Souris

Pour étudier le rôle de gènes du métabolisme, 900 souris, dont des souris génétiquement privées d'un gène et nourries ou non d'un régime enrichi en graisses ou en sucre, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes. Pour les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline, les souris reçoivent un gavage de sucre ou une injection d'insuline et restent environ trois heures dans un tube de contention, le temps de cinq prélèvements de sang à la queue. Elles passent aussi 72 heures isolées pour une mesure de calorimétrie, et ces séries peuvent être répétées trois fois en 20 à 30 semaines, avec une évaluation cardiaque sous anesthésie dans certaines études et, depuis un amendement, l'injection d'un colorant dans la veine sous anesthésie terminale. Le régime enrichi fait prendre du poids et peut provoquer des lésions de la peau liées à un toilettage excessif, que le porteur dit traitées localement et vite résolues. Les éventuels médicaments chez l'humain sont renvoyés à plus long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de gènes potentiellement impliqués dans la régulation du métabolisme chez les mammifères. Chaque projet se focalisera sur un gène d'interêt disposant d'éléments de la littérature justifiant son analyse dans un modèle physiologique complet. Afin de déterminer ce rôle, nous disposons du modèle Souris qui permet des modifications génétiques capables d'annuler la présence de ce gène chez l'animal. En retirant le gène de l'organisme, nous pouvons ainsi étudier comment les réponses à différentes variables métaboliques sont impactées. Ainsi, nous souhaitons comparer des souris contrôles à des souris génétiquement modifiées pour un gène, en présence ou non d'un régime enrichi en graisses et/ou en sucre, selon les mécanismes d'actions supposés du gène ciblé. Le facteur sexe pourra aussi être étudié, selon le gène cible. La mise en place d'une obésité ou d'une affection du foie liée à ce régime enrichi sera suivie par différentes analyses au cours du temps, et les données générées permettront de déterminer l'impact de la modification génétique dans ce cadre. Pour chaque gène analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 9 animaux pour chaque condition, soit 36 animaux par gène étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 36 animaux * 5 projets * 5 ans, soit 900 souris au maximum. Chaque projet contiendra 4 groupes expérimentaux de 9 animaux : Deux schémas expérimentaux sont ainsi possibles : 1) étude de l'effet de la diète, en se focalisant sur un seul genre male ou femelle controle avec une diète classique / controle avec une diète enrichie / animal mutant avec diète classique / animal mutant avec une diète enrichie 2) étude de l'effet du genre : controle male avec une diète enrichie / controle femelle avec une diète enrichie / animal mutant male avec une diète enrichie / animal mutant femelle avec une diète enrichie. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de progresser dans la connaissance que nous avons sur les gènes étudiés, en recherche préclinique. Les données générées nous permettront de mettre en évidence des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies liées à la régulation de la glycémie (diabete) et de l'obésité ainsi qu'aux comorbidités cardiaques. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicament chez l'Homme.

Procédures

Durant ce protocole, des cohortes de 36 animaux suivront une série de protocoles qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un test de tolérance au glucose, dans lequel l'animal reçoit un gavage de sucrose suivi de 5 prélevement d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes) ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un test de sensibilité à l'insuline sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie (chaque acte durant environ 30 secondes). Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contension afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 72h, ce qui peut être un stress d'isolement. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. Enfin, des prélevements sanguins seront effectués pour suivre l'évolution des paramètres biochimiques. Ces prélevements se font en quelques minutes. Là encore, nous définissons des volumes réduits pour éviter un impact sur le bien-être des animaux. Et une durée de récupération d'au moins deux semaines est appliquée après un prélevement sanguin. L'ensemble des ces procédures expérimentales pourront être répétées au maximum trois fois durant la durée du protocole durant les 20 à 30 semaines de durée du protocole, en espacant chaque geste pour éviter un stress cumulatif et donc un effet négatif sur l'animal. Dans certaines études, une analyse de la fonction cardiaque sera associée à l'analyse du métabolisme, pour comprendre les interactions entre ces deux aires qui sont souvent impliquées au niveau des comorbidités. Cette évaluation cardiaque pourra être effectuée deux fois au maximum et implique une anesthésie gazeuse de 30 minutes environ. L'ensemble du protocole sera réalisé environ 5 fois par an sur des lignées différentes durant une période de 5 ans (soit un total maximal théorique de 900 animaux) Amendement: Pour tester la fuite vasculaire une l'injection en intra-veineuse d'un colorant, sous anestésie gazeuse terminale, sera réalisée.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux subiront des prélevements sanguins, des mesures de la glycémie et de la sensibilité à l'insuline. Dans ce cadre, ils seront immobilisés durant quelques heures et prelevés de gouttes de sang. Durant la mesure de calorimétrie, les animaux seront isolés durant 72h ce qui peut créer un stress temporaire d'isolement. Les animaux prendront du poids du fait du régime enrichi, ce régime peut apporter aussi des lésions cutanées qui sont liées à un hypertoilettage des animaux. Ces lésions sont traitées localement et se résolvent rapidement. Si la fonction cardiaque est évaluée, les animaux seront anesthésiés durant environ 30 minutes et de fines électrodes seront piquées en surface de la peau des pattes pour obtenir le signal électrique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés histologiquement afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation sur les organes.

Remplacement

Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification génétique d'un gène sur des fonctions métaboliques complexes. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (homéostasie glucidique et lipidique et fonction cardiaque). Il n'existe actuellement pas de méthode alternative pour modéliser les analyses effectuées dans ce projet. Le modèle Souris nous permet d'accéder à une première approche de ces phénomènes physiologiques complexes afin de comprendre comment ceux-ci se transposent chez l'Homme. Par ailleurs, il permet des modifications génétiques ce qui facilite la compréhension du rôle des différents gènes que nous prévoyons d'étudier.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été determiné au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données paramétriques (poids, glycémie, paramètres sanguins, consommation d'oxygène, paramètres cardiaques) qui seront analysées à l'aide d'analyses de variances à deux facteurs, répétées pour les mesures ayant lieu dans le temps (suivi du poids ou de la glycémie). Nous avons aussi conçu notre protocole afin d'utiliser une seul cohorte d'animaux qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible les animaux employés pour répondre à notre problématique scientifique.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Durant les prélevements sanguins, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. Par ailleurs, nous nous efforcerons de fournir les meilleurs conditions d'hébergement possible avec la présence d'un enrichissement. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée, et adpatée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques..)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous disposons justement de modèles d'intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes d'intérêt. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux démarreront leur protocole en tant que jeune adulte, à partir de 6 semaines. A ce stade, ils ont déjà une régulation métabolique qui est mise en place.

Tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 66 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est maintenue éveillée dans un tube de contention pendant l'irradiation de la patte, l'autre reçoit la même irradiation sous vingt minutes d'anesthésie, l'objectif déclaré étant de vérifier si l'effet protecteur de la radiothérapie FLASH tient encore chez un animal conscient, comme le sont les patients. Suivent trois mois d'observation, avec douleur à la patte, perte de poids et baisse de mobilité pendant trois à cinq jours, puis dépilations, croûtes et parfois ulcérations au point d'irradiation. Le porteur affirme que les mécanismes inflammatoires et vasculaires ne s'étudient que dans un "organisme vivant intégré" et conclut qu'il lui est "indispensable" de développer des modèles animaux.

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Au moins 50% des patients atteints d’un cancer sont traités par radiothérapie durant leur maladie. Le principal défi de la radiothérapie est de parvenir à déposer une dose curative dans la tumeur tout en s’assurant que les tissus sains environnants soient préservés dans leur intégrité. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes utilisant de nouvelles modalités de traitement qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale et une activation efficace du système immunitaire chez des rongeurs. Il s’agit de la thérapie FLASH, qui utilise un fort débit de la dose, ca veut dire les temps d’irradiation sont très courts (< 1 ms) Nous cherchons à améliorer encore la compréhension et utilisation optimale de ce techniques innovantes qui utilisent un fort débit de la dose. Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur . En particulier, l’objectif est de comprendre si la diminution d’oxygénation des tissus irradiés liée à l’anesthésie impacte ou non l’effet de l’irradiation des tissus environnants et évaluer la pertinence du modèle d’irradiation chez l’animal anesthésié alors qu’en clinique l’irradiation est faite sur patient vigile. Il est donc pertinent de réaliser une expérience avec des animaux éveillés afin de vérifier si l’effet FLASH se maintient ou pas du tout dans des conditions de traitement réalistes.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques dans des conditions réalistes qui aideront a établir ou dessiner des essais cliniques de façon moins risquée et qui pourront bénéficier à des patients qui actuellement reçoivent un traitement seulement palliatif et pour lesquels les conséquences sur les tissus sains sont très impactantes pour leur qualité de vie et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer l’utilisation de la radiothérapie FLASH et les protocoles de patients futurs

Procédures

Dans un premier groupe, les animaux vigiles seront maintenus en contention en vue d’être irradiés au niveau de la patte (durée du geste inférieure à 3 minutes). Dans un second groupe, les animaux anesthésiés seront irradiés au niveau de la patte (durée de l’anesthésie : 20 minutes). Les deux groupes seront ensuite suivis pendant 3 mois pour évaluer les effets de l’irradiation sur la peau (contrôle visuel).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être (douleur à la patte irradiée)peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids transitoire et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours . Les souris seront maintenues dans un tube de contention adapté à l’irradiation de la patte (quelques secondes),

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains. De même, les mécanismes inflammatoires et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Il est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé à l'aide d'outils statistiques pour utiliser le moins d'animaux possibles tout en obtenant des résultats significatifs.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des souris sera mise en place avant toute expérimentation : les souris seront manipulées quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Les souris seront habituées au tube de contention dès la fin de leur acclimatation à leur nouvel hébergement. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons quotidiennement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de la procédure). Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème apaisante-cicatrisante et des antalgiques seront administrés sur la peau pour permettre la cicatrisation (au minimum 1 semaine, application quotidienne). En cas d’atteinte d’un point limite, conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. De plus le modèle utilisé est pertinent pour une translation clinique future des résultats. Si l’anesthésie induit une perte d’effet FLASH, son utilisation sera déconseillée pour les futurs patients. Le modèle de souris est parfaitement adapté pour répondre à cette question. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 8-10 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

Greffées sous la peau avec des cellules tumorales, tondues au flanc, pesées jusqu'à sept fois par semaine, 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Aucun médicament n'est évalué à ce stade. Le travail consiste à caler les conditions de greffe, lignée tumorale par lignée tumorale : taille de la tumeur, vitesse de croissance, moment où le traitement pourra commencer. Ces modèles serviront ensuite à tester des radiopharmaceutiques fournis par les clients du laboratoire, et le porteur précise qu'un modèle n'est monté que si le client ne le maîtrise pas déjà en interne.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapie innovantes et évaluer leur efficacité. L’utilisation de radiopharmaceutiques (molécules ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Une des approches de notre laboratoire est de caractériser la distribution tissulaire et sanguine, l’élimination de molécules fournies par nos clients dans le contexte de tumeurs sous cutanées. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L'approche suivante est de quantifier l’efficacité thérapeutique de molécules fournies par nos clients couplées à différents radioéléments (=élément radioactif) pour le traitement de différents modèles tumoraux greffés chez la souris en sous-cutanée et ainsi d’évaluer le retard de croissance tumorale ou sa régression. Ces molécules (=radiopharmaceutiques = molécules couplées à un élément radioactif) doivent viser spécifiquement les cellules tumorales pour permettre au radioélément d’y accéder. C’est le rayonnement ionisant de ces derniers qui doit aboutir à la destruction des cellules tumorales. L’objectif spécifique de ce projet est donc de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début de traitement à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne les maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué.

Bénéfices attendus

Le cancer est une des principales causes de mortalité dans le monde. Malgré de nombreuses avancées, le besoin en thérapies innovantes reste majeur. L’utilisation de radiopharmaceutiques (ciblant les cellules cancéreuses et entrainant ainso leur destruction par émission de rayonnement ionisant) est une nouvelle approche thérapeutique prometteuse. Ce projet permettra donc de déterminer les conditions optimales de greffes de tumeurs et leurs caractéristiques de croissance tumorale afin de disposer de modèles fiables et robustes utilisables pour la sélection de candidats médicaments aussi bien pour étudier leur biodistribution dans le cadre de souris porteuses de tumeurs sous-cutanées que pour évaluer l'efficacité thérapeutique de candidats médicaments (radiopharmaceutiques).

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 secondes) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 secondes) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 secondes)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous-cutanées ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; douleur légère liée à la pousse tumorale

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organes ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude

Remplacement

Evaluer l’efficacité de molécules couplées à des radioéléments nécessite d’être en présence d’un système biologique complexe. En effet, il est nécessaire dans le cadre de notre projet de vérifier que le candidat cible les cellules tumorales et de suivre son évolution dans d’autres tissus où il n’est pas souhaitable qu’il soit en trop grande quantité. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser un modèle tumoral maîtrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie par implantation de cellules tumorales chez la souris. Il n’est donc pas possible aujourd’hui de faire ce suivi in vitro et l’animal reste encore le modèle le plus fin et le plus pertinent pour ce type de traitement.

Réduction

En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10 souris maximum par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité du succès de l’induction et de la croissance tumorale. Les études menées dans le cadre de ce projet permettront ainsi de déterminer les conditions optimales de greffe de tumeur, leurs caractéristiques de croissance tumorale ainsi que les fenêtres de début des traitements à mettre en œuvre pour chacune des lignées tumorales qui constitueront nos modèles d’études. Ces modèles ne sont mis en oeuvre que quand le client dispose d'un traitement le visant spécifiquement et uniquement si notre client ne le maîtrise pas déjà en interne auquel cas, un simple transfert de technologie est effectué

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies anti-cancéreuses. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Les souris utilisées ici sont immunodéprimées par construction, seule condition pour que des tumeurs humaines prélevées sur des patients puissent pousser dans leur corps. 6 220 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une durée pouvant atteindre huit mois par animal. Les greffes se font sous la peau, dans l'os par injection intra-osseuse, ou dans la capsule du rein après ouverture chirurgicale, et une partie des souris est castrée pour les cancers hormono-dépendants. Toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus, quatre souris étant greffées par prélèvement de patient afin de compenser un taux de prise que le porteur situe entre 30 et 35 %.

Objectifs

Le développement des modèles proposés dans ce projet va nous aider à mieux comprendre pourquoi certains traitements contre le cancer échouent chez les patients. Dans notre équipe, nous utilisons des techniques de pointe pour étudier ces mécanismes sur des modèles de souris, qui portent des tumeurs humaines. Lorsque nous ne pouvons pas réaliser ces analyses directement sur les patients, nous utilisons les données obtenues à partir de ces modèles. Ensuite, nous développons des cultures de cellules ou des mini-organes à partir de ces tumeurs pour des études plus poussées. Ces recherches nous permettent de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Cela peut aider à améliorer les soins pour les patients atteints de cancer

Bénéfices attendus

Nos modèles seront disponibles pour d'autres chercheurs, ce qui leur permet de tester de nouvelles idées pour traiter le cancer. Par exemple, nous avons pu valider de nouveaux médicaments qui ont ensuite été testés chez des patients. En résumé, notre travail sur ces modèles nous aide à comprendre et à vaincre la résistance aux traitements du cancer, ce qui pourra conduire à de meilleurs traitements pour les patients dans le futur.

Procédures

Chirurgies : Greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale, une seule, durée 15 minutes. Castration des souris, une seule, durée 5 minutes sous anesthésie générale. La majorité des modèles seront établis par injection sous-cutanée, sauf pour les échantillons osseux qui seront greffés dans l'os. Injection sous-cutanée, durée 2 minutes, sous anesthésie générale, nombre de 1 à 2. Injections intra-osseuses : durée 8 minutes, une seule sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie gazeuse dans des conditions stériles. La greffe dans la capsule sous-rénale sous anesthésie générale peut causer un stress et une douleur légère, mais ces effets sont temporaires et sont atténués par l'anesthésie et des analgésiques. Castration des souris : pratiquée uniquement pour certains types de cancers, cette chirurgie brève sous anesthésie générale peut causer une douleur légère, atténuée par des analgésiques. Injections sous-cutanées ou injection de cellules: pratiquées sur la majorité des souris, cette méthode est la moins invasive. Les effets sont temporaires, légers et sont atténués par l'anesthésie et par des analgésiques. Greffe intra-osseuse : réalisée sur des échantillons osseux pour reproduire l'environnement tumoral. Elle peut causer une douleur modérée, elle sera faite sous anesthésie suivie d'un traitement analgésique et d'une alimentation adaptée.

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour études sur les tissus et organes des animaux (anatomie pathologique, biochimie, métabolomique, protéomique, génomique).

Remplacement

La complexité biologique des organismes vivants est extrêmement élevée, et les interactions entre différents systèmes biologiques peuvent être difficiles à reproduire en dehors d'un organisme vivant. Les modèles animaux peuvent fournir des informations cruciales sur la physiologie, la pathologie et les mécanismes de la maladie qui ne peuvent pas être obtenues par d'autres moyens. De plus, ils peuvent souvent mieux représenter les processus biologiques humains que les modèles cellulaires ou informatiques. Pour l'étude en cours, l'organisme entier est indispensable pour récapituler les communications humorales et cellulaires du micro-environnement tumoral avec le reste des effecteurs de l'immunité, les organoïdes ou d'autres systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D ainsi que les systèmes de modélisation mathématique et informatique ne sont pas adéquats.

Réduction

En parallèle du développement de modèles de tumeurs dérivées de patients, et afin de réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation, nous développons des organoïdes et des lignées cellulaires. Ces modèles in vitro permettent des études mécanistiques et un large criblage de médicaments, limitant ainsi l'utilisation d'animaux en validant les résultats in vitro avec des modèles plus proches de la biologie humaine. Étant donné que le matériel provient de biopsies, nous greffons 4 souris par prélèvement, ce qui est très peu mais suffisant pour obtenir un modèle selon nos données antérieures indiquant un taux de prise de 30-35 % lors de la primo-implantation. L'utilisation de 4 souris assure une quantité adéquate de matériel pour caractériser et préserver les tumeurs . Le nombre d'animaux prévu au projet est un nombre maximal qui va dépendre du nombre de tumeurs de patients accessibles sur la durée du projet.

Raffinement

Après l'arrivée des souris, nous les laisserons une semaine en acclimatation pour qu'elles s'habituent à leur nouvel environnement. Pendant les opérations chirurgicales comme les greffes sous-cutanées, l'ajout de pellets de testostérone, ou les greffes dans la capsule sous-rénale et dans les os, les souris sont anesthésiées par anesthésie générale et reçoivent un médicament contre la douleur. L'examen clinique est quotidien. Cette observation permet de vérifier si l’animal est en bonne santé, sa posture, son comportement afin de déceler tout signe de détresse. Pour les animaux avec une greffe dans la capsule rénale, une délicate palpation deux fois par semaine est réalisée au niveau du rein. Les animaux avec greffe osseuse sont suivis en vérifiant régulièrement leur état ainsi qu’en procédant à une palpation de la greffe au niveau de l’os en mesurant la largeur de l’os. Des points lmites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris participant à l'étude restent pendant au maximum 8 mois. Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental (maisons, tunnels, sizzlenests) et de matériaux pour construire un nid. Cette optimisation des conditions de vie permet aux animaux de s’exprimer, de se sociabiliser, de s’adapter à leur nouvel environnement mais aussi d’être moins stressés en restant actifs.

Choix des espèces

L'utilisation de souris est justifiée: par l'état de l'art des modèles murins pour le développement préclinique en oncologie et par la nécessité d’utilisation de modèles immunodéprimés afin de permettre la croissance tumorale de tumeurs humaines. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Injectées dans la peau avec des cellules cancéreuses, puis anesthésiées pour recevoir des anticorps radiomarqués par voie intraveineuse, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La prise de sang finale se fait dans le thorax, sur animal anesthésié et sans réveil, et les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et des troubles fonctionnels qui figurent parmi les points limites. Il s'agit de mesurer où se fixent des anticorps radioactifs dans l'organisme, pour développer un outil de diagnostic du mélanome par imagerie TEP. Le porteur annonce que tous les animaux seront tués à l'issue de chaque procédure, puis écrit quelques lignes plus loin que les souris saines seront conservées, si possible, pour d'autres manipulations.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic et le suivi de pathologies tumorales, telles que le mélanome. L’arrivée des nouveaux anticorps thérapeutiques sur le marché, tels que les inhibiteurs de checkpoint immunitaire (ICI), notamment les anti-PD-1 et anti-CTLA_4, nécessite de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer. En effet, les anticorps, de par leur spécificité, peuvent être utilisés en thérapie et en diagnostic ce qui en fait des candidats prometteurs pour la théragnostic. La variabilité de la réponse des patients à l’immunothérapie, malgré une analyse préalable de leur marqueur sanguin ou de leur biopsie, démontre la nécessité de développer ces outils théragnostiques. Nous proposons de développer et valider des radiotraceurs permettant un diagnostic précoce et un suivi de la réponse thérapeutique par imagerie nucléaire.Des études de biodistribution après administration intraveineuse seront réalisées sur les radiotraceurs d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques d’intérêt. Les études précliniques se dérouleront en 2 phases : études par imagerie de Tomographie par Emission de Positons (TEP) et études post-mortem sur les organes d’intérêt. Ces études seront réalisées avec l'aide des modèles de cancers pertinents. Face à l’hétérogénéité des cancers et des mécanismes immunitaires, il est nécessaire de travailler sur plusieurs modèles murins pour ce projet. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les études précliniques par imagerie TEP et par études post-mortem permettront d’étudier la biodistribution des anticorps thérapeutiques radiomarqués d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques. Ainsi nous pourrons évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic de pathologies tumorales, telles que le mélanome. Cette étude préclinique permettra de pouvoir évaluer par la suite nos anticorps radiomarqués chez l’homme afin de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer.

Procédures

Les animaux seront soumis à une induction des tumeurs par injection intradermique de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales de traitement, basé sur des anticorps. Quel que soit le modèle, l’administration du radiotraceur, sous anesthésie à l’isoflurane, par voie intraveineuse. Prélèvement sanguin transthoracique terminal réalisé sur l’animal anesthésié sans réveil. L’établissement des tumeurs avant immunoTEP sera réalisé dans l’EU1. Toutes les sessions d’ImmunoTEP seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

L’injection d’anticorps radiomarqués n’influera pas sur l’état de l’animal. Les quantités injectées d’anticorps sont à doses traceuses, c’est-à-dire inférieure à la dose nécessaire à un possible effet thérapeutique. Quant au radioélément, il n’influera pas sur l’état de santé de l’animal car les activités administrées restent faibles et il s’agit de radioéléments émetteurs béta+ à usage diagnostic. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les conditions d’hébergement seront optimisées par ajout d’enrichissement adapté pour assurer le bien-être des animaux. L’induction de modèles tumoraux peut entrainer une perte de poids de l’animal qui sera surveillée et qui fait partie des points limites. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal (points limites). Une observation visuelle quotidienne des animaux pour l’apparition des signes de douleurs sera faite par l’expérimentateur et le personnel animalier. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, décrit dans les points limites des procédures, sera exclu de l’étude et mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque procédure. La procédure d’étude de biodistribution des anticorps radiomarqués permettra de sélectionner les temps pertinents pour l’étude post mortem. Le protocole sera optimisé afin coïncider l’euthanasie des animaux avec l’étude post mortem. Les animaux malades ne peuvent pas être gardés et l’euthanasie est nécessaire au vu des modèles de maladie induits. Pour les animaux sains, si cela est possible, ils seront conservés pour d’autres manipulations afin de réduire au maximum le nombre d’individus nécessaires.

Remplacement

Une étude préalable in vitro des anticorps radiomarqués a été préalablement effectué pour vérifier l’intérêt des anticorps avant l’injection chez l’animal. Il a été testé la stabilité in vitro, l’affinité et l’immunoréactivité des anticorps radiomarqués sur un modèle cellulaire adapté. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

Une étude complète de la littérature a été effectuée pour ne pas reproduire des expériences. Nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats et limiter le nombre d’expériences. Par ailleurs, le suivi longitudinal des animaux sur 24 à 170h permis par l’imagerie non invasive TEP permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux impliqués dans l’études par comparaison avec la méthode plus classique de biodistribution ex vivo qui nécessiterait la mise à mort de lots d’animaux à chaque temps d’observation.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la souffrance et au stress des animaux ainsi qu’à anticiper l’atteinte des points limites. Le suivi de l’état général des souris sera effectué quotidiennement par le porteur de projet et le personnel. Pour diminuer la souffrance liée au procédures expérimentales et au développement du cancer, un traitement analgésique en locale (lidocaïne). L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations comportementales. Si un changement chez l’animal traduit un point limite, l’animal sera mis à mort, en accord avec le vétérinaire désigné. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool).

Choix des espèces

L’utilisation de modèles animaux de cancer est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous- jacents à son développement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine. Les expériences seront réalisées sur des jeunes adultes (6-16 semaines). Avant le système immunitaire est immature et après il est affaibli, de plus la croissance tumorale n'est pas la même sur des souris jeunes adultes que sur des souris âgées.

Vérifier si un bio-insecticide épandu en agriculture déclenche une inflammation intestinale chronique chez un mammifère conduit à faire ingérer Bacillus thuringiensis et ses toxines à 420 souris pendant douze semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune subit quatre prises de sang rapides, trois séries de prélèvements étalées sur deux heures, et un dernier prélèvement sous anesthésie. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur sera administré, le porteur indiquant que ces molécules fausseraient ses mesures, et la seule réponse prévue en cas de colite très sévère avec plus de 15 % de perte de poids reste la mise à mort.

Objectifs

Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer si l’ingestion à long-terme de bio-insecticides particuliers favorise le développement d’inflammation intestinale chronique et/ou de dérégulations métaboliques.

Bénéfices attendus

À cours termes, ce projet permettra de caractériser la sensibilité d’un organisme non-cible en particulier, la souris, à un produit et ses toxines contenues dans des produits utilisés en agriculture contre les insectes ravageurs. De plus, ce projet permettra également de faire avancer les connaissances sur les effets induits par la consommation chronique de produit sur la composition et les fonctions du microbiote intestinal, ainsi que l’induction de mécanismes inflammatoires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par prélèvement sur animaux vigiles. Au total, les animaux subiront - 4 prélèvements uniques de sang pour une durée < 1 minute - 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements multiples seront séparés d’au moins une semaine Les animaux subiront un prélèvement unique de sang sous anesthésie en fin de protocole

Impact sur les animaux

Les phénotypes attendus sont l’apparition d’inflammation intestinale chronique chez certaines souris et de légères dérégulations métaboliques chez d’autres souris. Les agents bio-insecticides étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront en effet favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée.

Devenir

A l’issue de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal (Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME), Mini BioReactor Array (MBRA)) ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en présence de biopesticides chez les individus non-cibles tels que les mammifères, en santé et en pathologie.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 25 souris par condition et par sexe devait être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les effets attendus concernant une ingestion chronique de produit sont en effet modestes.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, un suivi quotidien des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. De plus, toutes les cages seront enrichies en cocoon afin de favoriser le bien-être animal. En se basant sur notre utilisation passée de ce modèle, une possible légère inflammation intestinale chronique est attendue, mais n’engendrant pas de douleur sévère. Aucune molécule antidouleur ou anti-inflammatoire ne pourra être utilisée car notre projet se concentre sur l’étude de l’inflammation et l’utilisation d’analgésique impacterait les mesures réalisées. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place, avec la mise à mort par dislocation cervicale, seule alternative au cas où un point limite serrait atteint. La seule anesthésie réalisée sera gazeuse. En cas de perte de poids de plus de 10%, de la nourriture humidifiée sera placée dans une coupelle au sein même de la cage afin d’éviter toute malnutrition due à un accès restreint à la nourriture. L’apparition et la sévérité de la colite sera également largement surveillée, en cas de colite très sévère accompagnée d’une perte de poids de plus de 15%, les animaux seront placés en procédure terminale immédiate.

Choix des espèces

L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 4-8 semaines (après sevrage) lors du démarrage des procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser des animaux relativement jeunes afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote. Les traitements seront de 12 semaines afin de tester l’impact de la présence des toxines de Bacillus thuringiensis et auront donc, jusqu’à 20 semaines lors du passage en procédure terminale.