Souris

52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intraveineuse de cellules tumorales, puis jusqu'à seize cycles d'imagerie sous anesthésie gazeuse, avant une injection d'anticorps couplé à un métal radioactif et quatre anesthésies de quarante-cinq minutes en quatre jours consécutifs. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet de générer des métastases et que seul un "organisme complexe" reproduit ce que l'on rencontre chez le patient. Les métastases pulmonaires provoquent une perte de poids et des troubles respiratoires bien réels, quand le bénéfice annoncé reste un espoir pour les malades d'un sous-type de cancer du rein qui représente 5 % des cas.

Objectifs

Le rein est un élément central dans la régulation de l'homéostasie. Ils filtrent le sang et produisent un certain nombre d’hormones capitales dans la régulation de la tension artérielle. Le cancer du rein est un problème majeur de santé publique avec ~400 000 nouveaux cas par an dans le monde. Ce projet vise à cibler une protéine, initialement décrite comme participant au développement du cerveau, dans un sous-type de cancer du rein, dit chromophobe. En effet, cette protéine est spécifiquement exprimée par les cellules de la tumeur primaire et des métastases de cancer du rein chromophobe. Nous prendrons l’avantage du développement au laboratoire d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt couplé à un métal radioactif, technique appelée radiothérapie interne vectorisée. Cette technique permet soit de détecter des métastases par imagerie nucléaire ou de cibler thérapeutiquement les cellules tumorales sous l’effet des rayonnements ionisants. Ces candidats médicaments seront testés sur un modèle tumoral murin. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les cancers du rein chromophobe sont une maladie rare. Elle ne touche que 5 % des cancers du rein. Actuellement, ce sous-type de cancer du rein fait l’objet de très peu de recherche et par conséquent les perspectives thérapeutiques de ces patients sont pauvres. Par ailleurs, les patients métastatiques n’ont quant à eux aucune perspective thérapeutique, puisqu’ils reçoivent le traitement de référence des autres sous types de cancer du rein. Ce dernier n’a jamais montré d’efficacité thérapeutique dans leur pathologie. Ainsi, notre projet pourrait permettre de développer la première stratégie thérapeutique spécialement dédiée au cancer du rein chromophobe et apporter un espoir à ces patients métastatiques pour qui l’issue est aujourd’hui fatale.

Procédures

Dans ce projet, les animaux recevront tous une injection intraveineuse des cellules tumorales (2 minutes), puis au cours du suivi longitudinal hebdomadaire, ils seront au maximum soumis à 16 cycles d’imagerie (Injection d’un traceur et une anesthésie gazeuse à l’isoflurane durant l’acquisition 10 minutes). Ces gestes seront réalisés dans l'établissement utilisateur 1. Ensuite dans l'établissement utilisateur 2, certains animaux recevront une injection intraveineuse du composé pour l’imagerie sous anesthésie gazeuse (détection des métastases). Ces derniers seront ensuite soumis à 4 anesthésies gazeuse de 45 minutes pour l’imagerie nucléaire (4 jours consécutifs). Une autre partie des animaux recevront une injection intraveineuse du composé thérapeutique sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux développeront des métastases pulmonaires. L’apparition de ces métastases peut être associé à une perte de poids et à des problèmes respiratoires.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour réaliser une analyse histologique des tumeurs.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous cherchons à voir si notre molécule pourrait être utilisable pour la détection et le ciblage thérapeutique de métastases de cancer du rein chromophobe. Afin de tester l’effet de notre molécule sur des métastases, nous utilisons des modèles animaux, car il n’existe pas d’autre solution pour générer des modèles de métastases autrement que par des expériences in vivo. Seul un organisme complexe permet de récapituler les caractéristiques physiques et biologiques que l’on retrouve chez le patient (accessibilité du traitement au cellules tumorales, notamment).

Réduction

Afin de réduire considérablement nos effectifs, nous avons choisi d’utiliser une approche de suivi longitudinal par imagerie. De plus, le nombre d’animaux a été déterminé par des approches statistiques nous permettant de répondre à notre question biologique.

Raffinement

Méthodes utilisées pour réduire la douleur : La plupart des interventions sur les animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse (anesthésie générale). De plus, nous utiliserons le suivi longitudinal par imagerie pour suivre l’apparition des foyers métastatiques. De la sorte, nous serons dans la capacité d’arrêter la procédure avant l’apparition de signes cliniques. Nous avons également mis en place une grille de scoring. En fonction du score, les animaux recevront un analgésique ou ils sortiront de la procédure (mise à mort).

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle qui partage 98% son patrimoine génétique avec l’homme. Ce modèle permet donc d’étudier les mécanismes biologiques que l’on retrouve chez l’homme. Procédure 1 à 3 : 3: La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. Au début du projet, Les animaux sont âgés de 6 à 8 semaines car la prise tumorale est meilleure à cet âge.

Tuées pour des prélèvements d'organes ou de fluides à un volume qui ne permet pas la survie, ou réutilisées dans un autre projet après accord du vétérinaire : sur 780 souris, 450 passeront dans d'autres protocoles. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, suspendues par la queue pendant sept minutes, le temps qu'elles passent immobiles étant retenu comme mesure du comportement dépressif. Une partie reçoit vingt-quatre heures avant un agent pro-inflammatoire qui fait baisser leur activité, leur fréquence respiratoire et leur température, puis des candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant sept jours. Le porteur qualifie le stress de la suspension de transitoire puisque le test ne dure pas plus de sept minutes, et indique que les effets indésirables des produits seront anticipés avec le sponsor avant chaque étude.

Objectifs

La dépression, ou épisode dépressif caractérisé, est un trouble psychiatrique sévère touchant jusqu'à 20% de la population générale. Cette pathologie se caractérise par l'apparition de plusieurs symptômes comme la tristesse ou la perte de plaisir et de motivation. La dépression peut entraîner le décès du patient, notamment par suicide (jusqu'à 20% des patients atteints de dépression décèdent par suicide) (INSERM, 2019). Bien que la recherche a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes causant la ce trouble psychiatrique (comme l'inflammation ou des déficits en neurotransmetteurs), la majorité des traitements se limite aujourd'hui aux antidépresseurs. Malheureusement, ces traitements manquent d'efficacité et leur consommation s'accompagne de nombreux effets secondaires. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements pour combattre la dépression. Pour ce faire, plusieurs modèles et tests comportementaux chez l'animal existent afin de mettre en lumière des effets antidépresseurs avant caractérisation chez l'homme lors des essais cliniques. C'est par exemple le cas du test de suspension par la queue chez la souris ("tail suspension test": TST). Le test de suspension par la queue chez la souris permet de mesurer un comportement dépressif. Ce test repose sur le fait que les animaux soumis au stress inéluctable et de courte durée d'être suspendus par la queue développent une posture immobile. Ce comportement peut être exacerbé par des agents chimiques pro-inflammatoires puisque l'inflammation à un rôle dans la dépression. Divers médicaments antidépresseurs inversent l'immobilité et favorisent l'apparition d'un comportement de fuite. Le but du projet est donc de tester plusieurs candidat-médicaments indiqués pour la dépression dans le test de suspension par la queue chez la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter la dépression, une pathologie humaine touchant 20% de la population globale (INSERM, 2019). Du fait de leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer l'efficacité de nouveaux traitements antidépresseur dans un modèle expérimental de dépression mais également, d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant leur passage en phases cliniques. Ainsi, ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les animauxpourront reçevoir une administration d'un agent chimique pro-inflammatoire 24h avant le test (1 administration, env. 30sec l'administration) et reçevont des administrations de candidats-médicaments (généralement 1 administration aigue jusqu'à maximum 2 administrations par jour pendant maximum 7 jours, avec environ 2 minutes par administration) et des prélèvements (environ 3 minutes par prélèvement) et éventuellement une anesthésie en fin d’expérience pour des prélèvements. Les animaux passeront dans le test où ils seront suspendu par la queue pendant 7 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances associées au test sont l'inconfort/ douleur légère et brève et le stress induits par les administrations et la suspension de l'animal par la queue lors du test, un stress qui restera transitoire puisque le test ne durera pas plus de 7 minutes. Des effets connus et transitoires de l'agent chimique pro-inflammatoire sont également attendus à la dose max de 1mg/kg utilisée dans ce projet: baisse d'activité, de la fréquence respiratoire, et de la température. Ces effets sont transitoires et ne durent pas plus de 24h. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude avec le Sponsor afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux et/ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptomes de la dépression. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe (10 animaux par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur la depression du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

4 420 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six échocardiographies de vingt minutes sous anesthésie, six injections intrapéritonéales, six tests de force de préhension et six passages sur tapis roulant, plus une biopsie pour génotypage. Un quart des souriceaux d'une des lignées naît privé d'un gène nécessaire à la production d'énergie et meurt le premier jour de vie. Un quart de l'autre lignée développe une cardiomyopathie, avec perte de poids, mobilité réduite et posture anormale à partir de neuf semaines. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour analyse des tissus, le bénéfice annoncé se limitant à fournir des modèles et à comprendre des maladies qui restent incurables.

Objectifs

Les maladies dues à un défaut de production d’énergie, sont de maladies génétiques très rares et incurables. Ces maladies peuvent se manifester à tout âge et peuvent affecter plusieurs types d'organes en même temps. Les mutations du notre gènes d’intérêt n 1 et 2, codant des protéines essentielles pour la production d'énergie dans nos cellules, provoquent des maladies affectant le cerveau et le cœur. Comme ces maladies affectent les cellules qui ne se divisent pas, la culture cellulaire ne peut pas aider à comprendre comment le dysfonctionnement mitochondrial affecte le fonctionnement des organes affectés et le développement de la maladie. Ainsi, un modèle animal doit être utilisé pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ces maladies. Nous avons décidé d'utiliser les souris comme modèle parce que les souris sont plus proches de l’humain et la physiologie mitochondriale chez l’homme et la souris sont très similaires. Nos objectifs sont les suivants : - Création et étude d'un modèle de souris pour l'étude du développement des maladies associées au gène d’intérêt 1 et 2. La création de ces deux modèles animaux et la compréhension du développement de la maladie mitochondriale sont des étapes nécessaires à la mise au point d'un traitement efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet fournira des modèles murins pour les maladies mitochondriales et permettra de découvrir leurs mécanismes pathologiques. Ces deux points sont des étapes essentielles pour le développement d'un traitement pour ces maladies encore incurables.

Procédures

-échocardiographie (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -anesthésie gazeuse (20 min par souris; 6 fois maximum par souris) -injection intra-péritonéale (1 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -grip-test (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris) -treadmill (5 min par souris ; 6 fois maximum par souris); biopsie pour génotypage: (1 min par souris; 1 fois par souris )

Impact sur les animaux

Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 1 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront une cardiomyopathie.. À partir de 9 semaines, ces souris peuvent commencer à perdre du poids et avoir une mobilité réduite avec une posture anormale. Les souris où l’expression du notre gène d’intérêt 2 est abolie (seuls 25% des souris de chaque portée), développeront maladie neurologique et meurent le premier jour de vie. Les autres nuisances que les souris subiront sont le stress pendant le test comportementaux, pendant l’échocardiographie, pendant l’injection intra péritonéal et le stress pendant le transport vers le centre expert de l’échocardiographie.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour l'analyse moléculaire, histologique et biochimique des tissus.

Remplacement

L’objectif de notre projet est d’étudier la pathophysiologie des maladies mitochondriales. Pour cette raison l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. La préparation des cultures cellulaires primaires, pour l'étude du rôle moléculaire des protéines codées par notre gènes d’intérêt, aide à réduire le nombre d'animaux utilisés mais ils ne peuvent malheureusement pas remplacer l'utilisation du modèle animal.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris utilisées pour les expériences, nous nous sommes basés sur nos précédents travaux sur l’étude d’autres modèles murins de maladies mitochondriales et sur de méthodes et analyses statistiques. De plus, lorsque cela est possible, les prélèvements d’une même souris seront utilisés pour plusieurs analyses. L’échocardiographie est elle-même une méthode de réduction car elle permet un suivi longitudinal des souris, par opposition à une mise à mort séquentielle.Nous utiliserons des méthodes statistiques comme des tests t de Student et Anova en fonction des groupes d’animaux comparés.

Raffinement

Dans un contexte de raffinement adapté, les animaux seront surveillés quotidiennement par les techniciens de l'animalerie (dans les weekends par les personnes d’astreinte), et une fois par semaine par les chercheurs travaillant sur ce projet, pour détecter un éventuel état de souffrance et/ou d’angoisse. Pour minimiser la détresse causée par les symptômes de la maladie, nous avons établi des critères de décision pour la mise à mort des souris lorsque cela est nécessaire. Concernant l'échocardiographie, les souris seront anesthésiées, pour être capable de mesurer correctement les différents paramètres du système cardiaque et éviter le stress. Concernant les injections le volume injecté sera réduit au minimum possible et la solution sera chauffée à la température ambiante. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupée dans un milieu enrichi avec des carrés de coton, des maisonnettes et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Le transfert des souris vers le centre expert de l’échocardiographie se fera dans des cages de transport sécurisées dans des véhicules dédiées tout en réduisant les vibrations et le bruit.

Choix des espèces

Les souris sont génétiquement, physiologiquement et anatomiquement proches des humains. La physiologie mitochondriale et la tissu-spécificité des fonctions mitochondriales chez l’homme et la souris sont très similaires. Pour nos études, nous utiliserons des souris de différentes tranches d'âge (nouveau-nés, souris juvéniles et juvéniles adultes). Les tests comportementaux et les échocardiographies seront réalisés sur des souris âgées de 3 semaines et plus.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, l'autre sans chirurgie, puis toutes passent une échographie sous anesthésie chaque semaine, certaines une IRM d'une heure et des prélèvements de sang hebdomadaires pratiqués sur animal éveillé. Le porteur range parmi les effets attendus une perte de poids supérieure à 20 %, des mutilations, de l'agressivité et les douleurs dues à l'implantation des tumeurs. Il écrit que "seule l'utilisation de modèles animaux" permet d'atteindre ses objectifs, et que la mise à mort en fin de procédure est "indispensable".

Objectifs

Le cancer du pancréas (adénocarcinome pancréatique canalaire) est la troisième cause de décès par cancer dans les pays occidentaux. Son très mauvais pronostic s’explique par l'absence de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et d’approches thérapeutiques efficaces lorsque la chirurgie n’est plus possible. Les chimiothérapies actuelles améliorent peu la survie des patients, et les thérapies ciblées et immunothérapies n’ont pas encore eu l’effet clinique escompté. Dans ce contexte, notre équipe de recherche conduit depuis plusieurs années, des projets de recherche fondamentaux et translationnels jusqu’à la clinique pour comprendre comment ce cancer se met en place, pour identifier les patients à risque et ceux porteurs de lésions précoces, pour vaincre la résistance aux traitements et proposer une thérapie sur mesure. Seule l'utilisation de modèles animaux peut nous permettre d'atteindre ces objectifs. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs agréés.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la validation de stratégies thérapeutiques efficaces pour la prise en charge du cancer du pancréas

Procédures

Tous les animaux inclus dans les différents protocoles expérimentaux seront soumis au suivi de la progression tumorale par échographie, une fois par semaine au niveau de l'unité expérimentale EU 1/2. Cette procédure non invasive ne requiert que l'anesthésie des animaux. Sur la période, 480 souris seront soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques ne nécessitant pas de chirurgie. Sur la période, 480 souris seront soumises à une greffe de cellules tumorales pancréatiques nécessitant une chirurgie. La transplantation cellulaire sera effectuée en une seule intervention d'une durée de 15 à 20 minutes. Dans certains cas, les souris vigiles pourront être soumises à des prélèvements sanguins au cours du développement tumoral (recherche de biomarqueurs sanguins précoces, de réponse au traitement, marqueurs métaboliques, immunophénotypage). Un prélèvement sera effectué avant l'apparition de la tumeur puis une fois par semaine pendant la durée de l'expérimentation. En IRM des images anatomiques (pondérée T2) de l’abdomen (avec synchronisation au mouvements respiratoires) seront réalisé une fois, en contrôle, avant administration de la thérapie et une fois, 1 à 2 semaines après la première. Soit 2 acquisitions pas animal, afin de déterminer le volume et la localisation de la (des) tumeur(s). La durée d'analyse par souris est d'environ 1 heure. Le suivi de la progression tumorale par imagerie optique (durée de l'analyse 5 minutes par souris) et par échographie (durée de l'analyse 10 mn par souris) sera réalisé une fois en contrôle, avant administration de la thérapie puis une fois par semaine pendant la durée du protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une dégradation de l'état général ; comportement anormal (modification de l'activité générale, léchages, mutilation, agitation, agressivité), modifications d'aspect (perte de poids supérieure à 20%), modifications motrices, modifications végétatives (pilo-érection, variation de la température cutanée), des douleurs dues à l'implantation des tumeurs.

Devenir

La mise à mort des animaux en fin de procédure est indispensable à la réalisation d'études comparatives afin de mettre en évidence les mécanismes antitumoraux mis en jeux.

Remplacement

Notre projet de recherche fondamentale et translationnelle pour la découverte de biomarqueurs et pour la thérapie du cancer du pancréas nécessite l'utilisation de modèles murins de référence reproduisant fidèlement la complexité et l'hétérogénéité intra- et inter-tumorale de la pathologie humaine. Ces critères ne peuvent être apportés par les modèles cellulaires. L'utilité de ces modèles dans nos domaines de recherche est reconnue et validée internationalement. Les publications scientifiques, notre retour d'expériences et la mise en commun des informations et données expérimentales provenant de ces modèles permettent d'appliquer les principes de remplacement, de réduction et de raffinement dans nos protocoles.

Réduction

Nous avons réalisé une étude statistique qui nous a amené à réduire le nombre d'animaux par groupe à 6, afin d'obtenir des résultats exploitables

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront suivis quotidiennement et seront placés sous structure du Bien être animal (SBEA) pour les procédures classées modérées (chirurgie, prélèvement et injections). Par ailleurs, nous utiliserons deux méthodes d'imagerie non invasive pour le suivi de la croissance tumorale. Pour toutes les procédures décrites dans ce projet, les animaux hébergés en zone d'expérimentation EU 1/2 seront transférés vers les salles d'expérimentation selon une procédure adaptée qui garantit leur maintien en bonne santé, leur bien-être et respecte les exigences scientifiques. Les animaux seront transportés dans leur cage sur un chariot adapté, avec accès à la nourriture pendant le transfert. Les biberons seront retirés pour éviter l'humidification de la litière et remis en place dès l'arrivée des cages dans les laboratoires appropriés. Le retour vers la zone d'hébergement se déroulera selon les mêmes modalités. Nous utiliserons des analgésiques pour diminuer la douleur dès que nécessaire, et des croquettes seront placées dans la cage pour faciliter la récupération post-procédure. La douleur sera évaluée par observation du comportement général de l’animal (recherche de toute modification du comportement : isolement, absence de réaction lorsque l’animal est attrapé,ne s’agrippe plus aux barreaux de sa cage), de l’état du pelage (poils hérissés, mal entretenus, pelage terne). Des points limites ont été définis pour chaque procédure expérimentale. Dès que l'un d'entre eux sera atteint l'animal sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle d'étude de base le plus pertinent pour notre projet. Les allo- et xénogreffes chez la souris immuno-déficiente sont utilisées pour les tests précliniques. Les méthodologies d'investigation sont bien décrites, les protocoles expérimentaux sont disponibles et partagés. Ceci permet de réduire le nombre de souris nécessaires. Les animaux pourront être livrés à partir de 5 semaines d'âge, pour acclimatation d'une semaine avant la mise en expérimentation.

Une injection unique dans le muscle, puis jusqu'à dix prises de sang sous anesthésie gazeuse en quinze à soixante jours : 600 souris porteuses d'une anomalie génétique de dystrophie musculaire vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs muscles, leur foie et leur rate. Le projet compare des vecteurs de thérapie génique pour retenir celui qui reste efficace aux doses les plus faibles, le porteur rappelant que des essais cliniques récents dans la myopathie de Duchenne ont provoqué des effets indésirables allant jusqu'au décès. Il décrit pourtant toutes les atteintes comme légères et affirme qu'aucune nuisance n'est attendue des traitements, tous "de nature bénéfique". Sur les 600 animaux, il écrit seulement que le nombre par groupe est optimisé, sans donner ni effectif de groupe ni calcul.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont un ensemble de pathologies invalidantes sans traitement présentant des atteintes fonctionnelles (réduction de la force musculaire, avec parfois atteinte cardiaque ou respiratoire). Les modèles animaux de ces maladies sont des souris. Une option thérapeutique possible est la thérapie génique, qui consiste à apporter une copie normale correspondant au gène mutant à l’aide d’un véhicule appelé vecteur. Celui utilisé est dérivé d’un virus appelé virus non-pathogène associé à l’Adenovirus (AAV) dans lequel on introduit le gène médicament en lieu et place du génome viral. La thérapie génique clinique a connu un succès significatif ces dernières années avec, en particulier, l’autorisation du Zolgensma pour l’amyotrophie spinale de type I. Malgré ces récents succès, la délivrance sûre et efficace de matériel génétique continue d'être un défi majeur dans le cas des maladies neuromusculaires. En effet, le muscle squelettique représentant environ 40% de la masse corporelle est un véritable défi en termes de délivrance et de production de vecteurs, car jusqu'à présent les doses thérapeutiques prédites par les études sur de grands modèles animaux sont extrêmement élevées. Des effets adverses allant jusqu’au décès ont pu être observés dans de récents essais cliniques, en particulier dans la myopathie de Duchenne, sans compter que la perfusion de doses élevées de vecteurs est susceptible de déclencher des toxicités immunitaires indésirables. Par conséquent, il y a un grand intérêt à définir des stratégies permettant une efficacité aux doses les plus faibles possibles. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de produits portant un gène thérapeutique afin de sélectionner la forme la plus intéressantes en termes d’expression.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous proposons de définir les meilleurs produits de thérapie génique, Les résultats pourraient permettre l’établissement de traitements de thérapie génique ayant une meilleure efficacité et une plus grande tolérance pour de futures applications chez l'Homme afin de traiter ces dystrophies musculaires qui n’ont pas de traitement à l’heure actuelle et qui sont très invalidantes voire léthales.

Procédures

Le traitement par transfert de gène se fait par injection intramusculaire une seule fois en moins de 5 minutes, Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée moins de 5 minutes. Une étude peut durer entre 15 et 60 jours maximum de ce fait un animal pourra être prélevé au maximum 10 fois. Cependant pour certains transferts de gène les animaux ne seront prélevés que toutes les 2 ou 3 semaines en fonction de la nécessité de suivre la réponse immunitaire. Selon nos expériences certains gènes provoquent peu de réponse immunitaire. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères et sont liées en particulier à la nature des différents actes réalisés : douleur de piqûres pour administration d’anesthésique, d’intramusculaire pour injection du traitement par transfert de gène. Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie. Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. En ce qui concerne les modèles utilisés, même s’ils portent une anomalie génétique correspondant à une dystrophie musculaire progressive chez l’homme, ils présentent un phénotype moins important que les patients. Ils ne présentent donc pas de phénotype délétère à l’exception des modèles les plus sévères au stade avancé de la pathologie où l’on peut observer une scoliose ou une atrophie musculaire. Cependant, dans ce projet, nous utiliserons des animaux à des âges où aucune conséquence sur le comportement n’est observée. L’ensemble des animaux n’exprime donc pas de phénotype dommageable. Il n’y a pas de nuisances attendues dans ce projet par rapport à l’effet des traitements, qui sont tous de nature bénéfique et sont utilisés à des doses correspondant à la fenêtre thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes. Les muscles permettront de mesurer l’efficacité d’expression alors que, les organes tels que le foie ou la rate permettent de vérifier l’absence de toxicité.

Remplacement

Des étapes de validation de vecteurs antérieures à cette procédure ont été faites in vitro. . Théoriquement, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale peuvent être de différentes natures : méthodes in silico ou in vitro. Les approches in silico utilisées en alternative à l’expérimentation animale à ce jour permettent uniquement des modélisations physico-chimiques comme la relation entre structure et activité biologique d’une molécule ou des modélisations toxico-cinétiques d’élimination de molécules. Des modèles in silico qui pourraient permettre de modéliser numériquement les expériences proposées dans ce projet à partir d’un ensemble de données n’existent donc pas à ce jour. Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doivent prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire.

Réduction

Nous utiliserons les mêmes animaux contrôles pour des expériences différentes chaque fois que possible. Un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi. Les animaux sont anesthésiés lorsque les procédures expérimentales sont jugées potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique si nécessaire. Les prélèvements de sang sont effectués sous anesthésie de courte durée. Nous appliquons les points limites établis préalablement et utilisons les procédures d’euthanasies appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir la température corporelle stable lors de la phase de réveil, ou l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies. L’euthanasie des animaux est programmée avant l’âge d’apparition de signes cliniques pour éviter les risques d’apparition de phénotype dommageable pour les lignées les plus sévères.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur ces espèces. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de vecteurs. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité de vecteur suffisante pour mesurer l’efficacité d’expression du gène médicament.