + oxygène 1.5L/min) sera réalisée avant chaque greffe.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.

L'analgésique n'arrive qu'au-delà d'un score de douleur de 5 sur la grille du laboratoire. 80 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est gavée pendant quatre semaines, d'eau ou de sucralose, avant une anesthésie générale de quatre heures, avec pour une partie des animaux deux heures d'interruption du sang dans la patte arrière suivies de deux heures de reperfusion, et pour les autres une injection d'isoprénaline qui accélère et renforce les contractions du cœur. La question posée est de savoir si le sucralose, présent dans plus de 15 % des aliments et boissons consommés, aggrave ou atténue ces dommages, et le porteur retient des souris jeunes et de poids normal pour écarter l'effet du vieillissement et de l'obésité.

Objectifs

Pour limiter les effets délétères des sucres ajoutés sur la Santé, un remplacement par des molécules édulcorantes est fréquente dans l’industrie agro-alimentaire. Elles sont commercialisées avec le bénéfice d’avoir un fort pouvoir sucrant sans induire d’apport calorique (produits de type light). Selon les dernières estimations, plus de 15% des produits alimentaires ou boissons consommées comportent des édulcorants contribuant ainsi à une augmentation progressive de la consommation chez l’adulte et l’enfant. Ces molécules sont vendues comme des composés inertes et inoffensifs pour la santé. Cependant, cette neutralité biologique est actuellement questionnée, notamment au regard du risque cardiovasculaire observé chez les consommateurs fréquents de produits contenant des édulcorants. En effet, des études de cohorte de plusieurs centaines de milliers de personnes démontrent une augmentation significative du risque de morbi-mortalité mortalité cardiovasculaire chez les grands consommateurs d’édulcorants. De manière interressante, le suivie de la cohorte NUTRINET-santé a étudié les effets spécifiques de chaque molécule sur le risque cardiovasculaire. Une étude montre notamment pour le sucralose, l’édulcorant le plus consommé à ce jour au niveau mondial, une augmentation de la mortalité s’expliquant par une augmentation du risque de développer des maladies circulatoires, de type ischémique notamment. Néanmoins, aucune étude à ce jour n’a été menée de manière prospective pour confirmer ces observations épidémiologiques. L’objectif de cette étude est donc de voir si une consommation chronique à dose physiologique contrôlée de la molécule édulcorante sucralose peut moduler les dommages biologiques liés à des épisodes ischémiques, plus particulièrement suite à une ischémie soit du membre postérieur soit au niveau cardiaque.

Bénéfices attendus

Malgré les données epidemiologiques recensées dans la littérature, aucune étude à notre connaissance ne s’est encore interréssée à un potentiel impact d’une consommation de sucralose dans le cadre d’accidents cardiovasculaires. Ce projet vise donc à évaluer si une consommation chronique de 4 semaines de sucralose à une dose controlée et physiologique (respectant la Dose Journalière Admissible) est capable de moduler (aggraver ou protéger) les dommages occasionnés par une une ischémie-reperfusion du membre postérieur ou un infarctus de 2ème type chez la souris.

Procédures

Dans notre première procédure, deux groupes de 10 souris seront gavés pendant 4 semaines avec de l’eau et deux autres avec du sucralose. Puis deux groupes de 10 animaux, qui serviront de témoin, seront soumis à une anesthésie générale de 4 heures et deux autres groupes seront soumis à une anesthésie générale couplée à une chirurgie d'une durée de 4 heures. Dans notre seconde procédure, deux groupes de 10 souris seront gavés pendant 4 semaines avec de l’eau et deux autres avec du sucralose. Puis deux groupes recevront une injection en intrapéritonéal d’un liquide physiologique et les deux autres recevront une injection d’isoprénaline. Au bout de 7 jours, une échographie cardiaque sera réalisée sous anesthésie générale pour les 4 groupes.

Impact sur les animaux

L’administration de sucralose par voie orale (gavage) peut être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal. Une partie des animaux (groupes Ischémie-Reperfusion) sera soumise à une ischémie de la patte durant 2 heures qui provoque une diminution des apports en oxygène pouvant entrainer des altérations cellulaires (mort cellulaire, gonflement mitochondrial, etc.). Cette ischémie sera suivie d'une période de reperfusion de 2 heures qui entraîne une exacerbation de la mort cellulaire engendrée par l'apport massif en oxygène. Une partie des animaux (groupes Infarctus du myocarde) recevront une injection pouvant avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux. En effet, l'injection va principalement se traduire par une augmentation de la force et de la fréquence de contraction du coeur des animaux, impliquant de potentiels palpitations cardiaques.

Devenir

Mise à mort des animaux à l'issue de la procédure pour prélèvement des tissus nécessaire.

Remplacement

Les mécanismes de digestion, d’absorption et de bioaccumulation de molécules sont complexes. Aucune méthode in vitro ne permet de remplacer de manière exhaustive les mécanismes de digestion in vivo. De plus, il n'existe à l’heure actuelle, aucun modèle de substitution in vitro ne permettant d’évaluer l’impact de l’ischémie reperfusion périphérique ou de l’infarctus du myocarde de 2ème type suite à une consommation chronique de sucralose. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser nos mesures tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela un nombre minimum de 10 animaux par condition apparait comme nécessaire. Cet effectif est basé sur un calcul d'effectif statistique.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à leurs conditions d’hébergement pendant les 11 jours suivant leur arrivée, avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les animaux sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (igloos, tubes, et coton). Pour permettre aux souris de ronger, de petits bâtonnets en bois sont également proposés. Les animaux auront un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont visités bi-quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une table de score intégrant les différents point limites et mesures médicamenteuses ou non à mettre en place (annexe en pièce jointe). Au dela d'un score de 5 sur cette fiche l'utilisation un analgésique pourra etre utilisé afin de garantir le bien être de l'animal. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Lors de la procédure d’ischémie-reperfusion de la patte, les animaux sont anesthésiés et une injection d'un analgésique sera réalisée avant l'intervention puis une seconde au bout de 2 heures pour limiter au maximum la douleur ressentie. La température des animaux est maintenue constante grâce à l’utilisation d’un tapis chauffant. Pour la procédure d’injection d’isoproterenol, les animaux seront préalablement enduits d'un anesthésique local au niveau de la zone d’injection afin de réduire la douleur liée à celle-ci. Suite à cette procédure, les animaux seront surveillés attentivement pendant les heures suivant l’injection pour observer d’éventuels changements de comportements. En accord avec la grille de score, l’euthanasie de l’animal pourra etre envisagée.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent afin d’étudier les effets d’une molécule impliquant des mécanismes de digestion car son système digestif est proche de celui retrouvé chez l’Homme. Le modèle souris a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. De plus, ce modèle d’ischémie-reperfusion périphérique ainsi que celui de l’infarctus du myocarde de 2ème type spécifiquement sur le modèle souris est particulièrement validé dans la littérature et maitrisé au sein du laboratoire. L’utilisation de ce modèle permet également de réaliser ces modèles sur des souris transgéniques le cas échéant, afin de valider une voie de signalisation ou un mécanisme moléculaire sous-jacent. Les souris seront âgées de 9 semaines en début de protocole afin qu’elles atteignent un poids d’environ 30 grammes en fin de protocole. Nous avons choisi de travailler sur des souris jeunes afin d’exclure tout impact du vieillissement sur les paramètres analysés dans notre étude. Nous avons choisi de travailler sur des souris normo-pondérées afin d’exclure un potentiel impact de l’obésité qui pourrait également impacter nos résultats. En effet, notre objectif étant de valider l’impact de la consommation subchronique de sucralose sur les dommages liés à l’ischémie reperfusion périphérique ainsi qu’à l’infarctus du myocarde de 2ème type, nous souhaitons travailler chez des animaux jeunes et sains avant de potentiellement passer sur des modèles plus spécifiques (e.g. obésité).

Pour constituer une banque de tissus et de fluides partagée entre laboratoires, 150 souris et 30 rats, chez qui des maladies neurodégénératives sont modélisées, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soixante d'entre eux subissent une chirurgie de deux heures sous anesthésie, dès l'âge de quatre semaines. Tous sont tués par perfusion à travers le cœur, à partir d'un mois, pour l'examen histologique du cerveau. Le porteur annonce un risque de paralysie lié à la maladie modélisée et présente la banque comme un moyen de "ne pas générer des animaux supplémentaires", alors qu'elle repose sur 180 animaux tués pour la remplir.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) sont des troubles neurodégénératifs. Les similitudes et les différences entre les maladies neurodégénératives (MN) sont définies en fonction du statut pathologique des zones et des types de neurones affectés. Cependant, on ne sait toujours pas quelles altérations sont les causes ou les conséquences de ces maladies. Ce projet de recherche permettra de mettre en commun nos forces et notre matériel biologique afin d'élucider les points communs et les spécificités des pathologies. Pour ce faire, nous devons construire une bio banque (base de données) de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de MN qui sera utilisée et partagée par tous les investigateurs. Cet effort permettra de réduire le nombre d'animaux générés et utilisés indépendamment par chaque chercheur dans une seule bio banque utilisée et ouverte à tous ceux qui s'intéressent aux MN dans la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Construire une biobanque disponible de tissus et de fluides biologiques de modèles animaux de maladies neurodégénératives Cette biobanque disponible pour tous les laboratoires du departement et aura pour bénéfice de donner un accès aux tissus et aux prélèvements. Cette action permettra leur mutualisation, et ainsi de ne pas générer des animaux supplémentaires.

Procédures

Chirurgie à partir de 4 semaines (2heures sur animal anesthésié) pour 60 animaux Perfusion intracardiaque (sur animal anesthésié) et euthanasie à partir de 1 mois d'âge pour l'ensemble des animaux

Impact sur les animaux

1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie ce risque est compensé par l’analgésie 2/Risque de paralysie du à la MN

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser une étude histologique détaillée du cerveau

Remplacement

La souris et le rat sont les espèces de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Dans l’état actuel des connaissances, nous ne pouvons pas nous passer d’animaux vivants, car il n’est pas possible de mimer le développement des maladies neurodegenratives. Néanmoins, toutes les étapes préliminaires pouvant être réalisées in vitro, telles que les validations des constructions moléculaires qui seront injectés en intra cerebral le seront sur cultures cellulaires

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat sont deux espèces de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à partir de 4 semaines. Afin de travailler sur des modèles cohérents avec la mise en place de phénotypes pathologiques

Quinze minutes le nez maintenu au contact d'un aérosol de bacilles de la tuberculose, puis un gavage d'antibiotique cinq jours par semaine pendant quatre semaines : 5940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour compter les bactéries dans leurs organes. L'objet réel du projet est bactérien, il s'agit de savoir quelles fonctions permettent au bacille de survivre à la fois au traitement et à la réponse immunitaire, la souris fournissant le lieu de l'infection. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit les granulomes des phases tardives et que le modèle animal reste "incontournable". Les bénéfices annoncés, des traitements plus courts et plus efficaces, restent au conditionnel, l'infection de près de six mille souris étant, elle, planifiée sur cinq ans.

Objectifs

La tuberculose reste un problème majeur de santé publique dans le monde entier. Cette maladie se caractérise par la persistance des bacilles de la tuberculose chez l’hôte et la longueur des traitements antibiotiques. Plusieurs résultats suggèrent un lien entre la tolérance bactérienne aux médicaments, c'est-à-dire la capacité à supporter certains niveaux d'antibiotiques pendant un certain temps, et la capacité bactérienne à résister à la réponse immunitaire de l'hôte. Cependant, les études qui font le lien entre ces deux domaines manquent cruellement. Nous proposons ici d'explorer les fonctions et les adaptations importantes pour survivre au traitement médicamenteux et à la réponse immunitaire de l'hôte chez les bacilles de la tuberculose. Notre objectif est d’évaluer si cibler des fonctions importantes pour la persistance chez l’hôte et la tolérance aux antibiotiques permet une meilleure efficacité des traitements et une élimination plus rapide des bacilles. Dans des travaux antérieurs, nous avons sélectionné des mutants de bacilles de la tuberculose présentant une persistance accrue chez la souris. Nous avons constaté que la tolérance à l’isoniazide et la rifampicine, deux antituberculeux utilisés en clinique, était également accrue chez ces mutants. Dans un premier temps, nous avons entrepris de caractériser les mutations responsables et les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous construirons ensuite des souches recombinantes de bacille de la tuberculose dans lesquels les gènes identifiés seront soit inactivés soit placés sous contrôle d’un promoteur inductible à la doxycycline. Enfin nous évaluerons dans le modèle souris l'effet synergique des médicaments et de l’inactivation de ces gènes. Les résultats attendus devraient mettre en lumière les caractéristiques mycobactériennes expliquant la pandémie actuelle de tuberculose et fournir des perspectives intéressantes pour le contrôle de cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir de nouvelles connaissances scientifiques sur la tolérance aux médicaments chez les bacilles de la tuberculose et le lien entre la tolérance et la persistance chez l’hôte traité ou non-traité. Les résultats attendus devraient également fournir des informations sur l'effet synergique de la réponse immunitaire et des antibiotiques sur des souches recombinantes altérées pour la tolérance aux médicaments. Ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques intéressantes contre la tuberculose dans le but de réduire la durée des traitements et d’augmenter leur efficacité.

Procédures

Les animaux seront infectés avec des bacilles de la tuberculose. Pour cela, les souris seront maintenues dans des chambres individuelles de contention permettant de maintenir le nez de la souris en contact avec l’aérosol. Cette opération dure 15 minutes. Certains groupes d'animaux recevront 5 jours par semaine pendant 4 semaines maximum une dose d’antibiotique donnée par gavage.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux sont attendus à deux niveaux dans nos expériences: 1) lors de l’infection des animaux, et 2) lors des traitements antibiotiques . Pour le 1er niveau, il s’agit de nuisances modérées (contention) d’une durée d’environ 15 min. Enfin, concernant les antibiotiques, les animaux subiront une contention de quelques minutes 5 jours sur 7 pendant 2 ou 4 semaines. L’impact de cette manipulation sur le bien-être des animaux sera évalué lors d’expériences préliminaires.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans différents organes.

Remplacement

Les modèles cellulaires ne permettent pas à l’heure actuelle de rendre compte de la totalité des étapes de l’infection d’un hôte par les mycobactéries pathogènes, tel que les bacilles de la tuberculose. Ainsi il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour l’étude des phases tardives de l’infection telles que la persistance ou la transmission. Les modèles cellulaires ne permettent pas de reproduire les granulomes rencontrés dans ces phases tardives et d’étudier la réponse bactérienne aux stress rencontrés dans ceux-ci. Le modèle animal est donc incontournable à l’heure actuelle pour ces études. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé est le modèle souris. Ce modèle reproduit notamment au niveau immunologique bon nombre des observations faites chez l’humain. Dans ce projet, les souches mutantes de Mycobacterium tuberculosis seront testées au préalable in vitro et dans des modèles cellulaires mimant les étapes précoces de l'infection. Le modèle souris sera utilisé en cas de résultats positifs pour mimer les étapes tardives.

Réduction

Les différentes phases du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Nos expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité.

Raffinement

Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: limitation au minimum des temps de contention lors de l'infection et administration des antibiotiques, surveillance accrue après chaque geste, mise en place d'une grille de scoring et de points limites précoces. L’expérience implique un traitement antibiotique quotidien (5 jours sur 7). Nous réaliserons deux expériences préliminaires pour évaluer le stress et la contrainte sur les animaux et choisir la voie d’administration la moins contraignante pour les animaux tout en permettant d’observer l’effet des antibiotiques. Au cours de ces expériences préliminaires, nous déterminerons aussi le temps le plus précoce auquel un effet des antibiotiques est détecté

Choix des espèces

Pour notre projet visant à explorer le lien entre tolérance aux antibiotiques et persistance chez l’hôte par le biais de l'étude de souches bactériennes mutantes, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'existence et de l'excellente caractérisation des fonds génétiques de résistance variable à la pathologie , ii) du fort degré de convergence avec les paramètres de l'immunité chez l'homme, iii) de la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables. Pour ces raisons, le modèle souris est généralement le modèle utilisé en première intention dans les études précliniques. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, âgées entre 6 et 10 semaines. L’objectif est que les souris aient un système immunitaire mature et que les groupes soient homogènes en âge.

Tuées après leur dernier repas, celui des moustiques, 3600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris élevées pour cela servent huit fois, chaque fois anesthésiées dix à trente minutes le temps que les moustiques les piquent, avec une anémie passagère et une injection de sérum physiologique pour compenser le sang perdu. D'autres viennent des surplus de l'animalerie, animaux qui allaient être tués pour leur génotype ou leur âge, et ne servent qu'à un seul repas. Le porteur écarte le repas artificiel sur membrane parce que 40 à 50 % des moustiques femelles s'y nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant, ce qui menacerait le rendement en œufs de ses 110 lignées.

Objectifs

Les animaux de ce projet seront utilisés pour un élevage d’une centaine de lignées de moustiques que nous utilisons pour nos expériences, qui ont pour but de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions entre les moustiques et le pathogènes qu’ils transmettent, et de mettre au point de nouvelles stratégies de lutte contre ces maladies. Pour ce faire, nous générons diverses lignées de moustiques, sélectionnées en fonction de leur phénotype ou génétiquement transformées, et étudions leur comportement lors d’infections. Les repas sanguins sont nécessaires aux femelles pour pondre leurs œufs. Le site fournit également des services, notamment l’envoi ou l’infection de moustiques, à des laboratoires publics ou privés extérieurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de maintenir les lignées existantes en expérimentation, et d’en créer de nouvelles pour les projets de recherche de notre laboratoire et des laboratoires extérieurs utilisant notre plateforme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour permettre aux moustiques de prendre un repas sanguin pendant 10 à 30min. Ils sont exposés aux nuisances suivantes : (1) injection d’anesthésique, et (2) prélèvement sanguin par les moustiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont limitées. Aucun signe de démangeaison n’est observé après piqûres par les moustiques, et leur récupération est rapide. Cependant, au cours de sa vie, chaque souris est soumise à 8 anesthésies générales avec perte limitée de sang qui génère une anémie passagère.

Devenir

Les animaux surnuméraires qui seront utilisés pour un unique repas sanguin des moustiques seront mis à mort après le repas. Les souris spécifiquement élevées pour les repas sanguins des moustiques seront utilisées pour 8 repas et mises à mort après le dernier repas.

Remplacement

La méthode alternative à savoir la prise de repas sanguins sur du sang humain ou animal à travers une membrane artificielle, n’est pas applicable du fait des contraintes techniques de mise en œuvre de ce système qui ne sont pas adaptées au nombre élevé de lignées de notre élevage (≈ 110 lignées). De plus, lors d’un repas artificiel sur membrane, 40-50% des femelles moustiques se nourrissent contre 80 à 100 % sur un animal vivant. Ainsi, le rendement en œufs des lignées nourries artificiellement risque d’être insuffisant, et d’interférer avec les expériences ou même de conduire à la perte de certaines lignées.

Réduction

Chaque souris est utilisée en moyenne 6-8 fois pour les repas sanguins. Nous proposons également de récupérer les souris surnuméraires de l’animalerie (souris qui sont mises à mort sans être utilisées dans des protocoles expérimentaux à cause de leur génotype, de leur âge…) pour réaliser des repas sanguins uniques et ainsi réduire le nombre de souris que nous élevons spécifiquement pour les repas sanguins des moustiques.

Raffinement

Les souris utilisées pour le repas sanguins sont hébergées en groupe. Elles bénéficient de frisure de carton ainsi que de tunnels. Elles sont anesthésiées pour le repas sanguin puis elles reçoivent une injection de solution saline physiologique pour compenser les pertes en volume sanguin lors du repas des moustiques. Durant le repas, les yeux des souris sont protégés avec un gel pour éviter qu’ils ne se dessèchent. Pendant la phase de réveil, les souris sont placées sous lampe chauffante pour limiter les déperditions en chaleur. Les souris sont laissées au repos pendant au minimum 4 semaines entre 2 repas sanguins afin qu’elles puissent reconstituer leur stock de cellules sanguines et éliminer toute trace d’anesthésique.

Choix des espèces

Parmi les espèces de rongeurs possibles Mus musculus s’avère le choix le plus pertinent pour nos expériences : - Les moustiques Anophèles et les moustiques Aedes, naturellement anthropophiles, sont capables de se nourrir sur cette espèce. - Les souris ne présentent pas de signe de démangeaison après piqûres de moustiques. - Les souris récupèrent rapidement après avoir été soumises à un repas sanguin. - Les infections des moustiques pour leur phénotypage se font en majorité sur des souris infectées (avec le parasite murin Plasmodium berghei, ou avec les virus de la dengue ou Zika). - Les moustiques sont plus enclins à se nourrir sur les souris infectées quand ils sont régulièrement nourris sur la même source de sang. Nous utiliserons des souris adultes âgées au minimum de 8 semaines (> 35 g) car les souris plus petites risquent une perte volumique trop importante lors des repas sanguins.

Ce projet ne produit aucune connaissance, il sert à ce que des stagiaires, des contractuels et des titulaires s'exercent aux gestes techniques sur 1000 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris peut recevoir jusqu'à trois actes. Prises de sang à la joue ou à la queue, injections sous la peau, dans la patte, le muscle, l'abdomen ou la veine, instillation nasale sous anesthésie, gavage, pose d'une puce sous-cutanée. Le porteur précise que le nombre de souris dépend de la dextérité de la personne formée, qu'il puise dans les animaux de réforme et de surplus de l'élevage, et que les souris sont tuées selon leur état général ou gardées pour une à deux répétitions à 48 heures d'intervalle. Il écrit que les méthodes non animales, vidéos ou mannequins, "ne sont pas pratiquées" et qu'il les envisagera plus tard "si cela est possible", la formation continue étant réclamée par la réglementation.

Objectifs

Les objectifs pédagogiques et scientifiques de cette formation sont doubles et répondent à la réglementation en expérimentation animale en vigueur et à la maîtrise et au maintien du savoir-faire des expérimentateurs : - former les expérimentateurs à la mise en œuvre d’expérimentation animale : procédures faiblement invasives (injections intrapéritonéale, intradermique et sous-cutanée), pose de puces télémétriques, gavage et prélèvements sanguins. Cette formation fait partie de la formation réglementaire à l’expérimentation animale, du maintien de compétences et du suivi des compétences (livret de compétence individuel). - former les expérimentateurs à la maîtrise de leurs procédures expérimentales, au respect du bien-être animal et à l’utilisation du modèle murin dans leurs projets de recherche. Ce projet est validé par la direction de l’unité sur fonds propres afin de répondre aux attentes réglementaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est la formation du personnel et maintien des compétences des agents permanents et des contractuels temporaires (Main d’œuvre occasionnelle (MOO), contrat à durée déterminée (CDD) et étudiants de tous niveaux).

Procédures

Prélèvement de sang à la veine submandibulaire sur animaux vigiles : 5 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Prélèvement de sang à la veine caudale latérale sur animaux vigiles : 5 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Administration par voie sous-cutanée, intrapodale, intradermique, intramusculaire et intrapéritonéale, intraveineuse sur animaux vigiles : 10 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Administration par voie intranasale sous anesthésie générale : 10 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former. Administration de liquide par gavage Pose d'une puce télémétrique sous-cutanée sur animaux vigiles : 3 min Le nombre de souris dépend de la dextérité du personnel à former.

Impact sur les animaux

Trois actes maximums, décrite dans la procédure, peuvent réaliser sur un même animal. Les principales nuisances attendues seront donc le stress de la contention, la formation d’hématome lié à la prise de sang et les fausses routes au cours d’un gavage. Les différents sites d'injection (Intrapéritonéal (IP), intramusculaire (IM) et sous-cutanée (SC)) peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection, et en cas d’échec à l’injection, un hématome pourrait survenir.

Devenir

Les animaux utilisés par les stagiaires ne peuvent pas être réintroduits dans l’élevage et ne peuvent pas être utilisés pour des expérimentations. Les souris sont donc mises à mort en fonction de leur état général et de la dextérité l’expérimentateur ou conserver pour une à deux répétitions des gestes à 48h d’intervalle avant euthanasie.

Remplacement

A la fin de leur stage ou de leur contrat de travail à durée déterminée, les expérimentateurs sont sensibilisés à l'utilisation d'animaux vivants et savent comment réaliser une expérimentation animale dans sa globalité chez la souris. Il est donc nécessaire que leur formation, pour qu'elle soit complète, comporte des manipulations. Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode de remplacement pour étudier les agents infectieux permettant la formation appropriée de nos expérimentateurs. Les méthodes non animales ne sont pas pratiquées. Cependant, dans un futur, nous envisagerons, si cela est possible, d’utiliser ces méthodes.

Réduction

Utilisation des animaux de réforme et de surplus issus de l’élevage principalement et des 2 sexes, soit au total 1000 souris sur 5 ans (20 stagiaires par an pour 10 souris maximum, soit 200 souris par et dont sur 5 ans = 1000). Plusieurs actes pourront être effectués sur une même souris afin de réduire le nombre de souris utilisées Le nombre est à adapter en fonction du nombre d'essais pour les procédures à réaliser. Aucune analyse statistique ne sera réalisée. Les méthodes non animales ne sont pas pratiquées actuellement. Cependant, dans un futur, nous envisagerons, si cela est possible, de réaliser et d’utiliser ces méthodes (vidéos ou mannequins) afin de réduire l'utilisation de souris.

Raffinement

Avant le début de l’expérimentation, les personnes formées sont sensibilisées à la préhension/contention des souris, aux procédures à réaliser et au comportement à avoir afin de limiter le stress des animaux. Les souris sont acclimatées à leur nouvel environnement pendant une semaine avant la formation, et réparties en groupe de 3 animaux socialement harmonieux par cage et avec un environnement enrichi (type sopalin, tunnel (à ronger) ou igloo). Pour toutes les interventions nécessitant une anesthésie générale, les animaux sont maintenus sous tapis chauffant pour leur bien-être, afin de prévenir d’une chute de température corporelle lié à l’anesthésie. Les animaux sont placés dans leur cage les uns contre les autres avec les voies respiratoires dégagées pou favoriser également le réchauffement naturel entre eux. De l’enrichissement pour la nidation est également rajouté dans leur cage. Pas de point limite attendu car uniquement injection d’eau physiologique, donc en théorie pas de douleur attendue en dehors de celle potentielle à l’introduction d’une aiguille, mais tout de fois, si nous observons le moindre signe de mal être, au niveau facial, au niveau du poil (légèrement hirsute) ou au niveau de la posture (légèrement vouté), agressivité, l’animal sera automatiquement euthanasié par le formateur/tuteur.

Choix des espèces

L'unité doit s’assurer de la maitrise des gestes techniques mis en œuvre dans l’unité par l’ensemble du personnel y travaillants. Cette formation (tutorat) fait partie de la formation continue demandée par la réglementation sur l’expérimentation animale et du suivi des compétences de l’ensemble du personnel. L’objectif est de maîtriser certains gestes techniques sur le modèle murin afin de les mettre en œuvre dans des projets scientifiques. 1000 souris d'âges variables en fonction des demandes scientifiques : 20 stagiaires en moyenne par an et pour 10 souris maximum par stagiaire, soit 200 souris par an. La demande est prévue pour 5 ans et dont un total maximum de 1000 souris d'âges variables en fonction des demandes scientifiques.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard sept jours après le début de la procédure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule administration du composé, une injection dans l'abdomen ou un gavage de trente secondes, et son sang comme ses organes sont prélevés après la mise à mort. Le projet ne mesure pas l'efficacité de la molécule mais son trajet dans le corps, absorption, diffusion, élimination, afin de choisir la dose et la voie des futures études sur des souris atteintes de cancers du sang. Le porteur indique avoir calculé l'effectif par groupe avec des logiciels statistiques reconnus, sans dire combien de groupes il prévoit ni ce qui conduit à 370 animaux.

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Les traitements des cancers hématologiques peuvent entrainer un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une petite molécule qui a montré lors de précédentes études, un effet prometteur sur des cellules de cancers hématologiques. Cette molécule ou composé est capable d’être internalisé par les cellules, et d’empêcher l’interaction de différentes molécules, ce qui permet de perturber la survie et la prolifération des cellules tumorales puis de jouer sur leur résistance à différents stress cellulaires. Une étude de ce composé a déjà été réalisé au préalable chez la souris, celle-ci avait pour but de définir sa tolérance par l’animal selon les modes d’administration. Ayant connaissance de ces informations, le présent projet vise à étudier le devenir de ce composé dans l’organisme une fois administré. Différentes voies d’administrations, différentes doses seront testées chez l’animal et une analyse du composé dans le plasma au cours du temps, nous permettra alors d'étudier au bout de combien de temps celui-ci est-il est détectable dans le sang, la quantité maximale que l'on va pouvoir atteindre et au bout de combien de temps il va être éliminé. L’objectif principal étant alors grâce à ces informations, de conclure quant à la voie et la fréquence d’administration, ainsi que la dose, qui seront préférées pour de futures études d’efficacité de ce traitement sur des souris atteintes de cancers hématologiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intrapéritonéal (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang et d'organes sont réalisés en post-mortem.

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes dûe à l'aiguille lors de l'injection intrapéritonéale. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n'ont été observé chez la souris lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 7 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancer sur lequel il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez la souris a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de projets futurs son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantitiés maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de souris par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez la souris, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les souris seront observées tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des souris sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé ou le véhicule sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez la souris non consanguine. Les souris non consanguines sont utilisées pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les souris non consanguines présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressantes pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.

120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux examens d'imagerie de l'œil sous anesthésie gazeuse, un électrorétinogramme de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, et pour une partie d'entre elles une exposition à une lumière forte pendant trois heures, éveillées. L'objectif est de mesurer ce que devient la rétine quand une protéine protectrice manque, dans une lignée dont le porteur précise qu'elle ne développe pas de maladie grave. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit un trajet optique complet et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Les Rétinopathies Pigmentaires (RP) touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, les photorécepteurs à bâtonnets puis à cônes, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. Les études menées antérieurement par l’équipe sur les RP ont mis en évidence un gène qui code pour des facteurs ayant une fonction protectrice sur les cellules touchées. Une des deux protéines est sécrétée par un type de photorécepteurs, les batônnets et a une activité protectrice sur le 2ème type de photorécepteurs, les cônes. Le second produit du gène, joue un rôle protecteur contre l'oxydation. Pour ce faire, nous avons étudié les conséquences de l’absence d'un des produits du gène à l'aide d'un modèle de souris transgénique sur la fonctionnalité des photorécepteurs lié au stress oxydatif en comparaison avec des animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Les rétinites pigmentaires (RP), sont les formes les plus communes des dégénérescences rétiniennes congénitales. Elles touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer.

Procédures

- L’imagerie oculaire: examens réalisés sous anesthésie gazeuse sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée : 20 minutes par animal et par passage. Examen réalisé 2 fois par animal, espacé de 2 semaines. - Electrorétinogramme: examen réalisé sous anesthésie générale sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée 45 minutes. Examen réalisé une seule fois par animal. - Surexposition lumineuse pendant 3 heures sur animal vigile avec une seule mesure tout au long de l'expérience. Les animaux testés pour la surexposition lumineuse, auront avant le test, une injection sous-cutanée de sérum physiologique puis une pesée avant et après le test de surexposition lumineuse pour évaluer l'effet de cette surexposition sur une déshydratation éventuelle.

Impact sur les animaux

L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra-péritonéales et les examens phénotypiques de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées peuvent être considérées comme une nuisance de douleur légère et de courte durée dû à l'introduction de l'aiguille Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers. L'exposition des animaux à une lumière forte peut entrainer une déshydratation se traduisant par un poil hérissé dû au positionnement de la cage, placée en dessous des néons et séparés par une plaque en plexiglass.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale pour les analyses post-mortem. L’euthanasie est requise afin de procéder aux différents prélèvements nécessaires en vue des analyses à mettre en œuvre pour répondre à la question scientifique

Remplacement

L’étude de la fonctionnalité de la rétine ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Il y a nécessité d'avoir la rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Dans ce projet, le modèle animal développé s'inscrit dans certaines caractéristiques de pathologies. Il n’y a donc pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement en fonction des naissances. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel adapté. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque groupe a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe, en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe) et des contraintes techniques (rentabilité technique). Ce projet impliquera au maximum 120 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. L’application de cette échelle adaptée à nos expérimentations pourra nous amener à décaler dans le temps les actes prévus dans la séquence expérimentale. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale adaptée. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien-être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées avec un logiciel adapté. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Le raffinement réside aussi dans le fait de concevoir les expériences en limitant au maximum l'utilisation de groupes contrôles surnuméraires. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique permettant d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt. Cette souris ne présente pas de phénotype dommageable car elle n'entraine pas le développement d'une maladie grave. Nous avons sélectionné cette espèce car la rétine de la souris est semblable en plusieurs points à celle de l’Homme (organisation des couches neuronales, les membranes, la vascularisation, les circuits). Nous voulons commencer les études juste avant l’apparition de modification de la structure de la rétine (du fait du modèle animal). Les animaux auront environ deux mois à leur entrée dans les procédures expérimentales.

Nées avec une croissance dentaire anormale, des dents trop longues et incontrôlées pour certaines, rabougries pour d'autres, 2700 souris génétiquement modifiées sont élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À dix jours, chacune se voit couper un morceau de queue pour vérifier son génotype. Le porteur indique que la douleur y serait alors faible, voire nulle, l'ossification de la queue n'ayant pas commencé, et prévoit de la nourriture en gelée et des bâtonnets à ronger pour compenser les difficultés à s'alimenter. Cet élevage ne répond par lui-même à aucune question scientifique, il alimente de futures demandes d'autorisation sur les macrophages, et les animaux conservés à l'issue rejoignent d'autres projets.

Objectifs

Nous élevons une lignée de souris génétiquement modifiées qui présente un phénotype spécifique, impliquant des altérations physiologiques et comportementales. Ces souris, en raison de modifications précises de leur génome, affichent une croissance anormale des dents. Cette anomalie dentaire peut entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui, à son tour, peut causer un retard de croissance et une diminution de leur poids corporel. Pour atténuer ces effets néfastes, nous mettons en place une prise en charge adaptée, incluant une alimentation spécifique qui compense les limitations dues à la croissance dentaire. Ces souris sont produites dans le but de répondre à des objectifs scientifiques variés. En raison de leur modification génétique, elles sont un modèle précieux pour étudier les rôles spécifiques de certaines cellules immunitaires, comme les macrophages, qui jouent un rôle crucial dans divers tissus du corps. La suppression de certaines populations cellulaires permet d'examiner en profondeur les conséquences de leur absence, ce qui est pertinent pour la recherche sur le développement et la régulation immunitaire. De plus, ces souris modifiées sont utilisées pour modéliser diverses pathologies comme le cancer ou l’étude des rôles homéostasiques des macrophages. Permettant ainsi dans l’avenir des applications biomédicales.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, la recherche sur les macrophages a émergé comme un domaine clé en immunologie. Ceci est dû à notre compréhension croissante du rôle vital de ces cellules dans l'homéostasie des tissus et leurs divers rôles significatifs dans différentes maladies tels que le cancer, les infections ou encore maladies auto-immunes. Le premier Conseil Scientifique Présidentiel réuni en avril 2024 a spécifiquement souligné les macrophages comme un "axe majeur et émergent" pour les années à venir. Ce modèle de souris va permettre d'étudier le rôle de plusieurs populations de macrophages dans divers tissus très localisés. Les différentes caractéristiques observées après génération des souris confirment d'ailleurs la nécessité de comprendre leurs fonctions et l'utilité de ce modèle pour y répondre.

Procédures

2700 souris se verront prélever un morceau de queue 10 jours après leur naissance.

Impact sur les animaux

Après la première génération de souris, nous avons observé que certaines étaient plus petites que leurs congénères du même groupe. Nous avons également constaté une croissance anormale des dents : certaines souris présentaient des dents nettement plus petites et plus fines, tandis que d'autres avaient des dents beaucoup plus longues avec une croissance non contrôlée. Ces deux problèmes pourraient être liés, la croissance anormale des dents pouvant entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui diminuerait la prise de poids. Un prélèvement de la queue sera réalisé sur les animaux 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le système nerveux de cette partie est encore immature et l’ossification de la queue inexistante.

Devenir

Les animaux qui sont conservés après la fin de cette étude seront utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche. Cette utilisation continue permet de maximiser les données obtenues à partir des animaux tout en respectant les principes d'éthique de réduction du nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Ce projet décrit l’élevage de souris génétiquement modifiées en condition de maintien pour une lignée à phénotype dommageable. Ces souris seront utilisées pour de futures demande d’autorisation de projet interrogeant la fonction des macrophages ciblés. Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et son microenvironnement puisque nous ne connaissons pas l’ensemble des signaux.

Réduction

Nous maintiendrons un élevage à minima sur la base de 5 accouplements avec 1 mâle et 3 femelles par accouplement car cette lignée semble avoir des portées de petites tailles. Ces derniers seront renouvelés toutes les 26 semaines. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les descendants des accouplements précédents.

Raffinement

- de la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage pour surmonter toutes les difficultés d'alimentation des souris. - Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées lorsque cela sera nécessaire. - Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux seront surveillés pendant cette période d’accouplement et d’élevage et des mesures adéquates prises en cas de comportement agressif allant de l’enrichissement de la cage en dômes, de mesures d’isolement temporaire en cas de comportement agressif, en l’’administration de crème par voie cutanée sur de possibles blessures pourront être mises en place si nécessaire.

Choix des espèces

L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour de futures recherches. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement en fonction des projets dans lesquels ils seront impliqués. Par exemple, si nous nous intéressons au développement dentaire qui est altéré dans ce modèle, nous analyserons des souris durant les premières semaines après la naissance. Pour les projets étudiant le rôle des macrophages de la tête et du cou dans diverses pathologies (cancer, infection), des animaux adultes seront utilisés. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les individus âgés de 6 à 10 semaines au moment du début de l'accouplement.