Souris
Etude du rôle de métabolites de la flore microbienne intestinale dans le développement de l’obésité et du diabète chez la souris : enrichissement et transfert de flore intestinale.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une microcoupure d'un millimètre à l'extrémité de la queue chaque semaine, deux tests de tolérance au glucose de six prélèvements chacun, une inoculation de flore intestinale par voie rectale sous anesthésie : 284 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 264. Une partie est utilisée comme donneuse de caecum, les autres reçoivent un régime hyperlipidique destiné à les rendre obèses et diabétiques. Il s'agit d'établir un lien de cause à effet entre des bactéries intestinales productrices de 4-crésol et l'équilibre glycémique, avec des applications thérapeutiques annoncées à moyen terme. Le porteur retient la souris pour ses homologies de régulation glucidique avec l'humain et fixe leur âge entre trois et six mois, le temps que leur microbiote se stabilise.
Objectifs
Ce projet vise à mettre en évidence un lien de cause à effet entre la modification de la flore intestinale et la santé métabolique du rongeur. De nombreuses études mettent en évidence le rôle de modifications de l’architecture de la flore intestinale dans le risque de nombreuses maladies auto-immunes, métaboliques, neurodéveloppementales et neuro-dégénératives, y compris au cours du diabète de type 2. En revanche, l’impact physiopathologique de bactéries individuelles de la flore intestinale, connues pour synthétiser des produits à effets bénéfiques sur la santé, sur les caractéristiques et l'évolution de ces maladies est mal connu, et ce projet vise à en élucider les mécanismes à travers des études in vivo chez la souris. Plus particulièrement nous étudierons l'impact de bactéries productrices de 4-cresol, un métabolite synthétisé exclusivement par la flore bactérienne intestinale, sur l'homéostasie glucidique dans un modèle préclinique de diabète de type 2 : la souris soumise à un régime hyperlipidique. De plus, nous étudierons également l'impact d'un transfert de flore venant d'animaux résistants à l'obésité afin de mettre en évidence des effets protecteurs éventuels chez les souris receveuses. Ce projet sera réalisé en conformité avec la règle des 3Rs et dans le respect du bien-être animal. Ce projet durera 3 ans et le nombre total d'animaux utilisés est de 284 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de valider l'effet de métabolites de la flore bactérienne sur l'homéostasie glucidique de l'hôte et d’envisager des applications thérapeutiques dans le diabète chez l’Homme. En effet le rôle causal de produits de bactéries individuelles présentes naturellement dans le microbiote intestinal sur la modulation de la prise de poids et de l'équilibre glycémique n'est pas encore complètement démontré. Cela représente toutefois une piste prometteuse pour le traitement de l'intolérance au glucose et du diabète. Les résultats attendus pourraient ouvrir notamment de nouvelles perspectives pour le traitement du diabète de type 2, à moyen terme, avec l’élaboration de nouveaux produits probiotiques.
Procédures
Les animaux seront pesés 2 fois par semaine. Des prélèvements de sang au niveau des vaisseaux caudaux seront réalisés une fois par semaine (10 microlitres) pour mesure de la glycémie et de l'insulinémie basale (sauf pour les animaux des lots 1 et 2 utilisés comme donneurs de caecums). Des tests de tolérances au glucose (gavage par voie orale d'une solution de glucose 20% à 2g/kg) seront réalisés 15 jours après le transfert de flore, puis 2 mois après (les 2 tests seront donc espacés de 6 semaines). La glycémie sera mesurée aux temps 0, 10, 30, 45, 60 et 90) à l'aide d'un lecteur de glucose grâce à des prélèvements par les vaisseaux caudaux et à raison de 5 microlitre par prélèvements (25 microlitre par test). Pour résumer pour chaque animal: prélèvement basal (une fois par semaine):10 microlitres. Test de tolérance au glucose : 50 microlitres. Les animaux destinés au transfert de flore seront anesthésiés à l'isoflurance pendant quelques minutes dans la cage d'induction afin de s'assurer de leur immobilité pendant l'inoculation de la flore par voie rectale. Cette voie d'administration est parfaitement maîtrisée par l'équipe.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre expérience dans le type de procédures mises en oeuvre dans ce projet, qui ont toutes été déjà optimisées, nous ne prévoyons pas de nuisances ou effets indésirables (sauf l'induction de l'obésité et diabète, nuisance légère) qui pourraient conduire à la mise à mort anticipée des animaux. En ce qui concerne l'acte "transfert de flore", l'inoculation de flore par gavage que nous utilisons chez l’animal est une technique qui necessite une contention de courte duree (
Devenir
A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type "organ on chips" qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier des cibles d'intérêts parmi les bactéries grâce à des analyses de criblage in vitro et in silico. Ainsi cette sélection, effectuée en partenariat avec des experts en microbiologie, a abouti à ne retenir que les bactéries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront testées in vivo, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les animaux seront maintenus avec leurs congénères dans des milieux enrichis avec des morceaux de bois et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte de poids supérieure à 15 % , ou d'atteinte d'un point limite défini par notre grille de scoring décisionnel, l'animal sera euthanasié. Pour réduire le stress infligé aux animaux, le transfert de flore par voie rectale sera effectué sous anesthésie légère après passage dans une chambre d'induction à l'isoflurane, et le diamètre de la sonde est adapté à la taille de l'animal. Un intervalle de temps d'au moins 2 semaines est prévu entre le transfert de flore et le premier test. Pendant les tests de tolérance au glucose, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline par des kit Elisa ultrasensibles (nécessitant 5μl de plasma), et les tests eux-mêmes seront espacés de 6 semaines.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique et de l’adiposité. Adulte de 3 à 6 mois afin que le microbiote intestinal soit stable.
Analyse de la co-infestation Schistosoma-Plasmodium chez le modèle murin
- Protection de l’environnement
Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour que leur foie, leur moelle osseuse et leurs intestins soient analysés, 1 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 940. Elles sont infestées par des larves de schistosome après une heure passée à patauger dans l'eau, puis infectées par le Plasmodium responsable du paludisme par injection intrapéritonéale. À partir du quatrième jour, la queue est incisée deux fois par jour sur moins de deux millimètres pour évaluer la parasitémie, les souris devenant anémiées et pouvant souffrir d'hypoglycémie. Le porteur affirme que "le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire" faute de cycle parasitaire réalisable in vitro, et rapproche l'infestation de l'absence de douleur rapportée par les humains contaminés.
Objectifs
Le paludisme, également connu sous le nom de malaria, est une maladie infectieuse causée par le parasite Plasmodium transmis à l’Homme par piqûre d’un moustique infecté. Fléau économique et sanitaire, le paludisme constitue, avec près de 500 000 morts par an, la première parasitose et la troisième cause de mortalité au monde après la tuberculose et le SIDA et touche principalement l’Afrique subsaharienne, l’Asie du Sud-Est et l’Amérique du Sud. Dans l’ombre ces trois maladies infectieuses majeures, la Bilharziose ou schistosomiase est une maladie parasitaire faisant partie des maladies tropicales dites négligées, classée seconde après le paludisme, selon l’OMS. Les schistosomes infectent plus de 200 millions de personnes et causerait 200 000 morts par an. Le projet consiste à développer un modèle murin de co-infection afin d’analyser les interactions entre les parasites ainsi que la réponse physiologique de l’hôte dans le cas d’infections contrôlées. Ce modèle murin permettra également de tester des molécules actives sur les deux parasites. Des souris de deux souches différentes (CBA/J et C57BL/6J) seront infectés avec les deux pathogènes simultanément ou en différé afin d’analyser l’évolution de la virulence du pathogène dans un environnement changeant (i.e. hôte infecté par le paludisme) mais aussi la modulation de cet environnement hôte vis-à-vis de l’infection de ces deux pathogènes. Spécialistes de la schistosomiase, nous n’analyserons que les modifications du schistosome sous l’influence d’un environnement changeant (i.e. hôte infecté par le paludisme).
Bénéfices attendus
Malaria et schistosomiase sont les deux principales maladies parasitaires affectant les pays d’Afrique subsaharienne. Aujourd’hui, la plupart des recherches sont tubulaires et concernent soit un pathogène, soit l’autre. Pourtant de nombreuses études sur le terrain montrent l’interaction qui existent entre ces deux pathogènes. Le développement de ce modèle de co-infection permettra : à court terme, la compréhension des interactions phénotypiques et moléculaires dans l’association tri-partites souris-schistosome-plasmodium. A plus long terme, de tester l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les deux parasites (Alkoxyamine ou trioxaquines, par exemple).
Procédures
Plusieurs prélèvements sur souris seront effectués à des fins expérimentales et de maintien de cycle notamment des frottis sanguins afin d'évaluer la parasitémie à Plasmodium. A partir de 4 jours post-infection, la parasitémie à Plasmodium sera évaluée 2 fois par jour à partir d’un frottis sanguin
Impact sur les animaux
Concernant l’infection par le schistosome, le temps passé à patauger dans l'eau (1 heure) peut provoquer un stress chez l'animal. Les larves étant de petite taille, le transport à travers l’épiderme ne doit pas engendrer une souffrance importante. Les humains exposés ne relatent pas de douleur lorsqu’ils ont été contaminés. Les symptômes visuels sont le grossissement du foie et de la rate dû à l’accumulation des œufs du parasite. Ces effets sont chroniques. Les parasites sont récupérés avant que le parasite n'induise de souffrance. Concernant l’infection par le plasmodium, celle-ci se fait par injection intrapéritonéale qui engendre un stress de manipulation ainsi qu'une douleur d'injection. Des prélèvements dans le but de mesurer la parasitémie seront effectués deux fois par jours par incision de moins de 2mm sur le bout de la queue, la coupe de la queue est facile à réaliser et ne provoque qu'une douleur ou une angoisse minime. Une crème anesthésiante à base de lidocaïne sera appliquée en amont de la procédure sur la zone de coupe. La souris sera placée dans un tailveiner qui permet une contention de la souris afin de la maintenir et de minimiser le stress de la manipulation, facilitant le prélèvement. Les animaux seront anémiés et peuvent souffrir d’hypoglycémie ainsi que d’hyperinsulinémie. Les nuisances seront limitées car notre objectif est de traiter les animaux aux antimalariques avant que le parasite ne tue son hôte.
Devenir
Necéssité d'analyser les foies, moelles osseuses, intestins et autres post-mortem pour les besoins de l'expérience. Les souris seront donc toutes euthanasiées à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Pour les parasites, le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire car on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes. De plus, dans le contexte notre étude le rôle du vertébré est prépondérant car il s’agit d’analyser la réponse de l’hôte face aux co-infections.
Réduction
Le nombre de souris totales utilisées pour ce projet est de 1180 (dont 20 souris de maintien de cycle. Nous avons compté 10 souris de chaque sexe (n= 20) pour chaque temps de prélèvement dans chaque groupe. Au regard de plusieurs études antérieures visant à étudier la coinfection de plasmodium et schistosoma dans le modèle murin et d’un test statistique, le choix de 10 souris par expérimentation a été établie comme étant suffisant pour analyser la variation dans le modèle de coinfection. 1 lot équivaut à 10 souris. Chaque expérimentation correspond à un point temporel clé - dans la parasitémie des parasites et la symptomatologie de l’infection - de dosages et de mesures physiologiques et immunologiques nécessitant la mort des souris.
Raffinement
Les infestations se font avec un nombre optimal de parasites (assez pour être infectieux mais pas trop pour ne pas tuer la souris, soit 106 érythrocytes maximum pour le Plasmodium et 90 larves (~20 couples) de Schistosoma par souris) permettant à la fois le bien-être de l’animal et la survie de l’hôte. Une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée (surveillance visuelle, mesures de la température et du poids). Aucun rongeur femelle à l’animalerie ne reste isolé pour la sociabilité et le bien-être. Les mâles ne peuvent être replacés car ils se battent entre eux. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu tels que des tunnels en plastique ou en carton, des petits bouts de bois à ronger et des carrés de coton pour la nidification. Ces différents enrichissements leur permettent d’avoir des activités ludiques et sociales. La mortalité ne survient jamais à l’issue de l’infestation ; nous n’utilisons ni des souris jeunes ni des souris âgées. Durant l’expérience tout rongeur retrouvé en souffrance, c’est-à-dire ayant atteint un score de 3 dans les points limites (exemple : incapacité irréversible ou prolongée à s'alimenter ou à s'abreuver, distension abdominale significative, émaciation (état de chair 1/5) etc.) est euthanasié. Aucune médication n’est donnée car l’hépatosplénomégalie n’est pas réversible ; de manière plus générale, aucune médication ne peut être donnée car interférences avec le développement des parasites. La parasitémie au schistosome n’évolue pas post-infestation contrairement au paludisme. Les souris servant à l’entretien de la souche de Plasmodium sont mises à mort dès que leur parasitémie dépasse 30% avant que celles-ci présentent des signes de souffrance (4-5 jours suivant leur infection).Une parasitémie de 80% constituera un point d’arrêt. Pour le schistosome, le point d’arrêt a été fixé à 5 mois afin d’éviter toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur Schistosoma mansoni et Plasmodium yoelii nigeriensis. Nous avons choisi d’infecter les souris car il n’y a pas de souches consanguines à l’exception des rats. Les souches consanguines permettent d’obtenir des souris génétiquement identiques qui présentent une variété moindre d’un point de vue génétique et immunologique. Cela permet d’obtenir une base uniforme pour comparer les variations dues à une infection comme c’est le cas pour cette procédure. De plus, la diversité étant moindre, les résultats sont statistiquement plus homogènes et cela permet de minimiser le nombre de souris utilisées. Cependant le rat ne peut être infecté que par Plasmodium. C’est également sur le modèle souris qu’il existe le maximum d’information dans la littérature concernant les interactions Schistosoma/rongeur ou Plasmodium/rongeur. Lors du lancement de l’expérience, les souris seront âgées de 6 semaines pour la souche CBA/J et de 7 semaines pour les C57BL/6J ce qui correspond à environ 25 à 30 grammes. Les infestations par le parasite entraînant de fortes mortalités chez les rongeurs plus jeunes ou plus âgés. Elles seront suffisamment jeunes pour avoir un système immunitaire optimal. L’âge a également été choisi en fonction du poids ; 25 à 30 g étant un poids suffisant pour infecter les souris sans les affaiblir.
Développement d’un modèle syngénique d’hépatoblastome chez la souris et suivi du développement tumoral par IRM (EU2/2).
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Jusqu'à vingt échographies et dix prises de sang sous anesthésie, et pour une partie d'entre elles deux IRM après un transport vers un autre établissement : 1 515 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Selon les cas, elles subissent une chirurgie abdominale ou lombaire pour une injection dans le foie ou la rate, une injection à travers la peau, ou la greffe chirurgicale d'un fragment de tumeur dans le foie, afin de provoquer un hépatoblastome, cancer du foie de l'enfant, chez des souris au système immunitaire intact. La première procédure, chirurgicale, porte sur des femelles gestantes, et les vecteurs viraux destinés à provoquer la tumeur sont injectés avant la naissance ou à 2, 5 et 15 jours de vie. Le porteur indique que l'emploi de souriceaux aussi jeunes peut conduire la mère à les abandonner, voire à les manger.
Objectifs
L’hépatoblastome (HB) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. La survie globale à 5 ans actuellement est de 80 pour cent. Le traitement associe de la chimiothérapie à base de Cisplatine à une résection chirurgicale de la tumeur. Mais 20 pour cent des enfants traités vont développer une résistance au Cisplatine au cours de la chimiothérapie néoadjuvante ou au cours de la récidive de la maladie. Il existe actuellement peu d’alternatives thérapeutiques, avec des données insuffisantes sur les alternatives proposées. Il est donc crucial de pouvoir tester de nouvelles associations de traitement ou de nouveaux traitements. Les modèles pré-cliniques d’hépatoblastome qui existent aujourd’hui sont réalisés sur des souris nude, souris immunodéprimées, chez qui un fragment d’HB humain, ou des suspensions cellulaires issues de culture cellulaires d’HB sont implantés en sous cutané ou en situation orthotopique, c’est-à-dire directement dans le foie. Cependant le système immunitaire a un rôle primordial dans la réponse anti-tumorale. Il est donc très important de développer des modèles syngéniques d’hépatoblastomes chez la souris immunocompétente afin de pouvoir, une fois le modèle établi, étudier l’effet de nouveaux traitements et également étudier la réponse immunitaire impliquée dans la réponse anti-tumorale. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Notre équipe s’intéresse à deux grands types de tumeurs malignes du foie : les carcinomes hépatocellulaires (CHC) principalement développés chez l’adulte et les hépatoblastomes (HB) qui se développent chez l’enfant de moins de 5 ans. L’HB est une maladie rare mais c’est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. L'incidence est de 1 à 1,5 /1000000 d'enfant de moins de 15 ans, et cette incidence est en cours d'augmentation. Il touche 20 enfants par an en France. Dans le cas des HB, bien que la majorité des patients répondent aux traitements conventionnels, environ 20 pour cent sont réfractaires et décèdent. Les modèles de xénogreffes de lignées tumorales ou de greffes orthotopiques de tumeurs dérivées de pièces opératoires de patients représentent les modèles précliniques les plus pertinents actuellement pour étudier la réponse thérapeutique. Mais ces modèles sont développés chez des souris immunodéficientes et ne permettent pas d’étudier le rôle du système immunitaire. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, et notamment les mécanismes immunitaires, et de tester de nouvelles approches thérapeutiques pouvant être bénéfiques aux patients réfractaires aux traitements habituels.
Procédures
Les animaux pourront être soumis, selon les cas, à l’un des gestes suivants : 1) une chirurgie abdominale ou lombaire pour injection dans le foie ou la rate (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (réalisé dans l'établissement utilisateur 1 (EU1), 2) injection percutanée (animal vigile, 1 fois maximum, 15sec) (EU1), ou 3) une chirurgie abdominale pour greffe d’un fragment tumoral dans le foie (une seule fois, animal anesthésié et analgésié, 15min maximum) (EU1). L’ensemble des animaux seront amenés à avoir : des prélèvements de sang de faible volume (animal anesthésié, 10 fois maximum avec une intervalle d’une semaine minimum entre chaque, 1min) ; un suivi par échographie abdominale (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 min) (EU1) ; pour certains un transport dans un autre établissement afin d’effectuer une imagerie non invasive par IRM (animal anesthésié, 2 fois, 30 min) (réalisé dans l'établissement utilisateur 2 (EU2)). En fin de période de maintien les animaux seront anesthésiés, un dernier prélèvement sanguin (1 min) sera réalisé et ils seront immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues sont principalement celles engendrées par les procédures chirurgicales réalisées, qui peuvent engendrer une douleur au niveau de l’incision au réveil de l’animal et avoir une incidence sur l‘état général de santé de l‘animal (perte d‘appétit, baisse de l‘activité, infection de la cicatrice, détresse de l’animal dans les cas les plus grave), ainsi qu’entrainer une légère gêne dans la locomotion. Un risque anesthésique est également à prendre compte (détresse respiratoire, réveil intempestif). L’utilisation d’animaux à des âges précoces peut engendrer un abandon de la part de la mère, voir du cannibalisme dans le cas des nouveau-nés. Un stress de l’animal peut aussi être constaté lors des contentions, ainsi qu’un inconfort lors des injections. Le développement des tumeurs hépatiques est généralement asymptomatique et n’entraîne donc pas de nuisances en soit, car les animaux seront euthanasiés avant que les tumeurs entrainent une dégradation de l’état général des animaux. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance. Une imagerie non invasive (IRM) sera réalisée dans un autre établissement utilisateur, ce qui nécessite un transport des animaux qui peut entraîner une nuisance du fait du stress lié à la néophobie des rongeurs. Un risque anesthésique est également à prendre compte car l'IRM est effectuée sous anesthésie générale (détresse respiratoire, risque d'hypothermie, réveil intempestif).
Devenir
Le prélèvement des tissus d’intérêt étant nécessaire pour la réalisation de nos analyses, l’ensemble des animaux sera euthanasié à la fin des procédures grâce à une méthode réglementaire, et dans le respect des bonnes pratiques.
Remplacement
Les modèles in vitro ne miment que partiellement la pathologie humaine car ils ne permettent pas de modéliser certains paramètres biologiques pouvant influencer le développement tumoral ou la réponse thérapeutique, tels que les interactions des cellules tumorales avec leur environnement ou encore l'hétérogénéité intra-tumorale. Il est donc essentiel de disposer de modèles in vivo reproduisant le plus fidèlement possible les caractéristiques de la pathologie humaine. Le recours à des modèles animaux est donc indispensable pour mieux comprendre l'histoire naturelle de la maladie et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Les effectifs ont été réduits au maximum et les groupes seront composés de 8 à 12 animaux. Cet effectif a été déterminé grâce à un calcul de puissance, afin d’utiliser le moins d’animaux possibles tout en permettant d’obtenir des résultats suffisamment robustes, et les expériences pourront être réitérées jusqu’à 3 fois si nécessaire. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Afin de limiter au maximum les éventuelles variations entre les expériences, les paramètres d’hébergement et de soin des animaux seront contrôlés. Le suivi tumoral hépatique sera réalisé grâce à une méthode non invasive, l’imagerie par échographie et par IRM, ce qui diminue également le nombre d’animaux utilisés. Le nombre total d'animaux utilisés sur la totalité du projet s'élève à 1515.
Raffinement
Les paramètres d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Les cages seront enrichies avec du coton de nidification, des maisonettes en plastique ainsi que des batônnets à ronger. Les femelles gestantes seront regroupées à 2 par cages afin d’éviter leur isolement, et ne seront séparées qu’après avoir mis bas afin d’éviter la surpopulation au sein d’une même cage. Les animaux issus d’établissement fournisseur observeront une durée d’acclimatation de 7 jours minimum avant toute utilisation. Un change sera réalisé par le personnel de l’animalerie une fois par semaine (sauf indication contraire) et une surveillance quotidienne rigoureuse des animaux sera réalisée tout au long de leur vie. Des pesées seront également réalisées à intervalles réguliers et une grille de suivi est utilisée. Les procédures seront raffinées afin de limiter au maximum la douleur et l’inconfort des animaux (personnel formé et compétent, anesthésie et analgésie adéquate suite aux procédures chirurgicales puis surveillance rapprochée des animaux avec étiquetage spécifique des cages concernées), et des points limites précis seront établis. Si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, il sera immédiatement euthanasié par une méthode réglementaire afin d’éviter toute souffrance animale. La Structure chargée du Bien-Etre Animal et/ou le vétérinaire pourront être sollicités pour conseil si besoin. Les transposrts des animaux entre l'EU1 et l'EU2 est assuré par un transporteur agréé, dans des boîtes de transport appropriées, ventilées, sécurisées et suffisament spacieuses. Un apport en nourriture et en eau gélifiée sera fourni durant le transport. Le temps de transport est de moins de 20 minutes entre les 2 EU.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental de choix pour l'étude des pathologies humaines car c'est un petit mammifère qui se reproduit rapidement, est facile à manipuler, et dont nous avons une bonne connaissance du comportement et de la génétique. De plus, le génome de la souris est identique à plus de 95 pour cent à celui du génome humain, ce qui suggère une bonne homologie des mécanismes observés. On peut également facilement apprécier les modifications physiques et/ou comportementales traduisant une souffrance et/ou douleur, ce qui conduirait à l’euthanasie de l’animal. De nombreux outils moléculaires sont également disponibles chez ce modèle animal. La première procédure sera réalisée sur des femelles gestantes âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte et également à l’âge optimal permettant le bon déroulement de la gestation d’une part, et une bonne récupération de l’acte chirurgical d’autre part. Les vecteurs viraux seront injectés à différents âges (prénatal, 2, 5 et 15 jours de vie post natal), présentant un foie encore immature et en prolifération, afin de développer un hépatoblastome.
Etude du flux autophagique dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque d’origine génétique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Sectionnées à l'extrémité de la queue entre sept et dix jours pour le génotypage, puis soumises entre deux et cinq mois à une à quatre échographies cardiaques de dix minutes sous anesthésie gazeuse, 137 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 60 d'entre elles et modéré pour 77. Certaines subissent ensuite deux jeûnes de vingt-quatre heures séparés par deux heures d'accès à la nourriture, d'autres un gavage ou une injection intrapéritonéale. Quatre heures après cette injection, elles sont tuées. Le cœur et parfois les muscles des pattes sont alors prélevés, sur des animaux porteurs d'une mutation qui provoque chez eux une insuffisance cardiaque.
Objectifs
La cardiomyopathie dilatée (CMD) humaine est une maladie grave conduisant à l’insuffisance cardiaque (IC) et est la première cause de transplantation cardiaque. Les apports récents de la génétique ont permis l’identification de nombreuses causes génétiques de cette maladie. L’hétérogénéité génétique est très importante avec environ 30 gènes et de multiples mutations essentiellement privées impliqués à ce jour. Ces découvertes n’ont cependant pas été accompagnée, le plus souvent, de l’étude des mécanismes physiopathologiques. Dans cette pathologie à forte composante génétique les traitements restent avant tout symptomatiques, et non curatifs, et la compréhension des voies physiopathologiques apparaît indispensable pour avancer vers l’identification de cibles thérapeutiques potentielles. Nous avons, au laboratoire, identifié un gène portant des mutations responsables de CMD et fait développer par un prestataire un modèle de souris dans lequel nous avons introduit une mutation identifiée chez un patient. Ce modèle reproduit la maladie, avec le développement d’une insuffisance cardiaque dès les premières semaines de vie des animaux pour les cas les plus précoces. Les objectifs du projet visent à caractériser aux niveaux moléculaires et cellulaires les conséquences de la mutation dans ce modèle murin. Cela permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques à l’origine de la maladie et servira à la mise en place de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
La cardiomyopathie dilatée humaine (CMD) est une maladie grave conduisant à l'insuffisance cardiaque et est la première cause de transplantation cardiaque. La prévalence de la CMD est estimée à environ 1 cas pour 2500-3000 personnes, estimation qui peut varier avec l'âge, le sexe, les facteurs environnementaux et la génétique des individus. Ce projet permettra d’avancer dans la compréhension des mécanismes conduisant à la cardiomyopathies dilatée associée à des mutations du gène d'intérêt et ainsi révéler d’éventuelles cibles thérapeutiques appartenant aux voies de régulation de la protéostasie.
Procédures
Selon la procédure: Certains animaux seront soumis à 1 à 4 échographies cardiaques d'une durée de 10 minutes chacune sous anesthésie gazeuse (âges 2 à 5 mois). Les animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à une injection (petit volume de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures. Certains animaux seront soumis à l’âge de 2 ou 3 mois à un jeûne de 2 fois 24h séparées par un accès libre pendant 2h à la nourriture (procédure de synchronisation du jeûne) puis à une injection (petit volume de solution) suivie de leur euthanasie après 4 heures. Certains animaux seront soumis à une contention et un gavage qui dure au maximum 10 secondes en 1 seule fois ; ou à une contention et l’injection suivies du massage de la zone d’injection qui dure au maximum 20 secondes en 1 seule fois. Les animaux sont génotypé après section instantanée de l'extrémité de la queue à l'age de 7 à 10 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances découlant des procédures sont, 1/ L'utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des animaux réalisée par un seul prélèvement à l’extrémité́ caudale ce qui peut être source de stress et d’une douleur de courte durée, 2/ Stress lié à la contention lors de la phase d’anesthésie gazeuse lors de l’échographie ainsi que les risques anesthésiques (stress thermique, détresse respiratoire, etc.) durant les échographies, 3/ Pour les animaux subissant une injection intrapéritonéale, nuisance liée à douleur et au stress de l’injection elle-même 4/ Pour tous les animaux devant être pesés manipulation par l’expérimentateur et contrainte spatiale de courte durée, et enfin 5/Les challenge métaboliques un stress et une douleur de courte durée en raison des administrations et des quelques prélèvements d’une goutte de sang ainsi que des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie durant quelques heures 6/ une nuisance liée au gavage (irritation, stress de manipulation, risque de fausse-route) est possible. 7/ Les animaux utilisés peuvent avoir un phénotype entrainant une insuffisance cardiaque
Devenir
les procédures sont toutes suivies de l'euthanasie des animaux pour pouvoir collecter le tissus d'intérêt (ici le coeur et parfois les muscles des jambes).
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex-vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n'existent pas en lignées. Nous disposons des procédures d'établissement de Cardiomyocytes issus d'iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l'organisme in vitro) et utilisons également ce modèle. Cependant, ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration des signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
Les modèles cellulaires seront cependant utilisés quand cela sera adapté, pour valider les observations fonctionnelles, moléculaires et cellulaires du modèle murin et cela dans le but de limiter le recours à de plus nombreux animaux. Le nombre d’animaux requis est réduit en limitant la taille des groupes et en utilisant une approche statistique non-paramétrique (indiquée pour les petits effectifs) tout en maintenant une puissance statistique nécessaire. Dans le but de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les procédures ne seront réalisées que sur les souris mâles d’un seul génotype quand cela est adapté, qui présentent le phénotype d’insuffisance le plus précoce. Le phénotype des animaux issus d’un croisement de notre lignée, porteuse d’une mutation d'intérêt, avec une lignée porteuse d’une mutation pathologique d'un autre gène n’est pas connu. Ainsi une étude pilote sera effectuée sur quelques animaux afin de déterminer les conditions optimales de l’expérimentation en observant les phénotypes cardiaque et musculaire de la lignée hybride nouvelle ainsi qu’en fixant la variable d’âge d’observation et l’éventuelle atteinte du point limite de fonction cardiaque. 137 animaux seront utilisés au total dans ce projet.
Raffinement
Il s’agit de fournir aux animaux un environnement enrichi avec du coton et des caches en carton. Les animaux ne restent pas seuls dans les cages. Les cages sont nettoyées une fois par semaine. Les procédures proposées dans ce projet restent peu douloureuses et parcimonieuses (une seule injection /échocardiographies pour l’étude pilote uniquement). L’injection (solution saline ou chloroquine, insuline) est unique et réalisée par du personnel expérimenté et le jeûne est réalisé avec un accès constant à l’eau. Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures et les tissus collectés pour maximiser l’information analysable à partir de chaque animal inclus dans le protocole. La procédure d’échocardiographie est non invasive et le bien-être des animaux, en particulier en relation avec l’éventuelle dégradation de leur fonction cardiaque, sera surveillé. La procédure d’échographie permettant le suivi de la fonction cardiaque est indolore puisque réalisée sous anesthésie légère respiratoire et sur plaque chauffante pour éviter l’hypothermie. L’utilisation des contrôles identiques aux deux protocoles de stimulation sera choisie si les résultats du pilote indiquent cette possibilité. Les points limites entrainants l’arrêt de l’expérimentation sont précisés pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris a été choisie dans le cadre de ce projet puisqu’il s’agit de réaliser un croisement de lignées préexistantes pour produire un hybride de deux anomalies génétiques. Le recours à cette espèce est lié au fait que nous possédons déjà des informations sur des lignées développant une cardiomyopathie dilatée en relation avec l'atteinte génétique du gène d'intérêt, qui permettront des comparaisons, un approfondissement des connaissances et d'éventuelles généralisations sur les mécanismes de la pathogénèse. La génétique du modèle souris est bien connue ainsi que la maitrise des techniques de modification des gènes utilisé dans ce projet. Les procédures seront réalisées sur des animaux âgés de 2 mois à 5 mois. A ces âges, le phénotype pathologique est présent mais l’insuffisance cardiaque reste à un stade modéré, ce qui permettra la mise en place des différentes expériences sans souffrance animale anticipée.
Biodistribution de nouveaux ligands par imagerie fluorescente
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue de chaque procédure, réparties en groupes de quatre à raison de dix études par an. Chacune peut recevoir jusqu'à trois injections des molécules testées, dans la veine de la queue sous contention ou sous la peau de la nuque, sans anesthésie, puis subir jusqu'à quatre prises de sang éveillée et jusqu'à sept séances d'imagerie de fluorescence sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une société y développe des molécules qui se fixent sur des récepteurs cellulaires pour y acheminer des médicaments, et affirme répondre à une "demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique". Les retombées pour les patients restent au conditionnel : le porteur évoque, à terme, un bénéfice attendu qui "pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical".
Objectifs
A l'heure actuelle, beaucoup de besoins médicaux restent malheureusement insatisfaits, sans aucun traitement curatif ou palliatif, et peuvent devenir de véritables enjeux de santé publique dans le futur. Il existe ainsi une demande pressante de la part de l'industrie pharmaceutique pour l'identification de récepteurs exprimés à la surface des cellules, permettant des approches ciblées. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste à identifier des récepteurs exprimé sur les cellules que l'on veut cibler et de développer des molécules capables de les reconnaitre et s'y fixer. Nous pourrons ensuite conjuguer des médicaments sur nos molécules afin de les faire passer les barrières physiologiques naturelles et atteindre plus efficacement les tissus cibles. En effet, la plupart des médicaments restent inefficaces car ils n'atteignent pas de manière spécifiques les tissus voulus. Cette demande de projet a pour objectif le développement et l’amélioration de nos molécules pour faciliter le passage des médicaments à travers les membranes cellulaires. Le fait d'accrocher nos molécules à des proteines fluoresecentes permet de suivre leur localisation.
Bénéfices attendus
L'utilisation de nos molécules permet d'obtenir une localisation plus spécifique et d'éviter des effets sur les tissus non voulu et cela constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Les interventions auxquelles les animaux seront soumis sont les suivantes : -L’administration de nos molécules se fera sur animaux éveillés en une dose ou plusierus doses répétées (maximum x3). Ces dernières se feront : - Au niveau de la veine de la queue pour l'animal vigil en contention, geste rapide (≤ 2min). - Ou au niveau de la nuque pour les sous-cutanées, animal vigile, libre sans contention ; geste rapide (≤ 2min). L'injection intrapéritonéale (1 fois lors de la mise à mort des individus) -Les prélèvements sanguins intermédiaires sur animaux vigiles : au maximum 4 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7 jours et ≤20% sur 14 jours. Pour chaque imagerie la souris est anesthésiée. Il y aura à minima 1 imagerie et cela peut aller jusqu'à 7 imageries. Les différents types d'imagerie prendront quelques minutes (entre 2 et 25min).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : - La contention des animaux dans le cas des administrations intraveineuses et sous-cutanées. - Les différentes administrations réalisées : intraveineuses ou sous-cutanées et intrapéritonéales (lors de la mise à mort des individus). - Les prélèvements sanguins intermédiaires
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de caractériser ex vivo la biodistribution mais aussi l'efficacité selon le type de molécule couplée.
Remplacement
Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos molécules ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités, mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de 10 études par an, nous aurons besoin de 40 animaux par an (n mixte=4 *10), soit un total de 200 souris sur 5 ans. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires en cours de cinétique permet également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
Les imageries se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal tout en ayant un réveil rapide de l’animal. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées en plus de l’anesthésie générale d’une analgésie locale et/ou générale. Le bien être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieur à 20% du poids initial l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toutes souffrances inutiles. Les conditions d’hébergement classique, animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12h, seront enrichi en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, ou morceau de bois afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypies.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour des animaux adultes, ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade adulte présente un poids moyen de 17-28g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Développement de vaccins optimisés contre les infections respiratoires aéroportées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
3 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 456 d'entre elles et modéré pour 1 596. Elles subissent un génotypage par phalangectomie, de trois à douze prises de sang sur animal vigile, jusqu'à trois administrations intranasales et trois injections intramusculaires sous anesthésie, puis de sept à quatorze séances d'imagerie réparties sur cinq à sept semaines. Une partie est infectée par la grippe ou le SARS-CoV-2, à doses non létales ou létales, avec abattement, poils hérissés, dos voûté et perte de poids attendus chez les souris non traitées. Le porteur écrit qu'il privilégiera la culture cellulaire ou les organoïdes dès que ce sera possible, tout en concluant que les méthodes actuelles ne permettent pas d'étudier la mise en place d'une réponse immunitaire locale.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de développer un vecteur vaccinal optimisé pour une délivrance intranasale contre les infections respiratoires (virus Influenza A (IAV) et SARS-Cov-2) avec une efficacité accrue par rapport aux vaccins actuels administrés en intramusculaire. Une administration intranasale améliora grandement la mise en place d’une mémoire immunitaire forte, durable, et localisée, nécessaire à l’élimination rapide et efficace du virus, et évitant sa dissémination à d’autres individus. Dans notre stratégie, le vaccin sera administré à des souris de laboratoire sous forme de microgouttes dans le nez de souris de laboratoire. L’objectif sera, d’une part, d’analyser la capacité de notre vaccin à activer le système immunitaire et à induire une mémoire immunologique locale forte dans le nez des souris vaccinées. D’autre part, nous allons étudier la capacité du vaccin à protéger durablement et efficacement ces souris contre une infection par diverses souches de IAV et du SARS-Cov-2. La mise en place d’une mémoire immunologique lors d’une vaccination est un processus complexe qui nécessite l’utilisation d’un modèle souris pour son étude. La souris est un animal qui permet de modéliser de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection respiratoire chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les maladies respiratoires ont des impacts sociaux et économiques majeurs, tant au niveau individuel que sociétal, et ciblent particulièrement les populations à risque du monde (i.e., nourrissons, personnes âgées et patients immunodéprimés). De nombreux experts prédisent que de nouvelles pandémies de grippe seront très probables l’année prochaine, alors que le SARS-CoV-2 circule toujours avec de nouveaux variants. Même si des vaccins existent, aucun vaccin administré par voie nasale n'est disponible utilisant la technologie de l’ARN messager. Or, une forte réponse immunitaire dès l’arrivée du virus au lieu d’infection, i.e., le nez, favorise significativement l’élimination plus rapide du virus, évitant ainsi la propagation de la maladie d’un individu à l’autre. L’augmentation de l'efficacité des vaccins actuels aura un impact sur les questions économiques ainsi que sur les domaines sociaux et culturels, avec un impact majeur sur la santé et des conséquences sociales. De plus, dans ce projet, nous sélectionnons des antigènes très conservés par des souches de virus différentes et ainsi développerons des vaccins « universels » qui protégera chaque individu contre différentes souches d’un même virus et évitera le besoin d’une vaccination répétée pour des variants différents. D’un point de vue scientifique et technologique, ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le fonctionnement des réponses immunitaires associées à la muqueuse nasale. D’autre part, les équipes de recherche impliquées dans ce projet ont à cœur de sensibiliser le public et participent activement à accroître l'exposition de la recherche immunologique sur les vaccins à un large public. Un meilleur accès à la recherche sur les vaccins sans aiguille, mais en spray nasal, pourrait aussi accroître l’acceptation du vaccin au sein de la population. Par ce projet, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le développement de vaccins, qui pourrait également être utilisée pour la conception de nouveaux vaccins contre d’autres virus aéroportés et/ ou dans la lutte contre les cancers du système respiratoire et du cerveau par exemple.
Procédures
Le génotypage est réalisé sur les fragments tissulaires issus de l’identification par phalangectomie (une seule fois). De trois à douze prises de sang seront effectuées (quelques secondes par animal par prise de sang) sur animaux vigiles. Jusqu’à trois administrations intranasales (quelques secondes par animal) sur animal anesthésié. Jusqu’à trois injections intramusculaires (quelques secondes par animal) sur animal anesthésié. L’imagerie non-invasive in vivo sera réalisée sur animaux anesthésiés à l’isoflurane (quelques minutes) avec le système IVIS de 7 à 14 fois sur 5 à 7 semaines via une injection intrapéritonéale de D-luciférine.
Impact sur les animaux
Des souris de laboratoire seront utilisées pour ce modèle d’infection pour imiter les infections chez l’Homme. L’instillation intranasale du virus de la grippe ou du SARS-CoV-2 permet le développement d’une infection chez la souris. La période critique chez la souris avec les souches virales et les doses infectieuses utilisées sera à partir de J6 post-infection pour des doses non-létales et à partir de l’infection pour des doses létales. Les signes cliniques attendus sur les souris non traitées sont les suivants : abattement, poils hérissés, dos voûté, perte de poids et manque d’appétit, selon les doses virales. L’imagerie non-invasive in vivo sera réalisée sur animaux anesthésiés à l’isoflurane via une injection intrapéritonéale de D-luciférine, pas de nuisance attendue sauf une sensation de piqure lors de l'intrapéritonélae.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront infectés. De plus les animaux “contrôles” non-infectés devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.
Remplacement
Nous reconnaissons que les avancées dans les techniques de recherche et les technologies alternatives permettent un remplacement et/ou une réduction de l’utilisation d’animaux. Dès qu’il sera possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous privilégierons cette solution, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Il est important de noter que nos diverses formulations vaccinales seront systématiquement soumises à une caractérisation in vitro et à une validation sur des modèles de cultures cellulaires avant toute autre étape. Cependant, les méthodes alternatives actuelles, comme la modélisation mathématique ou les systèmes in vitro, ne permettent pas d’étudier la mise en place d’une réponse immunitaire lors d’une vaccination, notamment au niveau systémique, en préservant l'intégrité scientifique. De plus, l’infection par voie respiratoire fait intervenir de nombreux mécanismes physiopathologiques rencontrés dans l’infection humaine que nous ne pouvons pas reproduire par le biais de techniques in vitro. Par conséquent, nous utiliserons un modèle murin, le seul à permettre l'étude approfondie du mécanisme de transport du vaccin et des réponses immunitaires qu'il engendre. L'utilisation de modèle murin est essentielle pour tester nos vaccins réactivant localement et de manière systémique le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans la lutte contre les infections respiratoires.
Réduction
Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. La taille d'effet est calculée pour un certain niveau de risque et de puissance . Les animaux seront répartis en lots de 7 individus maximum par cage. Nous estimons qu’un effet cage peut représenter une part de la variabilité totale des données, ce qui nous amène à augmenter le nombre d’individus d’un certain facteur par rapport à un cas où aucun effet cage n’est observé. Les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs . Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance.
Raffinement
Pour l’administration par voie intranasale, les souris seront soumises à une anesthésie légère et de courte durée à l’isoflurane pour assurer une respiration calme et ample. Le raffinement sera aussi assuré par l’expérimentateur par un suivi clinique des animaux (observation et pesée). Les expériences pratiquées dans ce protocole seront réalisées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pratiquement, 2 types de critères (a et b) sont mesurés systématiquement. Le point limite est défini par l’occurrence d’un critère (b) minimum ou de 4 critères (a). Si le score limite est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine du développement de vaccins et de la réponse immunitaire. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt. De plus, la souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre les maladies infectieuses. Les animaux seront accueillis à 6-7 semaines d’âge (âge constituant un compromis adéquat entre maturité suffisante du système immunitaire et mis en expérimentation à partir de 7-8 semaines d’âge).
Rôle des cellules tuft dans la réponse antivirale précoce – étude pilote
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
240 souris vont être utilisées dans une étude pilote, réparties en cohortes de quinze par génotype et par condition de traitement, toutes tuées dans un délai allant de quelques heures à cinq jours après le traitement. Chacune reçoit une substance parmi huit, par injection intrapéritonéale ou par gavage gastrique, avant autopsie des organes digestifs. Le niveau de souffrance déclaré est léger, les lignées utilisées ne présentant pas, selon le porteur, de phénotype dommageable à l'état de base. Les bénéfices annoncés, comprendre pourquoi certains individus répondent mieux que d'autres à une infection virale, sont formulés au conditionnel, alors que le porteur reconnaît n'avoir aucune donnée préliminaire permettant de préjuger des effets attendus.
Objectifs
L’objectif de ce projet est simple, et consiste à réévaluer les séquences des évènements de la réponse immune précoce à la suite d’une infection virale. Nos données, obtenues dans un modèle cellulaire, indiquent que l’absence de certaines cellules épithéliales impactent de manière drastique la synthèse de molécules antivirales de type interférons, molécules sans lesquelles la réponse d’un hôte infecté est compromise. Ces données, inédites et encourageantes, méritent d’être approfondies le plus rapidement possible dans un modèle intégré, afin de mesurer le réel impact de ce défaut d’initiation de réponse antivirale. Notre stratégie expérimentale consiste à utiliser des analogues chimiques, disponibles commercialement, validés dans la littérature, capables d’activer et de mimer chaque étape de la réponse antivirale. De manière synthétique, les souris seront traitées avec les molécules ad hoc, avant d’être analysés dans un laps de temps n’excédant pas 5 jours, pour analyses histologiques et moléculaires. Nous comparerons ainsi la mise en place de la réponse immune précoce (d’où les temps de cinétique court) entre des individus contrôles et des individus dans lesquels certaines cellules intestinales sont absentes. Cette stratégie nous permettra de répondre à des questions simples : (1) quels sont les types cellulaires impliqués dans la mise en place de la réponse immune suite à une infection virale et (2), l’absence de certains type cellulaire compromet-elle l’efficacité de la réponse de l’hôte suite à une infection ?
Bénéfices attendus
La balance bénéfice/risque associée à ce projet est clairement favorable. Nos données préliminaires indiquent en effet que les expériences associées à cette étude peuvent aboutir à la découverte de nouveaux mécanismes associés à l’immunité antivirale précoce. Les retombées attendues en termes de connaissances fondamentales sont importantes, et pourraient avoir des répercussions en termes de santé publique, dans le contexte de pandémie que nous connaissons. A titre d’exemple, comprendre selon quelles modalités une réponse antivirale efficace doit se mettre en place est une question d’actualité, permettant virtuellement d’expliquer les raisons pour lesquelles certains individus réagissent favorablement à une infection virale (réponse interféron adéquate), alors que d’autres développent des formes graves (réponse inflammatoire prédominante). Notre stratégie expérimentale simple, nos données obtenues ex-vivo, le tout conjugué à la rapidité avec lesquelles nous devrions obtenir des réponses, font de ce projet une question importance majeure.
Procédures
Les souris se verront administrer 1 substance parmi les 8 testées au total, par voie intrapéritonéale ou gavage gastrique, à l'aide de seringue et de canules adaptées, via le personnel habilité de notre équipe zootechnique. Suite aux traitements, les animaux seront progressivement euthanasiés dans un laps de temps allant de quelques heures à 5 jours tout au plus, se focalisant sur les conséquences précoces de traitements initiés.
Impact sur les animaux
Les lignées utilisées dans ce projet ne présentent, à l’état de base, pas de phénotype dommageable. Les nuisances seront celles liées à l'administration des substances aux individus: injection intrapéritonéale et gavage gastrique.
Devenir
Les animaux devront être euthanasiés, puisqu’autopsiés afin de récupérer les organes digestifs
Remplacement
Ce projet doit être abordé de façon intégrée et ne peut être intégralement mené in vitro puisqu’il a comme objet principal l’étude des interactions entre les cellules épithéliales intestinales, les cellules immunitaires et certains virus. Nous ne disposons pas de méthode alternative à ce jour pour traiter ces questions. Nous avons, jusqu’à présent, pu valider notre hypothèse avec le modèle de culture d’organoïdes, légitimant cette demande d’expérimentation in vivo, et réduisant la probabilité d’échec de ce projet. Le système de culture d’organoides sera réutilisé en complément des données obtenues in vivo, dès que possible.
Réduction
A ce jour, nous n’avons aucune expérience préliminaire ni donnée nous permettant de pouvoir préjuger des effets attendus entre nos deux groupes d’animaux, faisant de cette étude une étude pilote. Cependant, étant donné l’absence de synthèse d’interféron dans les individus mutés, nous anticipons des différences drastiques entre nos groupes d’individus. Cette saisine intégrera donc des cohortes de 15 animaux par génotypes et par conditions de traitements, incluant tous les controles. Les conclusions seront obtenues via des analyses de comparaison de moyenne des paramètres mesurés. Lorsque possible, les analyses seront complétées en modèle ex-vivo (organoïdes intestinaux). La réduction de nombre d’animaux se fera aussi via l’utilisation de la majorité des animaux produits pour chaque lignée (études menées sur les mâles et femelles, la plupart des génotypes produits seront utilisés).
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum les hypothétiques risques de douleur et d’angoisse chez les individus du groupe mutant, un suivi individuel des individus sera réalisé selon les paramètres de masse corporelle et d’activité. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou l’apparition de signe de prostration seront considérés comme des points limites. En cas de signes de détresse ou de douleur, d’atteinte d’un point limite, en accord avec le personnel qualifié, le protocole sera immédiatement stoppé pour ces animaux qui seront euthanasiés et autopsiés.
Choix des espèces
Le système digestif de la souris présente de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. De plus, nous disposons du modèle idéal (souris mutées pour un gène essentiel pour la différenciation de certaines cellules intestinales impliquées dans l'immunité). La comparaison de la mise en place d'une réponse entre des souris contrôles et les souris mutées pour ce gène nous permettra donc de définir les types cellulaires impliqués dans la réponse antivirale. Les individus seront utilisés à partir de 8 semaines d’âge, lorsque le système digestif est mature
Rôle du facteur de virulence contenu dans les vésicules extracellulaires d’une mycobactérie : diffusion et réponse inflammatoire dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Deux lignées de souris ont été retenues pour une raison précise, l'une cicatrisant spontanément après infection par la mycobactérie, l'autre pas. 440 souris de ces lignées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent une injection de vésicules bactériennes fluorescentes dans la veine ou dans le coussinet de la patte, geste qui ouvre une brèche cutanée dont le porteur reconnaît qu'elle peut s'infecter. Toutes sont tuées après un prélèvement de sang, pour que le foie, la rate, les reins, les poumons, les ganglions et les tissus cutanés soient analysés.
Objectifs
Notre équipe de recherche travaille sur une maladie tropicale négligée qui provoque des ulcères de la peau, et qui est causée par une mycobactérie. Cette bactérie produit une toxine qui a des propriétés originales, dont un puissant effet anti-douleur, et qui peut avoir un rôle pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire. Notre équipe a montré que la toxine était libérée dans des particules, appelées MEVs, qui permettent la diffusion de la toxine et de propager l'infection. Bien que les effets des MEVs contenant la toxine aient été décrits dans des modèles cellulaires, leur rôle précis dans la maladie à l’échelle d’un organisme entier reste inconnu. Dans ce contexte, et en accord avec nos études passées et nos récents résultats, nous supposons que les MEVs contenant la toxine jouent un rôle primordial dans le développement de l'infection par la bactérie. Ce projet a pour but de comprendre comment les MEVs diffusent et comment s'organise la réponse du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle des MEVs contenant la toxine dans le développement de la maladie causée par l'infection par la bactérie. En particulier, il devrait permettre de comprendre comment la toxine diffuse dans les tissus infectés via les MEVs, et comment se développe la réponse inflammatoire. Ces nouvelles connaissances pourraient conduire au développement de nouvelles thérapies reposant sur la modulation de la réponse inflammatoire, afin de favoriser le contrôle de l’infection.
Procédures
Afin d'étudier la diffusion des MEVs, des MEVs marquées par fluorescence seront injectées soit en intraveineuse, soit dans le coussinet de la patte des souris, pour mimer une infection par la bactérie. Afin de limiter le stress des animaux, ce geste, qui prendra moins d'une minute, sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux seront surveillés jusqu’à la reprise complète d’une activité suite à leur réveil, puis seront remis dans leur cage avec leurs congénères sans réaliser d’autre geste jusqu’à la fin de la procédure. Avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera effectué. Le tout sera également réalisé sous anesthésie générale gazeuse afin de limiter le stress des animaux, et prendra également moins d'une minute. Différents organes seront ensuite prélevés (foie, rate, reins, poumons, ganglions lymphatiques, tissus cutanés et sous-cutanés au point d’injection).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables potentiels sont liés à l’injection, qui peut produire un stress et une douleur légère. Pour atténuer le stress, l’ensemble des gestes sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse, par une personne qui pratique régulièrement ces procédures, et chaque procédure durera moins d’une minute. Aucun effet indésirable n’est attendu suite au protocole expérimental. Cependant, l’injection va créer une brèche dans la peau. Le risque d’une infection via cette brèche n’est donc pas exclu, mais une visite quotidienne des animaux est prévue, et un tableau de suivi clinique des animaux sera mis en place afin de garantir leur bien-être suite aux injections.
Devenir
Le but de ce protocole étant de prélever les organes afin d’étudier la diffusion des MEVs et la réponse du système immunitaire suite aux injections, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Le bien-être animal a été l’une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. Nous avons déjà réalisé des études caractérisant la réponse inflammatoire de différentes cellules, en présence ou non de la toxine. Cependant, les processus inflammatoires sont complexes et font appel à un ensemble de cellules non modélisable in vitro. D’autre part, nous avons également réalisé des marquages des MEVs, mais leur diffusion dans les organes ne peut pas être étudiée sans utiliser d’animaux vivants. Aussi, seule l’utilisation de ces animaux peut permettre de comprendre le rôle de la toxine dans le développement de la maladie due à l’infection par la bactérie pour développer de nouvelles thérapies.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons organisé notre étude en 3 phases, chacune permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaires à la suivante. Ainsi, pour chacune des phases, le nombre de temps de prélèvements ne pourra être qu’inférieur ou égal à celui de la phase précédente.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, les animaux seront hébergés en groupes sociaux (6 animaux par cage), et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 28 jours, leur permettant de mettre en place une structure sociale. Les groupes seront définis à l’arrivée des souris, et ne seront pas modifiés par la suite, permettant ainsi de stabiliser les échanges sociaux. De plus, les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel pour faire des nids, cachettes). Pour éviter le stress lors de l’injection, le geste sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse par une personne qui pratique régulièrement cette procédure. Les souris seront surveillées jusqu’à la reprise d’une activité normale suite à leur réveil de l’anesthésie. Par la suite, une visite quotidienne des animaux est prévue pour garantir leur bien-être suite aux injections.
Choix des espèces
Ce projet ayant pour but de comprendre le rôle de la toxine contenue dans les particules produites par la bactérie dans l’infection, le modèle animal choisi correspond au modèle d’infection par la bactérie. Nos études antérieures ont utilisé deux modèles en particulier, qui sont intéressants du fait de leur capacité ou non à cicatriser spontanément suite à une infection par la bactérie : la souris BALB/c qui ne cicatrise pas spontanément, et la souris FVB/N qui au contraire a cette capacité. Les animaux seront âgés de 8 semaines au moment de l’inoculation, qui correspond à un stade de maturité immunitaire.
Etude pour l’évaluation de l’efficacité d’induction d’un gène de mort et de la destruction de lymphocytes T humains greffés chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Greffées avec des lymphocytes T humains modifiés, puis traitées par un médicament censé déclencher un gène de mort dans ces cellules, 80 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus. Chaque souris est pesée trois fois, reçoit au maximum deux injections sous anesthésie, et vingt-quatre d'entre elles subissent en plus un prélèvement de sang. L'enjeu déclaré est de valider chez l'animal vivant un système de sécurité destiné à éliminer des cellules CAR-T chez des patients en cas d'effets secondaires graves. Les nuisances décrites se limitent au stress de la contention et à la douleur des piqûres, sans que le RNT indique ce que provoque, chez la souris, la destruction massive des lymphocytes greffés.
Objectifs
Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement de maladies est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever les LT des patients pour les modifier génétiquement et les leurs réinjecter dans le but de reconnaître puis d'éliminer les cellules cancéreuses. Leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tels que la production massive de cytokines suivie par des neurotoxicités. Pour contrôler ces cellules CAR-T, en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvés. Les cellules CAR-T activées par le médicament meurent. Dans une étude précédente chez la souris, nous avons démontré que nous pouvions éliminer de façon contrôlée les cellules CAR-T génétiquement modifiées avec un médicament utilisé en clinique chez l'homme. Ce médicament est un immunosuppresseur, il ne peut donc pas être utilisé chez tous les patients notamment ceux qui sont déjà immunodéprimés. L’objectif de ce projet est de tester l'efficacité de deux autres médicaments non immunosuppresseurs cliniquement approuvés chez l'homme et capables d'induire la mort de LT humains équipés d'un gène suicide après une greffe chez la souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules CAR-T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules CAR-T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.
Procédures
Les souris seront soumises à 3 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile) à J0, J5 et J10. Deux injections maximum sur animal anesthésié et analgésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Un prélèvement de sang sur animal anesthésié sera réalisé sur 24 animaux.
Impact sur les animaux
Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et du médicament ainsi que le prélèvement de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.
Remplacement
Des tests réalisés in vitro ont montré que les médicaments utilisés sont capables d'activer le signal de mort dans des lymphocytes T humains modifiés. Nous souhaitons maintenant valider in vivo cette capacité d'induire le signal de mort, aussi, l'utilisation du modèle souris est indispensable.
Réduction
Il s'agit d'une étude comportant un effectif de 80 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 10 animaux maximum tout en permettant une analyse à l'aide d’outils statistiques appropriés sur les prélèvements analysés.
Raffinement
Les souris seront acclimatées au moins 7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les 3 pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Durant les 10 jours de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.
Choix des espèces
Afin de pouvoir greffer des LT humains, une immunodéficience est nécessaire. Nous utiliserons comme modèle une souris imunodéficiente. Cette mutation se caractérise par une absence des cellules T fonctionnelles et des cellules B, une diminution des activités des cellules présentatrices d’antigènes, des cellules myéloïdes et des cellules Natural Killer. Ces caractéristiques évitent le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-25 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.
Modèle de développement et du maintien de la gaine de myéline périphérique et centrale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
8 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent un tatouage des coussinets et une biopsie de la queue pour le génotypage, puis les jeunes de quatre à cinq semaines reçoivent des injections intrapéritonéales et sous-cutanées pendant un à quinze jours consécutifs selon le composé testé. Il s'agit de croiser deux lignées mutantes avec trois autres et de tester cinq molécules sur la formation de la gaine de myéline, les animaux atteints présentant des tremblements et une prostration qui les empêchent de se nourrir. Le porteur qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" pour comprendre le développement des cellules myélinisantes, et renvoie les retombées thérapeutiques annoncées à un terme qu'il ne précise pas.
Objectifs
Nous cherchons à déterminer le rôle d'un mécanisme moléculaire qui touche l'ARN pendant la formation et le maintien de la gaine de myéline qui entoure les nerfs chez la souris. Pour cela, nous avons généré deux modèles de souris. Le premier modèle permet d’étudier le rôle de ce mécanisme au cours du développement. Le deuxième permet une analyse chez les souris adultes. Nous souhaitons croiser ces 2 modèles avec 3 souris mutantes ou administrer par injection ou grâce à une alimentation modifiée 5 molécules différentes pour déterminer si cela permet de corriger les défauts observés. A terme, ces études permettront de proposer de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu est de déterminer si les traitements de deux modèles souris à l’aide de différentes molécules impliquées dans les voies de signalisation du stress peuvent corriger les anomalies de myélinisation périphériques et centrales. A terme, ces études permettront d'améliorer la prise en charge des patients en proposant de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Les souriceaux des lignées subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue qui engendrent un stress et une douleur de courte durée. Les mutants et les contrôles (issus de la même portée) de 4 à 5 semaines (poids >15g) subiront une injection intrapéritonéale et sous-cutanée d'une durée d'environ 15 secondes sur 1 à 15 jours consécutifs en fonction du composé.
Impact sur les animaux
Les étapes d’anesthésie, d’injection et contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. Les atteintes périphériques et centrales attendues se traduisent par des tremblements et des animaux prostrés qui se nourrissent mal, des nuisances qui seront également prises en compte dès apparition.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment les mutations d’intérêts impactent le développement et le maintien des cellules myélinisantes du système nerveux central et périphérique. L’étude des anomalies du développement de ces cellules et celle des mécanismes impliqués dans le maintien de la myéline ne peuvent pas être réalisées uniquement in vitro car elles nécessitent des interactions entre les différents types cellulaires.
Réduction
Pour chaque tissu et à chaque stade, nous anticipons que 5 animaux pour le lot mutant et le même nombre pour le lot contrôle doivent permettre d'obtenir des résultats significatifs. Les effectifs ont été déterminés pour une puissance de 80% et une p-value
Raffinement
Les femelles et leurs petits seront maintenus dans des cages contenant des enrichissements. Les nouveaux nés mutants seront surveillés quotidiennement. L'identification du phénotype délétère sera réalisée le plus tôt possible au cours du développement de l'animal et les animaux seront mis à mort dès qu'une souffrance sera détectée (prostration, tremblements...). Des points limites et une grille de score ont été définis. Points limites généraux : Souris adultes : observation quotidienne par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur de l’apparence des animaux et de leur comportement ; pesée une fois par semaine. Nouveaux nés : observation quotidienne par le personnel de l’animalerie et l’expérimentateur : absence de vitalité, isolement et absence de poche de lait. En cas d’observation de l’un de ces critères : mise à mort. Des souris de 4 semaines ou plus recevront un analgésique pré-opératoire et une dose d’anesthésique et antalgique et seront mises à mort.
Choix des espèces
Les mécanismes impliqués dans le développement des cellules myélinisées du système nerveux central et périphérique sont très conservés entre l'homme et la souris. En particulier, les phénotypes observés après délétion d’un grand nombre de gènes sont très similaires dans les deux espèces. Le modèle animal permet donc d'étudier la fonction de chacun des gènes d'intérêt au cours du développement et dans des organes de choix (nerf sciatique ou cerveau). De plus, il existe un ensemble d’outils (anticorps, culture organotypique, utilisation de lignées transgéniques permettant de tracer exclusivement le devenir des cellules de choix...) qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Nous étudierons des embryons à E18.5 mais aussi des nouveaux nés (P0, P4) et des animaux entre P30 et 4-10 semaines. Ces stades correspondent à des phases précises de développement des cellules d’intérêt que nous souhaitons étudier (E14.5/E18.5 correspond à la phase de développement des cellules d’intérêt ; P0/P4 correspond au début des processus de myélinisation périphérique ; Les analyses à P30-10 semaines et plus permettront de déterminer le rôle du gène d’intérêt sur le maintien de la myéline périphérique qui est mature à ces stades).
Evaluation de l’efficacité d’une nouvelle thérapie sur les atteintes cérébrales causées par une intoxication aux organophosphorés par imagerie TEP
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Intoxiquées par l'injection d'un agent neurotoxique organophosphoré, puis observées une heure pour relever les signes d'intoxication, 352 souris sont ensuite transportées une heure entre deux établissements pour des séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie gazeuse, jusqu'à soixante-quinze minutes chacune, répétées à un, trois et six mois. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour confronter leurs organes aux images. Le porteur attend des crises épileptiques chez les animaux exposés aux fortes doses, et précise que les antidotes administrés agissent en périphérie mais restent inefficaces sur le système nerveux central, ce que le projet vise justement à corriger. Deux critères de la grille de suivi, la respiration et la perte de poids, entraînent la mise à mort de l'animal lorsqu'ils atteignent leur valeur maximale.
Objectifs
Les composés organophosphorés (OP) tels que les agents neurotoxiques de guerre (NOP) comme le sarin, ou certains produits phytosanitaires (pesticides) (OPP), constituent une menace actuelle pour les populations militaire et civile. Si des intoxications à fortes doses constituent toujours une menace (attaque terroriste), l’exposition de manière unique ou répétée à des NOP et des OPP à des doses asymptomatiques (terrains de guerre, épandage de pesticides…) est une réalité permanente. Les rapports d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides (300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication reportés) ou lors d’utilisation de gaz neurotoxiques témoignent du besoin de développer des traitements neuroprotecteurs plus efficaces. Ce projet est un projet multisite avec deux établissements utilisateurs (EU) qui a pour objectif de tester une nouvelle thérapie pour contrecarrer les effets des intoxications aux NOP sur le système nerveux central. En effet, les traitements actuels sont composés de molécules qui n’atteignent pas le système nerveux central et constituent donc une mauvaise prise en charge des effets centraux des NOP. Le projet se concentre sur une nouvelle molécule qui semble avoir une action sur le système nerveux et son association avec une molécule déjà existante connue pour ne pas avoir d’action centrale. Ce projet est la continuité d’un autre projet et permettra d’évaluer l’efficacité de cette nouvelle thérapeutique par imagerie en utilisant la tomographie à émission de positons (TEP). En effet, des expériences menées dans le laboratoire partenaire ont mis en évidence une perturbation de la consommation de glucose après une intoxication à un analogue de neurotoxique organophosphoré (NOP) ainsi qu’une modification du nombre de synapses total, évalués par la TEP. Ce projet permettra donc d’étudier ce nouveau traitement sur ces paramètres in vivo.
Bénéfices attendus
Les données préalablement obtenues sur un modèle d’intoxication aux NOP ont montrés une modification de l’activité neuronale (mesurée par la consommation de glucose) et du nombre de synapses. Ces modifications vont entrainer des conséquences à court et à long terme, notamment comportementales. Le traitement devrait améliorer la récupération à court et long terme des animaux exposés à des agents neurotoxiques : -Lors d’une intoxication à forte dose : ce traitement devrait limiter la perturbation de la consommation de glucose et permettre de contrecarrer la perte synaptique importante engendrée lors de crise épileptique. -Lors d’une intoxication à faible dose : le traitement devrait notamment maintenir un niveau de consommation de glucose et de synapse normaux.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Intoxication à un agent neurotoxique organophosphoré par injection (temps d’injection 10 secondes) suivi par une étude comportementale d’observation (durée 1 heure) pour déterminer les signes d’intoxication. L’injection et l’étude comportementale ne seront réalisées qu’une seule fois. (Etablissement Utilisateur (EU) administration toxine) • Injection du traitement testé (une seule injection, avec un temps d’injection de 2 minutes ; (EU) administration toxine • Transport entre les deux établissements utilisateurs (1 seul transport d’une durée d’une heure) • Mise à jeun 2h avant l’imagerie (EU imagerie) • Réalisation de 2 ou 3 sessions d’imagerie à 1 mois, 3 mois et 6 mois post-intoxication (injection d’un radiotraceur durée 10 secondes) sous anesthésie gazeuse (durée 75 minutes au maximum) (EU imagerie)
Impact sur les animaux
Lors des expériences d’intoxication : •Les animaux peuvent être stressés lors des injections. De plus, l’injection du NOP ou du traitement antidotique peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Pour une partie du projet, les animaux seront exposés à une dose faible de toxique qui entraine une intoxication de faible sévérité. De plus, les effets périphériques de l’intoxication (fasciculations, tremblements…) seront atténués par l’administration des traitements antidotiques qui sont très efficaces en périphérie mais inefficace sur le système nerveux central. • En revanche, pour l’autre axe qui implique l’utilisation de fortes doses, le développement de crises épileptiques est attendu, mais les effets périphériques seront contrecarrés par l’administration des traitements antidotiques. Un stress lors du transport entre les deux établissements utilisateurs est possible. Une période d’acclimatation de 15 jours est prévue à l’arrivée avant toute expérience. Lors des expériences d’imagerie : • les rongeurs seront sous anesthésie gazeuse lors des sessions d’imagerie (2h maximum) . A leur réveil, les souris peuvent être désorientées et stressées. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage, pour remettre les animaux dans un milieu connu (congénères, odeurs…). Si un changement de cage est prévu, en cas de cage trop sale ou de dominance entre les animaux, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. • une mise à jeun des animaux 6h avant l’imagerie de la consommation de glucose dans le cerveau pouvant entrainer une perte de poids inférieure à 5%. Cette perte de poids est transitoire car les animaux sont remis en présence de nourriture dès la fin de l’expérience d’imagerie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever leurs organes et d’y étudier ex vivo certains paramètres et de les confronter aux données en imagerie.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière intégrée la réponse du système nerveux central et périphérique à un neurotoxique ou encore d’étudier la consommation de glucose et les modifications du nombre de synapses. Le recours à un modèle animal est donc indispensable.
Réduction
L’utilisation de l’imagerie permettra de réduire le nombre d’animaux, un même animal passant plusieurs examens d’imagerie au cours du temps. Nous avons calculé l’effectif des groupes (6 animaux par groupe/condition) nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Compte tenu des aléas techniques liés aux procédures d’imagerie, nous avons décidé d’inclure 8 animaux par condition pour garantir l’effectif de 6 souris pour l’interprétation des résultats finaux. D'après nos calculs/notre analyse, nous pourrons détecter une différence biologique d’au moins 20% entre les groupes traités et témoin avec une variabilité allant de 10 à 20% selon le paramètre étudié
Raffinement
Les animaux seront hébergés en conditions standards d’animalerie, 4 individus par cage avec accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Ils bénéficieront d’un milieu enrichi (matériel de nidification, tunnel). L’hébergement des animaux seul dans une cage sera limité au maximum afin de minimiser leur angoisse. Une surveillance journalière des souris pendant une semaine sera réalisée à la suite de l’intoxication et un indice sera calculé suivant une grille d’évaluation préalablement établie (ex: changements du rythme respiratoire, changement du comportement, réponses comportementales aux stimuli externes). L’indice cumulatif (addition des valeurs de chaque critère) permettra de déterminer si le bien-être de l’animal est affecté. Suivant cet indice, différentes prises en charge seront réalisées : augmentation de la surveillance (2-3 fois par jour), apport de complément alimentaire (gel hydratant…), injection de glucose et/ou injection de buprénorphine. Deux critères « vitaux » atteignant la valeur maximum entraineront l’euthanasie de l’animal : « respiration » et « perte de poids ». Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. A la suite de cette semaine et jusqu’à la fin des expériences (y compris la période d’acclimatation des animaux dans le deuxième laboratoire partenaire), des observations journalières des animaux par les expérimentateurs ou les zootechniciens seront réalisés. Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale afin de minimiser le stress de l’animal.
Choix des espèces
Les expériences se feront sur la souris Swiss. Cette souche est utilisée depuis 2005 dans l’un des laboratoires partenaires, et a permis la mise au point de récents modèles d’intoxication aux agents neurotoxiques. De plus, cette souche est maintenant utilisée dans le deuxième laboratoire partenaire et a permis la mise en évidence des désordres métaboliques sur un modèle d’intoxication à un OP. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes âgés de 9 semaines au moment de l’intoxication, poids de 38-43g. Cet âge correspond aux précédents modèles développés et utilisés dans les deux laboratoires partenaires. L’utilisation du même stade de développement nous permet ainsi de pouvoir comparer nos données et donc d’évaluer l’efficacité de ce nouveau traitement. De plus, cet âge correspond à un jeune adulte, plus applicable dans un premier temps à une prise en charge d’un jeune militaire.
Projet pilote : Evaluation de régimes optimums pour le développement des comorbidités associées à un syndrome métabolique dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune maintenue sept, huit, seize ou vingt-quatre semaines sous un régime enrichi en graisse, en cholestérol ou en fructose destiné à lui faire développer une obésité, une résistance à l'insuline, une stéatose du foie et une athérosclérose. Les femelles gestantes sont isolées cinq jours avant la mise bas et soumises au même régime, ce qui expose aussi les fœtus. Après une mise à jeun et deux tests métaboliques, les souris sont anesthésiées puis tuées pour le prélèvement de sang et d'organes. Ce projet pilote sert à choisir la lignée et le régime des études à venir, et le porteur annonce qu'il réduira le nombre d'animaux, sans qu'aucun calcul d'effectif ne soit donné pour ces 840 souris.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote qui a pour objectifs de : 1) Déterminer le modèle murin génétiquement modifié le plus adapté dans le cadre de projets de recherche étudiant l’impact de l’altération du métabolisme des lipides dans les maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité : athérosclérose, troubles du rythme cardiaque, maladies du foie non alcoolique (stéatose, stéatohépatite et fibrose hépatique), résistance à l’insuline et diabète. En effet, les souris non génétiquement modifiées soumises à un régime riche en graisse ou en cholestérol ne développent pas l’ensemble du spectre des maladies observées chez l’Homme de manière spontanée. Pour cela il est nécessaire d’utiliser des souris dont le métabolisme des lipoprotéines, les transporteurs circulants de lipides, a été modifié pour se rapprocher de celui trouvé chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but de valider quelle serait la meilleure lignée à utiliser pour permettre de répondre aux questions scientifiques du projet. 2) Déterminer le régime optimum qui permettrait d’étudier les différents aspects des maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité pour ces modèles. Ceci permettra de valider le choix de la lignée à utiliser, mais également de faciliter les échanges de données et donc de diminuer le nombre total d’animaux requis pour les différents aspects du projet..
Bénéfices attendus
Ce projet pilote permettra de sélectionner l’association régime/ génotype la plus adaptée pour répondre à différents objectifs scientifiques. Il permettra d’harmoniser les régimes et le modèle murin et de réduire le nombre d’animaux in fine. A plus long terme, le projet d’étude qui pourra être lancé permettra d’étudier les mécanismes associés à l’émergence de l’athérosclérose liés aux troubles métaboliques. De plus, ce projet permettra également de conforter l’hypothèse d’une programmation périnatale du développement de l’athérosclérose à l’âge adulte. L’ensemble de ces données permettra d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Tous les animaux impliqués dans ce projet (cohorte adulte et cohorte « développement » avec femelles gestantes et allaitantes) seront mis sous un régime riche en graisse et ou en fructose, et ou en cholestérol pour des durées variables (7, 8, 16 ou 24 semaines). La cohorte de souris adulte sera soumise à un prélèvement faible de sang sous anesthésie (moins de 10 min) avant la mise sous régime riche. Après le régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h), incluant un faible prélèvement de sang afin de mesurer le sucre dans le sang suite à une administration de glucose ou d’insuline. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes de la cohorte « développement » seront en hébergement individuel pendant 5 jours avant la mise-bas afin de préparer leur nid et assurer une alimentation comparable de leurs souriceaux, ce qui diminuera leurs interactions sociales pendant cette période. Elles seront exposées à un régime riche en graisse plus ou moins cholestérol plus ou moins fructose, ce qui pourrait générer un inconfort pour elles et le développement des fœtus. A partir de 8 semaines, les souris de la cohorte adulte seront exposées à des régimes riches en graisse plus ou moins cholestérol et plus ou moins fructose ou saccharose pendant 8,16 ou 24 semaines afin d’induire une obésité et les désordres métaboliques associés : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, etc. Ceci pourrait induire un inconfort. De plus, les souris seront soumises à deux tests d’évaluation du métabolisme qui inclus une mise à jeun et de très petits volumes de prélèvement de sang.
Devenir
Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins, sans induire plus d’inconforts aux animaux.
Remplacement
Le dialogue inter-organes (cœur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. Ainsi l’impact global d’un stress lipidique induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, il faut prendre en considération le concept que l’altération d’une fonction cellulaire (par exemple des macrophages) dans un environnement tissulaire spécifique peut avoir un écho profond dans des tissus/organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.
Réduction
Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre de lignées potentiellement intéressantes pour le projet à 2 lignées qui seront testées en séquentielle, la seconde n’étant produite qu’en cas d’échec avec la 1ère. De même, le choix préalable des régimes a pu être réduit au maximum afin d’induire les altérations cardio-métaboliques souhaitées tout en évitant les biais. La sensibilité à l’émergence des maladies métaboliques présente une différence sexuelle importante. Il convient donc de caractériser finement les animaux des deux sexes ainsi que les mécanismes impliqués, en accord avec les recommandations des sociétés savantes internationales et des comités éditoriaux des journaux scientifiques .
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux seront manipulés avec douceur, par du personnel formés et compétents, qui sera vigilant en cas de réaction comportementale excessive, ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. L’enrichissement des cages sera renforcé pour les femelles gestantes et allaitantes qui seront en hébergement individuel avec leurs petits, avec minimum de la frisure de papier kraft et un bâton à ronger.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de valider les conditions nutritionnelles qui permettent de programmer le développement d’une athérosclérose suite à une exposition périnatale. L’étude chez l’adulte permettra de d’associer le développement de maladies cardiovasculaires au régime alimentaire périnatale, mais sans éliminer l’impact du vieillissement. L’étude chez les souriceaux âgés de 10 jours quand ceux-ci sont strictement nourris au lait maternel permettra d’estimer si ce lien existe dès ce stade précoce, et ainsi de valider l’hypothèse d’une transmission maternelle. Ceci a également une importance pour la santé humaine car des hausses sensibles de la pression artérielle ont été observées chez des pré-adolescents avec un historique fœtal (retard de croissance, prématurité).