Souris
Modèles murins pour étudier le role des kinases Pim1 et Pim2 au cours de la réponse immunitaire humorale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injections intrapéritonéales, injections sous-cutanées, gavages à la canule métallique sans anesthésie et prélèvements sanguins submandibulaires répétés : 800 souris subissent ces actes sur animal vigile, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur reconnaît que le gavage peut provoquer une détresse respiratoire et un reflux, tout en affirmant que ses protocoles n'induisent "pas de phénotype" et pas d'autre stress que celui, "bref et modéré", de l'injection intrapéritonéale. L'enjeu déclaré est de comprendre comment deux kinases régulent la transformation des lymphocytes B en plasmocytes, étape que le porteur présente comme indispensable à la compréhension des lymphomes. Ni le nombre de prélèvements sanguins, décrits comme "itératifs à différents temps", ni le nombre d'immunisations, "soit unique ou répétée selon les expérimentations", ne sont précisés.
Objectifs
Les lymphomes sont des cancers des cellules du sang qui se développent à partir des lymphocytes B, cellules sanguines du système immunitaire, qui sont anormalement bloquées dans leurs processus physiologiques de développement. Les lymphocytes B ont physiologiquement la capacité à devenir des plasmocytes, cellules essentielles de l'immunité dont le rôle est de protéger l’organisme contre les infections par des agents extérieurs. L'incidence de ces cancers est en constante augmentation et restent incurables en dépit de nouvelles thérapeutiques. Identifier les étapes critiques et les acteurs qui régulent physiologiquement la transformation des lymphocytes B en plasmocyte est essentielle car leur altérations ou perturbations est à l'origine du développement de ces maladies. Dans des études menées hors de l’organisme (in vitro), il a été montré le rôle de essentiel de certains facteurs dans ce processus. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de déterminer quand et comment ces facteurs agissent au sein des organes de l'immunité où se déroule la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant le rôle de ces facteurs dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Notre objectif est d’étudier leurs rôles dans différents modèles in vivo. Tout d’abord, nous évaluerons l’effet de l’inhibition (à l'aide d'une moélcules chimique) de ces facteurs sur la réponse immunitaire dans des souris sauvages (exemptes de modification génétique). Aussi, nous utiliserons un modèle de souris modifié génétiquement dans lequel l’invalidation génique de ces facteurs sera induite spécifiquement dans les lymphocytes B activés. Pour activer les lymphocytes B, nous immuniserons les souris selon différents protocoles. Cela consiste à introduire dans l’organisme un agent (petites molécules) dépourvues de pathogénicité (incapable de rendre malade) mais capable d’induire une réponse immunitaire en induisant la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Cela nous permettra d’évaluer le rôle des facteurs clés dans la différenciation des lymphocytes B. Ce projet fera avancer les connaissances fondamentales sur la différenciation plasmocytaire normale, étape indispensable à la compréhension des mécanismes des lymphomes.
Bénéfices attendus
Nos travaux devraient permettre une meilleure compréhension du rôle de certains facteurs dans la biologie du lymphocyte B normal au cours de la réponse immunitaire, étape indispensable à la compréhension des mécanismes à l'origine des lymphomes.
Procédures
Les immunisations seront appliquées sur l'ensemble des animaux (aucune anesthésie requise). L' immunisation se fera par injection intra-péritonéale et sera soit unique ou répétée selon les expérimentations ; les injections se feront sur des animaux vigiles, et sont de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. L'injection d'une molécule spécifique pour l'étude de la prolifération sera réalisée dans certaines sexpérimentations. L'injection de cette molécule se fera sur des animaux vigiles en sous-cutanée ; elle est de très courte durée, de l'ordre de quelques secondes. Aussi, des prélèvements sanguins itératifs à différents temps après immunisation seront réalisés selon les procédures expérimentales décrites. Le prélèvement sanguin sera réalisé en submandibulaire et ne nécessite aucune anesthésie. Le prélèvement n'excèdera pas 1 minute. Enfin, des protocoles de gavage seront réalisés. Le gavage sera réalisé sans anesthésie à l'aide d'une canule métallique et l'introduction de la canule dans la bouche de l'animal sera de l'ordre que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Nos modèles de souris transgéniques ne devraient pas être à l'origine de phénotype dommageable. Dans notre modèle, l'invalidation génique des facteurs d'intérêt sera présente dans une population spécifique et minime de lymphocytes B activés et une population restreintes de plasmocytes, n'ayant donc pas de risque d'altérer la réponse immunitaire physiologique globale des animaux. Notre protocole d'induction de l'invalidation génique utilisé est un protocole standard largement décrit dans la littérature et n’induit pas de phenotype (nuisances ou effets indésirables) chez l’animal autre que les effets propres au geste du gavage (détresse respiratoire, reflux). Une molécule chimique (inhibiteur chimique de nos facteurs d'intérêt) sera utilisée à des doses décrites dans la littérature, sans risque d'induction de phénotypes (nuisances ou effets indésirables) chez les animaux. Notre protocole pour ce traitement chimique n'entrainera pas d’autres stress que ceux propres au geste du gavage (détresse respiratoire, reflux). Nos protocoles d'immunisations utilisés sont des protocoles standards largement décrits dans la littérature et n’induisent pas de phenotype (nuisances ou effets indésirables) chez l’animal, aussi bien à court terme (plusieurs jours) qu'à long terme (plusieurs mois). Ces procédures d'immunisation ne nécessitent ni anesthésie générale ni antalgie et n’entraineront pas d’autres stress que celui, bref et modéré lié à l'injection intrapéritonéale, sans forte douleur pour les souris.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes et fluides d'intérêts (sang et organes de l'immunité). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur lsur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Dans des études menées hors de l’organisme (in vitro), il a été montré le rôle de essentiel de certains facteurs clés, des protéines à activité kinase, dans le processus de la différenciation des lymphocytes B. A l’heure actuelle il n’existe pas d’étude menée chez l’animal démontrant le rôle de ces facteurs dans la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes. Cependant ces modèles in vitro ne miment que partiellement la réponse immunitaire et ne peuvent pas se substituer efficacement aux analyses menées dans un organisme vivant car elles ne prennent pas en compte la complexité des organes où se produit la réponse immunitaire. L'utilisation d'un modèle animal, et le cas échant de la souris, est donc indispensable pour confirmer nos observations.
Réduction
Dans l’intérêt de réduire le nombre d’animaux utilisé, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins possible de souris, en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes et fluides d'intérêt (sang et organes de l'immnité) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Enfin les protocoles d'immunisations seront réalisés successivement afin de définir les meilleures conditions expérimentales pour notre étude et uniquement si les résultats obtenus justifient de réaliser un autre type d'immunisation. Pour nos explorations sur les modèles d'invalidation, les expérimentations seront faites parallèlement sur tous les modèles (différents gènes invalidés) afin d'utiliser le même groupe contrôle et donc de miniser l'utilisation d'animaux contrôle. Pour chaque étude, nous réaliserons des groupes de 8 animaux par génotype ou traitement, ce qui nous permettra d'obtenir des statistiques fiables et publiables.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel.
Choix des espèces
Nous souhaitons évaluer in vivo le rôle des certaines facteurs clés u cours de la différenciation des lymphocytes B suite à une immunisation. La souris est un modèle de choix pour l'étude in vivo des réponses immunitaires. Différents modèles murins seront utilisés. La maturité du système immunitaire chez la souris est optimale à l’âge adulte (environ 2 mois), ainsi nos études seront effectuées uniquement sur des animaux adultes à partir de 8 semaines d'âge.
Etude du rôle des NETs dans la progression tumorale du cancer de la peau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une substance cancérigène est appliquée sur la peau du dos de 6 336 souris, deux fois, aux semaines 0 et 8, puis les tumeurs se développent jusqu'à la semaine 30. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des problèmes de déplacement et des signes de douleur parmi les effets attendus. Le porteur annonce avoir conçu ce projet "en respectant la règle des 3R", tout en écrivant qu'aucun anti-inflammatoire ne sera donné, puisqu'il veut caractériser le rôle de l'inflammation, et qu'aucun morphinique ne sera utilisé, puisque les morphiniques diminuent la prise tumorale. Le suivi se fait trois fois par semaine, un score supérieur à 6 entraînant la mise à mort, et les tumeurs sont disséquées après la mort des animaux.
Objectifs
Objectif : Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact des voies de signalisation responsables du recrutement des neutrophiles (qui sont des cellules imminutaires) dans la progression tumorale des cancers de la peau in vivo.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons a ce que les resultats obtenus avec ce projet nous permette d'etablir de nouvelle strategie dans le but de contrecarrer l'initiation et la progression des cancers de la peau
Procédures
Dans ce modèle, les 6 336 souris sont traitées avec une substance cancérigène (appliquée pour modéliser un cancer de la peau) à la semaine 0 (S0) et à la semaine 8 (S8) sur la peau du dos, et sont analysées jusqu'à la semaine 30 (qui marque la fin de l’expérience). Chaque intervention durera environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus chez les animaux développant des tumeurs incluent des problèmes de déplacement et des signes de douleur. Le bien-être animal sera évalué de manière objective à l'aide de fiches d’évaluation adaptées à cette procédure, qui prennent en compte les éventuelles nuisances et dommages causés, tels que la perte de poids et la douleur. Le suivi des animaux sera effectué trois fois par semaine jusqu'à leur sacrifice, au maximum 30 semaines après l'initiation de la carcinogenèse par une substance cancérigène (S0) ou lorsqu’un point limite sera atteint. Ce projet a été conçu en respectant la règle des 3R. Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux, mais elle pourrait conduire à la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de cancer de la peau. De plus, aucun anti-inflammatoire ne sera donné puisque nous souhaitons caractériser le rôle de l’inflammation dans la résistance et aucun morphinique ne sera utilisé puisqu’ils diminuent la prise tumorale.
Devenir
Les souris seront mises à mort les unes après les autres dans une pièce séparée. Nos expériences nécessitent la mise à mort des animaux car, en fin d'expérience, les tumeurs seront disséquées pour analyser les effets des différents traitements.
Remplacement
Remplacer: L’utilisation de cultures organotypiques en 3D in vitro nous permet de diminuer considérablement l’utilisation de modèles animaux pour mener à bien ce projet de recherche. Celles-ci permettent d’aborder la complexité des interactions entre plusieurs types cellulaires dans un gel de Matrice Extra Cellulaire. Cependant, il est encore impossible de récapituler toute la complexité d’un organe au point de vue cellulaire et matriciel en utilisant ces modèles. Afin de récapituler toute la complexité des interactions multicellulaires et matricielles observées au cours de la progression tumorale, la souris est un excellent modèle car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, la validation des cibles moléculaires identifiées et étudiées in vitro dans le cadre de l’élaboration de thérapies anticancéreuses ne peut se faire qu’à l’aide d’un modèle animal pertinent, comme nous le proposons.
Réduction
Réduire : Le nombre d’animaux a été déterminé pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un minimum de souris. Ce nombre a été calculé grâce à une analyse statistique prévisionnelle. Il se justifie par la fréquence des lésions tumorales observées 30 semaines après dans ce modèle murin de cancer de la peau. Les résultats obtenus en laboratoire in vitro et in vivo (sous un précédent CIEPAL) permettent de réduire le nombre d’animaux. En effet, nos précédents résultats, ainsi que le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique, nous permettent de connaître la cinétique de développement de la maladie. Ainsi, ces résultats ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Raffiner : En complément des conditions de base d’hébergement conformes à la réglementation européenne (calme, hébergement en A1, 4 souris par cage, rythme nycthéméral de 12h, eau et nourriture à volonté, cages enrichies avec des abris et des carrés de coton), nous mettons en place des mesures spécifiques pour atténuer les contraintes liées à l’expérimentation. Les animaux seront manipulés exclusivement par du personnel formé et expérimenté pour minimiser le stress. La réhydratation, si necessaire, sera assurée après les manipulations par l'apport d'aliments gélifiés enrichis. De plus, les animaux seront placés dans un environnement calme avant et après chaque intervention. La période d’acclimatation sera de 5 jours pour garantir leur bien-être avant l’expérimentation. Un suivi régulier sera effectué via une grille de score et un score supérieur à 6 entraînera une mise a mort.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des neutrophiles dans le développement des cancers de la peau. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes, car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle proposé, basé sur l'utilisation d'une substance cancérigène pour induire le cancer de la peau, a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. Nos résultats préliminaires montrent déjà un nombre anormalement élevé de neutrophiles dans les cancers de la peau chez ces souris. L’application d'une substance cancérigène induisant la carcinogenèse sera réalisée sur des souris âgées de 7 à 9 semaines, âge auquel les follicules pileux sont en phase de repos. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront 30 semaines après le début de l'expérience, correspondant à la formation de cancers de la peau. Les souris seront mise a mort avant les prélèvements.
Génotypage invasif des lignées transgéniques murines
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Les souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt sont tuées pour cette seule raison, les autres partant vers des projets de recherche ou vers l'élevage, où elles seront tuées en fin de période reproductive. 90 000 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue entre le septième et le dixième jour de vie, sans anesthésie ni analgésie, le porteur écrivant que celles-ci "induiraient des nuisances supplémentaires" et que la partie distale de la queue n'est pas encore ossifiée à cet âge. Ce chiffre de 90 000 n'est rattaché à aucun calcul, seulement à l'adaptation des croisements aux besoins de plusieurs dizaines d'équipes, dont certaines utilisent ces lignées pour des formations réglementaires à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre centre assure l'hébergement, le soin et l'élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Le présent projet vise à identifier les génotypes des animaux dans divers modèles de souris. Plusieurs dizaines d’équipes utilisent des modèles murins mutants et transgéniques pour étudier leur comportement et/ou les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la régulation des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, et pendant le développement.
Bénéfices attendus
Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux. L’étude des différents modèles murins mutants et transgéniques permettra de faire des avancées significatives dans la connaissance des processus physiologiques ou physiopathologiques dans les systèmes cardiovasculaire, nerveux, immunitaire, reproducteur, endocrinien/métabolisme, de la biologie du développement et du comportement animal. Ces connaissances pourront permettre le développement de traitements contre différentes pathologies des domaines concernés.
Procédures
Prélèvement d'une biopsie caudale par animal (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s). Si un animal doit être re-prélevé lors de sa vie, il le sera par encoche à l’oreille et génotypage sur le fragment de tissu prélevé (contention et biopsie moins d'1 minute, prélèvement en lui même moins d'1s).
Impact sur les animaux
La biopsie de l’extrémité de la queue, pour le génotypage des animaux, pourra générer une légère et brève douleur. Des petits saignements peuvent être constatés lors du prélèvement de la biopsie caudale, cela ne dure que quelques secondes. Toutes les contentions, manipulations représentent un stress léger pour les animaux.
Devenir
Les animaux disposant d’un génotype d’intérêt seront utilisés dans les projets de recherche préalablement autorisés par le ministère dans le cadre d’une utilisation continue. Les autres animaux seront soit utilisés dans les élevages puis euthanasiés en fin de période reproductive, soit euthanasiés pour génotype sans intérêt, par une méthode réglementaire adaptée à l’âge des animaux concernés.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à la physiologie de l’organisme qui implique l’interaction entre différents organes et l’environnement. Même si nous nous efforçons au maximum de travailler in vitro, nos projets s’intéressent à des systèmes complexes impliquant l’interaction entre différents organes et l’environnement et nécessitent une étude à l’échelle de l’organisme. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. Les résultats obtenus au laboratoire sont toutefois complémentaires à ceux obtenus chez l’homme. L’anatomie, la physiologie et les comportements murins sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine. Nous étudions la souris afin de tirer profit des techniques de transgénèse conditionnelle pour l’étude de la fonction des gènes.
Réduction
Le nombre total d’animaux du projet sera de 90 000. Pour le maintien de lignées et la production des animaux pour l’expérimentation, lors de réunions avec les concepteurs des différentes équipes, nous adaptons les croisements (choix des génotypes et nombre de portée) pour effectuer un élevage raisonné. Le choix des génotypes des reproducteurs est effectué pour obtenir le maximum d’animaux ayant un génotype d’intérêt dans la descendance et donc pour générer le moins d’animaux possible. Les croisements sont arrêtés dès le bon nombre d’animaux avec le génotype d’intérêt obtenus.
Raffinement
Les animaux sont observés quotidiennement. En cas de bagarre un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté (type maisonnette en carton). Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de souffrance possible. Les animaux ne sont séparés que le temps strictement nécessaire pour la procédure. De même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé. La biopsie caudale est prélevée lors du marquage par tatouage, entre P7 et P10, et n'induit donc pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'inconfort, du fait que la partie distale n'est pas encore ossifiée. Le geste est très rapide et les souriceaux rapidement remis avec leur mère et observés pour vérifier qu’elle les reprend bien en charge. L'absence de saignement et la bonne cicatrisation sont vérifiés. La méthode de prélèvement est éprouvée, précise, rapide et standardisée. Elle a été élaborée pour limiter les effets indésirables (stress, douleurs) et ne nécessite pas ni anesthésie ni analgésie, qui induiraient des nuisances supplémentaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. Notre centre assure l’hébergement, le soin et l’élevage de lignées murines impliquées dans de nombreuses thématiques de recherche (comme par exemple la biologie du développement, la reproduction, la physiopathologie des maladies du système nerveux, l’étude du vieillissement) ou dans des formations pour des étudiants de Licence ou Master et des formations réglementaires pour l’expérimentation animale. Les animaux sont manipulés avant le sevrage (entre le 7ème et le 10ème jour après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sexage, tatouage et biopsie sont réalisés en même temps.
Détermination préliminaire de la toxicité et de la toxicocinétique de candidats médicaments chez la souris
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
2 880 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois administrations par jour pendant trois semaines et subir six prélèvements sanguins en vingt-quatre heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, 2 700 souris sont tuées et 180 réutilisées ailleurs, ces dernières étant celles sur lesquelles un geste invasif a été pratiqué sans qu'un candidat médicament leur soit administré. Gavage à la sonde, injections intraveineuses après passage en enceinte thermorégulée, injections intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales et sous-cutanées, instillations oculaires, recueil d'urine de quatre heures, examen ophtalmologique, prélèvement en veine jugulaire sous anesthésie juste avant la mise à mort : le porteur ajoute que la molécule testée peut par elle-même provoquer des effets cliniques. Il s'agit de trouver la dose maximale tolérée avant les études d'efficacité, et le porteur présente ce projet comme une réduction des contraintes futures, puisque les études suivantes utiliseront davantage de souris.
Objectifs
L’objectif principal de la recherche et développement (R&D) est de développer de nouveaux candidats médicaments chimiques ou biologiques qui seront évaluées durant des essais cliniques en vue de satisfaire les besoins médicaux. des études préliminaires in vivo de sécurité non clinique sont mises en place sur des espèces rongeurs afin de déterminer un profil de sécurité robuste des nouvelles molécules avant administration chez l’Homme,. le développement d’un médicament nécessite d’évaluer à la fois : - la sécurité : par des études de toxicologie sur la souris (procédures encadrées par la présente DAP). - l’efficacité : à l’aide d’études de pharmacologie sur la souris (modèle mimant la pathologie) (procédures encadrées par d’autres DAP). Ces études in vivo de sécurité non clinique interviennent précocement dans le processus de développement pharmaceutique (en amont des études vivo d’efficacité) et ne sont réalisées que sur des molécules sélectionnées après des étapes de caractérisation/sélection in vitro (modèles cellulaires de toxicité) et in silico (ex. analyse informatique de la génotoxicité). A ce stade ni la dose efficace ni la première dose toxique in vivo ne sont connues. La réalisation de ces études chez la souris permet de déterminer un intervalle de doses tolérées par l'animal ainsi que la dose maximale à ne pas dépasser. Ces données sont essentielles pour que les études de pharmacologie, utilisant un effectif plus important de souris, puissent être réalisées dans des conditions optimales. Dans ce projet, des études de sécurité non clinique chez la souris seront réalisées afin de prédire la toxicité chez l’animal dans les études d’efficacité qui nécessiteraient d’utiliser de fortes doses et/ou des doses potentiellement toxiques (souvent le cas en oncologie). Elles permettent d’évaluer sur une courte durée et avec moins d’animaux si la dose et le schéma d’administration seront bien tolérés dans les études d’efficacité. L’utilisation de doses croissantes dans ces études peut permettre d’identifier la Dose Maximale Tolérée (DMT) pour un produit (ou un nouveau véhicule) et de l’utiliser en toute sécurité dans les études ultérieures. Ces études utilisent des souris ayant le même fond génétique (modèle non pathologique avec phénotype dommageable non exprimé) que les études d’efficacité afin qu’elles soient les plus prédictives possibles.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche et développement de nouvelles entités à visée thérapeutique. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet aux doses envisagées en efficacité et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental. Cette approche permet ainsi de réduire les contraintes auxquelles les animaux seraient soumis dans les études d’efficacité par la suite et qui, elles, utiliseront un nombre plus important d’animaux.
Procédures
- A l’administration (unique à réitérée 1 à 3 fois par jour pendant 1 jour à 3 semaines) de composés par voie orale ou parentérale - A l’administration sous-cutanée d’analgésique avant l’euthanasie - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 4h heures sur sable hydrophobe (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang en veine jugulaire réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, nécessitant une contention légère au maximum 2 fois par étude
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 1 jour à 3 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : •Administration orale de la molécule : la contention d’une durée de moins de 15sec et le passage de la sonde de gavage dans l’œsophage (moins de 10sec) peuvent générer du stress chez l’animal (maximum 3 fois par jour). (Degré de sévérité léger) •Administration intraveineuse : le passage dans une enceinte thermorégulée (nécessaire pour dilater les veines et réaliser le geste dans de bonnes conditions) d’une durée maximale de 5min, la contention dans une boite adaptée à l’espèce utilisée (2min maximum) peuvent générer du stress et l’injection de la douleur (maximum 2 fois par jour) (Degré de sévérité modéré). •Administrations intrapéritonéales, intramusculaires, intranasales ou sous-cutanées : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’injection (moins de 10 sec) de la douleur (maximum 3 fois par jour). Degré de sévérité léger pour une ip unique ou modéré si l’administration ip est réitérée. Pour les autres types d’administrations degré léger. •Instillation oculaire (topique externe) : la contention d’une durée de moins de 15sec peut générer du stress et la molécule administrée de la douleur pour l’animal. (maximum 1 fois par jour) (Degré de sévérité léger) •Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte, veine mandibulaire ou à la veine caudale : la contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (maximum 6 points de prélèvement sur 24h) (Degré de sévérité modéré) •Recueil urinaire (sable hydrophobe) : le changement d’environnement et l’isolement de courte durée (4 heures maximum) peuvent générer une nuisance et un stress pour l’animal (Degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques et provoquer une nuisance pour l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyse et d’organes pour lecture anatomopathologique. . Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet
Remplacement
Ce projet couvre les études de sécurité très précoces réalisées sur les candidats médicaments de notre recherche, études pour lesquelles il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux. De méthodes alternatives in vitro et in silico sont utilisées au préalable dans la caractérisation et la sélection des molécules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement le nombre de molécules testées in vivo. Cependant, la mise en place précoce d’un profil de sécurité d’un candidat médicament nécessite l’utilisation d’organismes complexes après ces premières étapes de sélection par des méthodes alternatives. Les études incluses dans ce projet ont un design optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données essentielles pour les études ultérieures.
Réduction
Les molécules les plus prometteuses sont sélectionnées à l’aide de tests vitro et ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre d’animaux est adapté à la variabilité des paramètres étudiés et prend en compte l’homogénéité des souches, la disponibilité de données historiques pour les paramètres étudiés et de leur variabilité. Pour ces études, le nombre habituel d’animaux est déterminé pour être le compromis le plus efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint. Il permet d’intégrer de la mixité male/femelle dans les groupes sans avoir à doubler le nombre d’animaux. Exceptionnellement ce nombre peut être ponctuellement augmenté dans le cas où la variabilité d’un paramètre serait élevée (ex : haute variabilité individuelle dans la distribution du produit). Ces études permettent de confirmer les premières données in vitro, avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles participent à la réduction du nombre total d’animaux utilisés par projet thérapeutique car les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie utilisant un nombre d’animaux plus important en prédisant la toxicité éventuelle aux doses testées. Selon la procédure, un ensemble d’examens cliniques et paracliniques peuvent être réalisés par animal (observations cliniques, poids et température corporelle, examen ophtalmologique, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, collecte d’urine, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire. Dans le cas d'un véhicule bien connu, les données historiques internes vont permettre de réduire le nombre d'animaux dans l'étude en supprimant le groupe témoin véhicule). En cas de protocole particulier (ex : nouveau schéma d’administration ou besoin de suivre plus précisément un paramètre/biomarqueur particulier), le service de biostatistiques pourra aider à définir le design expérimental adapté. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte ou veine mandibulaire) peu invasive, rapide, permet de permet de réduire le nombre d’animaux en réalisant une cinétique complète sur un même individu (sans animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal.
Raffinement
Ces études permettent de mieux cibler les doses et le schéma d’administration pour les études suivantes, diminuant ainsi le risque pour les animaux. Des observations cliniques approfondies sont réalisées chaque jour. Les administrations pourront être réalisées de manière décalée : si un premier animal traité présentait des signes cliniques précoces (30 minutes après traitement par ex.), les autres animaux du groupe pourraient ne pas être traités ou leur dose administrée pourrait être diminuée. Dans tous les cas, si apparition de signes cliniques, une décision rapide est prise entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la SBEA et les équipes en charge des animaux. Cette décision peut mener à une prescription de soins, un arrêt de traitement, une diminution de dose ou une euthanasie, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude (si besoin utilisation du score d’une grille de points limites spécifique à la souris). L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement strictes empêchant ainsi l’expression du phénotype dommageable lorsque les animaux utilisés sont immunodéprimés. Les animaux sont manipulés par un personnel technique formé au bien-être animal afin de limiter le stress et peuvent être entrainés si l’étude nécessite un geste technique particulier (ex : contention pour administration intraveineuse. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel (signes cliniques nécessitant l’isolement, recueil urinaire), avec de l’enrichissement adapté à la souris (matériel de nidification). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling est mise en place dès que possible. Cette technique, rapide, peu invasive et peu stressante, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites de volémie physiologiques. Elle permet d’éviter le placement de l’animal dans une enceinte thermorégulée pour la dilatation des vaisseaux. La durée du recueil urinaire sera limitée à son minimum (max 4h) et réalisé en cage conventionnelle en remplaçant la litière par du sable hydrophobe. Cela permet d’éviter l’usage de cage à métabolisme (environnement plus stressant). Dès qu’un acte expérimental nécessite une incision (ex: prélèvement de sang en veine jugulaire), une analgésie adaptée est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
L‘unique procédure de ce projet sera réalisée sur l’espèce souris car elle intervient en amont des études d’efficacité réalisées sur ce modèle. De plus cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’homme et ainsi une forte valeur translationnelle. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont chez le rongeur. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.
Génotypage de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Les 25 000 souris de ce projet naissent dans l'animalerie de la plateforme et sont génotypées pour être triées, celles qui portent la mutation attendue étant destinées à d'autres protocoles. Elles subissent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une biopsie caudale de moins de cinq millimètres pratiquée sur animal vigile en cinq secondes. Le porteur décrit une légère perte de sang, une contention brève, du stress et une légère douleur, et ne dit rien du sort des souris dont le génotype ne présente pas d'intérêt. Il affirme travailler sur des pathologies "qui ne peuvent être mimées par des cellules en culture" et conclut que l'utilisation de souris transgéniques "reste obligatoire" pour de nombreux projets de recherche.
Objectifs
Les diverses unités utilisatrices de notre plateforme s’intéressent à des thématiques diverses aussi bien dans le domaine de la biologie du développement, du métabolisme, de la trisomie 21, de tumorigénèse, le développement de vaccins… Parmi les maladies sur lesquelles nous travaillons, des modèles murins précliniques présentent des mutations gain ou perte de fonction, modèles inductibles Cre-Lox. L’objectif de ce projet est d’identifier et de génotyper des animaux génétiquement modifiés reproduits au sein de notre animalerie. Cette étape est essentielle pour identifier les animaux qui seront ensuite utilisés à des fins expérimentales dans les projets déposés au MESRI.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre la mise à disposition d’animaux d'un génotype d'intérêt pour le projet. Des lignées de souris transgéniques sont nécessaires pour la compréhension de certains mécanismes du vivant.
Procédures
Un prélèvement caudal (biopsie de la queue) de moins de 5mm pour génotypage (5s) sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) peut conduire à une légère perte de sang. Une contention de courte durée est nécessaire, pouvant entrainer un stress et une légère douleur.
Devenir
Les animaux comportant la mutation ou transgène d’intérêt seront utilisés en continu dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le MESRI.
Remplacement
Nous travaillons sur des pathologies qui ne peuvent être mimées par des cellules en culture (développement d’une obésité, d’une trisomie 21...). Il n’est donc pas encore possible de se passer totalement des modèles animaux. A ce jour, l'utilisation de souris transgéniques reste obligatoire pour de nombreux projets de recherche fondamentale et translationnelle.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche des équipes. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris transgéniques (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. En effet, le nombre de couples en reproduction est monitoré au plus près afin de l’adapter en temps réel aux besoins expérimentaux. A cette fin, les animaux sont génotypés avant le sevrage pour anticiper les besoins avant la naissance de la génération suivante et afin de grouper les animaux d’intérêts pour les autres procédures expérimentales.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées en groupe dans l’animalerie avec un statut sanitaire contrôlé. Les installations (ventilation, température et lumière) ainsi que les cages (nourriture, eau, enrichissement) sont vérifiées quotidiennement afin de réduire la détresse des animaux. De plus, un suivi quotidien des animaux est réalisé par les animaliers afin de vérifier leur bien-être. Les animaux sont euthanasiés par des procédures appropriées si leur état se dégrade soudainement. Les souris présentant une perte poids de plus de 10% ou une dégradation de leur état général sont monitorées tous les jours par le personnel de l’animalerie.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La souris mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles transgéniques pour nos molécules d’intérêt existant, l’utilisation du modèle murin est légitimée. Enfin, nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et possibilité de les prendre en charge facilement. Les animaux seront marqués avant le sevrage entre 10 et 15 jours afin d’être génotypés avant le sevrage (soit à minimum 21 jours). Cela permet de rapidement déterminer le génotype des animaux afin de les regrouper et d’adapter le nombre de couples en reproduction au plus proche des besoins expérimentaux au moment du sevrage.
Etude des canaux potassiques dans l’activité neuronale du réseau locomoteur spinal chez les souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés sont retirés à leur mère pendant quatre heures au maximum, le temps qu'une injection virale soit faite dans leur colonne vertébrale, puis rendus à une femelle qui peut se montrer agressive à leur retour. 540 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 444 d'entre elles, léger pour 64, et menées sous anesthésie sans réveil pour 32. À partir du cinquième jour suivant l'injection, chaque animal passe trois sessions de tests comportementaux de trois à quarante minutes, et celles issues de la lignée génétiquement modifiée subissent une biopsie de l'extrémité de la queue. Le porteur indique qu'une mauvaise manipulation de l'injection rachidienne peut, rarement, léser la moelle épinière et paralyser les pattes arrière dès le réveil, 508 souris étant tuées pour prélèvement de tissus et 32 gardées vivantes pour l'élevage ou des prélèvements hors saisine.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'équilibre de la balance portée par les fibres nerveuses qui inhibent ou qui excitent le réseau de neurone innervant les muscles des pattes postérieures, est renforcé par les propriétés endogènes de ces neurones. C'est ce jeu d'influence qui dans sa finalité, conduira ou non à une contraction musculaire. L'un des projets de l'équipe est d'étudier, dans les conditions normales, les mécanismes moléculaires qui conduisent à cette réponse musculaire. Une protéine est principalement ciblée. Elle existe sous différentes formes et s'exprime à la surface des neurones. Ces différentes versions seraient susceptibles de jouer un rôle dans l'activité électrique de la cellule nerveuse. Des approches génétiques, biologiques, seront employées pour caractériser la contribution individuelle ou collective de ces protéines sur le modèle murin, des études comportementales analyseront leur effet global sur la posture et la locomotion de l'animal.
Bénéfices attendus
La complémentarité des procédures employées dans ce projet offrira une meilleure compréhension des mécanismes responsables de l'activité des cellules nerveuses dans un réseau sain. En ciblant spécifiquement une protéine d'intérêt par l'outil génétique sur le modèle de la souris, ces études approfondies fourniront des données solides sur le rôle de cette protéine dans les conditions normales. Enfin, ce projet pourra bénéficier à l'ensemble de la communauté scientifique.
Procédures
Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection du virus pendant 4h maximum car c'est toute la portée qui est concernée, l'injection proprement dit se fait en moins d'une minute mais la préparation en post injection et pré-injection nécessite 20 min par animal. Plus tard dès le 5eme jour post injection, les animaux injectés vont suivre des sessions d'expérimentations non invasives à une fréquence de 3 sessions par animal sur l'ensemble de l'étude, couvrant les 3 premières semaines postnatales. Ces tests comportementaux durent entre 3 et 40 min maximum en fonction des tests, les enregistrements vidéo durent 3 min maximum par animal. Chez les souris génétiquement modifiées, pour distinguer précocément celles qui le sont de celles qui ne le sont pas, il est nécessaire de faire un test génétique à partir d'un fragment (
Impact sur les animaux
Les animaux nouveau-nés sont séparés de leur mère au moment de l'injection virale, puis plus tard lors des tests comportementaux et des enregistrements vidéos. Les manipulations et les changements de lieux des animaux pour ces tests peuvent également engendrer du stress. Bien que l'injection dans la colonne vertébrale soit généralement sûre, dans de très rares cas , une mauvaise manipulation peut entraîner une lésion de la moelle épinière, pouvant causer une paralysie partielle ou totale des membres postérieurs, visible dès le réveil. Les animaux injectés peuvent perdre du poids. La mère peut être stressée du fait de l'enlèvement de la totalité de ses petits et peut avoir des signes d'agressivité au retour des souriceaux qui auront subi une injection virale à la naissance. Le phénotype éventuel attendu serait un déficit moteur qui pourrait potentiellement se manifester par un affaissement de l'arrière train, des tremblements des pattes postérieures. La biopsie de l'extrémité de la queue des souriceaux provenant de la lignée de souris génétiquement modifiée, peut induire du stress chez l'animal et un léger saignement.
Devenir
les animaux sont mis à mort pour prélèvement tissulaire. Les 32 animaux gardés en vie seront potentiellement utilisés pour l'élevage ou pour des prélèvements tissulaires pour des procédures hors saisine.
Remplacement
Les données préliminaires de ce projet ont été obtenues à partir de lignées cellulaires et de modélisation, ce qui nous a permis de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Néanmoins, l'expérimentation sur l'animal demeure essentielle, car nous étudions la complexité du réseau de neurones innervant les muscles des pattes postérieures dans les conditions normales d'une activité de locomotion où de nombreux paramètres rentrent en jeu.
Réduction
Ce projet nécessitera un total de 540 animaux. Il s'agit d'une poursuite des recherches précédemment menées par notre équipe. Cela nous a permis de réduire le nombre d'animaux utilisés. Le nombre de rongeurs par groupe expérimental sera limité à son strict minimum, en tenant compte des contraintes de chaque technique, et les analyses statistiques seront adaptées. Les études comportementales seront menées longitudinalement, ainsi chaque animal sera son propre contrôle, ce qui diminuera le nombre d'animaux utilisés. A la fin de cette étude longitudinale, les tissus des animaux âgés de 21 jours seront prélevés, évitant ainsi de rajouter un lot d'animaux supplémentaire pour les études protéiques prévues à la 3eme semaine postnatale.
Raffinement
Une fois injectés, les animaux sont maintenus en fratrie et ramenés à la mère. Pour minimiser les épisodes d'agressivité de la mère envers les nouveau-nés injectés, nous évaluons soigneusement le comportement de la mère en choisissant des femelles plus calmes et sans comportements stéréotypés ou anxieux. De plus, nous pourrons utiliser des récompenses pour la mère la semaine précédant la mise bas et la première semaine après la naissance. Nous prenons un soin particulier à enrichir leur cage (rondin de bois,matériel de nidification, tunnel...). Que ce soit pour l'injection virale, les tests comportementaux, les animaux resteront en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine pour qu'ils soient en présence d'odeurs familières. A partir du stade juvénile, du gel nourrissant ou des récompenses peuvent leur être fourni dès qu'ils sortent de la zone de stabulation. Tout au long de l’étude, la douleur et/ou la détresse de l’animal seront évaluées 2 à 3 fois par semaine par l’expérimentateur, en observant des points limites pour les jeunes animaux.
Choix des espèces
Cette étude est dans la continuité de nos projets scientifiques précédents. Nous avons une grande expertise de ce modèle, nous avons accumulé de nombreuses données sur lesquelles nous pouvons nous baser. L'injection virale est également un outil que nous maîtrisons sur ce modèle. Les animaux seront utilisés principalement au cours des 3 premières semaines post-natales. La tranche d'âge de la première et deuxième semaines post-natales restent compatibles avec les techniques d'enregistrements de l'activité neuronale sur tissu prélevé tandis que la deuxième et troisième semaines post-natales sont des périodes clés pour l'acquisition de la marche et donc pour nos études comportementales chez l'animal. Nous postulons que le niveau d'expression des protéines d'intérêt est déjà détectable à la naissance, ce qui permet une étude protéique couvrant les 3 premières semaines de vie de l'animal.
Mise en place d’un protocole de cultures cellulaires primaires d’ostéoblastes et d’ostéoclastes à partir de prélèvements d’os et de moelle osseuse chez la souris C57Bl/6j irradiée ou non avec des rayons X.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Brûler la patte arrière de souris pour en tirer des cultures de cellules osseuses : 144 souris sont utilisées à cette fin, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 96. Chacune est épilée sous anesthésie, puis sa patte arrière est irradiée aux rayons X de basse énergie pendant vingt minutes au maximum, avant un suivi quotidien du pic lésionnel entre le septième et le trentième jour. Le porteur décrit sur la zone irradiée un œdème, une desquamation, un érythème, parfois une nécrose, une rétractation des tissus à la cicatrisation et une mobilité réduite de la patte. Tous les prélèvements sont faits après la mort, et le porteur qualifie le passage par un modèle "in vivo" d'"indispensable" pour mettre au point ces cultures cellulaires.
Objectifs
Bien que l’utilisation des rayonnements ionisants dans le domaine médical, industriel ou militaire soit majoritairement maitrisée, des surexpositions accidentelles peuvent se produire. Ces expositions peuvent entrainer un syndrome cutané radio-induit se traduisant par l’apparition d’érythème, de desquamation ou de nécrose tissulaire, musculaire voire osseuse dans les cas les plus sévères. Afin d’avancer dans la connaissance scientifique des expositions accidentelles induites par des rayons X de basses énergies et de contribuer à l’amélioration de la prédiction du risque de complications, nous avons développé un modèle de brûlures radiologiques induites par des rayons X de basses énergies chez la souris (irradiation localisée de la patte). Afin de mieux comprendre les processus biologiques mis en place suite à une exposition avec ces rayons X de basses énergies pour lesquels le dépôt de dose est très hétérogène (Dtissu ≠ Dmoelle ≠ Dos), nous souhaitons mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires, ostéoblastes et ostéoclastes, à partir de prélèvements faits chez la souris afin d’étudier l’impact de l’irradiation et du temps sur le devenir et les capacités de ces cellules. En effet, les ostéoblastes, d’origine mésenchymateuse, jouent un rôle clé dans la formation et la minéralisation de l’os tandis que les ostéoclastes, d’origine hématopoïétique, jouent un rôle clé dans la résorption osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en place deux modèles de cultures cellulaires primaires à partir de prélèvements médullaires fait chez des souris irradiées localement avec des rayons X de basses énergies. Au-delà de la mise en place de ce protocole pour notre projet de recherche, à plus long terme, nous souhaitons grâce à ces modèles de cultures cellulaires primaires mieux comprendre les processus biologiques impliqués dans l’homéostasie osseuse suite à une irradiation.
Procédures
Epilation des pattes sous anesthésie (environ 10 minutes) Irradiation patte arrière sous anesthésie (maximum 20 minutes) Scoring des lésions (contention, environ 1 minute) Tous les prélèvements seront réalisés post-mortem.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet les animaux vont développer des brûlures radiologiques au niveau de la patte arrière. Ce modèle expérimental de gravité modérée nécessite une vigilance particulière en particulier au pic de la lésion. Sur la base de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle une évaluation de la brulure radiologique basée sur du scoring lésionnel sera effectuée entre 7 jours et 30 jours après l’exposition (pic lésionnel) par des personnes formées à l’évaluation de ce type de lésions. L’irradiation localisée de la patte peut entrainer les signes suivants au niveau de la zone irradiée : œdème, desquamation, érythème, voire nécrose dans certains cas. Il s’en suit une cicatrisation qui peut conduire à une rétractation des tissus. Cette irradiation peut entrainer une mobilité moindre de la patte irradiée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les cultures primaires et les analyses éventuelles.
Remplacement
Dans le but de mettre en place des cultures cellulaires primaires et d’étudier l’impact de l’irradiation sur ces cellules irradiées in vivo, l’utilisation d’un modèle « in vivo » demeure indispensable au bon déroulement des projets scientifiques mais le nombre de souris utilisé sera réduit autant que possible. Les utilisations d’animaux dans le cadre de ce projet seront tracées (date, projet concerné, informations sur les animaux, devenir des animaux, type d’irradiation). Tout événement non attendu sera également tracé, répertorié et des actions seront mises en place si nécessaire.
Réduction
Ce projet prévoit d’utiliser au maximum 16 souris par groupe de dose et par temps. Comme nous allons procéder en étape Go / no Go l’intégralité des souris ne seront peut-être pas utilisées. L’objectif est d’avancer pas à pas afin d’utiliser le moins de souris possible pour la mise en place de ces cultures cellulaires primaires.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux seront adaptées aux procédures réalisées afin de limiter le plus possible le stress et la souffrance de l’animal. Les souris seront hébergées en groupe et dans un environnement enrichi. Lors des irradiations, des anesthésiques seront utilisés et une surveillance des animaux sera mise en place après les irradiations. Le bien-être animal sera également évalué en réalisant des pesées, des photos des lésions et un scoring lésionnel, basé sur l’observation des modifications des tissus, ainsi que la mise en place de points limites adaptés. Ce modèle expérimental de gravité modérée où des brûlures radiologiques vont être développées au niveau du membre inférieur nécessite une vigilance particulière. Sur la base de notre expérience, de notre précédent projet, des résultats obtenus et le recul sur ce modèle, un suivi journalier sera effectué entre 7 jours et 30 jours après l’exposition correspondant au pic de la lésion. Des croquettes pourront également être déposées au fond de la cage avec de l’eau gélifiée afin de faciliter l’alimentation des animaux si des souris perdaient beaucoup de poids durant le pic lésionnel.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé pour les études physiologiques. De plus, le modèle de lésions musculo-cutanée radio-induites a été précédemment caractérisé pour des irradiations avec des rayons X de basse énergie au sein de notre. Le mise en place de ces cultures cellulaires primaires fait suite à ces deux projets afin de mieux comprendre l’impact de l’irradiation sur les ostéoblastes jouant un rôle clé dans la formation osseuse et la minéralisation et les ostéoclastes impliqués dans la résorption osseuse. Pour les besoins de ce projet, des animaux adultes seront utilisés (8-10 semaines). Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge. De plus, en vieillissant, les souris C57BL/6J ont tendance à développer des comportements agressifs.
Etude longitudinale par IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) in vivo de l’effet d’une supplémentation en phosphate sur l’ostéodystrophie dans un modèle de souris d’insuffisance rénale par néphrectomie.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Ablation des deux tiers d'un rein, puis ablation complète du second une semaine plus tard : 173 souris subissent cette double néphrectomie, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent ensuite dans un imageur à résonance magnétique à 22, 26, 28 et 32 semaines, avec un prélèvement sanguin après chaque séance, pour suivre la dégradation osseuse qui accompagne l'insuffisance rénale et tester l'effet d'un régime enrichi en phosphate. Le porteur écrit ne pas prévoir d'analgésique pour l'imagerie, celle-ci n'étant pas douloureuse, et juge négligeable le risque d'infection des incisions chirurgicales. Il indique dans le même temps que le taux de survenue des effets secondaires de ce modèle, hypertension et modifications de la production d'urine comprises, n'est pas mentionné dans les publications.
Objectifs
Nous proposons donc de réaliser une étude prospective longitudinale dans un modèle murin afin d’étudier les corrélations entre plusieurs techniques d’évaluation osseuse - de la biologie à l’imagerie IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) et SRM (Spectrsocopie par Résonance Magnétique) hautes résolutions- in vivo. L’objectif principal sera de rechercher la meilleure combinaison de marqueurs, biologiques, imagerie, corrélés entre eux et comparée au gold standard (l’histologie) afin de caractériser le TMO MRC (trouble du métabolisme minéral et osseux de la maladie rénale chronique) en suivant son évolution au cours de la dégradation de la fonction rénale chez la souris, pour se rapprocher des stades 3 à 5 définis chez l’Homme. Le deuxième objectif est d’évaluer l’impact du régime phosphaté sur les marqueurs du remodelage osseux. En effet il a été montré depuis longtemps que le phosphate joue un rôle important dans la minéralisation osseuse. A long terme l’objectif clinique est une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une meilleure prise en charge thérapeutique des insuffisants rénaux afin de contrôler au mieux la dystrophie osseuse qui est une complication importante de leur maladie.
Procédures
Les souris seront soumises deux chirurgies (néphrectomie 5/6eme) : Ablation des 2/3 d'un rein et ablation complète du second rein 1 semaine plus tard. Les souris passeront dans le spectromètre imageur IRM/SRM avant chirurgie (à 22 semaines) et toutes les 4 semaines après (à 26, 28 et 32 semaines). Des prélèvements de sang seront réalisés après chaque IRM/SRM
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont liés à la chirurgie néphrectomie de l’insuffisance rénale et feront l'objet de points limites. La fonction rénale de la souris sera réduite. Comme toute chirurgie, il peut y avoir un risque d’infection au niveau des incisions. Même si ce risque est négligeable vu que la chirurgie sera réalisée dans une salle dédiée à l’expérimentation animale avec des mesures d’asepsie. Dans ce modèle il peut être observé parfois une hypertension ainsi que des modifications de la production d’urine et du métabolisme des protéines. Dans les publications le taux de survenue des effets secondaires n’est pas mentionné. L’injection ntraveineuse (IV) des agents de contraste ne provoque pas de douleur supérieure à celle d'une piqure d'aiguille . Pas d’effets indésirables liés à l’IRM qui est une technique d’imagerie totalement non invasive et atraumatique. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse (isoflurane à 1.5%) pendant toute la durée des acquisitions IRM. Leur rythme respiratoire est surveillé tout au long de l'imagerie par un ballonet placé sous la cage thoracique. De plus la souris est placée sur un petit tapis chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37,4°C.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin des acquisitons IRM/SRM à chaque stade pour l'étude par stade et au dernier stade (36 semaines) pour l'étude longitudinale. La mise à mort est faite pour des études post mortem.
Remplacement
L’ostéodystrophie osseuse ne peut être étudiée autrement que sur un système vivant car elle est une des conséquences de l’insuffisance rénale. Cette pathologie osseuse ne peut être induite sur cellules. Dans la bibliographie il existe plusieurs modèles d’insuffisance rénale ou transgénique mais aucun mais ils n’entraînent pas forcément une ostéodystrophie qui se maintient au cours du temps (pas de remodelage osseux).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM pour le suivi du développement de l’ostéodystrophie ainsi que la SRM permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Ce projet nécessitera 173 souris.
Raffinement
PPendant toute la durée de l’expérimentation, les souris sont hébergées en portoir ventilé. Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Pendant les actes d’imagerie les souris sont sous anesthésie à l’isoflurane. Pas d’analgésique puisque l’IRM n’est pas douloureuse. L’hypothermie est évitée puisque les souris sont placées sur un tapis chauffant (circulation d’eau chaude). Pour la chirurgie, une analgésie préopératoire sera réalisée par injection sous cutanée La souris sera alors anesthésiée à l'isoflurane. En post opératoire, afin d’éviter les douleurs post-opératoires, des injections sous cutanées d'antalgique seront réalisées. Pour la nuit une gelée àd'analgésique sera réalisée.
Choix des espèces
Le modèle d’insuffisance rénale peut être réalisé sur souris ou sur rat. Nous avons choisi la souris pour deux raisons : 1) nous nous sommes appuyés le modèle souris déjà publié et validé (Shobeiri N., Am J Nephrol 31(6), 471-481, 2010) 2) et 2) Notre spectromètre imageur IRM 7T possède tout le matériel optimisé pour réaliser les études chez la souris.
Effets de la radiothérapie FLASH sur la réponse vasculaire tumorale EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales prostatiques humaines, passent un scanner puis une séance de radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant que la tumeur grossit, ce qui peut selon le porteur atteindre leur mobilité et les fatiguer. Les bénéfices annoncés restent en amont de la clinique : établir si les vaisseaux tumoraux répondent à cette radiothérapie ultra-rapide comme à la radiothérapie conventionnelle, et apporter des connaissances utiles à la communauté scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme que "tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait" et que l'oxygénation d'un tissu ne s'étudie que dans un organisme perfusé.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans difféerents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en terme d'oxygénation du tissu tumoral. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.
Bénéfices attendus
La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.
Impact sur les animaux
Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.
Devenir
Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.
Remplacement
Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.
Réduction
La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).
Rôle du récepteur Rev-erb alpha dans l’accélération de la cicatrisation endothéliale
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quatre cents ovariectomies, trois cents agressions électriques de la carotide, trois cents agressions mécaniques, deux cent quarante poses de capsule ou de mini-pompe sous la peau : ces actes se répartissent sur 610 souris, toutes tuées à l'issue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 600 d'entre elles, et le porteur prévoit d'enchaîner plusieurs interventions sur les mêmes animaux "dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général". Une souris qui montre des signes de douleur importante ou perd plus de 20 % de son poids est sortie du protocole et tuée. L'objectif est d'évaluer un récepteur des rythmes biologiques comme cible thérapeutique dans les maladies cardiovasculaires, ce qui conduit à opérer les femelles pour leur retirer les ovaires afin de mimer la privation œstrogénique de la ménopause.
Objectifs
En termes de santé publique, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime que les maladies cardiovasculaires demeurent la principale cause de décès dans le monde, avec un coût estimé à 196 milliards d'euros en Europe. Outre les médicaments diminuant les taux de lipides les médecins ne disposent en effet pas de stratégie thérapeutique alternative efficace pour traiter les patients à haut risque cardiovasculaire et réduire le risque résiduel cardiovasculaire. À cette fin, l'identification de cibles thérapeutiques originales est indispensable. Sur la base de nos données préliminaires convaincantes et solides, ce projet a pour objectif d’évaluer le rôle d’un récepteur régulant les rythmes biologiques dans les artères, notamment dans le processus de cicatrisation endothéliale. Cibler ce récepteur par des approches pharmacologiques pourrait donc représenter un nouveau traitement alternatif aux médicaments actuels, ou pourrait être utilisé en association avec ces composés pour réduire le risque cardiovasculaire résiduel chez les patients. Cette question, qui englobe des aspects intégrés, nécessite le recours à l'expérimentation animale dans le respect des normes éthiques. L’impact du genre/sexe ainsi que de la ménopause étant déterminant dans l’apparition/le traitement des maladies cardiovasculaires, les deux sexes seront étudiés, ainsi que l’impact de la privation oestrogénique mimant la ménopause (période à haut risque cardiovasculaire chez la femme).
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de proposer un nouveau traitement alternatif aux médicaments hypolipidémiants actuels, ou pourrait être utilisé en association avec ces composés pour réduire le risque cardiovasculaire résiduel chez les patients.
Procédures
Certains animaux seront soumis à différentes interventions : - Injection intrapéritonéale (5 à 10sec) (240 animaux) - Pose de capsule ou mini-pompes en sous cutanée (5 à 10min) (240 animaux) - Ovariectomie (10 à 20min) (400 animaux) - Agression électrique de la carotide (20 min) (300 animaux) - Agression mécanique de la carotide (20-30 min) (300 animaux)
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisés dans ce projet sont de classe modérée (ovariectomie, pose de capsule, pose de mini-pompes, agression électrique ou mécanique de la carotide). Elles peuvent générer une douleur mais qui sera traitée par analgésique. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué : si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un morphinique sera administré à visée antalgique. Enfin, si des signes comportementaux indiquent une douleur ou un inconfort important, la souris sera mise à mort.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes et réaliser des analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
L'utilisation du modèle murin nous permettra d'identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant le processus de cicatrisation endothéliale. Ce processus implique des phénomènes de communication intercellulaire et des notions de flux/débit sanguins qui ne peuvent pas être modélisés ou reproduits ex vivo ou in vitro. De plus, aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire les variations hormonales auxquelles sont soumises les cellules endothéliales, d'autant plus que l'expression du récepteur des œstrogènes est perdue dans l'ensemble des lignées cellulaires endothéliales. Par ailleurs, l'étude de l'effet du sexe, via la sécrétion d'hormones stéroïdiennes telles que l'œstrogène et la testostérone, implique de multiples fonctions, tissus et cellules dans l’organisme, qui ne peuvent être modélisés par des approches in vitro. C'est pourquoi le recours à l'expérimentation animale est l'unique approche permettant la réalisation de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.
Raffinement
Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris resteront en acclimatation pendant un minimum d'une semaine en présence d'enrichissement (de type cartons, batôns ou balle en bois) pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Les animaux issus de différentes cages de transport ne sont jamais mélangés dans les cages d’hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié. Critères d'arrêt par rapport à la souffrance : dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessous, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (variation de poids corporel, apparence et mobilité de l'animal, comportement à la contention) seront surveillés permettant de mettre en application l’arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d’arrêt des souffrances. Pour l’ensemble des chirurgies, les animaux sont gardés sur plaque chauffante pendant toute la procédure jusqu'à leur réveil. Un analgésique (morphinique) sera administré. En post opératoire, les souris sont surveillées et pesées. En cas d'amaigrissement excessif (>20%) ou de signe de souffrance de l'animal (apathie, yeux fermés, absence de toilettage, prostration, blessure), l’animal sera sorti de la procédure et euthanasié.
Choix des espèces
Mus musculus. La souris est un modèle reconnu dans l’étude des maladies cardio-métaboliques Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisé chez la souris adulte (à partir de 8semaines).
Elevages de souris pour l’optimisation de protocoles de transplantation de cellules souches hématopoïétiques dans des modèles de pathologie du globule rouge.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les couples reproducteurs sont tués en fin d'élevage parce qu'ils sont "trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales". 4 880 souris vont être utilisées dans cet élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 100 réutilisées ailleurs et 4 780 déclarées mortes, alors que le porteur décrit par ailleurs une utilisation continue des jeunes souris dans ses expériences de transplantation. Elles sont mises à reproduire pendant six mois, et les jeunes porteuses du modèle de drépanocytose subissent un prélèvement sanguin au niveau de l'œil pour être génotypées, tandis que les lignées immunodéficientes sont élevées en conditions stériles pour éviter les infections auxquelles leur système immunitaire les expose. Les souris qui n'entrent pas dans les expériences de transplantation "pourront également être proposées pour des formations", ce que le porteur présente comme une manière de limiter l'utilisation des animaux non-humains.
Objectifs
Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs de thérapie génique permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines, pour améliorer les protocoles de greffes et de thérapie génique chez l’homme afin de traiter deux maladies génétiques du sang, la drépanocytose et la bêta-thalassémie. L’objectif de ce projet consiste à générer un modèle de souris qui mime certains aspects de la drépanocytose et qui doit être génotypé par un prélèvement sanguin ainsi qu’un modèle murin immunodéficient permettant de réaliser des greffes de cellules souches humaines et de les maintenir dans les meilleurs conditions d’élevage possibles Ces modèles de souris sont nécessaires à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux vecteurs de thérapies géniques avant leur utilisation chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer d'élevages de modèles murins de pathologies du globule rouge (drépanocytose et beta-thalassémie) ainsi que des modèles murins immunodéficients permettant de réaliser des greffes de cellules souches humaines. Des greffes de cellules souches seront réalisées sur ces modèles afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux vecteurs de thérapie géniques développés par notre laboratoire pour traiter ces maladies génétiques. Les protocoles améliorés de correction et de greffe des cellules souches sanguines dans le cadre de thérapies géniques pourront être appliqués à l’Homme.
Procédures
Les souris seront mis en accouplement pour plusieurs cycles de reproduction pendant 6 mois. Les jeunes souris modèles de la drépanocytose seront également soumises à un prélèvement sanguin qui dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les modèles immunodéficiences présentent un risque potentiel de développer des infections diverses par des pathogènes (virus, bactéries). Les souris modèles de la drépanocytose doivent être phénotypées par prélèvement sanguin, ce qui peut entrainer un stress dû à la contention ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.
Devenir
Les couples reproducteurs seront euthanasiés en fin de procédure d'élevage car ces animaux seront trop âgés pour être replacés dans d'autres procédures expérimentales. Les jeunes souris générées seront utilisées pour nos expériences de transplantation (utilisation continue). Les animaux ne rentrant pas dans des expériences de transplantation pourront également être proposés pour des formations afin de limiter au maximum l’utilisation des animaux
Remplacement
La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines est un phénomène complexe. Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative in vitro permettant de reproduire les différents processus physiologiques mis en jeu dans ce phénomène : guidage, implantation, survie, prolifération et différenciation de ces cellules. Leur transplantation chez un modèle animal est la seule solution pour évaluer leur capacité à se loger au niveau de la moelle osseuse et à reconstituer le système sanguin à long terme. Nous ne disposons donc pas actuellement d'alternative à l’utilisation de modèles animaux dans le cadre de nos projets de recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ces élevages dépend des projets de recherche dans lesquels ils sont utilisés. Son évaluation repose sur des travaux de recherche réalisés au sein de notre laboratoire sur les dernières années. L’anticipation et la rationalisation de nos besoins en fonction des différents projets permet de ne mettre en accouplement uniquement le nombre minimum d’animaux pour obtenir ceux nécessaires à nos expériences.
Raffinement
Les souris immunodéficientes sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce qui est stérilisée par autoclave. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Le génotypage des animaux se fait lorsque les souris sont jeunes et par une méthode peu douloureuse (prélèvement sanguin). Par ailleurs, la visite journalière des techniciens animaliers ainsi que la mise en place de points limites et de critères d’arrêts permettent de limiter la douleur à son minimum et d’intervenir rapidement en cas d’effet inattendu afin de décider avec le vétérinaire quelle est la suite à donner.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de la greffe de cellules souches sanguines. La lignée de souris drépanocytaire est utilisée comme modèle de pathologie humaine du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. La lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet d’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie génique sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de β-thalassémie. Dans ce projet la mise en accouplement se fera à 8-10 semaines, âge ou les souris sont fertiles. Le génotypage des petits s’effectuera après le sevrage afin que le prélèvement sanguin soit le plus faible possible par rapport au volume sanguin total de l’animal.
Génotypage des souris transgéniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Un prélèvement de tissu sous anesthésie gazeuse, de quelques secondes, permet de génotyper les souris transgéniques nées dans l'animalerie. 2 400 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la seule atteinte décrite étant le stress de la manipulation et de la contention. Le projet ne couvre que cette étape d'identification, les expériences elles-mêmes, portant sur des délétions de gènes de l'immunité liées au cancer, faisant l'objet de demandes séparées. Le devenir déclaré ne fait état d'aucun animal gardé vivant, alors que le porteur écrit que ces souris seront utilisées en continu et entreront ensuite dans d'autres protocoles.
Objectifs
Ces dix dernières années, l’immunothérapie s’est développée et a permis la mise en place d’une réponse puissante et durable chez un nombre limité de patients (20% en moyenne). Dans le but d’améliorer l’efficacité de l’immunothérapie des études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes de mise en place la réponse immunitaire anti-tumorale. Les études que nous réalisons au laboratoire utilisent des souris transgéniques possédant des délétions conditionnelles de gènes impliqués dans l’immunité, nous permettant d’étudier ces gènes comme des marqueurs ou des cibles pour améliorer la réponse à l’immunothérapie mais également les connaissances dans le domaine. La demande d’autorisation concerne le génotypage des souris transgéniques générées. L’utilisation de ces souris pour des études fera l’objet de demandes d’autorisation ultérieures.
Bénéfices attendus
Le cancer est aujourd’hui un problème de santé publique majeur et est la seconde cause de mortalité dans le monde. A titre d’exemple, en 2020, 20 millions de personnes ont été diagnostiquées et 10 millions de personnes sont décédées. Au laboratoire, nous travaillons sur des pistes d’améliorations pour augmenter l’efficacité de l’immunothérapie. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus permettrons de mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans une réponse anti-tumorale.
Procédures
Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse (durée : quelques secondes).
Impact sur les animaux
Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.
Devenir
Les animaux de ces colonies seront utilisés en continue. Ils entreront dans d’autres protocoles expérimentaux suite à leur génotypage. Ces protocoles seront soumis au comité d’éthique en amont.
Remplacement
Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, la tumeur, le système vasculaire... En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux transgéniques. Le décryptage des mécanismes moléculaires sera par la suite réalisé in vitro.
Réduction
La taille des élevages sera adaptée en fonction des nécessités expérimentales, elles-mêmes soumises au comité d’éthique. Les 2 sexes seront utilisés.
Raffinement
Les souris seront élevées dans un milieu enrichi avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture. Chaque animal sera examiné 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. La procédure sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux de référence pour les études sur le cancer et l’immunité. De plus, les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée. Les manipulations relatives au génotypage et à l’identification par puce seront réalisées sur des animaux très jeunes (1ère semaine de vie) pour limiter le mal-être.