Souris
Activité in vivo de copolymères synthétiques dégradables dans des modèles de souris de pneumonie et de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant au moins neuf gestes : trois administrations directement dans la trachée, une injection intraveineuse sous anesthésie générale et cinq injections dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, l'infection déclenchant une pneumonie ou un sepsis avec une perte de poids que le porteur annonce inférieure à 10 % et limitée à deux jours. Des copolymères synthétiques dégradables sont testés là comme candidats antibiotiques, dans un contexte de résistance bactérienne croissante. Le porteur écrit que les procédures n'entraînent aucune douleur résiduelle, tout en prévoyant jusqu'à quatre injections de morphinique selon l'état des animaux.
Objectifs
Les infections restent la 3ème cause de mortalité dans les pays développés et la 2nde au niveau mondial. En pratique clinique, on assiste au déclin inexorable de l’activité des antibiotiques disponibles en raison de la capacité des bactéries à développer des mécanismes de résistance contre l’ensemble des molécules disponibles à l’heure actuelle. L’augmentation continue de la résistance bactérienne implique de poursuivre le développement de nouvelles options thérapeutiques en favorisant la création de nouvelles classes de molécules antibactériennes. Les objectifs de ce projet sont donc : 1) d’évaluer l’activité de nouveaux copolymères synthétiques dans un modèle expérimental de pneumonie (infection locale). 2) d’évaluer l’activité de nouveaux copolymères synthétiques dans un modèle expérimental de sepsis (infection systémique). 3) d’identifier un composé appartenant à une nouvelle classe d’antibiotiques possédant une activité prometteuse in vitro et in vivo.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : 1. Il permettra de mieux appréhender la corrélation entre l’activité in vitro et in vivo de copolymères synthétiques dégradables. 2. Il permettra d’évaluer l’activité in vivo de nouveaux composés antibactériens dans un modèle d’infection locale et dans un modèle d’infection systémique. 3. La finalité de ce projet est d’identifier une molécule candidate afin de poursuivre son développement pré-clinique. 4. Enfin, l’ambition de ce projet est de démontrer l’intérêt d’une nouvelle classe de molécules antibactériennes (copolymères dégradables synthétiques) dans un contexte de combat contre la résistance antibactérienne.
Procédures
Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à trois administrations intra-trachéales, une administration intraveineuse sous anesthésie générale, et à 5 injections intrapéritonéales. En fonction de l’état général des animaux et si nécessaire, une ou plusieurs injections (de 1 à 4) sous-cutanées de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Toutes ces interventions ont une durée inférieure à une minute.
Impact sur les animaux
Les modèles aigüs d’inflammation (locale ou systémique) sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendrent pas de douleur résiduelle ni de stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse bactériologique.
Remplacement
Dans ce projet, une présélection rigoureuse des molécules candidates a été réalisée à l’aide de différentes techniques in vitro afin de limiter au maximum le nombre de molécules à tester in vivo. Malgré tout, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre activité in vitro (paramètres contrôlés) et in vivo (paramètres variables) après l’infection nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une validation approfondie de l’activité de nouvelles options thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Un test statistique sera utilisé et une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de buprénorphine seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale (modèle de pneumonie), la sonde de gavage est préalablement enduite d’un analgésique afin d’anesthésier localement la trachée. De même, lors de l’injection rétro-orbitale, une administration de morphinique sera réalisée afin de prévenir tout risque de douleur et de stress.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une bonne corrélation des résultats à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser et valider l’activité de nouvelles options thérapeutiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 2 mois). À ce stade, le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.
Etude de la neurogenèse embryonnaire dans le cortex cérébral sur des souris gestantes génétiquement modifiées impliquant une injection d’EdU
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Une injection unique de marqueur dans l'abdomen, puis l'anesthésie et la mise à mort pour prélever les embryons : 45 souris gestantes génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des nouveau-nés sont également tués quatre jours après leur naissance pour analyse histologique du cortex, et chaque future femelle reproductrice subit une biopsie de queue entre le septième et le dixième jour de vie pour génotypage. L'objet du travail est de préciser le rôle d'un gène dans la production des neurones du cortex embryonnaire, sur deux années de prolongation d'un projet arrivé à échéance. Le gène en question n'est jamais nommé, et les 45 femelles forment le seul effectif annoncé, les embryons et les souriceaux tués n'étant comptés nulle part.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre le rôle d'un gène dans le contrôle de la neurogenèse dans le cortex cérébral chez l’embryon. Le développement du cortex est un processus complexe encore très mal compris dont les dérèglements sont à l’origine de pathologies graves chez l’humain (épilepsie, retards mentaux, troubles comportementaux et cognitifs). Il implique de nombreux partenaires moléculaires dont beaucoup restent à découvrir. Nous disposons d’un modèle de souris génétiquement modifiée dans lequel notre gène d’intérêt est inactivé spécifiquement dans les cellules à l’origine des neurones du système nerveux central. Des résultats préliminaires nous ont montré que l’inactivation de ce gène modifiait le nombre de neurones produits dans le cortex de l’embryon à des stades précoces. Afin de préciser ces défauts de neurogenèse, nous souhaitons pouvoir analyser les conséquences de l’inactivation de ce gène à plus long terme, à différents stades embryonnaires et après la naissance, sur l’organisation anatomique du cortex cérébral et le nombre de neurones générés. Pour cela nous effectuerons une injection intrapéritonéale unique à des souris génétiquement modifiées gestantes à un stade donné d’une solution d’une molécule qui permet de repérer les neurones en cours de génération. Un à sept jours embryonnaires plus tard, la mère gestante sera anesthésiée et euthanasiée selon les procédures réglementaires pour prélever les embryons pour des analyses histologiques. Des nouveaux-nés seront aussi euthanasiés 4 jours après leur naissance pour des analyses histologiques. La présente DAP est une demande de prolongation de 2 ans d'une DAP arrivant à échéance fin 2024.
Bénéfices attendus
La prolongation de ce projet permettra de finaliser l'étude visant à comprendre le rôle de notre gène d'intérêt dans le développement du cortex cérébral. Chez l'homme, des formes mutées de ce gène conduisent à plusieurs pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, dépression et schizophrénie) chez l'adulte et des retards mentaux chez l'enfant. Cette étude permettra de proposer de nouvelles hypothèses sur les processus physiopathologies générés par ces mutations.
Procédures
Les 45 femelles gestantes vigiles sont soumises à une seule injection intrapéritonéale durant 2 secondes d'un composé de marquage non douloureux. Elles sont anesthésiées avant euthanasie. Chaque animal voué à devenir une femelle transgénique gestante fait par ailleurs l’objet d’une biopsie de queue entre J+7 et J+10 pour génotypage.
Impact sur les animaux
La présente demande est de classe légère. L’injection intrapéritonéale du composé en solution physiologique provoque une douleur légère et de courte durée. Le produit injecté n’a pas de conséquence délétère sur la santé de la mère et des embryons ou jeunes souriceaux. Le phénotype des embryons et des jeunes souriceaux génétiquement modifiés « mutants » n’est pas dommageable. Le phénotype des individus génétiquement modifiés contrôles n’est pas dommageable. Cette étude nécessite le maintien d’une lignée transgénique pour générer les parents impliqués dans l’étude. Le phénotype des parents n’est pas dommageable.
Devenir
Les souris gestantes ayant subi l'injection intrapéritonéale du composé de marquage, seront anesthésiées et euthanasiées pour le prélèvement des embryons. Elles ne peuvent être réintroduites en animalerie, ni réutilisée du fait de la présence du composé de marquage dans les tissus. Les embryons et nouveaux-nés sont euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Le cortex cérébral étant caractéristique des mammifères et les protocoles de culture in vitro ne permettant pas de reconstruire un cortex typique, nous sommes contraints de travailler sur des souris à différents stades embryonnaires et post-natals. Compte-tenu des similitudes entre les processus de développement du cortex chez les primates et la souris, le modèle souris permettra d'obtenir des résultats vraisemblablement utiles à la connaissance des processus humains.
Réduction
Pour limiter le nombre de souris gestantes, tous les individus de la portée qu’ils soient mutés ou non mutés seront utilisés pour les analyses, les animaux non mutés servant de contrôles. De plus, nous combinerons plusieurs types de marquages histologiques sur les mêmes individus. Nous prélèverons et archiverons un maximum de tissus à partir d’un même individu, et ce, en prévision de futures expériences.
Raffinement
Pour raffiner les conditions d’utilisation des animaux, les souris gestantes sont élevées dans un environnement enrichi. Préalablement à l’injection, les souris gestantes seront habituées à une contention manuelle. L’injection sera effectuée en respectant la stérilité et les volumes autorisés. Une surveillance journalière des souris gestantes sera effectuée pour vérifier le non dépassement des points limites adaptés et précoces jugés à travers le comportement, l’absence de souffrance, d’hémorragie ou d’infections.
Choix des espèces
Le cortex cérébral étant une structure très complexe, il n’est pas possible de le reconstruire en culture in vitro pour l’étudier. De plus, le cortex cérébral est une structure typique des mammifères. Le recours à des souris est donc nécessaire. De plus, l’invalidation d’un gène est nécessaire pour en comprendre le rôle chez le modèle souris. Nous avons choisi une stratégie invalidant de manière conditionnelle notre gène d’intérêt de manière restreinte dans le système nerveux central pour éviter une atteinte d’autres organes et ainsi avoir un phénotype le moins dommageable possible.
Développement d’un modèle murin de maladie de Sjögren pour tester un nouveau traitement ciblant les cellules B auto-immunes
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections de protéine SSA avec adjuvant complet de Freund pour déclencher une maladie auto-immune, sept prélèvements de sang à la joue sous anesthésie générale, et cinq recueils de salive provoqués par la pilocarpine, au rythme d'une série par mois. Le traitement testé, un anticorps bispécifique censé détruire les seuls lymphocytes B auto-immuns, est injecté jusqu'à trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur justifie la mise à mort de toutes les souris par l'analyse histologique de leurs glandes salivaires, et ajoute que les exposer à vie à la sécheresse buccale provoquerait des pathologies dentaires rendant leur adoption inenvisageable.
Objectifs
Le syndrome de Sjögren (SS) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales, entraînant une sécheresse de la bouche et des yeux. Cette pathologie se complique de manifestation graves comme des atteintes d’organes sévères (poumon, muscle, nerfs). La maladie de Sjögren augmente de 20 fois le risque de faire un lymphome lié à la maladie. Il n’existe à ce jour aucun traitement approuvé pour cette maladie. Cette pathologie est caractérisée par la présence d’auto-anticorps dirigés contre la protéine SSA aussi appelée Ro60 qui sont produits par des lymphocytes B spécifiques. Les modèles murins utilisant la vaccination contre la protéine SSA reproduisent les caractéristiques de la pathologie humaine. Notre objectif est de développer un nouveau traitement de cette pathologie avec un anticorps bispécifique qui détruit spécifiquement les cellules B auto-immunes qui sont à l’origine des auto-anticorps anti-SSA. Cet anticorps bispécifique portera sur un bras l’antigène SSA et sur l’autre un anti-CD3 qui dirigera une réponse des lymphocytes T qui détruiront spécifiquement les cellules B autoimmunes dirigées contre SSA sans détruire les autres lymphocytes B qui sont utiles pour portéger des infections. Pour cela nous avons besoin du modèle animal préclinique de vaccination anti-SSA pour tester l’efficacité du traitement.
Bénéfices attendus
La maladie de Sjögren est due à une petite fraction de globules blancs( les lymphocytes B) qui détruisent les glandes produisant de la salive. Cependant les traitements actuellement disponibles pour détruire les lymphocytes B les détruisent en totalité. La destruction de tous les lymphocytes B entraine un risque important d’infection. L’objectif est d’aboutir à une guérison des patients grâce a une destruction ciblée des lymphocytes B qui détruisent les glandes salivaires. Ceci ne peut être obtenu qu’après démonstration de l’efficacité de cet anticorps bispécifique dans un modèle murin de la maladie. Après d’autres études chez l’animal le traitement pourra faire l’objet d’essais cliniques chez l’homme.
Procédures
-Injection : 5 fois. durée
Impact sur les animaux
1)Douleur liées aux injections de vaccination, de médicaments: légère de courte durée 2)Douleur et stress de courte durée liée aux prélèvements sanguins sur la joue 3) Stress lié à la contention pour le recueil de salive limitation par l’anesthésie générale. 4) L'adjuvant complet de Freund sera injecté en sous-cutané pour limiter les lésions cutanées au point d'injection. En cas de lésions nous appliquons un antiseptique et un antibiotique en crème si besoin.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés car pour démontrer à la fois l’existence de la maladie de Sjögren et l’efficacité des traitements il est nécessaire de réaliser des analyses histologiques des tissus cibles de la maladie comme les glandes salivaires qui sont le siège de la maladie. Par ailleurs exposer tout le reste de leur vie de les animaux à la sècheresse buccale peut entrainer à long terme des pathologies dentaires qui pourraient entrainer des difficultés d’alimentation des animaux. Il n’est donc pas envisageable d’adopter ses animaux.
Remplacement
Le développement d’un nouveau médicament utilisant un système immunitaire complet et des organes cibles comme les glandes salivaires et reproduisant la pathologie ne peuvent être effectués que sur un modèle animal. En effet la réalisation sur des cellules humaines humains est rendu impossible par le fait qu'il nous faudrait reproduire plusieurs organes (rate, glandes salivaires, ganglions) reliées entre eux par des vaisseaux dans lesquels circulerait des cellules immunitaires. Ceci n'est pas réalisable à ce jour par les outils à notre disposition.
Réduction
Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été calculé précisément à l'aide d'outils statistiques qui permettent d'être surs que le nombre d'animaux par groups (ici 15) est suffisant pour être sur de voir une différence significative d'augmentation du flux salivaire si le traitement fonctionne. Pour cela nous avons analysé les données disponibles de variations de la production de salive entre différentes souris malades et non malades.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un milieu enrichi avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et des points limites sont prévus pour veiller à ce bien-être . Les injections et les prelèvements seront faits sous anesthésie génrale et/ou locale.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car nous avons besoin d'un organisme entier avec un système immunitaire proche de celui de l'homme. Par ailleurs le modèle de maladie de Sjögren avec immunisation avec le peptide SSA a été developpé par une équipe américaine sur la souris il est donc logique pour le reproduire d'utiliser la même espèce. Nous utiliserons des animaux adultes entre 10 à 12 semaines ce qui est l’âge habituel auquel les protocoles d’immunisation commencent dans les protocoles de vaccination.
Etude des mécanismes responsables du syndrome cardiorénal chez des modèles rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 500
Un rein retiré par chirurgie, un second passage sur la table dix jours plus tard, une échocardiographie sous anesthésie, vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme, cinq mesures de pression artérielle sur cinq jours consécutifs, un électrocardiogramme, une prise de sang après un mois d'insuffisance rénale : 500 rats et 540 souris vont subir cet enchaînement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie rénale ainsi provoquée entraîne perte de poids, perte d'appétit et augmentation de la diurèse, auxquelles s'ajoute un régime alimentaire spécial qui peut modifier la mobilité et le comportement. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre le syndrome cardiorénal, en partant de l'hypothèse que l'inflammation y joue un rôle central. Tous sont tués en fin de procédure, le porteur jugeant "obligatoires" les analyses de sang et d'organes prélevés.
Objectifs
Les comorbidités cardiovasculaires de l’insuffisance rénale chronique , ce qu’on appelle le syndrome cardiorénal, sont dramatiques et impactent la survie des patients. La prévalence de l’insuffisance rénale chronique en Europe est pres de dix pour cent. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre rein et coeur par exemple ou rein et microbiote, mais également d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’inflammation (infiltration de monocytes et macrophages, augmentation de l’expression de molécules pro-inflammatoires) joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l’aldostérone. La modulation de l’inflammation dans les organes affectés (rein, cœur) peut également jouer un rôle critique dans l'instauration et/ou le maintien du remodelage rénal et cardiaque. Les anomalies du microbiote intestinal associées à l’insuffisance rénale chronique peuvent contribuer à ces altérations. Les objectifs du projet sont de comprendre les mécanismes et éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques du syndrome cardiorenal. Notre hypothèse est que l’inflammation joue un rôle central dans le syndrome cardiorénal, soit directement au niveau de l’organe cible, soit indirectement en affectant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de comprendre les conditions et mécanismes par lesquels un récepteur hormonal et sa cible aval sont impliqués dans le syndrome cardiorénal présent lors d’une insuffisance rénale chronique dont la prévalence en Europe est d’environ dix pour cent. Pour cela, l’efficacité des antagonistes de ce récepteur hormonal et de sa cible aval seront étudiés ainsi que le rôle de la dysbiose induite par l’insuffisance rénale chronique dans ce processus. Le rôle des cellules intestinales (épithéliales, cellules musculaires lisses) ou inflammatoires/macrophages dans ces processus seront identifiés. Ces résultats permettront de proposer des alternatives diagnostiques et thérapeutiques aux patients souffrant de syndrome cardiorénal
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Pour induire une insuffisance rénale chronique, l’ablation d’un rein est réalisée par chirurgie sous anesthésie et avec une prise en charge analgésique avant/pendant et après l’opération (20 min, 2 fois à 10 jours d’intervalle). L exploration de la maladie cardiaque comporte une échocardiographie sous anesthésie gazeuse (15 min, 1 fois). Pour recueil des urines (une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Un électrocardiograme (une fois, durée 15 min) est réalisé (animal vigile). Des prélèvements sanguins sont effectués une fois après 1 mois d'insuffisance rénale chronique (1 minute) chez l’animal vigile. L’euthanasie est réalisée en fin de période expérimentale après analgésie et anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (chirurgie rénale, échocardiographie) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de la maladie rénale chronique (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial peut entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle ou l’installation des gilets pour l’électrocardiograme 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, cytokine, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris et le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde et de la signalisation sous-jacente dans le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
1040 animaux (500 rats et 540 souris) seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft et batonnet en bois. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. Lors des anesthésies, la température interne est suivie et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. La douleur post-opératoire sera prise en charge par une analgésie et des croquettes hydratées seront déposées au fond de la cage pour faciliter l’alimentation. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, les analyses cardiovasculaires seront réalisées sous anesthésie afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris ont été choisies car ce sont des modèles établis pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons de deux modèles de rats génétiquement modifiés permettant de surexprimer le récepteur minéralocorticoïde (RM) dans ses territoires naturels d‘expression (rat) et d’inactiver l’expression d'un gène d'intérêt, ainsi que de modèles souris génétiquement modifiées permettant de moduler l’expression du RM de façon conditionnelle uniquement dans les types cellulaires d’intérêt. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Évaluation de l’effet anti-inflammatoire de métabolites produits par le microbiote intestinal dans un modèle pré-clinique de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Aucun antalgique ne sera donné aux souris rendues colitiques, le porteur indiquant que ces molécules interféreraient avec l'inflammation qu'il étudie. 932 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. 464 d'entre elles reçoivent pendant une ou deux périodes de sept jours une eau de boisson additionnée de dextran sulfate de sodium, qui déclenche la colite avec ses douleurs et sa perte de poids, 388 sont gavées quotidiennement avec des bactéries, et toutes sont pesées chaque jour, une contention manuelle venant au besoin stimuler l'émission de fèces. L'enjeu affiché reste la "preuve de concept" de métabolites bactériens anti-inflammatoires, qui justifierait plus tard des essais cliniques chez l'humain.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin se caractérisent par des inflammations fortes et répétées au niveau intestinal. La répétition de ces épisodes d'inflammation conduit à des complications telles que des des diarrhées, des saignements, des douleurs abdominales, une perte de poids et d’autres symptômes sévères. Ces symptômes diminuent de façon très significative la qualité de vie des patients. Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin constituent un enjeu majeur de santé publique dans de nombreux pays. Il n’existe pas, actuellement, de traitement permettant de soigner définitivement ces maladies. Différents traitements médicaux sont utilisés pour traiter les patients mais, malheureusement, un certain nombre de patients ne répondent pas à ces traitements. Il existe donc une forte demande pour trouver de nouveaux médicaments contre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Certaines molécules, produites par des bactéries vivant dans le tube digestif, possèdent des propriétés anti-inflammatoires. Les objectifs de ce projet de recherche sont d’évaluer l’effet de ces molécules sur l’inflammation intestinale chez la souris. Pour cela, l’effet de l’ajout de ces molécules dans l’eau de boisson des animaux, ou l’effet de l'administration de bactéries productrices de ces molécules sur l’inflammation sera évalué. Les résultats obtenus par ce projet constitueront des données essentielles pour valider et poursuivre le développement de nouveaux médicaments basés sur ces molécules.
Bénéfices attendus
L’ensemble des procédures expérimentales présentées dans ce projet permettront de déterminer si les métabolites peuvent constituer des outils thérapeutiques innovants dans le traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le potentiel anti-inflammatoire de diverses espèces bactériennes sera déterminé. Elles pourront constituer des probiotiques d’intérêt dans le traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. L’ensemble des données précliniques obtenues dans ce projet seront essentielles pour valider la « preuve de concept » de l’utilisation de ces métabolites et pour justifier d’initier des essais cliniques chez l’Homme basés sur ces molécules.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront hébergés dans des cages et bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Une période d’habituation de 3 jours à la manipulation/contention par les expérimentateurs (une fois par jour), sera réalisée avant le début des expérimentations. Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront pesés (animaux vigiles) une fois par jour sur une période de 10 à 15 jours. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. Une partie des animaux (388 souris) seront gavés oralement avec des bactéries, une fois par jour pendant 5 à 15 jours consécutifs. 832 souris recevront un gavage oral de dextran couplé à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextran) le dernier jour du protocole. Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. Il y aura un délai de 4 heures entre l’administration de l’isothiocyanate de fluorescéine et la mise à mort. Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques. Une partie des animaux (464 animaux) auront accès uniquement à de l’eau de boisson supplémentée en Dextran Sulfate Sodium, qui génère les symptômes attendus de la colite, sur une ou deux périodes de 7 jours. Pour chaque souris (932 souris), une collecte de fèces sera réalisée une fois par jour sur une période de 10 à 15 jours, lors de la pesée. Si aucune fèces n’est récupérée, une contention manuelle de quelques secondes sera réalisée afin de stimuler l’émission de fèces.
Impact sur les animaux
- Des administrations par gavage seront réalisées au cours de ce projet. La réalisation de ces gavages oral (et la prise des animaux en contention) peut engendrer un stress de quelques secondes (nuisance légère). - L’induction de la colite peut être associée à une perte de poids et à des douleurs chez les animaux. Ces effets indésirables surviennent après environ 3 jours de traitement au Dextran Sulfate Sodium et peuvent durer jusqu’à la fin du traitement au Dextran Sulfate Sodium soit une durée totale d’environ 7 jours (nuisance sévère).
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Ce projet de recherche vise à étudier les interactions entre le microbiote intestinal, l’épithélium intestinal et le système immunitaire dans un modèle de colite sévère. Ce projet se focalise donc sur une réponse intégrée de l’organisme faisant appel à plusieurs grands systèmes, et ne pouvant être modélisée par des procédures moléculaires et cellulaires simples. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs facteurs ont été combinés. L’utilisation d’une lignée de souris congénique, présentant une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été limité au maximum de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats. Un maximum de tissus sera collecté après la mise à mort des animaux et stocké de façon à maximiser les données obtenues et permettre de réaliser des analyses complémentaires ultérieurement, sans avoir à renouveler les expérimentations chez l’animal.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Une période d’habituation à la manipulation de 3 jours sera réalisée à la suite de la période d’acclimatation. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule Structure chargée du Bien Etre des Animaux. Un suivi quotidien de la consommation hydrique sera réalisé pour prévenir une éventuelle déshydratation des animaux. Une augmentation de la quantité de matériaux de nidification sera réalisée. L'usage est de ne pas utiliser d’antalgiques pour limiter la douleur des animaux avec colite en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire qui est l'élément central étudié dans ce projet.
Choix des espèces
Les souris sont très régulièrement utilisées dans la littérature pour l'étude des mécanismes pathologiques associés aux colites aigües ou chroniques. Il est donc pertinent d'utiliser cette espèce dans ce projet de recherche centré sur l'inflammation intestinale. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées (stade jeune adulte).En effet, ce stade correspond à la période d'apparition des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin chez l'homme.
Etude de l’effet d’une infection bactérienne sur une voie de l’immunité innée chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une sonde de température est implantée sous la peau de chaque souris, qui reçoit ensuite dans la veine de la queue une injection de bactéries pathogènes. 176 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatorze jours d'infection sont résumés à une "variation de température", alors que le raffinement prévoit d'administrer des analgésiques en cas de baisse trop forte de la température corporelle. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur donnant pour seule raison qu'elles auront été infectées par des bactéries pathogènes.
Objectifs
La pyrine est un composant de l'immunité. La pyrine est activée lors de certaines infections bactériennes et déclenche une réaction inflammatoire (variation de température) qui permet de lutter contre ces infections. A ce jour, les mécanismes d'activation et de régulation de la pyrine lors d'infections est peu compris. Le but de ce projet est de mieux décrire les mécanismes d'activation et de régulation de pyrine lors d'infections bactériennes dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices scientifiques de ce projet : progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de pyrine et sur l’utilisation d’un modèle murin pour modéliser l’activation de pyrine lors d’une infection. L'inflammasome pyrine étant associé à des maladies génétiques chez l'homme (la fièvre méditerranéenne familiale entre autres), l'utilisation d'un modèle murin humanisé pourra nous permettre de développer de nouveaux traitements pour ces maladies génétiques.
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse qui durera 30secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée qui durera 30 secondes d'une sonde de température, certains animaux pourront recevoir une injection sous cutanée de qui durera 30secondes d'analgésique.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles, mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Pendant les 14 jours d’infection, les souris pourront ressentir les effets de l’infection (variation de température).
Devenir
Les animaux auront été infectés par des bactéries pathogènes, ils seront donc euthanasiés
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaire déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. Les modèles in vitro étudient la réplication de bactéries dans un seul type cellulaire dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôtes-pathogènes rencontrées lors d’une infection.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Nous prévoyons 5 animaux par lot de génotype et de souche d’infection, 3 animaux par lot contrôle pour les analyses post-mortem. Les nombres d’animaux sont calculés au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Utilisation d’implants pour prendre la température (la pose de l’implant est plus invasive mais cela permettra de rendre les prises de température moins intrusive) 3) Anesthésie gazeuse lors de la pose de l'implant de température 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) L'utilisation d'analgésiques en cas de trop forte baisse de température corporelle des animaux suite à l'infection. Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées humanisées, KO (délétion de gènes) et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Par ailleurs, les animaux portant un gène humanisé nous permettront de savoir si les réponses observées in vitro sont transposable à l’échelle de l’organisme. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.
Circuits à deux cellules stroma-macrophage
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Six mois d'antibactérien dans l'eau de boisson pour les souris mises à la reproduction, et de la conception jusqu'à six semaines d'âge pour leur descendance : 945 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, et la tumeur est laissée croître jusqu'à 12 mm avant la mise à mort, avec un risque d'ulcération que le porteur reconnaît douloureux. Toutes finissent tuées pour le prélèvement d'organes ou de tumeurs, les reproducteurs étant retirés de l'élevage à six mois d'âge pour une "raison éthique" invoquée sans autre précision. L'ensemble sert à cartographier les niches de macrophages dans les tissus, et le porteur indique que le projet repose exclusivement sur des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Cellules immunitaires vitales présentes dans tout le corps, les macrophages contribuent à la santé et au fonctionnement de nos tissus. Leur absence entraîne des changements biologiques significatifs, soulignant leur importance. Les macrophages remplissent divers rôles dans différents organes, de la promotion de la croissance des neurones dans le cerveau à la régulation du développement osseux. Ils sont également impliqués dans différentes pathologies telles que le cancer. Ils peuvent donc être considérés comme des régulateurs fonctionnels de nombreux processus clé de notre organisme. Malgré leur importance, nous ne savons que peu de choses sur la façon dont ces régulateurs biologiques sont eux-mêmes régulés. Le concept de « niche des macrophages » suggère qu'un environnement local spécifique appelé « niche » régule le développement, l’instruction et le comportement de ces cellules immunitaires. Les cellules de soutien dites « stromales », connues pour agir comme des niches pour les cellules immunitaires dans les organes lymphoïdes, jouent probablement un rôle similaire dans le soutien des macrophages dans divers tissus. Ce projet de recherche propose d’étudier les relations complexes existant entre les cellules immunitaires et leurs environnements, offrant ainsi des perspectives sur leurs échanges qui assurent l'harmonie et la stabilité des tissus, et sur les traitements potentiels pour les maladies impliquant une dysfonction des macrophages (des maladies infectieuses au cancer). Il vise à accomplir deux objectifs cruciaux : (1) construire un atlas complet détaillant la distribution des niches de macrophages à travers différents tissus, (2) élucider les mécanismes moléculaires régissant la communication réciproque entre les cellules niches et les macrophages.
Bénéfices attendus
Les macrophages jouent un rôle vital dans le maintien de l'équilibre physiologique et la réparation des tissus. Cependant, dans de nombreux contextes pathologiques tels que cancers et maladies infectieuses, la diversité des macrophages et leur capacité d'adaptation peuvent avoir des effets bénéfiques et/ou néfastes. Par exemple, une présence accrue de macrophages dans les tumeurs est souvent associée à des résultats défavorables dans différents types de cancer. Étant donné les rôles doubles des macrophages dans divers tissus, les approches thérapeutiques efficaces devraient idéalement cibler les macrophages "défavorables" tout en préservant les "bénéfiques". Pour y parvenir, il est nécessaire de manipuler individuellement les différents sous-ensembles de macrophages in vivo. Ce projet vise à cibler les macrophages via la manipulation de l'environnement nutritif qui les entoure pour à terme en comprendre leurs fonctions. Cette approche innovante permettra non seulement de révéler de nouvelles fonctions de ces cellules immunitairess, mais aussi d’infirmer ou confirmer les rôles qui leur ont été précédemment attribués. Elle nous permettra également d'identifier les niches des macrophages à travers les tissus, d'explorer la réponse fonctionnelle fournie par les macrophages à leurs niches, et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. En résumé, ce projet éclairera de nouveaux aspects des fonctions des macrophages tout en fournissant un niveau de détail sans précédent de la compréhension du concept de la niche de ces cellules immunitaires. Les résultats de notre recherche pourraient servir de cadre pour comprendre les rôles polyvalents des macrophages, guidant ainsi potentiellement les stratégies thérapeutiques futures pour diverses maladies où ils sont impliqués.
Procédures
Notre demande de projet comporte 2 types d’interventions : nos animaux recevront soit un antibactérien à large spectre, soit une injection en sous-cutanée de cellules tumorales. Les animaux vigiles recevront un antibactérien à large spectre administré dans l'eau de boisson : depuis la saillie jusqu'à la fin de l'accouplement pour les animaux en accouplement soit durant 6 mois ; de la conception (embryon) jusqu'à l'âge adulte pour les individus issus de ces accouplements soit durant 6 semaines. Les animaux anesthésiés recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanée, et seront mis à mort dès que la tumeur atteindra la taille de 12mm (longueur ou largeur) soit avant la semaine 4 post-injection tumorale.
Impact sur les animaux
Les systèmes de régulation dépendants d’antibactériens sont couramment utilisés chez les souris génétiquement modifiées depuis le milieu des années 1990, et cette procédure ne devrait engendrer aucune douleur, souffrance ou angoisse. La pousse de la tumeur peut induire une perte de poids, et interférer avec les besoins / comportements normaux de la souris. La tumeur peut évoluer en ulcération et causer une souffrance à l’animal.
Devenir
Les animaux de nos groupes d'étude seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de multiples organes. Les animaux reproducteurs seront gardés en vie jusqu'à l'âge limite de mise en reproduction (= 6 mois d'âge) pour raison éthique. Les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem de tumeur.
Remplacement
La complexité et la dynamique des interactions entre les macrophages et leur microenvironnement ne peuvent être étudiées efficacement à l'aide de modèles in vitro : les macrophages présentent en effet une plasticité remarquable, et peuvent modifier leur physiologie en réponse à des stimuli environnementaux. Pour obtenir une compréhension de leurs fonctions ils doivent donc être considérés dans leur environnement et, à ce titre, seuls les modèles in vivo permettront de décrypter les contacts cellulaires authentiques sous-jacents aux interactions macrophage-niche. Enfin, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide d’un logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
Le statut EOPS (= Exempt d'Organisme Pathogène Spécifique) de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux utilisés dans cette étude sont traités conformément aux règles éthiques édictées par la directive 2010/63/UE, ainsi que par le décret n°2013-118 et ses 5 arrêtés : - Les cages utilisées dans les zones d’hébergement ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et de limiter l’agressivité. - Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi : du matériel de nidification ainsi que des dômes seront introduits dans chaque cage pour confectionner des nids. - Les animaleries bénéficient d'une température régulée, d'un taux d'humidité dans l'air contrôlé, ainsi que d'une exposition à la lumière contrôlée. - Les animaleries sont calmes. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/souffrance. Tout au long de la vie de l’animal, nous mettrons en place des points limites prédictifs et adaptés à chaque procédure afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress. Bien que nous ne nous attendions pas à des nuisances liées au traitement ou à l’arrêt du traitement antibactérien, nous effectuerons des surveillances quotidiennes pendant la première semaine de traitement et la première semaine d’arrêt du traitement afin de garantir le bien-être de nos animaux. Si l’ajout d’antibactérien dans l’eau de boisson impacte la quantité d’eau bue par les souris, nous rajouterons du sucrose pour augmenter son appétence. Si l’ajout / l’arrêt du traitement antibactérien ou la pousse de tumeur entraine une perte de poids, les animaux recevrons de la nourriture sous forme de gelée. Si une posture anormale ou une blessure est détectée l'animal sera isolé, et un médicament pour soulager la douleur sera mélangé à du nutella et ajouté dans la cage pendant 5 jours maximum. Sans amélioration de la condition de l’animal pour l’ensemble des points limites décrits, celui sera mis à mort par inhalation progressive de CO2.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés et ce projet est entièrement basé sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les souris mises en accouplement recevront un traitement antibactérien de la saillie jusqu’au retrait de la mise en reproduction (6 mois d’âge). Les souris issues des accouplements recevront un traitement antibactérien de la gestation à 6 semaines d’âge. Elles seront euthanasiées et prélevées à partir de 10 semaines d’âge puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement. Des animaux âgés de 6 semaines seront utilisés, puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.
Etude du métabolisme d’un acide aminé, le tryptophane, par microdialyse cérébrale dans un modèle de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Infectées par gavage avec un milliard de bactéries, puis trépanées pour recevoir un guide de microdialyse cimenté dans le crâne, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune est manipulée 46 fois sur quatre mois, en plus des pesées quotidiennes, et subit deux fois par semaine pendant trois mois une perfusion cérébrale de deux heures, éveillée. L'objectif déclaré consiste à relier un dérèglement du métabolisme du tryptophane à l'hypersensibilité colique et aux troubles anxieux du syndrome de l'intestin irritable, pour identifier de futures cibles pharmacologiques. Le guide qui dépasse de cinq millimètres du crâne est décrit comme une "légère gêne" pouvant occasionner des grattages, alors que le même texte annonce une hypersensibilité colique et un comportement anxieux installés jusqu'à la fin des expériences.
Objectifs
L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du syndrôme de l'intestin irritable (SII) mais s’accompagnent très fréquemment de comorbidités psychologiques. La prise en charge de ces symptômes en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces symptômes afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes centraux impliqués dans l’initiation, le développement et le maintien d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC) ainsi que des comorbidités psychologiques (anxiété, dépression, troubles de la cognition) sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux (SII-PI). En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du métabolisme du tryptophane pouvant être l’origine d’une HSVC ainsi que de comorbidités psychologiques. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre du métabolisme du tryptophane et le développement d’une HSVC et des comorbidités psychologiques afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement des symptômes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes associés au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettrait d’envisager une étude clinique. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs et des comorbidités psychologiques chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Les groupes "infectés" seront infectés une fois par un gavage de 0,2ml de suspension de bactérie dans du PBS à une concentration de 10E9 bactéries/souris. Les groupes "non-infectés" seront traités une fois par un gavage de 0,2mL de PBS pour ne pas induire un biais. Un prélèvement de fèces sera effectué à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif nécessitant une contention de 5 minutes maximum. Les souris recevront un traitement par gavage oral deux fois par jour à base de métabolites dérivés du métabolisme du tryptophane entre J16 et J23. Chaque gavage prendra au maximum 30 secondes. A la suite de la période post-infectieuse (J16) les animaux subiront une procédure chirurgicale prenant une heure environ permettant l’implantation du guide de microdialyse au niveau cérébral. Après 48h de récupération suite à la chirurgie, les animaux subiront des perfusions de liquide céphalorachidien artificiel d’environ 2h à travers une sonde de microdialyse permettant de récupérer 200µL de liquide céphalorachidien sur animaux vigiles de façon bihebdomadaire sur une période pouvant s’étendre jusqu’à 3 mois. De plus, les animaux seront pesés quotidiennement pour vérifier leur bien-être. Au total, les animaux seront manipulés 46 fois en plus des pesées quotidiennes sur une période de 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront pris en en contention lors de l’infection à J0 et lors de la récupération de fèces à J3, J7, J10 et J16 induisant un stress léger. L’infection par C. rodentium induira des symptômes associés au syndrome de l’intestin irritable post-infectieux tels qu’une hypersensibilité colique et un comportement anxieux en phase post-infectieuse et jusqu’à la fin des expérimentations. L’administration d’un traitement curatif par gavage intragastrique deux fois par jour sur 8 jours lors de la phase post-infectieuse nécessitera une contention quotidienne rapide des animaux. Pour la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés par injection sous-cutanée de kétamine/xylazine, plus un mélange de lidocaine et buvipacaine en analgésique. Le crâne des animaux sera percé permettant l’implantation du guide en conditions stériles, la zone sera refermée par un ciment dentaire laissant dépasser le guide. Celui-ci dépasse d’environ 5mm du crâne des animaux et pourrait donc occasionner une légère gêne et des grattages. A la suite, les animaux seront stabulés individuellement permettant leur récupération optimale et minimisant le risque de déplacer le guide. Une douleur au niveau du site chirurgical pourra être observée chez les animaux mais ce phénomène sera étroitement surveillé et la douleur sera traitée par des injections de lidocaïne et buvipacaine pendant 2 jours minimum après la chirurgie. Si un animal montre des signes d’infection post opératoire, il sera traité ou retiré de l’expérimentation. Pour la microdialyse, les animaux seront habitués 30min dans des cages de microdialyse, permettant leur libre déplacement, équipé d’eau et de nourriture à volonté, ensuite, les animaux seront rapidement anesthésiés par anesthésie gazeuse pour l’introduction de la sonde de microdialyse au travers du guide implanté, habitués à nouveau 30min puis perfusés (2h environ). A la fin, une nouvelle anesthésie gazeuse aura lieu pour retirer la sonde de microdialyse du guide et les animaux seront remis dans leur cage d’origine. Cette perfusion de microdialyse sera répétée de façon bihebdomadaire sur une période de 3 mois pouvant entrainer un stress lié à la manipulation. Durant la phase infectieuse et suivant la chirurgie, une perte de poids (maximum 5% du poids initial) pourra être observée chez certains animaux. Un suivi quotidien du poids et de l'état général des animaux sera effectué.
Devenir
A l'issu de la procédures, les animaux seront mises à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur les variations du métabolisme du tryptophane au niveau cérébral. De plus, une étude comparant des données de métabolomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Ce nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (week-end et jours fériés compris) voir deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20% sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Modèles de migraine pour évaluation de traitements
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2415
Pour évaluer des candidats anti-migraineux, 1 623 souris et 2 415 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des crises de migraine leur sont provoquées par injection d'un réactif ou par stimulation optogénétique, une fois par jour ou tous les deux jours pendant deux à quatre semaines, après une chirurgie de trente minutes à deux heures pour implanter des électrodes crâniennes chez une partie d'entre eux. Le porteur décrit des tests de réaction à des stimuli tactiles ou thermiques provoquant une douleur aiguë, arrêtée dès le retrait de la patte, et un hébergement en cage individuelle jusqu'à quatorze jours pour les rats blessés par leurs congénères. Les animaux porteurs d'implants crâniens et ceux soumis à des inductions répétées sont tués, le porteur estimant qu'un maintien en vie les exposerait à des céphalées récurrentes, tandis que 50 souris et 50 rats sont réutilisés.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique courant et potentiellement invalidant, caractérisé par des crises récurrentes de maux de tête modérés à sévères, souvent accompagnés d'autres symptômes tels que la sensibilité à la lumière, au son et/ou aux odeurs, ainsi que des nausées et des vomissements. Les migraines peuvent être classées en deux principaux sous-types : les migraines avec aura et les migraines sans aura. Les migraines avec aura représentent environ un quart de tous les cas de migraines. L'aura se réfère à une série de symptômes neurologiques qui précèdent habituellement le mal de tête, pouvant inclure des phénomènes visuels tels que des éclairs de lumière, des taches aveugles ou des zigzags lumineux, ou des sensations sensorielles telles que des engourdissements ou des picotements dans les membres. L'aura dure généralement moins d'une heure et précède souvent le mal de tête, bien que parfois elle puisse se produire simultanément avec le mal de tête ou même après. Les migraines sans aura sont beaucoup plus courantes, représentant environ 75 à 85 % de tous les cas de migraines. Contrairement aux migraines avec aura, celles-ci surviennent sans les symptômes neurologiques précurseurs. Les migraines constituent un fardeau significatif pour les individus qui en souffrent, ainsi que pour la société dans son ensemble, en raison de leur prévalence élevée, de leur impact sur la qualité de vie et de leurs coûts économiques associés. Malgré les progrès dans la compréhension de la physiopathologie de la migraine, le développement de thérapies efficaces reste un défi majeur. Dans ce contexte, l'évaluation préclinique d'agents pharmacologiques potentiels est essentielle pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques. Le présent projet vise ainsi à évaluer l'efficacité voire potentiellement la sécurité d'anti-migraineux chez le rongeur, en utilisant des modèles animaux présentant des symptômes typiques de la migraine.
Bénéfices attendus
L'objectif principal est de déterminer si les candidats médicaments sont capables de réduire l'intensité, la fréquence et/ou la durée des crises migraineuses chez le rongeur afin de potentiellement développer de nouveaux traitements plus efficaces contre les différents types de migraine. De plus, cette évaluation permettra de recenser de potentiels effets secondaires de ces traitements, tels que la toxicité et les altérations comportementales. Cette approche préclinique revêt une importance cruciale puisqu'elle permet une évaluation initiale de l'efficacité des anti-migraineux potentiels avant de les tester chez l'homme, réduisant ainsi les risques et dans une moindre mesure les coûts associés au développement clinique. De plus, elle offre la possibilité d'identifier de nouveaux mécanismes thérapeutiques et de comprendre les bases biologiques de la migraine, ce qui pourrait conduire au développement de thérapies plus ciblées et plus efficaces à l'avenir. En résumé, ce projet s'inscrit dans une démarche visant à améliorer la prise en charge de la migraine en identifiant de nouveaux traitements potentiels et en comprenant mieux les mécanismes sous-jacents à cette pathologie. Les résultats obtenus contribueront au développement de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 4 semaines en fonction de la spécificité du traitement), sous anesthésie (quelques minutes) si nécessaire. L'induction de crises migraineuses sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou quelques minutes sous anesthésie) ou par stimulation optogénétique (quelques minutes, sous anesthésie), de manière unique ou répétée (en général, 1 fois/jour ou tous les 2 jours pendant 2 semaines, max 4). Cette induction et éventuellement le placement d'électrodes pour enregistrement d'ondes cérébrales pourra nécessiter une phase chirurgicale (de 30 minutes à 2h si électrodes) sous anesthésie. Dans certains cas, les signaux électriques au niveau cérébral seront mesurés après l'induction de la migraine (en général pendant 1h). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes à 30 minutes pour les tests d'exploration/activité locomotrice) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non).
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte, ou placement dans un dispositif nouveau comportant une zone ouverte ou fortement éclairée) ou du prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Dans les modèles impliquant une chirurgie, il est possible que celle-ci entraîne une douleur post-opératoire au niveau de la peau du crâne (un analgésique est toutefois administré en péri-opératoire). Pour les cas avec implantations d'électrodes chez le rat, ceux-ci seront potentiellement hébergés en cage individuelle en cas de blessure causée par le congénère, ce qui peut entraîner un stress le temps de l'étude (1 à 14 jour en général). Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone cutanée peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal). L'induction de crises migraineuses est supposé entraîner une douleur de type céphalées pour les animaux le jour de test (il n'est pas attendu de crises spontanées).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin d'étude dans les modèles sévères, impliquant à la fois une chirurgie avec placement d'implants crâniens qui ne permettent pas un maintien en vie dans de bonnes conditions. Ils seront également euthanasiés en cas d'induction répétée de crises de migraine et de tests de douleurs, afin déviter tout risque de développement de céphalées récurrentes ou de pathologies associées à un stress chronique. Les animaux ayant reçu un traitement aux effets potentiellement néfastes ou soumis à un prélèvement de sang ou d'organes terminal seront euthanasiés car cela ne permet pas leur maintien en vie dans de bonnes conditions. Les animaux ayant reçu une seule induction de crise migraineuse, ou les animaux Sham (pas d'induction de la migraine), pourront être maintenus en vie, s'ils n'ont pas reçus un traitement induisant des effets néfastes.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier. Les migraines sont des affections complexes impliquant des interactions entre différents systèmes biologiques incluant notamment le système nerveux central et le système vasculaire. Les modèles animaux permettent d'étudier ces interactions multisystémiques dans un contexte physiologique plus réaliste. Les modèles animaux permettent d'évaluer à la fois l'efficacité et, si pertinent, la sécurité des anti-migraineux potentiels à différents niveaux, notamment l'absorption et la distribution du médicament, ainsi que ses effets sur les organes et les systèmes biologiques. Cependant, dans certains cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques (test t de Student, ANOVA one-way) ou non paramétriques (tests de Mann-whitney, Kruskal-Wallis) pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori la catégorie éthique et les méthodes de raffinement, si pertinent. Le cas échéant, pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
Les rats et les souris partagent de nombreuses similitudes physiologiques et génétiques avec les humains, ce qui en fait des modèles animaux pertinents pour évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Des modèles de migraine chez le rat et la souris ont été développés pour reproduire certains aspects de la pathophysiologie de la migraine, tels que l'hypersensibilité à la lumière et au son. Ces modèles permettent d'étudier les mécanismes de la migraine et d'évaluer l'efficacité des traitements anti-migraineux potentiels. Majoritairement à l'âge adulte (au moins 6 semaines après la naissance), mais la migraine pouvant survenir chez des patients jeunes, potentiellement dans certains cas spécifiques des rongeurs plus jeunes (stade post-natal - adolescence) pourraient être utilisés.
Etude de la cicatrisation cutanée au cours du diabète et de l’effet de l’application d’un substitut cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une partie des souris utilisées est immunodéprimée, donc plus exposée aux infections, alors que le protocole leur inflige des plaies ouvertes. 1 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles suivent un régime gras et sucré pour devenir prédiabétiques, subissent une plaie d'excision ou deux plaies de pression de trois heures chacune sous anesthésie, un débridement, la greffe d'un substitut cutané humain et des tests répétés de tolérance au glucose avec incision de la queue, chacune finissant isolée en cage individuelle pour que ses plaies ne soient pas aggravées. Le porteur attend de cette durée d'expérimentation des signes excessifs d'agressivité, des griffures, de l'apathie ou de la prostration, et la mise à mort intervient pour prélever la peau totale du dos.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension de l’intégration de cellules humaines dans la problématique des plaies chroniques non cicatrisantes afin de déterminer la contribution des cellules du donneur versus hôte dans la régénération tissulaire. Les plaies chroniques sont des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques, qui persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque pouvant entraîner de graves complications voire un décès. La thérapie locale des ulcères du pied repose principalement sur le débridement de la plaie et la protection des plaies à l’aide de pansements mais la cicatrisation reste longue et peut échouer. Il y a une urgente nécessité à trouver de nouveaux traitements et augmenter la compréhension du défaut de cicatrisation. Les études d’efficacités des pansements et peaux artificielles incluant des cellules sont principalement effectuées sur des animaux sains avec quelques études sur des animaux pathologiques et exclusivement réalisées sur des plaies aigues de type coupure. Toutefois, la peau d’un patient diabétique ou d’un sujet sain sont différentes, de même qu’une plaie liée à la gravité par application de la pression du corps est très différente d’une coupure. L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle d’une peau artificielle humaine dans l’amélioration significative de la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après coupure et application de pression chez des souris non et pré- diabétiques, mâles et femelles.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de contribution des cellules du donneur versus hôte dans la formation du nouveau tissu permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de cicatrisation qui peuvent affecter les patients diabétiques et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime hypercalorique riche en graisse et sucre, associé ou non à des injections (x5, 3sec/injection – 20 sec/ contention) afin d’induire un pré-diabète. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à une plaie d’excision (1 en 1 min) ou deux plaies de pression (2x 3h), associé ou non à la greffe d’un substitut cutané. Il existe une répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de pression, le débridement des plaies (10min) et le suivi des plaies par photo (5min). La détermination du temps de régime hypercalorique nécessaire pour induire un prédiabète nécessite la répétition de tests de tolérance au glucose et de tests de sensibilité à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline nécessitent une seule incision (2 sec) de la queue pour chaque test. Pour les souris poilues, une crème dépilatoire VEET sera utilisée (appliquez 30 sec et bien rincé à l’eau claire avec compresse stérile)
Impact sur les animaux
Les souris immunodéprimées sont sujettes à plus d’infection. La génération de la plaie et le débridement peuvent engendrer une douleur. La durée des expérimentations peut engendrer des signes excessifs d’agressivité et l’apparition d’irritations ou de griffures cutanées ou l’apparition d’apathie, de prostration ou d’immobilité. La mise en cage isolée des souris pour préserver les plaies induites et ne pas avoir de sur-blessure peut engendrer une perte d’interaction, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Une douleur transitoire peut être associé aux injections répétées.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus. MODIFICATION du 16/04/2024 : mises à mort par la méthode réglementaire pour prélèvements de peau totale du dos. Pour les souris avec plaie, mise à mort par injection d’euthasol ou induction en cage à CO².
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime enrichi en sucre/gras), et l’effet de la pose d’un substitut cutané sur les blessures, notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1592 incluant les 2 sexes, la réalisation d’expérimentation se fera par salves. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Les animaux ayant été utilisés pour la première partie du projet et répondant à nos attentes pourront être réutilisés pour la suite du projet, dans un objectif de réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Des croquettes mouillées au sol et/ ou gel nutritifs pourront être ajouté à la cage si les souris présentent une difficulté à se déplacer et/ ou se mettre debout ou si il n’y a pas de prise de poids. Toutes les anesthésies seront gazeuses Des analgésiques seront administrés 30 min avant l’acte chirurgical, puis 6-8h après et enfin 24h après l’acte chirurgical. L’hébergement et les instruments utilisés sont stériles, et les cages sont chauffées après les chirurgies via des pads chauffants disposés sous les cages, pour aider le réveil des animaux. Une fois les animaux isolés seul par cage, il y a l’ajout d’une maison carton comme nouvel enrichissement.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie et une organisation cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier l’induction des plaies et les processus de cicatrisation, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 3 semaines pour débuter les régimes hypercaloriques et pour que les souris soient sexuellement matures au moment de l’induction des plaies. Excepté pour les souris NSG qui auront 6 semaines d’âge au moment de la greffe de peau humaine.
Etude des conséquences du diabète sur la réactivité vasculaire chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris engagées dans la procédure sont gavées et pesées chaque jour pendant 42 jours, après une biopsie de la queue et un transfert entre deux établissements. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le modèle repose sur des animaux rendus diabétiques et obèses, qui peuvent développer une cardiopathie et des irritations cutanées, et qui urinent assez pour imposer de limiter les cages à deux individus et de les changer plus souvent. Quarante souris seulement entrent dans la procédure et voient leurs organes prélevés, les autres, dépourvues de la mutation recherchée, étant tuées sans y avoir été soumises.
Objectifs
Le diabète est la quatrième cause de décès dans la majorité des pays développés, notamment par suite de maladies cardiaques et d'accident vasculaire cérébral. Dans ces pays, le diabète est aussi la principale cause de cécité, d'amputation des membres inférieurs et d'insuffisance rénale. La dysfonction endothéliale est un marqueur précoce du développement de la pathologie métabolique et du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction doit par conséquent être évaluée tôt dans l’histoire naturelle du diabète. Les stimuli à l’origine des lésions des vaisseaux sanguins induites au cours du diabète ne sont pas complètement connus. L'objectif principal est d'identifier si la modulation pharmacologique de certains mécanismes d'atteinte délétère des vaisseaux sanguins permettrait de limiter les lésions des vaisseaux sanguins au cours du diabète. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs, EU1 qui élèvera les animaux et EU2 qui fera les analyses fonctionnelles sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la dysfonction endothéliale dans le diabète et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des complications vasculaires du diabète.
Procédures
Biopsie à la queue (EU1, 1 fois 10 secondes), préhensions quotidiennes et gavage (EU1 et EU2, 42 fois 1 minute), pesées quotidiennes (EU1 et EU2, 42 fois 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effet indésirable lié au modèle de diabète et d'obésité: cardiopathie, irritation cutanée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort. Les 40 utilisés dans la procédure verront leurs organes prélevés pour analyse. Les animaux qui n'ont pas la mutation d'intérêt seront également mis à mort.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). Ici nous étudions les propriétés de vasoconstriction et vasodilatation des artères en réponse à différents signaux moléculaires et mécaniques. Ces propriétés des vaisseaux sont essentielles pour assurer le bon fonctionnement des organes. Elles dépendent des différents types cellulaires qui composent les artères et également des molécules sécrétées par différets organes de l'organisme. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur un logiciel en ligne et donnait 8 animaux par groupe requis. 2 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental et des analyses post-mortem. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. animaux utilisés du sevrage (identification) à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.
Étude fonctionnelle de protéines associées à l’ADN au cours de la reproduction
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale est immédiatement mise à mort, comme tout animal dont le score de bien-être ne s'améliore pas après 48 heures ou qui perd plus de 20 % de son poids. 476 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. 120 femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales espacées de 48 heures pour déclencher une sur-ovulation, puis sont mises à mort entre 12 heures et 4 jours plus tard, dans une étude sur des variantes d'histones propres aux cellules reproductrices. Les autres sont tuées au titre de l'entretien de la colonie, parce que leur génotype ne sert pas au projet ou qu'elles ont dépassé douze mois, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de leur éviter les complications de santé liées à l'âge.
Objectifs
L’information génétique transmise par les gamètes est compactée en fibre de chromatine dont l’unité de base se compose de protéines appelées histones. Les cellules reproductrices présentent la particularité́ d’utiliser des variantes d’histones qui ne sont pas trouvées dans les tissus somatiques et sont uniques à chaque espèce. Ces variantes sont parfois induites de manière aberrante dans des cancers humains. Que ce soit au cours de la reproduction ou dans un contexte pathologique, les fonctions de ces histones restent, à ce jour, peu connues. Ces histones se trouvant exclusivement sur le chromosome X des mammifères, l’étude de leurs fonctions in vivo nécessite une approche en modèles murins. Il existe des modèles de souris mutantes déficitaires pour ces histones et des travaux antérieurs ont montré que les mâles mutants présentaient une sous-fertilité et que 10 % des embryons succombaient in utero post-implantation. Ce projet, a pour but d’identifier les conséquences de la perte de ces histones sur la structure de la chromatine des cellules reproductrices ainsi que leurs rôles au cours du développement embryonnaire précoce. Enfin, il n’existe pas d’anticorps permettant de purifier ces histones dans leurs contextes natifs, et ce projet propose de produire de nouveaux modèles de souris permettant de les identifier in vivo. Dans son ensemble, ce projet permettra de comprendre de nouveaux mécanismes mis en jeu lors de la reproduction. L’identification des fonctions de ces variantes d’histones ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques aussi bien ciblant certains cancers que combattant des infertilités.
Bénéfices attendus
Les modèles murins de ce projet ont pour but d’identifier de nouveaux processus contribuant à l’hérédité durant la reproduction. Ils présentent donc un bénéfice pour la compréhension fondamentale de ce processus. Les histones étudiées étant aussi présentes chez l’homme, ce projet contribuera à notre compréhension de la fertilité humaine. Enfin, ces variantes étaient induites de manière ectopique dans de nombreux cancers, leur caractérisation fonctionnelle ouvrira la voie vers de nouvelles routes thérapeutiques.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à deux injections intra-péritonéales durant chacune moins de 5 secondes et espacées de 48h afin de stimuler l’ovulation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont : du stress et de l’angoisse de courte durée (moins de 2 minutes), et une douleur légère et transitoire, de quelques secondes, lors des injections intrapéritonéales. Bien qu'aucun phénotype dommageable n’ait été observé sur les lignées existantes, l'établissement des nouvelles lignées pourrait entrainer une baisse transitoire des performances reproductives chez les mâles.
Devenir
Pour la collecte de tissus, les procédures s’effectuent post-mortem. Pour le maintien de la colonie, le sort prévu est l'euthanasie pour les génotypes non-utilisés ainsi que pour les animaux au-delà de 12 mois. Ceci permet de minimiser le stress dû à l'élevage et d'éviter les complications de santé pouvant apparaître avec l’âge. Les 120 femelles soumises à la sur-ovulation sont euthanasiées entre 12h et 4 jours suivant les injections.
Remplacement
L’expression des gènes étudiés est limitée aux cellules reproductrices, y compris chez l’Homme. Actuellement, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire de remplacement. Les effets de ces gènes sont mesurables sur l’embryon avant l’implantation, le recours à un mammifère placentaire est donc nécessaire. La souris présente une bonne traçabilité génétique et il existe des approches génétiques déjà établies. Date de recherche de méthodes de remplacement sur base de données : 01/01/2024.
Réduction
La stratégie expérimentale choisie afin de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet est la suivante : 1) Minimisation de l’élevage par des schémas de croisements qui permettent de générer une partie des animaux contrôles et tests dans la même portée. Les estimations du nombre de cages de croisement prennent aussi en compte une portée moyenne de 8 animaux tous les mois 2) La stratégie expérimentale de collecte de tissus post-mortem permet de prélever plusieurs tissus sur un même individu. Les estimations prennent aussi en compte le fait que plusieurs types de mesures (protéines, ARN, ADN…) peuvent être effectués sur 3 à 5 échantillons de tissus (testicules, épididymes, foie…), ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
La stratégie mise en œuvre pour réduire l’angoisse et la douleur induite est la suivante : 1) Utilisation du fond génétique qui présente peu de maladies spontanées et est bien adapté à l’élevage en laboratoire dans un contexte de recherche scientifique. Toutes les souris (maintenance et groupes expérimentaux) seront maintenues dans des cages avec milieu enrichi (matériel de nidification et tunnel de carton). Les lignées mutantes pour les histones étudiées présentent une légère diminution de fertilité, mais pas d’autres phénotypes dommageables à la survie et au confort des animaux en laboratoire. Ces animaux sont suivis de manière journalière. Les phénotypes des animaux produits dans ce projet n’ont pas encore été caractérisés et leur bien-être suivra une procédure d’évaluation accrue (grille d’évaluation sur deux générations) afin de déterminer s’ils présentent un phénotype dommageable. 2) Tous les tests s’effectuent post-mortem sur tissus, cellules ou embryons pré-implantatoires. 3) Afin de minimiser l’angoisse, l’ensemble de nos animaux sera surveillé chaque jour pour détecter tout signe de mal-être. Quatre indicateurs sont utilisés : - Posture et activité exploratoire dans la cage - Comportement naturel - Réponse à des stimuli extérieurs - Anomalie liée à la mise-bas chez les femelles gestantes. Tout individu présentant un signe de mal-être lors de ces surveillances fera l’objet d’une surveillance renforcée pendant 48h (voir point suivant). 4) La surveillance renforcée consiste en un suivi par grille d’évaluation du bien-être pendant 48h. Pour chacun de ces indicateurs, un score est déterminé par vérification visuelle et par manipulation. Un animal présentant un score entre 5 et 9 sera pesé. L’animal sera euthanasié si aucune amélioration du score n’est observée ou s’il présente une perte de poids supérieure à 20 % après 48h. Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale sera immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser la souris répond aux critères de fertilité́ et de temps de génération requis pour une étude expérimentale en laboratoire. De plus, ces études nécessitent un modèle placentaire possédant tout le complément de gènes présents chez l’homme. Enfin, nous disposons d’outils génétiques chez la souris qui ne sont pas disponibles pour d’autres organismes modèles Pour les croisements ainsi que la collecte de tissus reproductifs matures post-mortem des animaux à maturité sexuelle sont utilisés – c’est à dire après leur sevrage et jusqu'à un an d’âge. Pour les études préimplantatoires, des stades de développement précédant et suivant l’activation du génome zygotique de 0,5 à 4,5 jours post-fécondation sont étudiés.