Souris

272 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à huit enregistrements de trente minutes en cylindre et douze épreuves de toucher léger de la peau, à raison de cinq par jour. La peau rasée sous anesthésie, chacune reçoit une injection d'une substance qui déclenche chez l'humain des démangeaisons persistantes, une partie d'entre elles recevant une semaine plus tôt un colorant destiné à marquer les cellules exposées. Le porteur annonce des démangeaisons d'intensité faible à modérée durant moins de deux secondes chacune, réparties sur vingt à trente minutes, et une douleur transitoire au point d'injection. Sur les 272, 232 seront tuées pour prélèvements ou parce que l'exposition à la substance interdit selon lui toute réutilisation, 20 seront réutilisées dans d'autres expériences et 20 placées.

Objectifs

Le projet vise à étudier une substance qui induit chez l’homme des démangeaisons persistantes par l’activation de nerfs de la peau. Sur la base de nos expériences précédentes menées sur des cellules, ce projet a 2 objectifs : 1) Etudier la capacité de la substance à induire des démangeaisons chez la souris suite à une administration locale au niveau de la peau, 2) Débuter l’étude des mécanismes impliqués par l’analyse de prélèvements post-mortem (peau et cellules des nerfs).

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement spécifique des démangeaisons induites chez l’homme par la substance étudiée. Mieux connaître leurs mécanismes permettra à terme de développer des traitements spécifiques pour les soulager. Les bénéfices de ce projet en termes d’avancées scientifiques et thérapeutiques pourraient aussi s’étendre aux démangeaisons présentes dans d’autres maladies (eczéma, psoriasis).

Procédures

1) Rasage de la future zone d’injection, réalisé 1 fois sous anesthésie, éventuellement renouvelé 1 fois, durée maximale de 5 minutes. 2) Injection de la substance étudiée (1 fois) ou d’une substance contrôle (1 ou 2 fois espacées de 3 jours), durée maximale de 30 secondes. Sur les animaux destinés à obtenir des prélèvements : 3) Injection préalable, 1 semaine avant, d’1 substance permettant de colorer les cellules exposées.

Impact sur les animaux

1) Stress de faible intensité lors de l’anesthésie générale (durée < 5 min, réalisée 1 fois). 2) Stress et inconfort lors des manipulations et de l’injection (durée < 5 min, réalisées 1 fois ou 2 fois espacées de 3 ou 7 jours). 3) Stress lors de l’enregistrement des démangeaisons spontanées dans un cylindre (durée 30 min ; réalisé 1 à 8 fois, maximum 1 fois/jour). 4) Stress lors des mesures répétées des démangeaisons induites par le toucher léger dans une cage ouverte (réalisées 1 à 12 fois, maximum 5 fois/jour, durée < 7 min). 5) Démangeaisons spontanées localisées, d’intensité faible à modérée, intermittentes, d’une durée < 2 secondes chacune, réparties pendant 20-30 minutes suivant l’injection réalisée 1 fois. 6) Démangeaisons localisées induites par à un toucher léger, d’intensité faible, d’une durée < 1-2 secondes uniquement en réponse au toucher léger appliqué 10 fois en 7 min. Épreuve réalisée 1 à 12 fois au total, maximum 5 fois/jour. 7) Douleur d’intensité faible localisée au point d’injection et très transitoire (5 premières minutes suivant l’injection réalisée 1 fois).

Devenir

En fin de procédure, il est prévu la mise à mort de tous les animaux destinés à des prélèvements post-mortem de tissus à des fins d'analyses (histologiques et fonctionnelles : 132 animaux de la procédure 3) ou qui auront été exposés à la substance étudiée, ce qui interdit leur réutilisation, replacement ou adoption (100 animaux de la procédure 2), soit au total 232 animaux. Les 40 autres (4 de la procédure 1 + 36 de la procédure 2) seront ré-utilisés (20 animaux) ou placés (20 animaux).

Remplacement

Depuis plus de 10 ans, nous étudions les effets de la substance sur des modèles cellulaires. Nous avons montré l’implication de plusieurs mécanismes qui, cependant, peuvent aussi être à l’origine d’autres sensations que les démangeaisons, que nos modèles cellulaires ne permettent pas de distinguer. Nous continuerons à utiliser ces modèles cellulaires pour cette étude mais nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale pour étudier les démangeaisons induites et leurs mécanismes. Un 2ème aspect est l’implication de multiples types cellulaires dans les démangeaisons. Ces cellules ne peuvent pas être rassemblées dans un modèle cellulaire. Nous ne pouvons pas nous passer de l’expérimentation animale pour prendre en compte l’ensemble de ces types cellulaires.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu en vue de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés sans compromettre les objectifs ou l’analyse statistique des résultats. Notre démarche de réduction se base tout d’abord sur les résultats de nos travaux précédents sur modèles cellulaires, et se poursuivra sur ceux qui seront obtenus lors de ce projet, pour ne réaliser que les expériences les plus pertinentes scientifiquement. Étant donnée la variabilité́ des démangeaisons induites par la substance, nous prévoyons 20 animaux/groupe pour garantir des résultats robustes. Cependant, nous réaliserons toujours une 1ère série d’expériences sur 12 souris (minimum pour que des résultats se dessinent) suivie de son analyse, et ne complèterons que si nécessaire d’après ces 1ers résultats. Le nombre d’animaux prévu est un maximum qui sera réduit autant que possible en pratique.

Raffinement

Les responsables du projet mettront en œuvre des mesures pour assurer et maintenir le bien-être de chacun des animaux : enrichissement des cages, habituation des animaux aux manipulations et aux tests, renforcement positif, points limites et stratégie d’analgésie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée comme modèle d’étude des démangeaisons. Le développement des nerfs impliqués dans les démangeaisons évolue chez la jeune souris jusqu’à l’âge de 3-4 semaines. Leur état de développement est stable à partir de l’âge de 5 semaines. Les souris âgées ne sont pas appropriées du fait de modifications physiologiques dues à l’âge. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de 8 à 16 semaines.

Avant toute application à une maladie, ce projet sert à valider une nouvelle lignée de souris fluorescentes comme outil de laboratoire. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles de leurs pattes arrière. À dix semaines, chacune subit la section définitive du nerf sciatique d'une patte, opération de quinze minutes qui provoque une atrophie musculaire visible au bout de deux semaines, précédée au sevrage d'une biopsie de l'oreille. Le porteur affirme que l'étude ne peut être conduite que sur un "organisme entier", la communication entre motoneurone et muscle restant selon lui impossible à reproduire in vitro, tout en annonçant que des cellules issues de ces souris serviront à développer des organoïdes neuromusculaires.

Objectifs

Les cellules musculaires contiennent plusieurs centaines de noyaux. Parmi eux, 5 à 8 sont spécialisés pour maintenir la jonction neuromusculaire, qui est le lien crucial entre le nerf et le muscle. Ils sont nommés noyaux sous-synaptiques. Cette jonction est essentielle pour que les muscles fonctionnent bien, tout le long de la vie. Si cette jonction est endommagée, les muscles peuvent perdre leur connexion nerveuse et fonctionner moins bien. En raison de leur faible nombre et du manque d'outils disponibles, il est encore très difficile d'étudier la structure et la régulation des noyaux situés à la jonction neuromusculaire par rapport aux autres noyaux de la cellule. La lignée murine utilisée a pour but de suivre la fluorescence des noyaux musculaires impliqués dans le maintien de la jonction neuromusculaire. En temps normal, seuls les noyaux sous-synaptiques (5 à 8 par fibre musculaire) seront fluorescents. Si la connexion nerveuse est altérée, la fluorescence s'étendra rapidement à tous les noyaux le long de la fibre musculaire (plusieurs centaines par fibre). L’objectif de ce projet est donc de valider ce nouveau modèle murin pour isoler et étudier les noyaux sous-synaptiques des autres noyaux de la fibre musculaire, afin de comprendre comment ils régulent les fonctions musculaires en conditions normales et lors de problèmes d’innervation. A long terme, ce modèle de souris sera le premier outil pour étudier les maladies rares où l'innervation ou la communication entre le nerf et le muscle est affectée. Il permettra de visualiser et de mesurer les fibres musculaires touchées et de tester des médicaments pour prévenir ou réduire la perte d'innervation.

Bénéfices attendus

Ce modèle offrira la possibilité d’aborder les aspects encore peu explorés de la biologie cellulaire et des régulations au niveau des noyaux musculaires impliqués dans le maintien de l’innervation motrice au cours de la vie postnatale saine et pathologique. A plus long terme, la disponibilité de ce modèle de souris constituerait le premier outil pour étudier des maladies rares dans lesquelles l'innervation et/ou la neurotransmission sont compromises. Cela permettrait de visualiser et de quantifier les cellules musculaires présentant de tels défauts, mais aussi de tester facilement des médicaments visant à prévenir ou à réduire la perte d'innervation et à proposer et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Une petite biopsie d’oreille (=1mm) sera réalisée au moment du sevrage pour pouvoir effectuer l’identification génétique de chacune des souris. Le temps du geste par animaux et < 1min. Les animaux agés de 10 semaines subiront une intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes pour réaliser une section définitive du nerf sciatique d’une seule patte arrière. Pour cela ils recevront plusieurs injections : une sur animal vigile pour l’anesthésie générale (durée < 1 minute) et une sur animal anesthésié pour l’analgésie pré- et post-opératoire (durée

Impact sur les animaux

La petite biopsie d’oreille conduit à une douleur transitoire avec cicatrisation. Une chirurgie de dénervation de la patte postérieure gauche sera réalisée. Cette dénervation conduit à une atrophie des muscles de la patte observable à partir de 14 jours, donc à une perte de force musculaire sur le membre. Comme la souris est quadrupède, cette intervention ne l’empêche pas de se déplacer, de grimper dans la cage et de s’alimenter. La technique de dénervation définitive est une chirurgie modérément invasive et parfaitement maitrisée. Les 4 dernières injections de molécule pour exprimer la protéine fluorescente, réalisées hors anesthésie, génèreront une douleur transitoire au site d’injection (gonflement et inflammation).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation afin de collecter tous les muscles squelettiques des pattes postérieures. Ces tissus prélevés serviront pour les analyses de biologie moléculaire et d’histologie pour décrypter les acteurs moléculaires responsables du maintien du muscle.

Remplacement

Cette étude ne peut être conduite que sur un organisme entier car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le système complexe de communication entre les motoneurones (types de neurones qui interagit avec le muscle pour le mouvement) et le muscle. La souris est le modèle idéal pour cette analyse car les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution en particulier chez les mammifères. Cependant des cellules seront isolées de ce modèle pour participer au développement d’organoides neuromusculaires.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal mais suffisant sera utilisé pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le maximum de données pouvant être générées à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. D’après l’expérience acquise au laboratoire, un effectif de n=20 animaux par point de collecte sera suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables générés sur différents types d’analyses. Ce nombre est nécessaire car plusieurs types de prélèvements non compatibles sur la même souris sont requis et nécessitent donc de doubler les effectifs. Après obtention des résultats expérimentaux, les données seront analysées à l’aide de tests statistiques. L’ensemble des muscles des deux pattes postérieures sera collecté. La patte droite non dénervée servira de contrôle. Ainsi, l’ensemble des tissus collectés d’une même souris pourra être évalué et comparé par différentes techniques complémentaires.

Raffinement

Pendant toute la chirurgie, les animaux seront sous anesthésie générale et locale, et sur coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux afin d’éviter tout dessèchement de l’œil. Après la chirurgie, les animaux recevront pendant 3 jours un traitement analgésique et antalgique. Pour une meilleure récupération après l’anesthésie générale, les animaux seront gardés une nuit en armoire chauffante. Afin de faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau après l’intervention chirurgicale, des croquettes et de l’eau gélifiée seront déposées sur le sol de la cage. Le jour même et les 2 jours suivants la dénervation, une analgésie post-opératoire sera également appliquée afin de limiter toute douleur. Au total, pendant les 5 jours suivant l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement afin de vérifier la bonne cicatrisation de la suture et d’euthanasier l’animal en cas de souffrance non jugulée, appréciée par des critères de signes cliniques, d’aspect et de comportement. Toutes les souris de la même cage seront opérées le même jour afin de maintenir le groupe social.

Choix des espèces

Malgré des différences entre de symptômes chez les souris et les hommes, le modèle murin est extrêmement utile pour les études mécanistiques, physiopathologiques et la mise au point de traitements thérapeutiques. Plus spécifiquement, le muscle, que ce soit en termes de structure, de fonctionnement et de pathologie est extrêmement proche de celui de l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’age de 2.5 mois. A cet age, la souris est adulte et la maturation du muscle est bien finalisée.

Un mois de gavage quotidien pour les souris traitées, une échographie cardiaque et une IRM du cerveau sous anesthésie, des tests moteurs sur tapis roulant et sur cylindre rotatif : 2 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'équipe a créé deux lignées porteuses d'une mutation retrouvée chez des patients atteints d'une maladie mitochondriale, pour décrire leur pathologie et tester des médicaments candidats, dont certains ont déjà été essayés sur des cellules de peau de patients. Les souris mutantes pèsent moins dès le sevrage et deviennent apathiques vers 3 ou 4 mois. Entre 4 et 7 mois, certaines maigrissent brutalement ou s'isolent, signes qui ont déjà conduit l'équipe à les mettre à mort. Dans la grille de suivi, l'isolement vaut à lui seul 3 points, le seuil où la souris est mise à mort.

Objectifs

Les mitochondries jouent le rôle essentiel de centrale énergétique dans nos cellules. Les maladies mitochondriales regroupent de nombreuses pathologies héréditaires qui résultent d'un dysfonctionnement du métabolisme énergétique mitochondrial. Ces pathologies ont été associées à de nombreux symptômes incluant désordres du mouvement, cécité, surdité, épilepsie, accidents vasculaires, atteintes cardiaques ou encore neurodégénérescence. Les maladies mitochondriales peuvent débuter à tout âge, de la naissance, dans l'enfance et chez l’adulte jeune. A ce jour il n’existe pas de traitement curatif pour ces maladies. De ce fait, la recherche dans ce domaine des thérapies pour ces maladies mitochondriales est capitale. Nous avons identifié des médicaments candidats pouvant améliorer le fonctionnement des mitochondries. Certaines de ces molécules prometteuses ont été ensuite testées sur des cellules de peau de patients de maladies mitochondriales. Afin de tester les effets bénéfiques de ces médicaments sur un modèle in vivo, nous avons généré des souris présentant une mutation retrouvée chez des patients humains. Notre objectif principal pour ce projet est donc de caractériser en profondeur la pathologie de ces souris et valider l'efficacité des médicaments candidats identifiés, qui pourront ensuite être testés chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet est justifié d'un point de vue scientifique, car il propose d'étudier les effets de médicaments candidats dans les maladies mitochondriales, maladies qui ne bénéficient pas actuellement de traitements curatifs. Le développement d’une médecine mitochondriale est fortement compromis par l’absence de thérapies efficaces avec un nombre limité d'essais cliniques à ce jour. Raison pour laquelle la recherche sur les pathologies mitochondriales humaines s’oriente aujourd'hui résolument vers la thérapeutique. La présence de mutations pathogènes mitochondriales est responsable de maladies mitochondriales sévères et souvent fatales. Ainsi, déterminer l’impact de plusieurs médicaments pourrait permettre de restaurer le fonctionnement mitochondrial, apparaissant comme un objectif important, qui pourrait déboucher sur des essais cliniques pour les patients souffrant de maladies mitochondriales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: Echographie cardiaque sous anesthésie générale (30 minutes, 1 fois); Test de la fonction motrice sur tapis roulant et cylindre rotatif (durée variable en fonction des performances des animaux); Imagerie par Résonance Magnétique du cerveau (sous anesthésie, durée 30 à 60 minutes, 1 fois); Administration des médicaments par gavage à l'aide d'une sonde adaptée (1 fois par jour pendant 1 mois).

Impact sur les animaux

Les souris des deux modèles présentant une mutation que nous allons utiliser sont de nouveaux modèles murins pour lesquels nous décrivons un phénotype pour la première fois. Nos observations montrent que les animaux des deux modèles ont un poids plus faible dès le sevrage, et un comportement apathique qui apparait entre 3 et 4 mois et devient plus marqué au fur et à mesure. Les jeunes souris présentent parfois une dépilation transitoire. Nous avons observé qu'entre l'âge de 4 mois et 7 mois, certains animaux présentent une perte de poids brutale, ou une forte apathie et un isolement qui nous ont conduits à les mettre à mort. Le traitement médicamenteux par gavage pourrait entraîner une irritation de l'oesophage, et nous avons donc prévu de donner au animaux traités accès à de l'eau contenant un antalgique pour prendre en charge la douleur éventuelle.

Devenir

Les reproducteurs seront utilisés pendant leur phase reproductive (2 à 6 mois) puis mis à mort. Pour toutes les autres expériences prévues, tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires humains tels que les fibroblastes de peau pour répondre à certaines questions scientifiques. Cependant ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans les maladies mitochondriales, puisqu'elles ne tiennent pas compte l’ensemble des interactions biologiques existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour la suite du programme de recherche et pouvoir valider et passer aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Aucune expérience inutile ne sera menée. Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, nos expériences solides des méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental par sexe pour la métabolomique. Pour la biologie moléculaire et l'histologie, des groupes de 8 animaux/génotype sont prévus, ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux sans compromettre l'obtention de résultats statistiquement valides.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure de Bien-Etre Animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent, et seront pris en charge selon la grille de points limites suivante: Perte de poids 20% = 3 points Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points Isolement: 3 points. A partir de 1 point, un signalement sur la cage avec le numéro de l’animal concerné sera apposé, de telle sorte à ce qu’il y ait une attention particulière lors du contrôle quotidien pour déceler rapidement toute évolution négative, 2 points, surveillance bi-quotidienne de l'animal concerné, 3 points, l’animal est mis à mort en point limite.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le présent projet, la souris que nous utilisons est un modèle de maladie mitochondriale unique, le seul qui permette d'étudier l'impact des médicaments candidats sur les fonctions mitochondriales dans les tissus habituellement affectés dans ces pathologies, que sont le cerveau, les muscles squelettiques et les coeur. Les animaux utilisés pour la mise en place de l'élevage le seront dans leur phase reproductive (2 mois à 6 mois). Pour la caractérisation de la maladie, les animaux seront utilisés entre les âges de 2 mois et 12 mois. De plus, nous traiterons les souris avec des médicaments candidats de l'âge de 3 mois à 4 mois dans la phase d'expérimentation de traitements potentiels.

Dans une partie du projet, des souris reçoivent sous anesthésie une injection de glycérol dans le quadriceps pour léser le muscle, puis passent dix jours plus tard deux tests métaboliques, chacun avec une injection dans l'abdomen et des prises de sang à la queue. D'autres, doublement transgéniques, sont gavées cinq jours de suite, reçoivent deux semaines plus tard une ou deux injections dans le quadriceps sous anesthésie, puis passent ces tests métaboliques ou, pour une partie d'entre elles, un test d'agrippement, un test du cadre inversé et un test d'endurance sur tapis roulant. 1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines nourries d'un régime riche en graisses qui les rend obèses, avec un inconfort qui peut durer plusieurs semaines. Toutes sont tuées pour des prélèvements de tissus, selon leur groupe à 2-3, 6-7, 12-13 ou 18-19 mois. Pour fixer l'effectif, le porteur cite en premier lieu ses "habitudes expérimentales", puis des expériences préliminaires et la variabilité entre individus.

Objectifs

L'augmentation du nombre de personnes âgées et/ou obèses constitue un enjeu majeur de santé publique. Ces 2 situations vont avoir des conséquences (i) individuelles, favorisant la fragilité et la dépendance et (ii) sociétales, entrainant une augmentation des dépenses de santé. De plus, ce sont des facteurs de risque de pathologies telles que le diabète de type 2 (DT2), lié à des désordres du métabolisme glucidique, et la sarcopénie, liée à une diminution de la masse et de la force musculaire. Le vieillissement et l’obésité représentent deux contextes dans lesquels il y a émergence, au sein du muscle squelettique, d’un tissu adipeux intramusculaire (IMAT) dont les cellules matures sont les adipocytes intramusculaires. Ce tissu a été relativement bien documenté dans les muscles squelettiques des animaux de rente, puisqu’il donne son goût à la viande, mais il n’existe que peu de données chez l’Homme. Toutefois, des données corrélatives semblent indiquer que la présence chronique d’IMAT pourrait participer à la perte de sensibilité à l’insuline musculaire participant à l’étiologie du DT2. Nos données préliminaires chez la souris sont encourageantes et vont dans le même sens. D’un autre côté des données observationnelles dans différents modèles de lésions musculaires, chez la souris, révèlent une émergence transitoire d’IMAT qui pourrait participer à la régénération musculaire nécessaire au maintien de la masse et de la force de ce tissu. C’est en tout cas l’hypothèse que nous avançons. Il semble donc que l’IMAT via son abondance, sa cinétique d’apparition/disparition et/ou son phénotype soit un acteur important des fonctions métabolique et régénérative du muscle squelettique. Ce projet a comme objectif principal de montrer le lien causal entre (i) IMAT et désordres métaboliques glucidiques, principalement musculaires et (ii) IMAT et régénération musculaire ; et ce à l’aide d’un modèle murin transgénique dans lequel l’ablation spécifique et contrôlée des adipocytes intramusculaires, constituant l’IMAT, est possible. Afin d’avoir une étude la plus complète possible et étant donné le dymorphisme sexuel existant à la fois dans la composition corporelle (i.e. masses grasse et maigre), la régulation des métabolismes ou encore les capacités régénératives, des animaux femelles et mâles seront inclus dans cette étude. Ces animaux seront étudiés à des âges physiologiques différents, afin de reproduire les effets de l’avancée en âge chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, pour la première fois, de mettre en évidence les effets d’un dépôt adipeux ectopique méconnu, l’IMAT sur l’homéostasie du muscle squelettique en fonction du sexe et de l’âge. Le muscle squelettique représente, en masse, le tissu le plus abondant de l’organisme et joue un rôle majeur dans certaines fonctions clés telles que la locomotion mais aussi dans la gestion de l’énergie, i.e. le métabolisme. Il devrait permettre, d’une part, d’obtenir des données nouvelles sur le contenu lipidique et le phénotype de l’IMAT (i.e. hypertrophie/ hyperplasie adipocytaire, inflammation, sécrétions, etc…), son évolution avec l’âge et/ou l’obésité mais également avec le sexe des individus. D’autre part, grâce à l’originalité du modèle de souris double transgénique permettant une diminution partielle ou totale de l’IMAT, il devrait permettre d’établir un lien causal (délétère ou bénéfique) entre ce tissu et les fonctions musculaires étudiées (i.e. métabolisme glucidique et régénération) selon le sexe, l’âge, le régime alimentaire et/ou le statut régénératif. Ce projet pourrait en particulier faire émerger des molécules actives (lipides, cytokines, etc…) explicatives des effets observés lors de l’obésité, du vieillissement ou bien de la régénération. A plus long terme, les connaissances générées par cette étude pourraient être exploitées en santé humaine puisque de nombreuses conditions pathologiques musculaires aiguës ou dégénératives sont caractérisées par un dépôt important d’IMAT. Nous anticipons que ces travaux pourraient donc avoir des répercussions sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du patient en situation de fragilité musculaire résultant de l’avancée en âge, d’obésité ou même de myopathies.

Procédures

La 1ère partie du projet s’attellera à caractériser les désordres métaboliques glucidiques et l’IMAT en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à 2 tests consécutifs d'évaluation de leur métabolisme comprenant chacun 1 injection intrapéritonéale et des prélèvements sanguins à la queue (20 sec à 2 min/prélèvement, 130 µL de volume cumulé maximal). La 2ème partie du projet consistera en l’étude du lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle murin de lésion musculaire induite par l’injection intramusculaire de glycérol facilitant le développement d’IMAT. Les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie. Le geste chirurgical (anesthésie + injection) durera moins de 10 min. Les mêmes animaux seront soumis 10 jours plus tard à 2 tests consécutifs d'évaluation de leur métabolisme comme décrit précédemment. La 3ème partie du projet consistera en l’étude du lien causal entre la présence d’IMAT et les désordres métaboliques glucidiques dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge, du régime alimentaire et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours. La préhension de l'animal et le gavage est estimé à 20 sec. Deux semaines plus tard, les animaux seront soumis à 1 injection unique dans le quadriceps sous anesthésie. Le geste chirurgical (anesthésie + injection) durera moins de 10 min. Les mêmes animaux seront soumis 10 jours plus tard à 2 tests consécutifs d'évaluation de leur métabolisme comme décrit précédemment. La 4ème et dernière partie du projet concernera le lien causal entre la présence d’IMAT et la régénération musculaire dans un modèle de souris double transgénique permettant l’élimination sélective de l’IMAT, en fonction de l’âge et du sexe des animaux. Les animaux seront soumis à un gavage 1 fois par jour pendant 5 jours. La préhension de l'animal et le gavage est estimé à 20 sec. Deux semaines plus tard, les animaux seront soumis à 2 injections consécutives séparées de 4 jours dans le quadriceps sous anesthésie. Le geste chirurgical (anesthésie + injection) durera moins de 10 min. La fonction musculaire d’une partie des animaux sera ensuite évaluée par différents tests non invasifs : test d’agrippement, test du cadre inversé et test d’endurance sur tapis roulant.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables pourraient être observés dans cette étude : 1- Stress lié à la contention lors des gavages et lors des injections. La durée de cet effet indésirable sera réduit au minimum de part l’expérience de l’expérimentateur ; 2- Stress lié à l'isolement, lors des expériences de mesure de la composition corporelle, de la force musculaire ou lors du test d'endurance ; 3- Inconfort voire douleur lors du réveil des animaux anesthésiés pour la réalisation des injections intramusculaires ou pour leur identification par tatouage. Dans premières heures suivant la réalisation de l'injection intramusculaire, une mobilité réduite pourra être observée. Le geste chirurgical étant réalisé le matin et cet état de mobilité réduite n’étant que passager, il n’entrave pas la prise alimentaire la nuit suivante ; 4-Inconfort engendré par l’obésité résultant de la mise en régime enrichi en lipides. Cet inconfort pourrait durer plusieurs semaines.

Devenir

Comme indiqué dans les pagraphes concernant chacune des procédures expérimentales, les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus d'intérêt. Ils seront mis à mort en fonction des groupes d'âge inclus dans les procédures: à 2-3 mois, à 6-7 mois, 12-13 mois ou à 18-19 mois.

Remplacement

A l’aide d’expériences réalisées in vitro avec des cellules humaines nous avons précédemment publié que les sécrétions des adipocytes musculaires obtenus en culture étaient capables de diminuer la réponse à l’insuline des cellules musculaires également obtenues en culture, appuyant l’hypothèse que l’IMAT pourrait être un régulateur du métabolisme glucidique musculaire et plus particulièremet des perturbations de ce métabolisme. Par ailleurs, nous avons également mis en évidence plus recemment des modifications du phénotype des adipocytes musculaires obtenues in vitro en fonction de l’age des volontaires dont étaient issues les biopsies musculaires. Ce sont ces données qui nous ont conduits à nous tourner vers l’animal. En effet, il est bien connu que la culture à a ses limites qui sont clairement ici (1) que les cellules (adipocytes et myocytes) n’arrivent jamais au stade terminal de différenciation donc sont des formes immatures des cellules observées in vivo et (2) qu’il est impossible dans un tel modèle d’imaginer l’impact sur le muscle en entier et sur l’organisme. Il est cependant évident qu’en fonction des résultats obtenus dans ce projet des expériences complémentaires sur des points mécanistiques précis seront réalisées sur des cultures primaires humaines et/ou murines qui permettent de par la capacité de prolifération des cellules de réaliser un certain nombre d’analyses.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales, des expériences préliminaires et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en oeuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en oeuvre seront des tests pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, un test différent pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, un autre test à une ou deux voies pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés dans les cages. Un suivi quotidien sera réalisé soit par le personnel de la zootechnie soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permettra une habituation à l'Homme et, le stress ainsi diminué, devrait diminuer la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées. Le réveil de l'animal, après injection musculaire, se fera dans une cage posée sur un tapis chauffant ; du collyre sera appliqué sur l'oeil de l'animal qui aura été injecté. L'observation et la surveillance des animaux permettent d’appliquer des points limites précis et des critères d’arrêt des souffrances.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux de différents âges seront inclus dans les procédures : 2-3 mois, 6-7 mois, 12-13 mois ou 18-19 mois. L'utilisation de ces différents groupes d'âge permettra, dans certaines procédures, d'étudier la cinétique d’évolution « naturelle » de certains paramètres (i.e. régulation du métabolisme, composition corporelle, développement du tissu adipeux intramusculaire, etc....) au cours d’une diète normale ou riche en graisses. Dans d'autres procédures, l'utilisation des animaux de différents groupes d'âge permettra de mettre en évidence l'impact du vieillissement sur certains processus (i.e. processus d'installation du diabète et rôle du tissu adipeux intramusculaire, processus régénératifs musculaires, etc...). Les âges des souris de chaque procédure ont été choisis en fonction de résultats d’expériences préliminaires du laboratoire et de données rapportées dans la littérature.

Des souris génétiquement modifiées pour que le gène PPARa et ceux de deux autres protéines ne fonctionnent plus dans leur foie sont soumises, selon les groupes, à deux semaines de régime cétogène, à 20 heures de jeûne ou au gavage d'une molécule qui libère une grande quantité de graisses dans leur sang. 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur annonce la mise à mort de toutes à la fin des procédures pour récolter leur sang et leurs organes. Le jeûne peut faire chuter leur glycémie et leur température corporelle, le régime cétogène leur faire perdre du poids, et chaque souris subit juste avant sa mise à mort une prise de sang à la veine sous-mandibulaire, sous contention. Le porteur écrit aussi qu'un individu qui atteint un critère d'arrêt sera "replacé en conditions d'hébergement standard après examen par la vétérinaire référente", sans dire ce qu'il devient ensuite.

Objectifs

Le foie est un organe majeur qui est capable de s’adapter aux différents changements nutritionnels auxquels nous sommes exposés (période de jeûne, régime enrichi ou carencé en certains nutriments, …). Par exemple, lors d’un jeûne, le foie est le lieu de production du sucre nécessaire au fonctionnement de l’organisme en période de carence en nutriments. Cette grande capacité du foie à s’adapter à différents statuts nutritionnels est principalement assurée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARa, qui est également importante lors de la consommation d’un régime cétogène (très riche en graisses et pauvre en sucres). Dans ce projet, pour étudier les interactions entre PPARa et 2 autres protéines lors d'un afflux d'acides gras arrivant au foie, nous générerons des souris dont le gène PPARa et le gène d’autres protéines ne sont plus fonctionnels dans le foie. Les animaux seront soumis à une période de jeûne ou à un régime cétogène ou traités avec une molécule pharmacologique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les différentes protéines qui sont impliquées lors du jeûne et de la consommation d’un régime cétogène, qui sont 2 interventions nutritionnelles actuellement étudiées pour leurs effets bénéfiques dans plusieurs pathologies. Ainsi, les résultats obtenus lors de ces expériences apporteront ainsi une contribution à la recherche biomédicale.

Procédures

Des groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou un régime cétogène riche en graisses et pauvre en sucre pendant 2 semaines. Les animaux seront pesés chaque semaine. La glycémie sera mesurée chaque semaine (2 fois au total) par prélèvement d’une seule goutte de sang à la queue (petite piqûre de la veine caudale avec une lancette de 1 mm). La mesure ne nécessite pas de contention mais uniquement une prise en main de la queue et prend moins de 5 secondes. Juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront nourris à volonté avec un régime standard ou mis à jeun pendant 20h. Après les 20h de jeûne et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire. D’autres groupes d’animaux seront traités par gavage avec une molécule pharmacologique permettant la libération d’une grande quantité de graisses dans la circulation sanguine. Le gavage prend moins de 30 secondes. Six heures après et juste avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la veine sous mandibulaire.

Impact sur les animaux

Le jeûne peut induire une baisse de la glycémie et de la température corporelle. Le régime cétogène peut induire une perte de poids et une baisse de la glycémie. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et une légère douleur. Le gavage peut entraîner un stress des animaux.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de l’animal entier car les réponses de l’organisme engendrées par les interventions pharmacologiques nutritionnelles (jeûne et régime cétogène) étudiées sont complexes et ne peuvent pas être mimées avec fidélité en culture cellulaire. En effet, plusieurs organes de l'organisme communiquent entre eux. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car il est possible d'étudier le rôle de protéines spécifiques.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie). Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant la piqûre permettant de prélever une goutte de sang. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons les consommations alimentaire et hydrique. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure et replacé en conditions d’hébergement standard après examen par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

Des souris nude dépourvues de système immunitaire et des rats ZDF porteurs d'une mutation qui les rend diabétiques dès le plus jeune âge : le projet repose sur des animaux construits pour être malades. 80 souris et 208 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reçoivent des hydrogels implantés sous la peau, les rats subissent une craniotomie de trente minutes avec pose d'un implant osseux, et une partie d'entre eux une thoracotomie terminale que le porteur qualifie lui-même de geste douloureux. Tous sont tués pour retirer les implants et prélever les calvarias, afin de mesurer la formation osseuse et la vascularisation autour du matériau.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est un problème de santé publique. On compte 537 millions de personnes diabétiques dans le monde et environ 4 millions en France. Outre plusieurs complications cliniques, les patients atteints de DT2 présentent une fragilité osseuse avec un risque accru d’ostéoporose, de fracture osseuse et d'altération de la réparation osseuse. Parallèlement à l'augmentation de la prévalence du DT2, on observe une augmentation du nombre de patients atteints de DT2 nécessitant et subissant des interventions chirurgicales orthopédiques/orofaciales, avec un taux élevé de complications et une augmentation inévitable de la charge et des coûts socio-économiques. À ce jour, la réparation osseuse dans l'environnement compromis du DT2 reste très difficile, et des recherches supplémentaires sont nécessaires pour développer des stratégies efficaces, y compris des thérapies cellulaires. Les cellules stromales mésenchymateuses issues de la moelle osseuse par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier à des cellules qui forment l’os (ostéoblastes) et /ou par des facteurs qu’ils secrètent (sécrétome et vésicules extracellulaires) et qui stimulent la formation des vaisseaux sont proposées pour réparer des défauts osseux. Cependant, le diabète caractérisé par un taux élevé de glucose dans le sang, perturbe la fonction de ces cellules et la réparation de l’os. L’utilisation de ces cellules pour réparer et l’intérêt de leur produit de sécrétions dans la réparation de l’os diabétique restent peu étudiés. L’objectif du projet répond au besoin scientifique et clinique de mieux connaitre et optimiser la réparation de l’os diabétique. Il vise à évaluer la capacité à former l’os (potentiel ostéoformateur) et des vaisseaux sanguins (potentiel angiogénique) du sécrétome et des vésicules extracellulaires de cellules stromales mésenchymateuses dans le but d’améliorer la réparation osseuse chez le rat diabétique. L'hypothèse sous-jacente au projet de recherche proposé est que cela constitue une alternative de choix à la thérapie cellulaire pour réparer l’os diabétique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en biothérapie. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes de réparation osseuse chez le diabétique de type 2. Par ailleurs, il fournira des informations sur l’effet bénéfique ou pas du sécrétome et des vésicules extracellulaires comparé à celui des cellules stromales mésenchymateuses dans la réparation de l’os diabétique. A long terme un tel projet permettra de mettre sur pieds des stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients diabétiques qui présentent des accidents du squelette avec une perte osseuse importante ou nécessitant la pose d’implants.

Procédures

Pour les souris: 1-Implantation sous cutanées (72 + 8 souris de marges) d'hydrogels ( 1X ; durée ~30 min) 2- Imagerie (24 + 8 souris de marges) micro-scanner in vivo (4X; durée 15 min) Pour les rats : 1- craniotomies avec implantation d’un hydrogel ostéoinducteur (168 rats ZDF + 10 rats ZDF imprévus et 24 rats ZL + 6 rats ZL imprévus) (1X, durée 30 min) ; 2- Imagerie (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) micro-scanner in vivo (5X; durée 15 min) ; 3- Infiltration du réseau vasculaire (56 rats ZDF + 5 rats ZDF imprévus et 8 rats ZL + 3 rats ZL imprévus) par un agent radio-opaque (1X; durée 30 min)

Impact sur les animaux

L’implantation sous cutanée chez les souris nudes peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, oedème. La chirurgie sur calvaria de rat peut également entrainer un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire et post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). Une complication éventuelle est l’infection cutanée, susceptible d’entrainer de la douleur et de la souffrance chez les animaux. Elle constitue un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). L’anesthésie chez les souris et les rats, nécessaire à l’imagerie non invasive en microscanner va également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort et les explants retirés pour évaluer la réponse tissulaire (formation osseuse, inflammation et angiogenèse) en site sous cutané (ectopique) afin d’identifier les conditions pertinentes à tester en site osseux (orthotopique). Les rats seront tous mis à morts aux temps terminaux et les calvarias seront prélevées pour l’étude de la formation osseuse, de la vascularisation et de l’inflammation au niveau des défauts osseux. Justification de la mise à mort : prélèvement des implants pour évaluer la réponse tissulaire et la formation de l’os autour de ces implants.

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel, orchestré et complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoïde, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages ostéoblastes/ cellules endothéliales par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Cependant ces modèles sont dénués de système vasculaire. Or, la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier l’apport de cellules souches et le sécrétome dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir des résultats valident en respectant le principe de réduction des 3 R est de 6 animaux /groupe /temps / type d’analyse. Pour tenir compte des éventuelles pertes lors des procédures ce chiffre est porté à 8 animaux/groupe /temps/ type d’analyse. Pour étudier le potentiel à former des vaisseaux sanguins et de l’os en sous cutané, quatre implants seront posés par animal afin de réduire le nombre total de souris nécessaire pour obtenir des groupes de 8 par condition. Par ailleurs, l’inflammation et l’angiogenèse seront étudiés sur les mêmes animaux, permettant de réduire leur nombre et de maximiser la contribution de celles-ci. Dans la même visée de réduction du nombre d’animaux, seules les conditions pertinentes (meilleur potentiel ostéoinducteur et faible inflammation) seront testées pour les procédures chez le rat. De plus, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. Par ailleurs, la réparation osseuse et la vascularisation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans les protocoles expérimentaux. Au cours des chirurgies (avec champs et instruments stériles) un gel oculaire sera appliqué dans les yeux des animaux pour éviter leur dessèchement. Ils seront placés sur tapis chauffant pour limiter les pertes thermiques. Pour les implantations sous-cutanées, une analgésie préventive sera mise en place par injection sous cutanée (SC) 20 minutes avant la chirurgie. Les animaux seront ensuite anesthésiés par injection intra-péritonéale (IP) puis le dos sera rasé et désinfecté avec une solution antiseptique à large spectre. Une analgésie post-opératoire se fera par injection SC pendant 2 à 3 jours après l’opération. Pour les implantations intra-osseuses, une analgésie pré- et post-opératoire se fera par une injection SC ainsi qu’une antibiothérapie préventive. Après chirurgie, les animaux seront hébergés, seuls en cage jusqu’au lendemain matin dans une pièce dédiée avec température ambiante à 26° puis remis en conditions standards d’hébergement. Pour l’imagerie micro-scanner in vivo, les souris et les rats seront anesthésiés par voie gazeuse et seront surveillés jusqu’à leur réveil. À la suite des procédures chirurgicales, les expérimentateurs observeront les animaux deux fois par jour les 3 premiers jours post-opératoires puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des critères définis et scorés au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à la procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal. Les mesures retenues pour les atténuer et/ou les supprimer seront appliquées si nécessaire. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée par les zootechniciens. Pour un groupe d’animaux, l’injection d’un agent de contraste intracardiaque en point terminal nécessitera une thoracotomie qui est un geste douloureux. En conséquence, les rats recevront une prémédication analgésique par injection SC avant anesthésie par voie gazeuse jusqu’à immobilité totale de l’animal puis une IP d’un anesthésique générale couplé à un analgésique.

Choix des espèces

La souris nude nRI de 9 semaines sera utilisée pour l’évaluation en dehors d’un site osseux du potentiel des cellules souches mésenchymateuses et de leurs produits de secrétions à induire la formation des vaisseaux sanguins et de l’os. Possédant un système immunitaire déficient, la souris nude est la candidate de choix pour apprécier les mécanismes d’intégration d’implant sans crainte d’une réaction de rejet immunitaire. Nous étudions le diabète de type 2 (incidence élevée chez l’Homme) pour lequel les modèles animaux proposés ne présentent pas de surmortalité, et ne requièrent pas de soins spécifiques. Afin de garantir l’homogénéité et la reproductibilité, nous avons opté pour un diabète d’origine génétique à savoir le rat ZDF (Leptr -/-) de 24 semaines, car ce modèle de diabète mime fidèlement le diabète de type 2 comme chez l’humain, depuis son mode d’installation jusqu’aux complications associées incluant les complications osseuses. De plus, nos études précédentes sur le même modèle animal ont montré qu’ils pouvaient vivre en animalerie jusqu’à un âge avancé sans nécessiter des soins particuliers et qu’ils supportaient relativement bien les procédures du protocole. Les rats Zucker LEAN (ZL) de 24 semaines ne présentent pas de mutation Leptr -/- et ne développent pas spontanément de diabète ils sont des contrôles de choix.

Injectées de cellules tumorales puis traitées tous les deux jours, une partie des souris subit aussi deux irradiations à trois jours d'intervalle, calibrées pour détruire leur moelle osseuse. 4 871 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre pourquoi les immunothérapies échouent chez une partie des patients. Toutes sont tuées, y compris les témoins sans tumeur, parce que l'étude porte sur les cellules contenues dans leurs organes. Le porteur écrit que ses procédures n'impliquent pas l'arrivée des animaux aux points limites, après avoir décrit une gêne respiratoire, une nécrose tumorale et une baisse de tonicité dans les derniers stades de la maladie.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier le mode d’action des immunothérapies (IT) afin de mieux appréhender les échecs de ces traitements chez les patients/cancers non répondeurs. Dans cet objectif, il est dans un premier temps nécessaire de mieux comprendre les réactions immunitaires ayant cours durant les cancers et la façon dont elles sont modifiées par les IT. Cela devrait permettre de mettre en évidence les types cellulaires qui sont impliqués dans l’élimination de la tumeur et la façon dont ces cellules immunitaires tuent les cellules tumorales. En particulier, ce projet s’articule autour de 4 objectifs principaux : - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient les cellules immunitaires infiltrant la tumeur - Comprendre comment la tumeur et les IT modifient la génération des cellules du SI à distance dans la moelle osseuse - Identifier les types cellulaires essentiels au fonctionnement des IT - Identifier les mécanismes d’action utilisés par le système immunitaire (SI) et activés par les IT pour lutter contre la tumeur Ce projet nécessite l'utilisation de plusieurs procédures censées reproduire a minima la diversité des cancers observés chez l’être humain. Nous nous focalisons sur trois types principaux de cancer à savoir le cancer du poumon, le cancer de la peau et les lymphomes. Ces cancers sont bien modélisés chez le petit animal et les traitements utilisés chez l'être humain fonctionnent sur les animaux. Cela permet de modéliser avec précision le contexte immunitaire de l’animal avec une certitude convenable que les effets puissent être, au moins en partie, similaires chez l’humain. Hautement translationnel, ce projet permet de tester rapidement la cohérence des résultats obtenus sur les modèles murins avec les observations réalisées sur deux cohortes de patients atteints de cancers et traités par IT. Ainsi, ce projet devrait permettre de mieux comprendre pourquoi une fraction significative de patients/cancer ne répondent pas aux IT, malgré les résultats très prometteurs observés chez les patients répondeurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Premièrement, la description de nouvelles cellules dans le cancer du poumon permettra d’établir de nouvelles pistes pour le ciblage thérapeutique des immunothérapies dans cette pathologie. Deuxièmement, la compréhension des mécanismes de fonctionnement des immunothérapies permettra de mieux comprendre la réponse des patients au traitement. Ici, nous estimons qu’il est probable que nous puissions proposer un biomarqueur circulant chez les patients permettant d’évaluer rapidement leur réponse au traitement (en 1 à 2 semaines) contrairement à 2 à 3 mois actuellement. Troisièmement, la description de nouvelles molécules et mécanismes des cellules myéloïdes impliquées dans la lutte contre les cancers permettra de proposer des traitements de synergie avec les immunothérapies visant spécifiquement les cellules myéloïdes. Ces traitements pourraient grandement améliorer la réponse des patients aux immunothérapies. Dans l’ensemble, ce projet tire sa cohérence de l’approche globale qu’il propose vis-à-vis du fonctionnement des immunothérapies. Ce projet est suffisamment diversifié pour résister à l’échec potentiel d’une sous-partie.

Procédures

Les animaux anesthésiés ou vigiles pourront être injectés une fois en sous-cutané, intra-péritonéal, ou intra-veineux d’une solution de cellules tumorales. L’anesthésie prend quelques minutes à agir et l’injection quelques secondes. Les animaux pourront subir des injections intra-péritonéales (animaux vigiles ou anesthésiés) ou intra-veineuses de traitement tous les deux jours. Du sang pourra être prélevé une fois sur les animaux anesthésiés avant leur mise à mort. Ce prélèvement se fera en quelques secondes. Les animaux ne se réveilleront pas entre le prélèvement et la mise à mort. Dans certains cas, une goutte de sang pourra être prélevée deux fois à huit jours d’intervalle. Pour certaines procédures, les animaux seront irradiés (deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle; leur durée sera mise au point durant le projet, elle doit pouvoir conduire à une myélosuppression).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Néanmoins, la fréquence des injections peut tout de même entraîner une nuisance, de même que les prélèvements. Nous n’utilisons pas d’animaux ayant un phénotype dommageable, hormis une lignée qui sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux sains, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie selon un tableau de suivi des points limites. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales sont comme suit : - Pour les tumeurs pulmonaires : gène à la respiration, baisse de la tonicité générale et perte de poids dans les derniers stades du cancer. - Pour les tumeurs sous cutanées : Nécrose de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie. Les procédures que nous utilisons, hormis l’étude de la survie, n’impliquent pas l’arrivée des animaux aux points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentes dans les organes et devons nécessairement mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une modélisation in vitro, via de la culture cellulaire ou la conception d’organoïdes 3D nous le ferons, comme nous l’avons déjà fait par le passé. Cependant, ni la modélisation mathématique, ni les systèmes in vitro ne permettent d’étudier les effets du développement tumoral et les réponses immunitaires anti-tumorales induites par les tumeurs ou la vaccination. Nous nous intéressons à des cellules nouvelles non encore décrites et dont nous ne connaissons par les progéniteurs ni l’origine. Il est donc impossible de ne pas travailler sur l’animal. Dès que les cellules auront été décrites et les progéniteurs identifiés, nous tâcherons de mettre au point des méthodes de cultures in vitro pour en étudier la fonctionnalité au plus près sans impliquer les animaux dans des procédures expérimentales.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animal. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistique. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques. En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées. Deux irradiations seront réalisées à 3 jours d'intervalle.

Raffinement

Dans la mesure du possible, les animaux ne seront pas laissés seuls dans leur cage. Les expériences impliquant le développement de tumeurs seront pratiquées en accord avec les points limites acceptables définis dans la littérature. Afin de minimiser l'impact des procédures, nous allons anesthésier les souris avant d'injecter les tumeurs. Les signes cliniques permettant d’évaluer l’état de douleur ou détresse seront évalués tous les 3 jours afin de mettre à mort les animaux dépassant un certain niveau de souffrance défini par un point limite intégrant plusieurs critères. Pour éviter des lésions sur les tumeurs palpables, de la litière à base de cellulose sera utilisée dans les cages, dès que la taille ou l’aspect de la tumeur le nécessitera. Du Gel hydrique et/ou des réhydratations en sous-cutanée seront donnés aux animaux ayant du mal à se nourrir, s’abreuver ou avec des poils hérissés (signe d’un défaut d’alimentation). Si les animaux présentent des signes d’hypothermie, les cages seront chauffées. Des maisonnettes en carton ou des tubes (carton ou plastique) pourront être introduits dans les cages de stabulation en guise d’enrichissement. La lignée immunodéprimée à phénotype dommageable sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’être humain. Cette espèce a une reproduction facilement manipulable avec un temps de gestation court et plusieurs individus par portée, donc des conditions d’élevage optimales. De plus, ce modèle étant très étudié, il y a une vaste expertise technique et scientifique autour de son utilisation et de nombreux outils sont déjà disponibles (anticorps, molécules inhibitrices/activatrices, modèles de souris génétiquement modifiées…). La souris est donc le modèle le plus pertinent pour notre étude. Les animaux seront mis en expérimentation à l'âge adulte à partir de 8 semaines après leur naissance et jusqu’à 25 semaines environ. Cela permettra d’étudier un système immunitaire mature proche de celui de l’être humain.

Toutes tuées pour prélever tissus et sang, 1 500 souris rendues obèses et diabétiques par une mutation du récepteur à la leptine vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une à deux fois par jour, elles reçoivent des composés par voie orale, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse, et subissent cinq prélèvements sanguins, des jeûnes de quatre à quatorze heures, des épilations sous anesthésie et des séjours de vingt heures en cage métabolique. Le porteur reconnaît que la contention répétée peut créer des lésions cutanées et que la surcharge en glucose empêche ces souris diabétiques de revenir à une glycémie normale. Il affirme que les cultures cellulaires ne sont pas un miroir suffisamment fiable de l'organisme et que les dysfonctions métaboliques ne peuvent être reproduites qu'in vivo.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline et au diabète de type 2. Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. Le modèle murin utilisé au cours de cette étude est un modèle dont la mutation spontanée touchant le récepteur à la leptine rend la souris hyperphagique dès la naissance et donc obèse, et ce, même sous régime standard. Son obésité s’accompagne de diabète de type 2 et constitue un modèle classique et standard utilisé lors des études précliniques pour démontrer l’efficacité des molécules thérapeutiques à la fois sur l’obésité et le diabète. Au cours du temps, d’autres comorbidités associées au diabète sont observées chez ces souris tels que la néphropathie diabétique et certaines cardiomyopathies.

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant l’obésité, ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète, ou ciblant l’insulinopénie, phase tardive du diabète peuvent être trouvés. Ceci permettra d’éviter les complications induites lors des phases avancées du diabète et d’augmenter les taux de survie des patients.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 5 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectué en milieu et fin de projet. Le test de tolérance au glucose nécessite une mise à jeun de 14h qui implique une individualisation des animaux. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Afin de déterminer si le traitement a un impact sur la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale des animaux, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire (GFR) en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement. La GFR consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse après 2h de jeun (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies et les GFR, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 20h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

1) Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Les contentions répétées peuvent créer des lésions cutanées sur les souris diabétiques. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 2) Les mises à jeun (4h ou jeun complet sur la nuit) lors des prélèvements de sang et tests de tolérance peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques et hyperphagiques. Pour éviter tout risque de cannibalisme lors de la période de jeun de 14h, les animaux seront mis en cage individuelle. 3) La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. 4) Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. 5) Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h. 6) Plus les souris vieillissent, plus le risque de complications liées à la maladie augmente.

Devenir

Tous les animaux (1500 souris) seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études précoces de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra de d’utiliser le nombre minimal d’animaux tout en assurant la robustesse des résultats

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : du coton en vrac sera systématiquement ajouté pour permettre aux souris de se réchauffer. La litière sera changée régulièrement car ces souris urinent beaucoup. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé au cours de cette étude est un modèle dont la mutation spontanée touchant le récepteur à la leptine rend la souris hyperphagique dès la naissance et donc obèse, et ce, même sous régime standard. Son obésité s’accompagne de diabète de type 2 et constitue un modèle classique et standard utilisé lors des études précliniques pour démontrer l’efficacité des molécules thérapeutiques à la fois sur l’obésité et le diabète. Au cours du temps, d’autres comorbidités associées au diabète sont observées chez ces souris tels que la néphropathie diabétique et certaines cardiomyopathies. Les souris diabétiques sont hyperphagiques depuis la naissance, l’obésité apparaît très précocement dès le plus jeune âge (4 semaines d’âges). Ainsi le diabète apparait très précocement avec des niveaux de glycémies et d’insulinémies très élevés dès les premières semaines de vie (stade d’insulinorésistance) puis une phase d’insulinopénie à l’âge adulte (insuffisance des cellules béta qui n’est pas observée chez des souris rendues obèses sous régime gras). Les comorbidités touchant le rein et le cœur apparaissent dès 12-15 semaines d’âges. Ainsi, en les prenant à 6 semaines d’âges nous garantissons d’agir lorsque la diabète s’installe et nous permet d’étudier l’efficacité des thérapies sur l’avancée du diabète et des comorbidités.

Pour comparer deux méthodes de fabrication de cellules CAR-T anti-CD19, l'une en deux jours, l'autre en onze, 120 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques, jusqu'à trois injections intraveineuses en contention, trois prélèvements sanguins submandibulaires et un prélèvement de moelle osseuse au fémur, avec un suivi des tumeurs par imagerie. Le porteur écrit que ces gestes n'induiront aucune nuisance, tout en décrivant chez les souris témoins une leucémie qui restreint les mouvements des pattes arrière et fait perdre l'appétit et le poids. La réaction du greffon contre l'hôte, qui peut survenir plusieurs semaines après l'injection des CAR-T, figure parmi les points limites qui déclenchent la mise à mort.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’étudier l'efficacité de 2 modes de production de cellules dites CAR-T qui sont des cellules du système immunitaire qui ont été génétiquement modifiées dans le but de reconnaître puis d'éliminer des cellules cancéreuses. La thérapie par cellules CAR-T consiste en l'injection au patient de ses propres cellules T après leur amplification ex vivo et leur modification pour leur faire exprimer un récepteur capable de reconnaitre une protéine exprimée à la surface d'une cellule tumorale et ainsi de pouvoir la détruire. La thérapie cellulaire CAR-T ciblant la molécule CD19 a montré une efficacité remarquable dans le traitement des hémopathies malignes-B, cependant, des essais cliniques ont rapporté que 30 % des patients n'ont pas pas pu recevoir de perfusion de cellules CAR-T en raison de leur décès (dû à une progression trop rapide de la maladie) et en lien avec un processus long de fabrication de ces cellules qui est actuellement de 7 à 14 jours. Il est donc essentiel de réduire la durée de production des cellules CAR-T pour une utilisation à plus grande échelle. Une étude préclinique a montré que les cellules CAR-T produites avant 3 jours avaient une capacité proliférative accrue et un effet antitumoral plus important que celles produites dans les 9 jours, néanmoins, la faisabilité de la production accélérée de CAR-T ainsi que son efficacité n'ont pas été suffisament testées. Dans ce projet nous allons comparer l'efficacité antitumorale de cellules CAR-T anti-CD19 produites au laboratoire en 2 jours (appelées FASTCAR) à celles de cellules de CAR-T (dites conventionnelles) produites en 11 jours. Ces cellules CAR-T seront injectées et testées dans 2 modèles murins de cancer du sang [Leucémie Aigue Lymphoblastique de type-B (LAL-B) ou Leucémie Aigue Myéloïde (LAM)] qui expriment la cible CD19.

Bénéfices attendus

Cette approche devrait nous permettre d’évaluer dans un modèle murin l’intérêt d’une telle stratégie d’injection chez l’homme afin d’améliorer la sécurité du traitement et d’optimiser l’injection des cellules CAR-T afin d’en améliorer l’efficacité thérapeutique.

Procédures

Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention, 1 injection de cellules à J0 puis 1 ou 2 autres (J10 et J17 selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Des prélevements sanguins seront réalisés en submandibulaire sur souris anesthésiée tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, moins de 10 secondes par prélèvement. Suivi du développement des tumeurs sur souris anesthésiée par utilisation d'un bioimageur, acquistion du signal durant 2 minutes. Prélèvements de sang et de moelle sur souris après le mise à mort.

Impact sur les animaux

Les interventions : injections en intra-veineuse, les prélèvements et le suivi par imagerie sont réalisés dans des conditions maitrisées qui n'induiront pas de nuisance sur les animaux. Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hote plusieurs semaines après l'injection des CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure expérimentale.

Remplacement

Nous avons déjà étudier le phénotype et la fonctionnalité des CAR-T cells in vitro en démontrant leur capacité à tuer les cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de démontrer la qualité et l'efficacité des cellules CART à court terme. Pour nous rapprocher des conditions physiologiques chez le patient, une étude de l'efficacité des CAR-T à long terme dans un modèle in vivo reste cependant indispensable et incontournable avant leur utilisation en thérapeutique clinique. Le choix de la souris repose sur la connaissance du système immunitaire de cette espèce, sur l’abondance des outils d’analyse des réponses immunitaires à disposition et par sa proximité phylogénétique avec l'homme qui permet d’envisager la transposition en clinique des stratégies évaluées.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF (Specific Pathogen Free) : ce statut SPF considère les principaux pathogènes chez les rongeurs et permet donc d’établir un état sanitaire pour des animaux « en bonne santé » et indemnes des principaux pathogènes. Les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse en respiration spontanée. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront réduit au strict minimum. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) sera mise en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un analgésique sera utilisé le temps nécessaire.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observé dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.

Jusqu'à cinq injections dans un muscle, dans l'abdomen ou dans le sang, espacées de vingt-quatre heures, et pour une partie des souris six jours de tapis de course à dix minutes par jour : 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines jeûnent jusqu'à douze heures et perdent du poids. Toutes sont tuées pour prélever leurs muscles et analyser les protéines des membranes qui déclenchent la contraction, structures défectueuses dans des maladies génétiques du muscle et dans le diabète de type 2. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants ne permet ce travail, les cultures de cellules musculaires n'atteignant pas selon lui un stade assez mature, et ne donne aucun élément sur le calcul qui aboutit à 422 souris.

Objectifs

Les muscles se contractent grâce à des connexions avec le cerveau via des neurones. Les signaux émis par les neurones se propagent à la surface des fibres musculaires, le long de leurs membranes, ce qui déclenche d’autres signaux au sein des fibres et entraîne leur contraction synchronisée. Les structures membranaires des fibres musculaires impliquées dans la transmission de ces signaux sont défectueuses dans certaines maladies génétiques du muscle et le diabète de type 2. Elles ont été peu étudiées et des données de la littérature suggèrent qu’elles sont impliquées dans d’autres fonctions que la contraction comme le stockage de glucose. L’objectif de ce projet est d’étudier ces structures membranaires pour mieux comprendre leur implication dans des pathologies. Les études seront réalisées avec le modèle souris qui présente un degré de similitude important avec l’humain en ce qui concerne les muscles.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de comprendre le fonctionnement et toutes les fonctions associées aux membranes des fibres musculaires impliquées dans leur contraction. C’est une étape essentielle pour connaître les défauts responsables de 2 types de maladies associées à ces structures : des maladies génétiques du muscle et le diabète de type 2, et pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques pour ces pathologies.

Procédures

Les souris seront injectées au maximum 5 fois dans un muscle, l’abdomen ou la circulation sanguine pendant moins de 30 secondes. Les injections seront séparées d’au moins 24h. Certaines de ces souris seront entraînées sur un tapis de course à raison de 10 min par jour pendant 6 jours.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur tous les animaux sont la douleur due aux piqûres d’aiguilles avec un faible risque d’hématome au point d’injection. Certains animaux auront une perte légère de poids corporel dû à un jeûne de 12h maximum. Le protocole d’entraînement à la course peut entraîner une fatigue passagère mais ne conduit pas à l’épuisement des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever les muscles et réaliser des analyses moléculaires.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, permettant la réalisation du projet. Les cultures in vitro de cellules musculaires ne se développent pas suffisamment pour atteindre un stade mature des structures étudiées. Elles ont cependant permis de faire un premier tri des réactifs pour réduire le nombre de ceux qui seront testés chez les animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé grâce à des tests statistiques afin d'obtenir des résultats standardisés et reproductibles en réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en en gardant suffisamment pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Les injections seront réalisées à l’aide d’aiguilles fines et sous anesthésie générale pour les injections dans la circulation veineuse pour réduire la douleur de l’injection. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par un personnel formé et évalué grâce à des signes cliniques codifiant le niveau de bien-être pour intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance apparaissent, notamment par la délivrance d’anti-douleurs. Les souris qui réaliseront l’exercice de course seront entraînées les 5 jours précédents pour réduire le stress de la nouveauté.

Choix des espèces

La souris présente un degré de similitude important avec l’humain en ce qui concerne les muscles. Des animaux âgés d'au moins 2 mois seront étudiés car les muscles sont matures à cet âge.