Souris
Identification de molécules pour traiter un stress chronique imprévisible (CUS) chez la souris et évaluation du comportement 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Un projet qui vend à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques la validation in vivo de leur molécule antidépressive utilise 1 500 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère pour 1 250 d'entre elles. Pendant huit semaines, chaque animal reçoit un stress par jour, contention, stress olfactif, stress social, perturbation du rythme circadien, avant cinq jours d'isolement en cage individuelle pour mesurer sa préférence pour l'eau sucrée. Toutes sont tuées ensuite, pour mesurer la motilité de leur intestin et doser des marqueurs de dépression dans leur cerveau. Le porteur classe chaque stress isolé comme léger en raison de sa brièveté, et reconnaît que leur accumulation sur huit semaines relève de la classe sévère.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs -EU 1/2 et EU 2/2/). Aujourd’hui, la recherche sur la dépression est entravée par la complexité des facteurs induisant cette maladie. Par ailleurs, il est connu que le stress chronique imprévisible (CUS), assimilé à la dépression, est un modèle de fragilisation de la barrière intestinale. Ce modèle CUS validé par la communauté scientifique chez la souris, permet la découverte de nouvelles molécules (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) agissant sur le système digestif afin de diminuer la dépression. Notre objectif est donc d'offrir à des entreprises pharmaceutiques ou nutraceutiques, publiques ou privées, une validation in vivo de leur molécule (probiotiques, prébiotiques, molécules pharmacologiques) et montrer qu'elle peut être un traitement antidépresseur. La dépression affecte 15% de la population. Ces chiffres n’ont cessé d’augmenter depuis les années 70 ce qui en fera la pathologie la plus coûteuse d’ici 2030 selon l’OMS. Les traitements actuels sont insuffisants puisqu’il existe un risque de récidive de l’ordre de 50% au bout de 6 mois d’arrêt de traitement. De plus, jusqu’à 80% des suicides sont le fait d’individus dépressifs. Par ailleurs, la recherche sur la dépression est entravée par les effets indésirables de certains antidépresseurs (troubles du sommeil etc) ainsi que par la complexité des facteurs induisant cette maladie (sociaux, psychologiques et biologiques). Ainsi, la pathologie de la dépression est un problème majeur de santé publique qui nécessite de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Il est connu que les antidépresseurs ont de nombreux effets indésirables. De plus, de nombreuses études ont démontré, lors d’études précliniques et cliniques, qu'à la dépression sont associés une altération de la fonction de barrière intestinale ainsi qu’un déséquilibre de la flore intestinale. La découverte de nouvelles molécules agissant sur le système digestif est donc considérée comme une avancée thérapeutique majeure pour traiter le syndrome dépressif.
Procédures
Les différents types d'intervention se feront sur animal vigile uniquement. Parmi 60 souris, 10 représentent le groupe contrôle (sans intervention) appelé G1. Pour développer un stress chronique et imprévisible chez la souris (e.g dépression), des stress différents vont être utilisés sur les 8 semaines de protocole de stress (CUS). Un seul stress par jour va être appliqué à l'animal pendant 8 semaines. Les différents types de stress sont des stress de contention, stress olfactifs, stress sociaux, stress environnementaux, et une perturbation du rythme circadien. Le second groupe (G2) subira ces stress pendant 8 semaines. Le troisième groupe (G3) subira le protocole de stress pendant 8 semaines et recevra un traitement antidépresseur connu. Ce groupe permet de comparer les effets des molécules à tester contre la dépression avec l’antidépresseur connu. Enfin, les souris du quatrième groupe (G4) subiront également les protocoles de stress associés à un traitement à tester (probiotique, prébiotiques par exemple). Cette étape d'induction d'un stress chez l'animal s'effectuera dans l'EU ½. Après 8 semaines, une évaluation comportementale des souris sera effectuée dans l’EU 2/2. Le niveau d’anxiété des animaux, leur activité exploratoire, ainsi que leur état “dépressif” sera évalué au moyen de tests de comportement sur une période de 8 jours.
Impact sur les animaux
Les souris des groupes stressés ou CUS seront soumises à un stress, une fois par jours pendant 8 semaines consécutives. Sur la durée, les animaux soumis à différents stress présenteront un pelage moins bien entretenu sans présenter de blessure ni d’anomalies physiques graves. Ces animaux vont subir certaines contraintes d'une courte durée (une fois par jour, le matin). L’intensité de la nuisance de ces stress cumulés est modérée. De plus, le groupe stressé recevant le traitement avec l’antidépresseur de référence recevra une injection quotidienne tout le temps du protocole de stress (8 semaines). L’intensité de la nuisance de ces injections répétées est modérée. Le dernier groupe recevra par voie orale le traitement à tester pendant la durée du protocole. L’intensité de la nuisance de ces gavages sur 8 semaines est faible. Les animaux vont également subir des contraintes de courte durée pendant les tests comportementaux, et notamment lors d’un test de comportement au cours duquel les animaux seront placés dans une position inconfortable pendant quelques minutes. L’intensité de la nuisance de ce test est modérée. Lors du test de préférence au sucrose, les souris vont être placées en cage individuelle pendant 5 jours afin de mesurer leur consommation hydrique. L’intensité de la nuisance due à l’isolation des animaux pendant 5 jours consécutifs est modérée.
Devenir
Les souris seront ensuite mises à mort afin d'étudier la motilité intestinale de ces souris grâce à des capteurs isotoniques. De plus en post mortem, l'analyse de marqueurs spécifiques d'un état dépressif sera effectuée sur différentes parties du cerveau.
Remplacement
Pour identifier des probiotiques ou molécules capables de diminuer la dépression, nous avons besoin d’individus vivants en contact ou non avec des agents stressants détaillés dans les procédures. En effet, l’état dépressif implique un contexte psychosocial, physique et physiologique particulier et leur combinaison est essentielle à son installation. De plus notre projet implique la communication inter-organes (intestin-cerveau), il n'est donc pas possible de se passer d'organismes complets. Malheureusement aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible pour répondre à la problématique posée.
Réduction
Le modèle de stress chronique imprévisible ou CUS est un modèle détaillé et validé dans la littérature. De plus, la souris est un modèle de référence dans l’étude des désordres psychiques comme la dépression. Notre maîtrise de l’utilisation de la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux. Par ailleurs, notre protocole de stress a été soumis à une veille bibliographique minutieuse et validé par différents spécialistes du secteur. Les effectifs ont été optimisés afin d’assurer la reproductibilité de nos résultats tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les stress pris individuellement peuvent être qualifiés de léger, en raison de leur brièveté. Deux des tests comportementaux peuvent être chacun considéré comme modérée, du fait de l’inconfort et de l’isolement nécessaire à leur exécution. Le temps de repos entre chaque test comportemental bien qu'important et suffisant pour permettre un retour à la normale de l’état des animaux, l'accumulation de l'ensemble de ces stress nous semble de classe sévère. C'est pourquoi la surveillance des animaux et surtout leur comportement seront observés avec une grande vigilance. Les conditions d’élevage des animaux non stressés seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Une surveillance quotidienne de chaque souris sera effectuée. La préhension des souris s'effectuera avec une nouvelle technique "main en coupe" permettant de limiter au maximum le stress de l'animal en dehors des procédures expérimentales de stress.
Choix des espèces
La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. En effet, de nombreuses publications justifient cet animal comme modèle à l’instar du rat. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux. La souris est un des modèles utilisés pour mimer parfaitement le syndrome de la dépression chez l’Homme. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux (pas d'induction de la dépression à cet âge), de ce fait les animaux auront à minima 8 semaines (âge adulte).
Prélèvements biologiques pour les analyses génétiques d’animaux en élevage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 660
Fournir aux chercheurs des lots d'animaux au génotype vérifié : c'est l'objet déclaré d'un projet qui porte sur 119 170 souris et 660 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit un seul prélèvement, un poinçon dans l'oreille en routine, parfois un morceau de queue entre quatorze et dix-sept jours de vie, très rarement une prise de sang. Le porteur décrit des nuisances "légères et brèves" tout en listant inflammation, œdème, hématome et saignement au point de prélèvement, et l'effectif de 119 830 animaux n'est appuyé par aucun calcul. Une partie part vers d'autres établissements pour y être expérimentée, une autre sert à l'élevage, et les animaux dont le génotype ne convient pas aux croisements ou dont la fécondité baisse sont tués.
Objectifs
Notre établissement héberge dans ces animaleries différentes lignées de souris et de rats génétiquement altérées pour le compte de chercheurs externes au laboratoire. Ce projet a pour objectif de décrire les méthodes de prélèvement d’échantillons biologiques (tissu, sang) pour les contrôles génétique (génotype) d’animaux en élevage. Ces analyses permettent de surveiller et préserver la qualité génétique des modèles élevés dans notre unité afin de fournir aux chercheurs les lots expérimentaux maîtrisés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec divers enrichissements. Le prélèvement invasif pour le génotypage est dissocié de l’intervention d’identification. Le génotypage ne sera pas systématique lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons ainsi uniquement les reproducteurs. Le prélèvement sanguin n'est pas utilisé fréquemment pour le génotypage et sera utilisé uniquement pour les protocoles particuliers. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser ces techniques rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal. Par ailleurs, les animaux seront suivis tous les jours et, si lors de la surveillance journalière un animal présente des signes cliniques suite au prélèvement, une grille d’évaluation de signes cliniques sera appliquée par les zootechniciens, et la vétérinaire et/ou la SBEA sera sollicitée pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement (par exemple : enrichissement supplémentaire, croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage).
Bénéfices attendus
Les prélèvements décrits sont effectués pour les analyses qui permettent de surveiller et préserver la qualité génétique des modèles élevés dans notre établissement afin de fournir aux chercheurs les lots expérimentaux maîtrisés.
Procédures
Un seul prélèvement par animal sera réalisé pour génotypage : - de tissu par poinçon (oreille, en routine) ou à l’aide d’un ciseau (oreille en routine, queue exceptionnellement), ou - de sang, très rarement (par la veine en sub-mandibulaire). Si les résultats obtenus ne sont pas clairs pour interprétation, nous referons l’analyse sur l'échantillon prélevé qui sera conservé. Si les résultats ne sont pas concluants après ce deuxième test, un échantillonnage supplémentaire (oreille ou sang) sera exceptionnellement effectué sur le même animal. Dans ce cas, il y aura a minima une semaine d’écart entre les deux prélèvements sur le même animal. Ces interventions durent moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
La manipulation pour les prélèvements peut provoquer un léger stress chez l'animal. Les signes cliniques (inflammation, œdème, hématome, saignement) sur le site de prélèvement sont possibles mais le plus souvent évités si la biopsie est bien exécutée. La biopsie de l’oreille (réalisée en routine) provoque moins d’inconfort que celle de la queue parce qu’elle ne touche pas un tissu osseux. La biopsie de l'oreille ne sera jamais effectuée chez les souris âgées de moins de 2 semaines compte tenu de la petite taille de leurs oreilles. La biopsie de la queue sera effectuée seulement si la biopsie de l'oreille ne convient pas à l'étude (justification scientifique) et après l'avis favorable de la SBEA. Cette technique pourra être effectuée seulement chez les jeunes souris (âgées de 14 à 17 jours) pour éviter de toucher aux vertèbres distales ayant atteint la maturité, et la taille de l’échantillon prélevé devra être la plus petite possible pour permettre le génotypage. Le prélèvement sanguin n'est pas utilisé fréquemment et sera réalisé pour des analyses particulières. Le volume prélevé dépendra du poids de l'animal et, compte tenu du risque de choc hypovolémique chez les jeunes animaux, sera réalisé uniquement sur des animaux âgés de 2 mois ou plus. Les prélèvements ne sont réalisés qu’une fois par animal et durent moins de 30 secondes. Les nuisances liées à ces techniques seront légères et brèves. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser ces techniques rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal.
Devenir
Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt sera expédiée dans d’autres établissements utilisateurs pour expérimentation. Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage ou l’expérimentation dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g. si génotype sans intérêt pour les schémas de croisements, surplus, ou si leur fécondité est réduite du fait de leur âge). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation seront mis à mort.
Remplacement
Les modèles de souris et de rats concernés par ce projet générique sont inscrits dans différents projets scientifiques extérieurs à notre laboratoire. Les porteurs de projets apporteront dans chacune de leurs DAP d'utilisation des précisions sur les alternatives non animales disponibles et expliqueront pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
Réduction
Le prélèvement pour génotypage sera réalisé uniquement sur les animaux reproducteurs lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote et ne sera pas systématique pour les autres lignées, mais limité aux besoins de l’élevage ou de l’expérimentation pour les EU destinataires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages de taille réglementaire avec divers enrichissements (tunnel et/ou dômes en polycarbonate transparent rouge, frisure de papier kraft et/ou du celluron et/ou des granulés ou bois de rongeage). Les animaleries de notre unité ont un contrôle sanitaire périodique. Les prélèvements pour les analyses durent moins de 30 secondes. Nous réaliserons en routine uniquement le prélèvement à l’oreille. Le prélèvement de la queue et du sang n'est pas utilisé fréquemment pour le génotypage et sera utilisé uniquement pour les protocoles particuliers. Le génotypage ne sera pas systématique lorsqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons ainsi uniquement les reproducteurs. L’expérience de notre unité dans la gestion de colonies permet de réaliser les techniques de prélèvements rapidement par du personnel qualifié, réduisant ainsi au minimum le stress et les nuisances associés à la manipulation de l’animal. Par ailleurs, si lors de la surveillance journalière un animal présente des signes cliniques suite au prélèvement, une grille d’évaluation de signes cliniques sera appliquée par les zootechniciens, et la vétérinaire et/ou la SBEA sera sollicitée pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement (par exemple : enrichissement supplémentaire, croquettes humides et/ou aliment gélifié déposés dans la cage, soin sur le site du prélèvement).
Choix des espèces
La souris et le rat sont parmi des modèles d'animaux les plus utilisés dans la recherche en raison de leurs nombreuses similitudes avec l’homme. De plus, le choix de ces modèles est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature permettant ainsi des échanges internationaux au sein de la communauté scientifique. Les justifications techniques et scientifiques détaillées pour chaque lignée utilisée seront apportées dans les projets « utilisateurs » (DAP spécifique). Une partie des animaux sera utilisée pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable selon la souche. Une autre partie sera utilisée dans notre établissement ou envoyée dans d’autres établissements pour expérimentation selon l’âge d’utilisation dans de différents projets scientifiques. Les animaux en élevage pourront être prélevés pour les analyses à différents âges selon la technique utilisée : - 15 jours ou plus pour le prélèvement à l'oreille (ne sera jamais effectué avant cet âge compte tenu de la petite taille des oreilles) - entre 14 et 17 jours pour le prélèvement de la queue (pour éviter de toucher aux vertèbres distales ayant atteint la maturité) - 2 mois ou plus pour le prélèvement de sang (compte tenu du risque de choc hypovolémique chez les jeunes animaux).
Comparaison de l’efficacité de deux traitements dans un modèle murin de syndrome hémolytique et urémique (SHU).
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Les tremblements sont retenus comme point limite déclenchant la mise à mort. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent une injection de Shiga-toxine qui reproduit un syndrome hémolytique et urémique, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil sous anesthésie. Le porteur écrit que ces injections n'induisent "pas de traumatisme ou de douleur" tout en décrivant des yeux mi-clos, des diarrhées, un poil piqué et des tremblements, et présente l'utilisation des animaux comme "indispensable" pour comparer deux traitements.
Objectifs
La Shiga-toxine (STx2) est produite par une bactérie de la famille Escherichia coli et est la cause d’une maladie infectieuse grave (SHU) le plus souvent d’origine alimentaire. Le SHU appartient à une famille de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. La STx2 entraîne d’une part l’inflammation et la mort cellulaire massive, et d’autre part l’activation du système du complément, qui participe aux mécanismes de défense naturels. Le traitement de ces pathologies comprend des traitements non spécifiques et des traitements spécifiques ciblant système du complément, comme l'anticorps anti-C5, le premier traitement approuvé pour le SHU chez les patients pédiatriques et adultes. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires dans les cellules et dans des modèles de souris infectées. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de la clusterine et de l’anticorps anti-C5a dans le SHU afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.
Bénéfices attendus
Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance rénale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.
Procédures
1/ L’Injection intra péritonéale sera utilisée pour les 4 lots de souris. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 2/ L’Injection intra veineuse sera utilisée pour 2 lots de souris. Elle concerne 40 au total, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 3/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée pour les 4 lots de souris. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 4/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée pour les 4 lots de souris. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner les 80 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal.
Impact sur les animaux
L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. Le poil pourra présenter un aspect piqué, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.
Remplacement
Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.
Réduction
Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (80) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Les souris seront placées par nombre de 4 par cage. L’alimentation et l’abreuvement seront fournies ad libitum tout le long de l’hébergement. Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro- orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.
Altération des oligodendrocytes dans la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
578 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, vingt d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Les animaux portent une mutation qui provoque une perte de poids vers quatre-vingt-dix jours, puis une paralysie vers cent vingt jours et la mort vers cent trente jours, avec des difficultés à se déplacer, à boire et à manger. Ils reçoivent une injection dans les ventricules cérébraux, des injections intrapéritonéales quotidiennes, des prises de sang tous les quatorze jours et des tests de force musculaire et de coordination jusqu'au point limite, pour évaluer une thérapie visant les oligodendrocytes. Le porteur écrit que le modèle animal est "indispensable", précise que 416 des 578 souris ne seront utilisées que si la première partie du projet échoue, et garde en vie les souris d'élevage pour les réutiliser dans d'autres projets tant qu'elles n'ont pas atteint les points limites.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurologique fatale qui apparait à l’âge adulte. Elle est caractérisée par la perte progressive des motoneurones, menant à une paralysie puis au décès 3 à 5 ans après le diagnostic. Jusqu’à présent, il n’existe pas de traitement curatif, d’où la nécessité de développer une thérapie efficace. L’altération des oligodendrocytes est l’un des mécanismes pathologiques proposés dans la sclérose en plaque. On observe chez les patients souffrants de cette maladie une diminution du nombre d’oligodendrocytes myélinisantes adultes. Par ailleurs différentes études chez l'animal vivant ont montré que les précurseurs des oligodendrocytes (OPC) ne parviennent pas à subir l'étape finale de différenciation dans les modèles animaux. Notre projet vise à développer une thérapie ciblée vis-à-vis des oligodendrocytes, qui a pour but de stimuler la différentiation des oligodendrocytes et par conséquent, rétablir le nombre des oligodendrocytes matures myélinisantes. Cette étude nécessite l’emploi de souris qui présentent un phénotype proche de la sclérose en plaque (perte de poids, faiblesse musculaire, paralysie). Les animaux déclarent les premiers symptômes à 90 jours, puis leur état général se dégrade jusqu’à la mort, à environ 130 jours. Ce projet a deux approches : une approche cellulaire et une approche génique virale visant à stimuler la différentiation des oligodendrocytes chez l'animal vivant.. L’objectif est de tester une possible thérapie qui pourra être utilisée chez les patients atteints de sclérose en plaque liées aux mutations SOD dans le futur.
Bénéfices attendus
Nous émettons l’hypothèse que l’augmentation du taux d’oligodendrocytes matures et myélinisantes puisse représenter un outil thérapeutique utile pour traiter la sclérose en plaque. A court terme nous envisageons les bénéfices sur les souris traitées avec la thérapie cellulaire et la thérapie génique virale. Nous attendons des effets bénéfiques sur les symptômes de la sclérose en plaque ainsi que sur la survie. S’agissant de bénéfices à long terme, nous envisageons la mise en place d'études pré-cliniques et cliniques pour étudier les effets bénéfiques de l'administration de la thérapie cellulaire et la thérapie génique chez des sujets atteints de sclérose latérale amyotrophique.
Procédures
Les souris élevées pour ce projet sont susceptibles de développer un phénotype dommageable caractérisé par une perte de poids vers 90 jours puis une atteinte musculaire conduisant à la paralysie (vers 120 jours) puis la mort de l'animal. Les souris immunodéficientes sont plus sensibles aux infections car elles ne possèdent pas de systèmes immunitaires. Un prélèvement de queue sera réalisé sur ses souris vigiles afin de vérifier si elles sont ou non porteuses du gène qui nous intéresse. Une anesthésie locale sera réalisée par immersion de la queue de l'animal dans de l'éthanol refroidi. Ce geste ne nécessite que quelques secondes. 5 différentes interventions auront lieu au cours des différentes procédures dont 1 sur souris anesthésiée et 4 sur souris vigiles ; une unique injection intracérébroventriculaire à J60, réalisée sous anesthésie générale et analgésie, et d’une durée n’excédant pas les 30 minutes, une unique injection intracérébroventriculaire chez le nouveau-né, sous anesthésie locale, d’une durée de 2 minutes, des injections intrapéritonéales quotidiennes sur souris vigiles, d’une durée de moins d’une minute, des prélèvements de sang au niveau de la veine sous-mandibulaire sur souris vigiles, tous les 14 jours de J60 jusqu’au point limite (1 minute suffit pour réaliser ce geste) et, sur souris vigiles, tests comportementaux (pesée, test de force musculaire, score neurologique et test de coordination motrice) une fois tous les 14 jours de J60 (dans le cas de l’injection chez l’adulte) ou de J21 (dans le cas de l’injection chez les nouveaux-nés) jusqu’au point limite. Le temps total pour réaliser ces tests comportementaux n’excède pas 20 minutes par souris ; le score neurologique, qui permet de scorer les signes de déficience neurologique, et la pesée sont réalisés l’un après l’autre avec une durée totale d’environ 1min, suivi par le test de force musculaire, qui nécessite moins de 5 minutes pour les 3 mesures. Pour finir, le test de coordination motrice a une durée totale inférieure à 10 minutes avec 2 mesures (de 2minutes maximum) et avec 5 minutes de repos entre les 2. Concernant l'euthanasie, les animaux pour lesquels des prélèvements seront réalisés seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative des motoneurones de l'adulte qui se caractérise par une dégénérescence progressive des motoneurones. Elle provoque une paralysie progressive de l'ensemble des muscles. Les souris utilisées pour la survie présenteront donc des signes de dégénérescence comme la paralysie des pattes et/ou du bassin. Cela entraînera des difficultés pour se déplacer, s'hydrater et s'alimenter. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie de queue de quelques millimètres pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée. Les chirurgies impliquent une anesthésie pouvant entraîner une hypothermie ou un arrêt cardio-respiratoire et peuvent entraîner des douleurs post-opératoires. Un inconfort lié à la contention ainsi qu'une douleur de courte durée associée à l’introduction de l’aiguille lors des administrations ou les prélèvements sanguins sont à prévoir. Les tests fonctionnels réalisés chez la souris peuvent également entraîner un stress chez l’animal.
Devenir
Tout au long de ce projet les souris seront euthanasiées et leurs cerveaux et moelles épinières seront récupérés pour faire des analyses biomoléculaires et histologiques afin de valider l'efficacité ou non de nos traitements, sauf les souris impliquées dans la creation des colonies, qui seront réutilisées pour d'autre projet tant qu'elles n'ont pas atteint les points limites.
Remplacement
Actuellement, aucun modèle in vitro n’existe pour pouvoir mener une étude pré-clinique dans la sclérose latérale amyotrophique. Le modèle animal est indispensable pour optimiser et développer nos approches de thérapie cellulaire et thérapie génique pour cette maladie. Ce modèle, particulièrement bien caractérisé, nous permettra de quantifier l’efficacité de nos traitements. La finalité de cette étude est de développer des stratégies thérapeutiques, ce qui ne peut se faire que sur un modèle animal. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Afin de limiter leur utilisation, un nombre restreint d’animaux sera utilisé en contrôle non injecté, un même animal servira pour différentes expériences et, pour chacune d’entre elles, le nombre d’animaux utilisés a été choisi pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement interprétables. De plus nous utiliserons des mâles et des femelles, ce qui nous permet d’utiliser l’ensemble des animaux générés par nos accouplements limitant ainsi d’autant le nombre de portées nécessaires. Il est également important de signaler qu'une partie du projet ne sera réalisé que dans le cas où la première partie ne fonctionne pas et que 416 animaux ne seront potentiellement pas utilisé sur les 578 animaux prévus.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Elles consistent en un contrôle quotidien des cages, un changement régulier, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de laine de bois afin que les souris puissent faire un nid ainsi que de lanières de papier Kraft et des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Au cours des différentes procédures, la température des souris est maintenue constante à l’aide d’une plate-forme chauffante ou sous lampe radiante. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de relever le moindre signe de souffrance. Une anesthésie sera réalisée et un contrôle post opératoire aura lieu dans les heures ainsi que les jours qui suivent afin de fournir une analgésie adaptée aux animaux. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de la naissance à la mort, et un contrôle du poids sera réalisé une fois par semaine avant l'apparition des symptômes de la maladie, puis autant de fois que nécessaire après l'apparition des symptômes afin de contrôler précisément les points limites qui, une fois atteint, entraineront automatiquement l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance excessive.
Choix des espèces
Dans le cadre de notre projet, nous utiliserons modèle murin transgénique pour la sclérose latérale amyotrophique. Cette souche reproduit les principaux symptômes de la sclérose latérale amyotrophique à partir de 90 jours due à l’accumulation de la protéine SOD entrainant la paralysie progressive, et éventuellement la mort aux alentours de 130 jours. Nous utiliserons les nouveau-nés et les souris adultes âgées de 90 jours afin d’évaluer l’efficacité du traitement précoce et plus tardivement
Etude de l’émergence d’anomalies épileptiques chez un modèle murin de Sclérose Latérale Amyotrophique et Démence FrontoTemporale
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à 576 heures d'enregistrement cérébral par animal, par tranches de quatre-vingt-seize heures consécutives chaque semaine : 132 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Celles opérées à l'âge adulte vivent seules pendant six semaines, de la chirurgie jusqu'à leurs trois mois, les électrodes implantées dans le cerveau interdisant de les garder en groupe. Le porteur indique que la moitié des souriceaux mutés meurent trois semaines après la naissance et que les autres font des crises d'épilepsie entre une et trois semaines de vie, l'objet du projet étant de caractériser ces crises. Il décrit la connexion hebdomadaire au système d'enregistrement comme "simple à réaliser et indolore", et prévoit la mise à mort des animaux surnuméraires au sevrage pour ne pas stresser leurs parents.
Objectifs
La protéine d’intérêt (PI) étudiée dans ce projet est impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la démence frontotemporale (DFT). Ces maladies sont dites neurodégénératives, c’est à dire qu’elles sont caractérisées par une perte progressive des neurones. Ce projet a pour but de mieux comprendre l'implication de cette protéine PI dans la régulation de l’activité des neurones. En condition normale, elle se situe majoritairement dans le noyau, où elle a plusieurs fonctions. Le noyau est la structure qui contient l’essentiel de l’information génétique de la cellule. Il est entouré du cytoplasme, qui est une structure cellulaire dans laquelle les protéines sont produites. Ainsi, PI doit être transportée du cytoplasme (où elle est produite) jusqu’au noyau (où elle doit se trouver pour remplir ses fonctions). Ce transport est permis car PI contient un "domaine de localisation nucléaire”. Ce domaine est une région spécifique qui indique qu’une protéine doit être transportée jusqu’au noyau. En condition pathologique, PI n‘est plus transportée jusqu‘au noyau, la protéine s‘accumule donc dans le cytoplasme. Chez les souris, il est possible d’induire la SLA et la DFT en supprimant le domaine de localisation nucléaire de PI afin qu’elle ne soit plus transportée jusqu’au noyau et s’accumule dans le cytoplasme. Chez les souris et les humains, cela s’accompagne, entre autres, de défauts des neurones inhibiteurs. Ces neurones sont importants pour réguler l‘activité électrique du cerveau en l‘empêchant d‘être trop élevée. Pour comprendre le rôle des neurones inhibiteurs dans les pathologies liées à PI, il existe une lignée de souris dans laquelle PI est mutée spécifiquement dans les neurones inhibiteurs. Les premières caractérisations de cette lignée montrent que cette mutation pourrait être pertinente en dehors de l'étude de la SLA-DFT. Lorsqu’une seule copie du gène PI est mutée (l’autre restant à l’état sauvage), les souris présentent une activité électrique anormale dans le cerveau à l’âge adulte. Lorsque les deux copies du gène PI sont mutées, les souriceaux développent des symptômes qui pourraient être liés à une activité électrique anormale dans le cerveau, voire à des crises d'épilepsie. Ce projet a alors pour but d’évaluer l’activité électrique dans le cerveau de souris juvéniles et jeunes adultes, et de caractériser les possibles crises d'épilepsie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes pathologiques présents chez des souris qui ont une protéine d’intérêt (PI) mutée spécifiquement dans certains types de neurones. Les neurones sont les cellules électriques du cerveau. Leur fonctionnement, et donc le fonctionnement du cerveau, peuvent être modifiés par des mutations. Ainsi, le projet permettra de savoir si l’activité électrique dans le cerveau des souris mutées est anormale avant même qu’elles ne deviennent adultes. Ces souris modélisent des maladies neurodégénératives. Or, les maladies neurodégénératives, telles que la sclérose latérale amyotrophique et la démence frontotemporale, apparaissent majoritairement à l’âge adulte mais il est possible que des altérations soient présentes dès l’enfance, voire avant. En observant des altérations chez des souriceaux et jeunes souris, ce projet soulèverait la question de possibles altérations précoces dans des maladies diagnostiquées bien plus tardivement. Ce projet permettra également d’étudier les mécanismes à l’origine des potentielles crises d’épilepsie. Ainsi, à long terme, ce projet permettra de mieux comprendre l‘implication de PI dans la régulation du fonctionnement des neurones chez l’humain. Un rapprochement pourrait alors être fait entre les pathologies connues pour être liées à PI et l’épilepsie.
Procédures
Les souris étudiées pour ce projet pourraient présenter une activité électrique anormale dans le cerveau, voire des crises d'épilepsie. Afin de vérifier cela, les souris seront étudiées et recevront les gestes techniques mentionnés ci-après. Pour savoir si les animaux sont mutants ou non, un prélèvement d’un bout d’oreille et/ou de l’extrémité distale de la queue devra être réalisé. Ce geste sera réalisé par des personnes expérimentées, sur animal vigile, une seule fois dans la vie de l’animal et durant très peu de temps (cela ne prend que quelques secondes par animal). Une chirurgie d'une heure maximum sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Une seule procédure chirurgicale par animal sera réalisée. Chez les souris adultes la chirurgie sera réalisée à partir de 6 semaines (1,5 mois). A partir de ce moment, ces souris devront être isolées jusqu’à leur 12 semaines (3 mois). Elles seront donc isolées durant 6 semaines (1,5 mois) maximum. La chirurgie sera également réalisée sur des souriceaux de moins d’un mois (avant sevrage). Les souriceaux non-sevrés rejoindront le reste de la portée et leurs parents, qui auront été préparés pour éviter de les rejeter. Ils ne seront donc pas isolés. Après une période de convalescence, l’activité électrique du cerveau des animaux sera mesurée. Pour cela les souris devront être connectées à un système d’enregistrement. Cette connexion hebdomadaire est simple à réaliser et indolore pour les souris. Ces dernières seront vigiles, et pourront se déplacer librement durant le test. Pour les souriceaux, ces tests auront lieu sur 5 jours consécutifs, d’abord durant 1h par jour puis en augmentant progressivement cette durée jusqu’à 3h par jour. Au maximum, les souriceaux réaliseront 5 enregistrements par semaine, soit (5 enregistrements x 3h)15h d’enregistrement par semaine . Pour les souris adultes les tests auront lieu (4 enregistrements *24h) sur 96 heures consécutives par semaine jusqu’à leur 3 mois. Au maximum, les souris adultes réaliseront (6x96h) 576 heures enregistrements. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
une partie des souriceaux mutés sont systématiquement plus petits et plus légers que leurs congénères appartenant aux mêmes portées. Par ailleurs, ces souriceaux développeront potentiellement des crises d’épilepsie lorsqu’ils auront entre une et trois semaines. Les premières caractérisations de la lignée montrent que ces souris ont parfois des phases d'absence ou de baisse d’activité. Ces phases sont courtes, le plus souvent suivies par une période où le souriceau redevient actif, et les mères continuent de s’occuper des souriceaux même quand ils sont peu actifs. La moitié de ces souriceaux mutés décèderont trois semaines après la naissance. En revanche, les souris mutées adultes ne présentent pas de symptômes indésirables visibles. Lors du prélèvement (du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue) pour déterminer si l’animal est muté ou non, il pourra ressentir une légère et brève douleur. La chirurgie pourrait créer de l’inconfort et des douleurs, qui seront suivies de près par les expérimentateurs et personnels de soin animalier. Pour mesurer l‘activité électrique du cerveau, les animaux devront être isolés. Pour les souriceaux, il pourrait y avoir un stress et un inconfort lié à l’absence de leur mère. En dehors des phases de test, le protocole mis en place permettra aux souriceaux et à leurs parents d’être hébergés ensemble, ce qui aura un effet bénéfique sur l’ensemble des animaux. A l’inverse les souris opérées à l’âge adulte devront être isolées dès la chirurgie et le resteront pendant la durée de l’étude jusqu’à l’âge de trois mois.
Devenir
Les animaux nécessaires à l’étude seront produits grâce à des accouplements contrôlés, les animaux surnuméraires seront euthanasiés au moment du sevrage (c’est-à-dire lorsqu’ils auront 3 à 4 semaines) pour ne pas stresser leurs parents. Les animaux inclus dans les procédures de chirurgie et enregistrements seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge de trois mois maximum si aucune crise ne survient. Ils ne peuvent pas être gardés en vie et réutilisés après ce projet car ils auront des électrodes implantées dans le cerveau. Les parents seront euthanasiés à la fin de l’étude car ils n’auront plus l’âge de se reproduire.
Remplacement
Avec ce projet nous souhaitons étudier l'implication d’une protéine dans la régulation de l’activité électrique du cerveau. Plus précisément, il s’agira de définir si une mutation, lorsqu’elle a lieu dans un type cellulaire spécifique, entraine la survenue de crises d’épilepsie. Nous ne pouvons pas étudier cela avec des cultures cellulaires car elles ne reproduisent pas toutes les propriétés des crises d'épilepsie observées dans un cerveau entier. La modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes et ne nous permet donc pas, pour le moment, de répondre à notre question scientifique. Sachant cela, l’utilisation d’un organisme entier est nécessaire. Cependant, nous ne pouvons pas étudier la mutation d’intérêt chez l’humain car il faudrait s’assurer que la mutation soit présente uniquement dans les cellules qui nous intéressent (ce qui n’est possible qu’avec une étude post-mortem), tout en mesurant l’activité électrique du cerveau des sujets vivants. Finalement, l’utilisation d’animaux est nécessaire afin de reproduire à la fois la complexité du système nerveux et la complexité comportementale.
Réduction
Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la constitution des groupes expérimentaux en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Au total nous aurons 132 animaux inclus dans le projet, dont 12 reproducteurs et 35 souris opérées. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul statistique. Ce dernier pourra être ajusté selon les premiers résultats, selon les différences observées entre chaque groupe et la possible variabilité au sein d’un même groupe. Une fois les données récoltées, des tests statistiques seront utilisés pour assurer une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur concernant la taille des cages, le nombre d‘animaux par cage, la température ambiante, le taux d‘humidité, les cycles de lumière, et l’accès à l’eau et à la nourriture. Les cages seront enrichies d’un nid de coton et, si besoin d’une maison en carton. Le prélèvement du bout d’oreille ou de l’extrémité de la queue (pour savoir si les animaux sont mutants ou non) est rapide, parfaitement maitrisé et pratiqué au calme. Il a lieu au même moment que l’identification pour limiter la manipulation de la portée. Le matériel est propre et désinfecté entre chaque animal pour limiter le risque d’infection et de contamination. Le transport des animaux sera réalisé selon les normes en vigueur et avec un transporteur agréé. Les symptômes que pourraient développer les souris ne sont pas encore complètement caractérisés, c’est pourquoi les animaux seront étroitement surveillé par le personnel de soin animalier et les expérimentateurs. Des points limites ont été définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Avant la chirurgie, des phases d’habituation permettront aux souriceaux et à leurs parents de découvrir les gestes et matériaux nécessaires pour l’opération. Lors de la chirurgie et après, une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée sera assurée. Une fois anesthésié, les animaux seront maintenus à bonne température et leurs yeux seront protégés pour qu’ils ne se dessèchent pas. Suite à la chirurgie, les animaux feront l’objet d’un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée jusqu’à leur réveil complet. L’expérimentateur et le personnel de soin animalier réaliseront ensuite une surveillance quotidienne étroite pendant une semaine. Un médicament antidouleur sera administré toutes les 12h. Si nécessaire, ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal. Après la chirurgie, les animaux seront pesés chaque jour pendant une semaine, puis une fois par semaine pour s‘assurer qu‘ils ne perdent pas de poids.
Choix des espèces
Ce projet sera mené avec des souris, qui sont encore aujourd’hui l’un des modèles animaux les plus pertinents dans le domaine de la recherche sur les maladies neurodégénératives et l’épilepsie. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques : 1) Cette étude nécessite des modifications génétiques très précises (mutation d’une protéine d’intérêt dans un seul type de cellules du cerveau). 2) Avoir une lignée pure, dont certaines caractéristiques génétiques sont stables, homogènes et utilisées dans les laboratoires du monde entier, permet de pouvoir comparer et reproduire des résultats. De cette façon, le nombre d’animaux nécessaires est réduit. 3) Cette espèce est largement utilisée pour étudier les crises d’épilepsie. Elle a été explorée de manière exhaustive, du niveau moléculaire jusqu‘à l‘échelle du comportement animal. Cela permet d‘avoir une solide base scientifique sur laquelle le projet se repose. 4) Les rongeurs ont un cerveau qui génère des activités électriques et des crises d’épilepsie dont les mécanismes pathologiques, au niveau moléculaire et cellulaire, sont similaires à l'humain. Les procédures seront réalisées sur des animaux de 7 jours (prélèvement pour savoir si les animaux sont mutés ou non) à 3 mois (euthanasie). Pour une partie des animaux, la chirurgie aura lieu quand ils auront 12 à 14 jours. Pour l’autre partie, la chirurgie sera réalisée quand les animaux auront 6 semaines (1,5 mois).
Etude de l’évolution du profil des macrophages lors d’un changement de régime alimentaire causant le diabéte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
20 440 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à onze prélèvements de sang, six injections intrapéritonéales, un régime alimentaire de une à vingt semaines, deux mises à jeun et un gavage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les régimes servent à provoquer obésité, athérosclérose et stéatose du foie chez des souris déjà modifiées génétiquement, pour suivre le comportement des macrophages. Toutes les souris en expérimentation sont tuées pour analyse, et le porteur ajoute que les femelles non mises en accouplement et celles dont le génotype ne convient pas sont tuées au sevrage. Le bénéfice annoncé tient en une phrase sur la progression du diabète de type II, quand le raffinement se limite à deux lignes sur des "conditions optimales" et des points limites "adaptés".
Objectifs
L’objectif du projet est de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans les différents problèmes médicaux engendrés par le diabète de type II (obésité, athérosclérose, stéatoses hépatiques, etc.). Pour cela les souris, en plus de leur modification génétique sur des gènes clés, seront soumises à différents régimes alimentaires afin d’induire les pathologies. Nous pourrons ainsi déterminer quels sont les cibles privilégiées pour envisager de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Améliorer la compréhenstion du rôle des cellules immunitaires dans les mécanimes des maladies impliquées dans le diabète de type II est primordial. En effet cette maladie, qualifiée d'épidémie mondiale sur le site du ministère de la santé et de la prévention, est en constante progression.
Procédures
• Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. • Prélèvement de sang : maximum 11 fois par animal, 2-3 secondes. • Prélevement sanguin en sub-mandibulaire maximum 6 fois par animal, 2-3 secondes• Régime alimentaire : " durée entre 1 et 20 semaines. • Injection intrapéritonéale (IP) : 6 injections, 2-3 secondes. A la fin du régime : • Mise à jeun : une fois 12h et une fois 6h. • Gavage : une fois par animal, 5-10 secondes.
Impact sur les animaux
• Biopsie extrême pointe de la queue : douleur légère de courte durée • Prélèvement de sang en sub mandubulaire et à l'extrémité de la queue sur animal vigile : douleur modérée au moment de la réalisation du geste. • Anesthésie gazeuse : légère hypothermie possible • Régime alimentaire : les animaux vont prendre ou perdre du poids • Injection intrapéritonéale (IP) : douleur légère de courte durée. A la fin du régime : • Mise à jeun : Jeun de courte durée: stress et sensation de faim. • Gavage : stress de courte durée.
Devenir
Tous les animaux en expérimentations seront mis à mort pour analyses. Les femmelles non-mises en accouplement et les souris n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort au moment du seuvrage.
Remplacement
Dans le cadre de l'étude des réponses du système immunitaire à des régimes alimentaires (mimants les maladies induites par le diabète de type II), nous avons besoin d'analyses ces variations à l'échelle d'un organisme entier. En effet, les régimes alimentaires vont provoquer des modifications dans les tissus gras, le foie et la pancréas. Nous ne pouvons pas étudier ces effets sans utiliser le modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales pour leur bien-être. De plus,nous avons mis en place des points limites adaptés.
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète, en effet les gènes impliqués dans l’obésité et le diabète (dont les gènes de l'inflammation chronique) jusqu’à présent identifiés sont très proches chez la souris et chez l’Homme. De plus la souris est un modèle permettant l'obtention relativement rapide du nombre d'individus suffisant. La souris est également un modèle pour lequel il existe beaucoup d’outils disponibles : modification du génome pour créer les meilleurs modèles d'études possible, méthodes d'analyses des tissus prélevés, etc. L'ensemble de ces critères font de la souris le modèle optimal pour répondre aux questions du présent projet. Les animaux seront inclus à partir de l'age de 8 semaines, ce qui correspond à l'age jeune adulte chez la souris.
Etude collaborative de l’impact de l’insuffisance cardiaque sur la sévérité du Covid 19 et de l’efficacité de son traitement chez la souris (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Rendues insuffisantes cardiaques par une chirurgie de cent dix minutes dans un premier établissement, puis transportées vers un second, 92 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles y reçoivent un traitement ou un placebo par voie orale, puis une suspension de SARS-CoV-2 dans le nez, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Ce qui est fait pendant l'opération de cent dix minutes n'est jamais précisé, alors que le RNT annonce un infarctus du myocarde et une insuffisance cardiaque installée, et qu'il affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des échographies des huit semaines suivantes. Sur le remplacement, le porteur conclut à la "nécessité" de réaliser l'étude in vivo, aucune approche in vitro ne reproduisant selon lui l'ensemble d'un processus d'infection.
Objectifs
Les coronavirus sont une grande famille de virus qui provoquent des maladies allant du simple rhume à des maladies respiratoires très graves. Au 2 février 2022, sur un total de plus de 376 millions d'infections liées au coronavirus (COVID-19) dans le monde, 5,6 millions sont décédées à ce jour, dont plus de 128 000 en France. 73% des victimes du coronavirus en France avaient 75 ans ou plus. Le type le plus courant de maladie associée entraînant la mort après une infection par le coronavirus SRAS-Cov-2 est la maladie cardiaque. En effet, près d’un tiers des personnes décédées du Covid-19 souffraient de maladies cardiovasculaires, dont l'insuffisance cardiaque était majoritaire. Les maladies cardiovasculaires préexistantes ont été proposées pour identifier les patients à risque plus élevé de résultats indésirables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), mais les preuves existantes sont contradictoires. Ainsi, il n'est pas clair si les maladies cardiovasculaires préexistantes sont indépendamment des facteurs prédictifs importants de COVID-19 sévère et encore plus importants pour le succès du traitement. Il a été montré que les maladies cardiovasculaires préexistantes entraînent une inflammation accrue et un risque de lésion myocardique lors de l'infection chez la souris, ce qui est cohérent avec les observations chez l'Homme. Une autre stratégie est l'induction de maladies cardiovasculaires, comme proposé dans ce projet. Dans ce contexte, l'objectif du projet est de tirer parti de la complémentarité des centres de recherche nationaux pour évaluer les effets des maladies cardiaques sur la sévérité de l'infection par le Covid19 et l'efficacité des thérapeutiques antivirales dans les conditions cardiovasculaires à l'aide d'un outil préclinique murin. Chronologiquement, un premier établissement de recherche va générer des animaux insuffisants cardiaques (avec les mêmes atteintes que celles développées chez les patients), puis dans un deuxième temps, un autre établissement de recherche va étudier les effets des traitements et de l’infection par le COVID-19 chez cette population de souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet se situent à différents niveaux : 1) Répondre au besoin de recherche sur la compréhension des mécanismes de la maladie grave dans la population touchée par le COVID-19, 2) Élaborer la preuve de concept pour offrir de nouveaux modèles expérimentaux plus proche de la clinique, 3) Délivrer un service basé sur des expertises complémentaires, en évitant de dupliquer investissements et expérimentations, 4) Évaluer l'impact de l'infection du covid-19 chez les patients souffrants de maladies cardiovasculaires. Il reste encore beaucoup à apprendre sur le rôle des maladies cardiovasculaires dans le COVID-19 humain, et les modèles animaux atteints de maladies cardiovasculaires sont fondamentaux pour déterminer le rôle de l'infection par rapport aux maladies cardiovasculaires dans la gravité de la maladie. Ces efforts peuvent également conduire à la conception et évaluation de thérapies antivirales, anti-inflammatoires et vaccinales spécifiques contre le COVID-19 sévère qui fonctionnent le mieux dans le contexte de conditions médicales particulières.
Procédures
Au sein de l’établissement EU1, chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une échographie cardiaque préopératoire (20 min), 2) une procédure chirurgicale (110 minutes), 3) une échographie cardiaque à 8 semaines (20 min). 4) envoi des animaux à l’établissement partenaire. Au sein de l’établissement EU 2 , chaque animal sera soumis sous anesthésie à : 1) une administration du traitement ou du placebo par voie orale (20 min), 2) une administration intranasale d’une suspension virale (20 min), 3) des prélèvements d’organes pour des études d’infection virale (30 min).
Impact sur les animaux
Les souris subiront un infarctus du myocarde et des symptômes d’insuffisance cardiaque conséquente à la maladie. Nous nous attendons à un cœur plus gros et un remplissage du cœur diminué, raison de l’étude. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) sur la période considérées (8 semaines). Les animaux insuffisants cardiaques seront ensuite envoyés vers l’EU 2 par un transporteur agréé. Aucune perte n’a été notée jusqu’à ce jour, et une procédure est en place pour limiter le stress des animaux. Les souris subiront aussi une infection avec le virus SarsCov2 et des symptômes de la maladie. Sous anesthésie, les souris subiront des injections intranasales pour tester l’efficacité des traitements contre les effets du covid-19, finalité de l’étude.
Devenir
A la fin des procédures expérimentales décrites ci-dessus, les animaux seront mis à mort pour les prélèvements des organes.
Remplacement
Notre étude ayant pour but d'établir une nouvelle stratégie d’étude du Covid-19 en association à différentes maladies cardiovasculaires et d'évaluer son impact à long terme sur l’efficacité de traitement contre la maladie virale, il apparait ainsi pertinent d'effectuer ces analyses sur l'animal entier et non sur des modèles in vitro. Il n’y a pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un processus d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivi de la réponse immune.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum de telle manière que les échantillons récupérés (n=5) soient suffisamment nombreux et donc représentatifs du groupe, afin que les données récoltées soient robustes statistiquement. En effet, si les groupes sont constitués de trop peu d’individus, la puissance statistique des données sera trop faible pour en tirer une conclusion fiable, ce qui impliquerait de répéter l’expérience et donc d’impliquer de nouveaux animaux. Il en va de même pour les animaux utilisés pour le suivi et la survie (n=13). De plus, dans cette étude, un groupe « témoin » (groupe 2, voir Annexe 1) ne portant pas de maladie cardiovasculaire est impliqué (constitué du même nombre d’animaux que le groupe 1 « test » soit n=36), et pourra être utilisé comme contrôle pour plusieurs prestations. Cela permettra de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés sur le long terme dans les recherches. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupe de 5 pour éviter le stress de l’isolement et les cages seront systématiquement enrichies par l’ajout de plusieurs éléments, notamment de la nourriture hydratée dès que nécessaire pour pallier toute perte de poids et/ou déshydratation durant leur hébergement. Les souris en expérimentations seront observées quotidiennement par le personnel formé et qualifié en charge de l’expérimentation. L’utilisation de grille de score journalier permettra de définir les soins à mettre en œuvre aux premiers signes de souffrance chez les souris sur la base de points limite définis. Selon le cas, le vétérinaire référent et le chef de projet sont prévenus pour décider, soit de soins/analgésie adaptés et compatibles avec le projet, soit de la mise à mort précoce de l'animal. L’expérimentation est optimisée en amont par le choix de modèle utilisé, la planification de protocole pour éviter le stress et mise en place des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure comme décrits ci-dessus. Le raffinement est également mis en place pendant l’expérimentation et il concerne les méthodes et les procédures des soins adéquats pendant et après l’infection ; l’anesthésie/analgésie et les procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
La physiologie et la génétique de la souris étant « proches » de celles de l’Homme, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Notre objectif principal est de comprendre l’effet des comorbidités à la susceptibilité à l’infection avec Sars Cov 2. Un modèle murin donnera non seulement des informations clés sur la physiopathologie du Covid19, mais servira également de plateforme d'évaluation préclinique à haut débit pour identifier des antiviraux et des vaccins performants, essentiels pour les essais humains en aval. Les nombreux travaux et les publications ont validé l’utilisation de modèle de la souris étant adapté pour comprendre et avancer la pathologie de COVID19. À l’heure actuelle, aucune approche in vitro ne permet de reproduire de façon satisfaisante l’ensemble des phénomènes impliqués dans un procès d’infection de l’initiation au développement de la pathologie et au suivie de la réponse immune. Ces différents arguments soulignent la nécessité de réaliser notre étude in vivo avec des modèles de souris. Il n’y pas de méthode sans l’utilisation de modèle animal permettant d’atteindre l’objectif visé de cette étude. Nous prévoyons d’utiliser des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Il s'agit ici d'un âge moyen le plus souvent utilisé pour les études dans le domaine dans la littérature.
Etude de l’impact d’une exposition fœto-maternelle au chlordécone sur le système nerveux nigro-strié de la souris et lien avec les syndromes Parkinsoniens – EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 souris exposées au chlordécone, pendant la gestation ou à l'âge adulte, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit d'entre elles passent une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, avec six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique par injection. Les quarante-huit autres enchaînent trois tests répétés jusqu'à six fois, motricité fine, olfaction après seize heures de privation de nourriture, puis anxiété et motricité générale, le projet se répartissant sur deux établissements avec un transport entre les deux. Le porteur écrit que les modalités d'exposition sont "présumées ne pas induire d'effets indésirables", et que des organoïdes existent mais ne sont "pas encore développés au laboratoire".
Objectifs
Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.
Procédures
Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.
Impact sur les animaux
Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance
Devenir
L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.
Remplacement
A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.
Raffinement
Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.
Mise en évidence du rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) dans le recrutement des lymphocytes B dans les tumeurs de souris (Mus musculus)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Après une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, des souris développent des nodules pulmonaires qui peuvent causer des douleurs, des difficultés respiratoires, une prostration et l'arrêt du toilettage. 1 794 souris de 6 à 10 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : selon les groupes, une injection sous anesthésie ou sous simple analgésie locale, puis trois ou quatre injections éveillées, et pour 54 d'entre elles une chirurgie suivie de 1 à 3 heures de microscopie intravitale. Le porteur affirme que le point final de chaque expérience "se situe bien avant d'atteindre les points limites", pour des procédures qu'il déclare pourtant en souffrance sévère. Toutes sont tuées pour des prélèvements de tumeurs ou d'organes, ou à l'issue d'une chirurgie prolongée, et 810 d'entre elles reçoivent encore une injection éveillées une heure avant leur mise à mort.
Objectifs
Les traitements par l’immunothérapie anti-cancéreuse ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces chez tous les patients. Les vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) sont des vaisseaux sanguins particuliers présents dans les tumeurs murines et humaines. Ils sont les portes d’entrées majeures des lymphocytes dans les tumeurs aux cours de l’immunité antitumorale et lors de traitements combinés d’immunothérapie (anti-CTLA-4 et anti PD-1). De plus, un traitement augmentant la fréquence et la maturité de ces vaisseaux induit une meilleure réponse à l‘immunothérapie dans des modèles précliniques murins. Enfin, dans les tumeurs fortement infiltrées par les cellules immunitaires ou tumeurs « chaudes », la présence de lymphocytes B et de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) riches en lymphocytes B dans les tumeurs est souvent associée à une bonne réponse à l’immunothérapie. Cependant, les mécanismes qui régulent l’entrée des lymphocytes B dans ces tumeurs restent inconnus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces vaisseaux dans l’infiltration des lymphocytes B et la formation des TLS dans les tumeurs « chaudes » traitées par immunothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs dans l'établissement de structures lymphoïde tertiaires (TLS). Ces TLS sont des structures qui ressemblent en partie à nos ganglions lymphatiques et leur induction et leur développement pourrait favoriser la réponse immunitaire anti-cancéreuse.
Procédures
540 souris subiront une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes), ces 540 animaux subiront aussi quatre injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 1200 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes) ainsi que trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). 810 souris parmi ces 1200 inclus subiront en plus, 1h avant leur mise à mort, une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes). 54 souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes), ces 54 animaux subiront trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). Ces 54 animaux seront anesthésiés avant la pose d’un cathéter, puis subiront une chirurgie nécessaire à la microscopie intra vitale, cette procédure dure moins d’1h, l’imagerie quant à elle dure en moyenne une heure pour la microscopie intravitale à champ large et de 2 à 3h pour la microscopie intravitale multiphoton.
Impact sur les animaux
Pour les modèles de développement de tumeurs au niveau des poumons, l’injection des cellules tumorales dans la veine de la queue peut induire une douleur modérée et la contention de l'animal pour cette injection peut entrainer du stress. L’évolution du cancer se manifeste par une apparition de nodules au niveau des poumons ce qui peut causer des douleurs, des difficultés respiratoires et une dégradation de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Pour les modèles de tumeurs développées, l’injection des cellules tumorales peut provoquer du stress chez l'animal. Le développement tumoral peut aussi causer des douleurs et une dégradation visible de l’état des animaux (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements…). Les traitements d'immunothérapie peuvent avoir des effets indésirables identiques à ceux observés chez l'homme avec une inflammation et une auto-immunité.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements de tumeurs ou d’organes ou bien à l’issue d’une chirurgie prolongée ne permettant pas de réutilisation des animaux
Remplacement
Les procédures réalisées sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximum pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement, en utilisant des tests de comparaison de moyennes multiples appropriés. Le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.
Raffinement
La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille des scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections intraveineuses sont réalisées sous anesthésie locale et avec un matériel de contention dédié et optimisé pour ces injections.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.
Evaluation de l’activité et d’absence de toxicité de produits synthétiques de transfert d’acides nucléiques chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour mettre sur le marché des agents qui font entrer de l'ADN et de l'ARN dans les cellules, des souris de 6 semaines reçoivent jusqu'à trois injections de ces produits, par voie sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intranasale. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques de leurs organes, après une à quatre prises de sang. Les produits peuvent provoquer des thromboses, des réactions inflammatoires ou des troubles de la démarche, alors que le porteur dit vouloir "valider l'activité et l'absence de toxicité des produits". Il justifie le choix de la souris par l'usage majoritaire de cette espèce dans les phases de recherche, et parce qu'elle "permet d'induire une réponse inflammatoire facilement identifiable".
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans le développement de solutions pour la production de thérapies biologiques, cellulaires et géniques. Le but est de commercialiser des agents pour libérer in vivo de l’ADN et de l’ARN. Dans le cadre des développements, de la production commerciale et des études de stabilité des produits précliniques et cliniques, des essais sur des modèles in vitro sont réalisés. Néanmoins, ces derniers ne reflètent pas le comportement des produits in vivo, notamment en termes d’activité et de toxicité. Pour cela, l’administration par voie locale ou systémique est nécessaire pour permettre de valider l’activité et l’absence de toxicité des produits. Ainsi, dans le cadre de ce projet, des vecteurs de transfection ou des acides nucléiques synthétiques seront testés chez la souris selon différents modes d’injection (sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale ou intra-nasal) en fonction de leur composition. L’objectif sera de valider l’efficacité de transfection in vivo, l’absence de toxicité mais aussi d’évaluer l’élimination des produits testés.
Bénéfices attendus
Ces agents, une fois testés chez la souris, pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système ayant une bonne distribution dans différents types cellulaires et sans impact toxique sur la souris.
Procédures
Les animaux recevront aux maximum 3 injections des composés de transfection (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un ou plusieurs prélèvements sanguins (maximum 4) (durée 2-3 minutes) avant l'euthanasie en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des injections (sous cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire, ou intranasale). De plus ils subiront un ou plusieurs prélèvements sanguins. Une potentielle toxicité suite aux injections pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement en particulier de la démarche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales afin de collecter les organes pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant ADN ou ARN. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé suite à des projets précédents. Nous avons effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que l’effectif de 6 animaux pour chaque condition utilisée dans l'étude constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux. Le test statistique utilisé sera un test paramétrique (comparaison des animaux traités avec des animaux contrôles).
Raffinement
Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires.
Choix des espèces
Le systèmes évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de modèles animaux standardisés comme la souris permet d’induire une réponse inflammatoire facilement identifiable. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 semaines, âge qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection.
Rôle de l’activité d’une protéine membranaire dans un modèle épileptique chez la souris. 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux injections dans le crâne à un jour de vie, une biopsie avant le sevrage, quinze injections de traitements entre le dixième et le vingt-cinquième jour, une chirurgie de trente minutes pour poser un transmetteur à l'âge adulte, puis une dernière opération de dix minutes sans réveil. 2 605 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour une partie et sévère pour 1 440 d'entre elles. Le projet crée des lignées porteuses d'un canal modifié afin de provoquer des crises d'épilepsie et d'étudier la sclérose tubéreuse de Bourneville. Le porteur résume les atteintes attendues en deux lignes, la survenue de crises d'épilepsie et des irritations dues aux injections répétées, sans décrire la fréquence ni l'intensité des crises, ni les points limites qui déclencheraient la mise à mort.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place des modèles de souris porteurs d'un canal modifié dans le cerveau. Ces modèles nous permettront de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement du cerveau et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
-2 injections chez le nouveau-né à P1 (2 min) -biopsies avant le sevrage à P21 (10 secondes) -15 injections de traitements pharmacologiques entre P10 et P25 (3 minutes) -chirurgie pour installation d’un transmetteur de 30 min à l’âge adulte -chirurgie sans réveil de 10 minutes à l’âge adulte
Impact sur les animaux
-survenue de crises d’épilepsies -irritations dues aux injections répétées
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever les tissus.
Remplacement
Le développement du cerveau et l’épilepsie sont des processus biologiques complexes où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes et le système immunitaire.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. En se basant sur les résultats de la litterature et notre expérience au laboratoire nous avons calculé que n=6 individus par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats exploitables et signitificatifs.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres formés et qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie ainsi que les weekends par les personnes d'astreinte. Les souris bénéficieront d'un enrichissement. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet formés aux gestes tiendront une fiche d’observation des points limites au cours de la procédure. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. Pendant les différentes chirurgies, les animaux seront sous anesthésie générale avec analgésie.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérêt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans; 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Évaluation d’un traitement in vivo chez la souris modèle du Syndrome de Rett like
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris mâles utilisées ici sont privées du gène Mecp2 et développent dès l'âge de trente jours des apnées, une hyperventilation, une perte de mobilité et une perte de poids. 1 695 souris entrent dans le projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester un virus modifié censé délivrer une copie saine du gène au système nerveux central. Chaque animal subit une biopsie d'identification, une injection sous anesthésie gazeuse, un gavage, des tests comportementaux dont l'un dure jusqu'à quarante-huit heures, puis une ponction et une perfusion intracardiaques. Une partie des souris est gardée en vie comme reproductrices, les autres sont tuées à la fin des procédures pour prélever leurs organes, et le porteur présente l'étude sur les femelles comme une étape "indispensable" avant l'essai clinique.
Objectifs
Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie rare neurodéveloppementale d’origine génétique liée au chromosome X. Elle conduit à une déficience intellectuelle progressive et sévère majoritairement chez les filles. Dans 95% des cas le RTT est dû à une mutation du gène MECP2. Le RTT ne connait à ce jour aucun traitement curatif. Les traitements administrés ciblent les symptômes et complications liées à la maladie afin de les alléger et ainsi améliorer la vie des patientes. Parmi les symptômes on retrouve notamment une perte des fonctions motrices volontaires, des troubles de la respiration et des troubles divers affectant le sommeil et l’alimentation. En 2007, la preuve de concept selon laquelle il est possible de restaurer un phénotype sain (c’est-à-dire que la souris malade est guérie) chez la souris mâle déficiente pour Mecp2 même à un stade avancé de la pathologie est publiée. Cette avancée est porteuse d’espoir et laisse place à de nombreuses études notamment en thérapie génique de remplacement visant à intégrer dans les cellules une copie saine du gène via un virus modifié. La cible étant le système nerveux central, les études se heurtent à un obstacle majeur : le passage de la barrière hémato-encéphalique présente autour du système nerveux central pour le protéger contre les substances étrangères. Jusqu’ici le virus le plus adapté pour infecter mène à un taux d’infection des cellules assez faible et plusieurs études utilisant ce virus rapportent également une forte expression du gène apporté dans le foie causant une toxicité. Récemment, une publication a montré le potentiel d’un nouveau virus conçu de manière à avoir une forte infection dans le système nerveux central mais pas ailleurs. Ces caractéristiques pourraient résoudre les effets secondaires observé avec le précédent virus. L’objectif de l’étude est de caractériser ce virus appelé AAV.Cap-B10 dans le cadre d’un traitement par thérapie génique sur des souris mâles Mecp2 et femelles déficientes et d’évaluer l’efficacité et la toxicité du traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité d’un nouveau virus capable de cibler spécifiquement le système nerveux central sans infecter les autres organes dans le cadre d’une thérapie génique d’une pathologie neuronale. Si l’infection s’avère spécifique et homogène les résultats pourront servir à d’autres équipes cherchant à infecter le système nerveux central dans d’autres pathologies du cerveau. De plus, si le traitement est efficace les résultats serviront de bases pour une étude sur le modèle femelle Rett, étape indispensable avant le passage en essai clinique chez les patientes.
Procédures
Les animaux seront soumis à: - une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) – déclaration de la maladie (troubles respiratoires, moteurs; stress et perte de poids) - une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l'injection pour la thérapie génique (durée environ 10min - 1 fois) - des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) - une administration par voie orale par gavage (30s à 1 minute) - une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois) – ponction cardiaque (1 fois 1min au décès) – perfusion intracardiaque (1 fois 1min au décès)
Impact sur les animaux
Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets cliniques attendus chez ces souris sont sévères et comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). Les nuisances générées par les procédures comprennent : - le stress léger lié à la réalisation d'une anesthésie générale gazeuse - le stress léger lié aux tests comportementaux non invasifs - la douleur modérée, de courte durée, modulée par une anesthésie et analgésie adaptée) liée au prélèvement intracardiaque et à la perfusion intracardiaque terminale.
Devenir
Certains animaux seront gardés en vie comme reproducteurs. Les autres animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales pour prélèvements d'organes.
Remplacement
La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle.
Réduction
La variabilité interindividuelle est réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Le nombre d’animaux a été déterminé en se basant sur nos études précédentes et sur le calcul statistique de puissance avec GPower pour répondre à la question expérimentale de façon que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats. Cependant, nous utilisons un nouveau vecteur et une nouvelle construction. De ce fait, les effets attendus pourraient ne pas correspondre à ceux émis pour effectuer le calcul de puissance. C’est pourquoi, les expérimentations seront initialement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenues feront l’objet d’une analyse statistique préliminaire (étude pilote) en fonction du résultat : - les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes - le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble exister mais ne ressort pas suffisamment pour atteindre la significativité. Enfin, les expérimentations post-mortem seront réalisées sur un demi- cerveau au lieu d’un cerveau entier (certaines expériences nécessitant des tranches et d’autres le broyage), permettant de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires pour ces expérimentations.
Raffinement
L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées en groupe, dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans des conditions environnementales maitrisées et conformes à la réglementation. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici les injections des vecteurs viraux et des microbulles de gaz inerte via la voie rétro-orbitale le cas échéant. Cette anesthésie, sous forme gazeuse (isoflurane), suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Des périodes d’habituation avec les expérimentateurs et pour les tests comportementaux le cas échéants sont prévues afin de diminuer le stress de nos animaux.
Choix des espèces
La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle Mecp2-deficient est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans les procédures 2 et 3 à 30 jours post-natal (P30). Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en procédure 1 durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an post-natal afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps d’acquisition de la maturité sexuelle.