Souris
Etude du rôle de l’hémoglobine intra-épithéliale colique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinq jours d'injections consécutives, puis une injection par semaine : 60 souris reçoivent du tamoxifène pour éteindre un gène de l'hémoglobine dans leur colon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur qualifie le produit injecté de "non irritant et non toxique", et décrit dans le même RNT les douleurs liées aux injections, l'irritation possible due au solvant huileux et le stress des contentions répétées. Il ajoute des diarrhées et une perte de poids possibles, liées au phénotype des animaux, et prévoit la mise à mort de celles qui atteignent un point limite. Toutes sont tuées à des temps échelonnés, pour analyser leur colon et le microbiote de leurs selles.
Objectifs
La muqueuse du colon est tapissée de cellules qui ont besoin d’une grande quantité d’oxygène pour exercer leurs fonctions. Dans le colon on retrouve aussi un grand nombre de bactéries jouant un rôle important dans la digestion des fibres alimentaires. Un certain nombre de ces bactéries sont tuées par l’oxygène. Il y a donc un gradient d’oxygène entre la muqueuse colique (la paroi du tissus) et la lumière colique (l’intérieur du colon). La manière dont ce gradient est généré n’a pas encore été élucidé. Chez tous les mammifères, l’oxygène est transporté dans le corps via le sang grâce à l’hémoglobine. Nous avons découvert que l’hémoglobine se trouve également dans les cellules de la muqueuse colique. Sur cette constatation, nous émettons l’hypothèse que les cellules de la muqueuse colique capture l’oxygène grâce à l’hémoglobine afin d’empêcher sa fuite vers la lumière colique préservant ainsi les bactéries sensibles à l’oxygène. L’objectif général est de comprendre comment fonctionne le gradient d’oxygène dans le colon c’est-à-dire comment l’oxygène nécessaire aux cellules épithéliales est capturé par celles-ci de façon à ne pas tuer certaines bactéries présentes dans l’intestin.
Bénéfices attendus
Le microbiote du colon est important pour la digestion. Tout processus qui perturbe ce microbiote peut être la cause de différentes pathologies comme des troubles digestifs allant de la simple diarrhée passagère aux maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) en passant par le syndrome du côlon irritable. Et depuis quelques années, différentes études ont également montré qu’il pouvait être à l’origine de cancers, diabète, obésité, anxiété… Ces travaux ont pour but de montrer la relation entre la respiration des cellules du colon et son impact sur le microbiote.
Procédures
Un lot d’animaux sera réparti en 6 groupes, un produit non irritant et non toxique sera injecté aux animaux vigiles sur 5 jours consécutifs puis seulement 1 fois par semaine. Les animaux seront ensuite mis à mort à différent temps pour analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront celles liées à des injections 5 jours consécutifs ; douleurs liées aux injections elles-mêmes, irritation possible liée au solvant huileux et stress lié aux contentions répétées Par ailleurs, des diarrhées et perte de poids liées au phénotype des animaux pourront éventuellement être observées
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Il a été développé dans le laboratoire des modèles cellulaires en trois dimensions que l’on appelle « organoïdes ». Ces modèles cellulaires sont obtenus à partir de la muqueuse colique de souris. Ils peuvent être gardés en culture et l’on peut faire agir sur ces organoïdes différents réactifs permettant d’étudier le rôle de l’hémoglobine dans les cellules les constituant. Nous utilisons en priorité ce modèle par rapport à l’expérimentation in vivo. Des tests préliminaires sur ces modèles ont permis de montrer l’impact qu’entraine une diminution de l’hémoglobine sur la respiration des cellules coliques. Toutefois, ces études in vitro doivent être complétées par une analyse in vivo pour étudier l’ensemble du processus dans un organisme intégré (notamment l’impact de la modification de la respiration des cellules épithéliales coliques sur les bactéries présentes dans les selles).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée.
Raffinement
L’ensemble des animaux sera surveillé tous les jours pendant les injections de Tamoxifène. Une surveillance supplémentaire sera faite lors des week-ends si et seulement si des signes précoces de détresse (diarrhée, perte de poids …) sont observés. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de manière objective l’état des animaux et des points limites ont été définis. En cas d’atteinte d’un point-limite, les animaux seront mis à mort Injection de solutés en cas de déshydratation et administration d’un antidiarrhéique en cas de symptômes.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée en biologie car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique. La connaissance du génome murin et l’existence de nombreuses lignées génétiquement modifiées permettant d’étudier la fonction des gènes dans les différents tissus en font un très bon modèle , notamment pour étudier l’impact sur le microbiote.
Évaluation et suivi du bien-être animal
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 1430
Moins de trente secondes, un poinçon dans le pavillon de l'oreille, une fois par animal : c'est le seul geste décrit pour 37 400 souris et 1 430 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet s'intitule "Évaluation et suivi du bien-être animal" et sert à héberger, croiser et produire des lignées génétiquement modifiées pour le compte de chercheurs extérieurs à l'établissement. Une partie des animaux part vers d'autres établissements pour y être expérimentée, une autre reste pour l'élevage, et le porteur indique que les surnuméraires, ceux dont le génotype ne sert pas aux croisements et les reproducteurs dont la fécondité baisse avec l'âge sont mis à mort. Les lignées concernées sont immunodéficientes, hémophiles ou porteuses d'un phénotype qui n'apparaît qu'avec l'âge, ces dernières étant expédiées ailleurs ou tuées avant que la tumeur ou la dystrophie musculaire ne se déclare.
Objectifs
Un phénotype est considéré comme dommageable si les animaux de la lignée sont susceptibles de ressentir, du fait de l’altération génétique, une douleur, une détresse, une souffrance ou un préjudice durable équivalents ou supérieurs à ceux causés par l'introduction d'une aiguille effectuée conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Aussi, toutes lignées avec un phénotype dommageable même s’il ne s’exprime pas dans des conditions qui permettent d’éviter son expression chez les animaux hébergés doivent être encadrées par une autorisation de projet. Notre établissement héberge différentes lignées de souris et de rats génétiquement altérées pour le compte de chercheurs externes au laboratoire et donc selon les projets, l’unité peut accueillir ou produire des lignées à phénotype dommageable. Ce projet a deux objectifs : - L’évaluation du bien-être animal par la mise en place d’une procédure d’identification et de caractérisation d’un phénotype dommageable (procédure 1). - Mise en place de raffinement afin que le phénotype ne s’exprime pas au sein de l’établissement, on parle ici de phénotype dommageable potentiel non exprimé dans nos conditions d’élevage (procédure 2). PROCÉDURE 1 Evaluation du bien-être animal, cette procédure s’applique à : 1. La réception d’une nouvelle lignée. 2. La création d’une nouvelle lignée par croisement entre deux lignées génétiquement altérées. Les animaux seront suivis avec la grille d’évaluation du bien-être animal au moins une fois par semaine. Suite à cette évaluation, les lignées seront classées comme suit : - lignée à phénotype NON DOMMAGEABLE ; - lignée à phénotype DOMMAGEABLE NON EXPRIMÉ, ces animaux entrent dans la procédure 2 ; - lignée à phénotype DOMMAGEABLE EXPRIMÉ, nécessité d’une DAP spécifique pour la prise en charge de ces animaux. PROCÉDURE 2 Cette procédure ne concerne que les lignées qui à l’issue de la procédure 1 de ce projet ont été identifiées comme lignée à phénotype dommageable non exprimé. Plusieurs types de lignées entrent dans cette catégorie : - les lignées immunodéficientes, - les lignées hémophiles, - les lignées pour lesquelles le phénotype dommageable ne s’exprime que pour un génotype donné, - et les lignées dont le phénotype dommageable apparait à un âge défini. Le but de cette procédure est de mettre en place une surveillance du bien-être de ces animaux afin de s’assurer que les raffinements mis en place permettent que le phénotype dommageable ne s’exprime pas.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la détection et la prise en charge précoce d’un phénotype dommageable potentiel et par conséquent d’une éventuelle douleur pour éviter que cette dernière s'exprime. La procédure 1 permettra de définir et mettre en place une méthode générique d’évaluation du bien-être animal lors de la réception ou de la création par croisement de nouvelles lignées dans l’établissement. La procédure 2 permettra de gérer différents types de lignées ayant un phénotype dommageable potentiel mais non exprimé au sein de l’établissement avec des raffinements adaptés. Elle précise également les modalités de surveillance du bien-être de ces lignées afin de confirmer l’absence des nuisances. Ces deux procédures permettront ainsi d’élever différents modèles de souris ou de rat de chercheurs extérieurs à notre laboratoire pour les intégrer dans leurs projets de recherche avec les différents bénéfices précisés dans chaque projet d’utilisation (DAP spécifique).
Procédures
Une partie des animaux sera prélevée à l’oreille afin de réaliser le génotypage. Cette méthode consiste à prélever un petit échantillon de tissu sur la périphérie du pavillon de l’oreille où le tissu est le plus mince, à l’aide d’un poinçon ou d’un ciseau. Cette intervention n’est réalisée qu’une fois par animal et dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les lignées IMMUNODÉFICIENTES peuvent présenter différents niveaux de déficits immunitaires dont certains se traduisent en caractéristiques phénotypiques variées (développement des infections, baisse de fécondité, mortalité précoce, diarrhées, etc.). Ces animaux seront hébergés en isolateurs ou en portoirs ventilés, en conditions sanitaires de type « SOPF » (sans opportuniste, ni pathogène) qui permettent d’éviter les nuisances liées à l’immunodéficience. Les lignées HÉMOPHILES (déficientes pour des gènes codant pour les facteurs de coagulation) sont caractérisées par le temps de saignement prolongé uniquement en cas de section de la veine de la queue, qui ne sera pas pratiquée dans notre établissement pour éviter les nuisances. Ces animaux seront prélevés uniquement à l’oreille pour le génotypage et l'identification (un seul prélèvement), qui ne provoque pas de saignement prolongé sur ces lignées. Par ailleurs, le génotypage et l’identification ne seront pas systématiques puisqu’il s’agit de lignées maintenues à l’état homozygote. Nous prélèverons et identifierons ainsi uniquement les reproducteurs. D'autres caractéristiques possibles de ces lignées qui n'ont pas été observées dans nos conditions d'élevage sont : le saignement spontané pouvant entraîner un gonflement/hématome (joue, pattes postérieures) et la mort prématurée après des bagarres en raison d'hémorragies internes. Cependant, une attention particulière sera apportée en cas d'agressivité entre animaux et, si cela est constaté, les animaux seront suivis tous les jours avec la grille d'évaluation. Les lignées à phénotype TARDIF lié à l’âge (par exemple : développement de tumeurs ou de dystrophie musculaire entraînant dégénérescence progressive des muscles et une faiblesse musculaire) seront systématiquement expédiées pour expérimentation dans un autre établissement ou mises à mort avant occurrence de la nuisance. Les lignées à phénotype lié au GÉNOTYPE seront maintenues avec un schéma d’accouplement connu pour ne pas générer d’animaux au phénotype dommageable. Aucune nuisance n'est prévue lorsque l'élevage est effectué dans nos conditions d’hébergement. Néanmoins, dès qu’un animal présente un score = 1, la surveillance sera quotidienne et la vétérinaire et/ou la SBEA seront sollicités pour la mise en place de mesures supplémentaires de raffinement.
Devenir
Une partie des animaux portant le génotype d’intérêt sera expédiée dans d’autres établissements utilisateurs pour expérimentation. Une autre partie des animaux sera utilisée pour l’élevage ou l’expérimentation dans notre établissement. Les animaux utilisés pour l’élevage seront mis à mort si non nécessaires pour maintenir l’élevage (e.g. si génotype sans intérêt pour les schémas de croisements, surplus, ou si leur fécondité est réduite du fait de leur âge). Les animaux ayant atteint les points limites selon la grille d’évaluation seront mis à mort.
Remplacement
Les modèles de souris et de rats concernés par ce projet générique sont inscrits dans différents projets scientifiques extérieurs à notre laboratoire. Les porteurs de projets apporteront dans chacune de leurs DAP d'utilisation des précisions sur les alternatives non animales disponibles et expliqueront pourquoi elles ne peuvent pas être utilisées aux fins du projet.
Réduction
Nous mettons en place le nombre minimal d’accouplements nécessaires pour produire sur demande les lots expérimentaux pour chaque porteur de projet. Le but étant de limiter au maximum le nombre d’animaux et, si aucune expérimentation n’est planifiée, les lignées seront maintenues au minimum. La production des animaux sera ainsi planifiée et suivie par l’expérimentateur et les zootechniciens afin de limiter le nombre d’animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Le nombre de reproducteurs, le schéma de croisement et la durée d’accouplement seront définies en amont de la mise en place des croisements. Ces paramètres seront définis en fonction des objectifs et des différentes caractéristiques connues des lignées (fertilité des reproducteurs, viabilité de la descendance, nombre d’animaux/portée, ratio génotypes). Les lignées à phénotype dommageable potentiel lié au génotype seront maintenues avec un schéma d’accouplement connu pour ne pas générer d’animaux au phénotype dommageable. Les élevages seront suivis via les fichiers de l'élevage. Le nombre total d’animaux indiqué comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour les projets scientifiques associés. Les chercheurs sont fortement conseillés de procéder au cryoarchivage de leurs lignées et de ne pas les garder sous forme respirant en fin de leurs projets expérimentaux. La SBEA prendra, le cas échéant, le contact avec le chercheur pour argumenter l’arrêt d’élevage et la cryoconservation de souche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec divers enrichissements. Pour les souris, elles sont hébergées en cage de type « II long » à 6 animaux maximum à partir du sevrage et à 4 animaux maximum au sevrage pour les cages de type « I long ». Pour les rats, ils sont hébergés en cage dite « 900 » à 2 animaux pour un poids individuel maximum de 600g ou à 3 maximum dans les cages dites « 1800 ». Les animaleries de notre unité ont un contrôle sanitaire périodique. Les animaux d’âge représentatif et de génotype pertinent seront suivis avec la grille d’évaluation et de surveillance du bien-être animal contenant des points limites précoces à minima une fois par semaine et ce jusqu'à leur mise à mort, décès ou l’envoi vers l’établissement utilisateur où sera réalisée l’expérimentation. Dans la procédure 2, en plus du suivi avec la grille de surveillance, des méthodes de raffinement spécifique au type de dommages potentiels seront mises en place pour éviter l’expression de ces phénotypes. Les lignées IMMUNODÉFICIENTES seront ainsi hébergées en isolateurs ou en portoirs ventilés, en conditions sanitaires de type « SOPF » (sans opportuniste, ni pathogène). Les lignées HÉMOPHILES seront prélevées uniquement à l’oreille pour le génotypage et l'identification (un seul prélèvement). Par ailleurs, le génotypage et l’identification ne seront pas systématiques puisqu’il s’agit de modifications en homozygote. Nous prélèverons et identifierons ainsi uniquement les reproducteurs. Une attention particulière sera apportée en cas d'agressivité entre animaux et, si cela est constaté, les animaux seront suivis tous les jours avec la grille d'évaluation. Par ailleurs, nous ne rassemblerons pas de mâles issus d'accouplements différents lors du sevrage pour limiter le risque de bagarres. Si nous devons le faire pour éviter d'isoler un mâle, nous rajouterons de l'enrichissement dans la cage et les animaux seront suivis tous les jours avec la grille d'évaluation. Les lignées à phénotype TARDIF lié à l’âge seront expédiées pour expérimentation dans un autre établissement ou mises à mort avant occurrence de la nuisance.
Choix des espèces
La souris et le rat sont parmi des modèles d'animaux les plus utilisés dans la recherche en raison de leurs nombreuses similitudes avec l’homme. De plus, le choix de ces modèles est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature permettant ainsi des échanges internationaux au sein de la communauté scientifique. Les justifications techniques et scientifiques détaillées pour chaque lignée utilisée seront apportées dans les projets « utilisateurs » (DAP spécifique). Une partie des animaux sera utilisée pour les croisements dès l’âge de deux mois et ce jusqu’à un âge où le taux de fécondité est maintenu stable selon la souche ou jusqu’au point précoce de l’expression d’un phénotype tardif. Une autre partie sera utilisée dans notre établissement ou envoyée dans d’autres établissements pour expérimentation selon l’âge d’utilisation dans de différents projets scientifiques ou avant l'expression d'un phénotype tardif lié à l’âge.
Rôle de l’activation du cortex rétrosplénial au cours du sommeil paradoxal dans un modèle murin de dépression
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, 120 souris rendues dépressives vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole les expose pendant trois semaines à deux stress modérés par jour, puis mesure leur "comportement de désespoir" en les suspendant par la queue, deux fois à un mois d'intervalle. Après une chirurgie du crâne de deux heures, chacune vit seule, reliée par un câble au système d'enregistrement du sommeil, et subit deux privations de sommeil paradoxal. Quatre tests comportementaux sont annoncés pour vérifier que les animaux sont bien dépressifs, sans que le porteur précise lesquels, et le bénéfice attendu reste au conditionnel, de nouveaux traitements pour les 30 % de patients qui résistent aux antidépresseurs actuels.
Objectifs
La dépression est un trouble de l’humeur très répandu, 1 personne sur 5 en souffrira dans sa vie. Les mécanismes à l’origine de cette pathologie restent mal connus. Le sommeil paradoxal (SP) jouerait un rôle clef dans sa mise en place et son maintien, les patients dépressifs montrant des augmentations de SP, sans que l’on sache pourquoi. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier le SP dans un modèle de dépression chez la souris. Dans une précédente étude ex vivo, nous avons montré qu’il y avait une zone du cerveau (cortex rétrosplénial) qui présentait moins d’activation pendant le SP chez les souris une fois dépressives comparés aux contrôles. L’idée de ce projet est d’abord de vérifier les résultats déjà obtenus en enregistrant directement in vivo l’activité des neurones du cortex rétrosplénial pendant l’installation de la dépression des souris. Ensuite, nous voulons activer artificiellement les neurones du rétrosplénial pendant le SP puisqu'ils diminuent leur activité à cause de la dépression. Pour ce faire, nous utiliserons de l'optogénétique pour grâce à des stimulations lumineuses tenter de rétablir un phénotype contrôle chez des animaux dépressifs.
Bénéfices attendus
Le lien entre SP et dépression a été établi depuis plus de quarante ans. Il a ainsi été rapporté chez les patients dépressifs une augmentation des quantités de SP au cours de la nuit et du nombre de mouvements rapides des yeux caractéristiques à ce stade. Ces résultats ont été confirmés sur les modèles rongeurs de dépression. Nos résultats pourraient ouvrir des perspectives nouvelles en remettant au gout du jour l’impact délétère du SP dans la dépression, ouvrant également la porte au développement de nouveaux traitements plus ciblés dans un contexte où 30% des patients résistent aux antidépresseurs actuels.
Procédures
Les animaux transgéniques subissent un prélèvement du bout de la queue à 6 jour pour vérifier leur fond génétique, ce qui génère une légère douleur de très courte durée. Chirurgie/anesthésie et récupération postopératoire : Les animaux sont anesthésiés et des prototoles avec traitement anti-douleur pré et post-chirurgie sont prévus (Durée de la chirurgie : 2 heures). Privation et rebond (hypersomnie) de sommeil paradoxal : Permet d’obtenir plus de sommeil paradoxal sur une période de 2/3 heures. Deux privations/rebond sont prévues à un mois d’intervalle. Tests comportementaux : Pour vérifier que les animaux sont bien dépressifs, 4 tests comportementaux sont réalisés. Isolement durant le protocole : Les souris étant reliées par un câble au système d’acquisition sur ordinateur pour enregistrement les signaux de sommeil elles devront être logées dans des cages individuels pendant la durée du protocole. Modèle de dépression : Le modèle de stress utilisé permettant d’induire un état dépressif consiste en l’exposition des animaux pendant 3 semaines à deux stress modérés par jour. Suspension Tail Test : Effet stressant de courte durée (5 min) pour pouvoir mesurer le comportement de désespoir des animaux, symptôme essentiel de la dépression. Les animaux sont testés deux fois à un mois d’intervalle.
Impact sur les animaux
Premier effet indésirable concernant la chirurgie. Nous observons dans de très rares cas une hémorragie, une hypothermie très sévère ou une absence de réveil après une demi-heure de fin d’anesthésie. Les animaux sont suivis ensuite en post-op tous les jours et une fiche de score est remplie et si un animal montre des douleurs trop importantes il est mis à mort. Ensuite, concernant le protocole de dépression, nous n’attendons pas de dégradation sévère de l’état général des animaux. Néanmoins, face à des signes de souffrance physique évidents (automutilation, stéréotypie sévère, anorexie) les animaux sont mis à mort immédiatement. Branchement et câblage des animaux : les animaux sont « branchés » pendant toute la durée de l’expérience, via un câble qui s’insère sans difficulté dans l’implant localisé sur leur tête. Les animaux ne ressentent aucune douleur et le branchement ne nécessite pas de contention, puisque les animaux seront habitués à la manipulation. Le câble est relié à une plaque tournante au sommet de la cage, ce qui permet de suivre les moindres mouvements des animaux et un peu de mou est laissé pour que l’animal ne ressentent pas le poids du fil. Rebond et privation : il a été mesuré que la privation sélective de sommeil paradoxal n’entraînait pas de changement du sommeil lent des animaux. De plus, les dosages de corticostérone ont montré que les animaux n’étaient pas stressés après 48 heures de privation.
Devenir
Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront l’euthanasie pour collecter les cerveaux afin de réaliser des études d’immunohistochimies.
Remplacement
Les alternatives actuelles telles que la modélisation sur culture cellulaire ne sont pas encore suffisamment développées pour permettre une analyse poussée des phases de sommeil et des mécanismes neuronaux. De plus, nous proposons ici d’induire volontairement la dépression chez des souris avant de tenter de réverser le phénotype dépressif via les stimulations lumineuses de neurones transfectés avec des virus. Par conséquent, nous utiliseront ici des souris génétiquement modifiées pour analyser ces processus neurobiologiques complexes
Réduction
La détermination de la taille de l’échantillon nécessaire est absolument cruciale pour assurer la reproductibilité et la véracité des résultats ainsi obtenus. Des données préalablement obtenues dans l’équipe ont été utilisées pour calculer la variabilité interindividuelle des phénotypes dépressifs ainsi obtenus par protocole de stress chronique. Ce qui donne un total de 90 animaux.
Raffinement
Les animaux avant expérimentation sont hébergés dans des conditions optimales, 3 ou 4 par cage pour permettre des interactions sociales normales. Des enrichissements environnementaux systématiques sont mis en place pour améliorer leur bien-être, tel que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des bâtonnets de bois à ronger. Les conditions d’élevages, les soins post-traitements et les différentes étapes de la procédure sont contrôlés pour réduire ou éliminer toute détresse potentielle. De plus, nous avons récemment substitué à l’injection intrapéritonéale classiquement utilisée une ingestion orale volontaire (sans gavage) des molécules d'intérrêt à donner aux souris qui sont dissoutes dans de la gelée aromatisée à la fraise. Une fiche de suivi est également tenue pour chaque animal, depuis la chirurgie implantatoire jusqu’à l’euthanasie. Pour le bien-être de l’animal et pour les besoins d’analyse de l’expérience, le poids et l’état du pelage sont mesurés quotidiennement. Un animal qui dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales est retiré des échantillons expérimentaux et euthanasié sans délai.
Choix des espèces
Notre projet repose sur l’utilisation d’une lignée de souris doublement transgénique. Les modèles murins sont fréquemment utilisés pour modéliser la dépression humaine étant donné la pertinence et similitude des symptômes observés. Le phénotype dépressif ainsi créé chez les animaux sont sensibles aux mêmes antidépresseurs que ceux utilisés chez les patients dépressifs. Cette combinaison de modèle de souris dépressive et transgénique constitue une approche innovante et puissante pour étudier les mécanismes physio-pathologiques complexes sous-jacents de la dépression. Nous utiliserons des animaux âgés de 8-10 semaines, puisqu’il s’agit de l’âge de référence le plus communément utilisé pour le modèle de dépression et le cycle veille-sommeil est mature chez ces jeunes adultes.
Rôle des interneurones dans la consolidation et la formation de mémoire à long terme. 1/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour mesurer ce que les neurones inhibiteurs apportent à l'apprentissage, ce premier volet du projet expose 1 260 souris transgéniques à une chirurgie du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes sont tuées à l'issue, par perfusion intracardiaque, pour prélever le cerveau. Chaque animal reçoit une injection virale sous anesthésie, parfois un implant posé en deux heures trente, puis apprend une tâche qui peut durer huit à douze semaines jusqu'à 90 % de réussite, sous contrôle de l'eau ou de la nourriture. Le porteur prévoit la mise à mort de l'animal si son état ne s'améliore pas au bout de quarante-huit heures ou si l'implant se détache, et retient parmi ses critères de suivi les blessures dues aux bagarres entre congénères.
Objectifs
La plasticité cérébrale est à la base de nos fonctions cognitives les plus élaborées, et de notre capacité à nous adapter aux changements de notre environnement. Un lien fort entre changement de force synaptique et phénomènes d’apprentissage et mémorisation a été proposé au début des années 70. Cependant, peu d’études expérimentales sont venues valider cette hypothèse principalement à cause de limitations méthodologiques. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’électrophysiologie et d’imagerie permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central (SNC), permettant l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses visées. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but premier de mieux comprendre les mécanismes qui soutiennent l’apprentissage, la formation de la mémoire et ainsi la manière dont notre cerveau traite ces tâches cognitives. De par les résultats qui en découleraient, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aiderons donc à mieux comprendre non seulement comment la formation de la mémoire s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liée à une altération d’apprentissage ou de mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est l’étude de la plasticité synaptique, c’est-à-dire comment les neurones encodent l’information d’une mémoire dans le temps. Pendant des dizaines d’années la communauté scientifique s’est principalement intéressée aux neurones excitateurs dans la plasticité synaptique ce qui a permis la mise en évidence de certains mécanismes physiologiques essentiels à la formation de la mémoire et d’un apprentissage. Cependant, de nombreux sous types cellulaires ont été laissés de côté, notamment les neurones inhibiteurs. Ces cellules sont très diversifiées avec des rôles très distincts mais essentiel dans le contrôle du réseau neuronal et la coordination des activités des neurones entre eux. Jusqu’ici, aucune étude à notre connaissance a visé à évaluer la composante des différents groupes de neurones inhibiteurs dans la formation de mémoire et d’apprentissage, malgré leurs rôles essentiels dans le réseau neuronal. Grâce à nos souris transgéniques pour différent sous types de neurones inhibiteurs, nous pourrons évaluer le rôle distinct de chaque groupe pendant un apprentissage et une formation de mémoire. Ceci grâce à une altération spécifique et ciblé de mécanismes physiologiques déjà reconnus pour jouer un rôle majeur sur les neurones excitateurs. Nous apporterons à la communauté scientifique un moyen d’altérer la plasticité synaptique de façon ponctuelle et ciblée non seulement chez les neurones inhibiteurs jusqu’ici impossible. Nos données nous apporterons des connaissances essentielles dans le rôle des différents neurones inhibiteurs dans la formation de mémoire et d’un apprentissage. Ce qui permettra de mieux comprendre dans certaines pathologies, comment remédier à des troubles d’apprentissage et/ou de mémoire en ciblant des mécanismes physiologiques spécifiques au sein de sous types cellulaires précis.
Procédures
L’ensemble des animaux subiront une chirurgie pour infection virale (30min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant et le test comportemental nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour une durée de 4-5 semaines pour la restriction alimentaire et 8 à 12 semaines pour la restriction hydrique suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Dans Les animaux effecturont différentes taches comportementales, le y-maze se réalise que 5 jours sucessifs, ou le radial maze qui se fait sur 10 jours successifs. Après une semaines de récupération, ils effecturont un test de conditionnement à la peur qui dure 5 jours. Pour la procédure d'imagerie calcique , la tache d'apprentissage peut durer jusqu'a 8 à 12 semaines pour que la souris atteingne une performance de 90%.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entrainant des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures. L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations, et lors le contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique lié aux contentions et à la tache comportementale de peur conditionnée.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutanée d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutanée en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d'un second analgésique est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de reflexe est vérifié avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal. Lors des suivis post opératoire, l’apparition de signes de douleur, de plaies, d’infection ou l’observation d’une perte de poids déclenchera la mise en place de mesures adaptées pour améliorer l'état des animaux ; désinfection du site de cicatrisation, mise à disposition de nourriture en poudre, injection d’analgésique. Si aucune amélioration n’est observée au bout de 48H ou dans le cas de la perte de l’implant, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Rôle des interneurones dans la consolidation et la formation de mémoire à long terme. 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Incision du crâne, craniotomie, injection d'un virus dans le cerveau puis pose d'un implant en deux heures trente : 1 260 souris subissent ces chirurgies dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour des analyses d'électrophysiologie ou d'histologie. Après l'opération, elles vivent seules en cage de quatre à cinq semaines sous restriction alimentaire, ou de huit à douze semaines sous restriction hydrique, pour éviter que leurs congénères n'abîment l'implant. Elles enchaînent ensuite le labyrinthe en Y sur cinq jours, le labyrinthe radial sur dix jours et un conditionnement à la peur de cinq jours, l'objectif déclaré étant de mesurer le rôle des neurones inhibiteurs dans la mémorisation. Le porteur affirme qu'il n'y a "aucune alternative à l'utilisation d'animaux" et que déterminer comment les informations sont traitées "exige que l'animal soit intact".
Objectifs
La plasticité cérébrale est à la base de nos fonctions cognitives les plus élaborées, et de notre capacité à nous adapter aux changements de notre environnement. Un lien fort entre changement de force synaptique et phénomènes d’apprentissage et mémorisation a été proposé au début des années 70. Cependant, peu d’études expérimentales sont venues valider cette hypothèse principalement à cause de limitations méthodologiques. L’utilisation de modèles génétiques chez la souris couplée à des méthodes d’électrophysiologie et d’imagerie permet de cibler de plus en plus finement les populations neuronales et les synapses d’intérêts dans le système nerveux central (SNC), permettant l’expression d’outils moléculaires par les cellules et synapses visées. Une grande variété d’action est alors possible afin de bloquer, augmenter ou moduler dynamiquement des processus cellulaires et synaptiques d’intérêts.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but premier de mieux comprendre les mécanismes qui soutiennent l’apprentissage, la formation de la mémoire et ainsi la manière dont notre cerveau traite ces tâches cognitives. De par les résultats qui en découleraient, nous nous attendons à apporter de nouvelles connaissances dans la compréhension de l’organisation du réseau neuronal. Ces connaissances nous aiderons donc à mieux comprendre non seulement comment la formation de la mémoire s’effectue, mais également comment des maladies ou des troubles psychiatriques liée à une altération d’apprentissage ou de mémoire peuvent se mettre en place. L’intérêt scientifique majeur de ce projet est l’étude de la plasticité synaptique, c’est-à-dire comment les neurones encodent l’information d’une mémoire dans le temps. Pendant des dizaines d’années la communauté scientifique s’est principalement intéressée aux neurones excitateurs dans la plasticité synaptique ce qui a permis la mise en évidence de certains mécanismes physiologiques essentiels à la formation de la mémoire et d’un apprentissage. Cependant, de nombreux sous types cellulaires ont été laissés de côté, notamment les neurones inhibiteurs. Ces cellules sont très diversifiées avec des rôles très distincts mais essentiel dans le contrôle du réseau neuronal et la coordination des activités des neurones entre eux. Jusqu’ici, aucune étude à notre connaissance a visé à évaluer la composante des différents groupes de neurones inhibiteurs dans la formation de mémoire et d’apprentissage, malgré leurs rôles essentiels dans le réseau neuronal. Grâce à nos souris transgéniques pour différent sous types de neurones inhibiteurs, nous pourrons évaluer le rôle distinct de chaque groupe pendant un apprentissage et une formation de mémoire. Ceci grâce à une altération spécifique et ciblé de mécanismes physiologiques déjà reconnus pour jouer un rôle majeur sur les neurones excitateurs. Nous apporterons à la communauté scientifique un moyen d’altérer la plasticité synaptique de façon ponctuelle et ciblée non seulement chez les neurones inhibiteurs jusqu’ici impossible. Nos données nous apporterons des connaissances essentielles dans le rôle des différents neurones inhibiteurs dans la formation de mémoire et d’un apprentissage. Ce qui permettra de mieux comprendre dans certaines pathologies, comment remédier à des troubles d’apprentissage et/ou de mémoire en ciblant des mécanismes physiologiques spécifiques au sein de sous types cellulaires précis.
Procédures
L’ensemble des animaux subiront une chirurgie pour infection virale (30min) avec ou sans implantation (2h30). La pose d’implant et le test comportemental nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour une durée de 4-5 semaines pour la restriction alimentaire et 8 à 12 semaines pour la restriction hydrique suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères. Dans Les animaux effecturont différentes taches comportementales, le y-maze se réalise que 5 jours sucessifs, ou le radial maze qui se fait sur 10 jours successifs. Après une semaines de récupération, ils effecturont un test de conditionnement à la peur qui dure 5 jours. Pour la procédure d'imagerie calcique , la tache d'apprentissage peut durer jusqu'a 8 à 12 semaines pour que la souris atteingne une performance de 90%.
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entrainant des effets indésirables sur les animaux : l’incision de la peau, la craniotomie, l’injection stéréotaxique, les différentes implantations et la réalisation des points de sutures. L’animal subit également un stress lié à la diminution de comportements sociaux suite à l'isolement des animaux après implantations, et lors le contrôle hydrique ou alimentaire. Un stress physique lié aux contentions et à la tache comportementale de peur conditionnée.
Devenir
L’ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure pour réaliser des expériences d’electrophysiologie in situ ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux. Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie implantaire est réalisée sous anesthésie gazeuse. Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflexe sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutanée d’un anesthésique local. L’injection d’un morphinique, en sous cutanée en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une injection d'un second analgésique est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture pendant les 12 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de reflexe est vérifié avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal. Lors des suivis post opératoire, l’apparition de signes de douleur, de plaies, d’infection ou l’observation d’une perte de poids déclenchera la mise en place de mesures adaptées pour améliorer l'état des animaux ; désinfection du site de cicatrisation, mise à disposition de nourriture en poudre, injection d’analgésique. Si aucune amélioration n’est observée au bout de 48H ou dans le cas de la perte de l’implant, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Autophagie et stimulation immunitaire précoce : effets neuro-inflammatoires et comportementaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 60 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Dans leurs deux premières semaines de vie, les souriceaux reçoivent des injections intramusculaires de composés pro-inflammatoires sous anesthésie, séparés de leur mère, puis passent des enregistrements de vocalisations ultrasoniques, de l'actimétrie et un test de nidification. À trois mois, chaque animal est isolé pendant trois semaines avant le test d'interaction sociale, pour stimuler ses comportements sociaux. Le porteur présente ces tests comme "non invasifs" tout en décrivant par ailleurs le stress lié à la séparation maternelle, à l'hébergement individuel et aux prélèvements sanguins.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 44 aux Etats-Unis pour l'année 2018 et 1 enfant sur 89 en Europe. Les troubles du spectre autistique se caractérisent notamment par une perturbation du comportement social. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. L’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Par ailleurs, la complexité des troubles neurodéveloppementaux suggère l’implication de combinaison de type « gènes x environnement ». La littérature scientifique indique ainsi qu’une exposition à des composants environnementaux, notamment pro-inflammatoires, à des stades précoces du développement du cerveau, est impliquée dans la survenue de troubles du développement. Parmi les facteurs environnementaux potentiellement à risque, nous étudions différentes particules auxquelles l’organisme est exposé dans les premières semaines de vie. La toxicité de ces composés bio-persistants et fortement pro-inflammatoires a été montrée dans différentes études, notamment en lien avec un effet sur le neurodéveloppement. Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier entre autres par différents tests de comportements, à différents âges, chez un modèle souris pour lequel i) un gène de l’autophagie a été invalidé ; ii) une exposition précoce aux particules est réalisée. Les échantillons prélevés à l’issue des tests nous permettront d’étudier les mécanismes cellulaires et la mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie en combinaison avec une exposition précoce à des composés pro-inflammatoires dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant l’autophagie pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de comportement non invasifs : enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte de séparation maternelle (5 minutes), enregistrement des vocalisations ultrasoniques dans un contexte d’interaction sociale (8 minutes à trois stades : jeune, adolescent, adulte), actimétrie à 2 et 3 mois (2 heures d’enregistrement), test de nidification (suivi sur 24 heures). Les souris sont isolées pendant 3 semaines en amont de la session de test d’interaction sociale à l’âge de 3 mois, afin de stimuler les comportements d’interactions. Les injections intra-musculaires de composés pro-inflammatoires (durée du geste d’environ 10 secondes) sont réalisées sous anesthésie (5 minutes d’anesthésie) et ne sont pas de nature à impacter de manière durable le bien-être des animaux. Ils sont ensuite soumis à une chirurgie sans réveil de quelques minutes réalisée sous anesthésie et analgésie, se finissant par l’euthanasie de l’animal. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile seront réalisés à deux âges différents, le second prélèvement sera suivi d’une euthanasie.
Impact sur les animaux
Des nuisances et effets indésirables de stress sont attendus, en lien notamment avec la séparation mère-petits lors des injections, l’anesthésie gazeuse, les prélèvements sanguins (douleur légère liée à la piqûre de la veine et risque possible d’hémorragie), la mise en place d’une période d'hébergement individuel pour les animaux, les tests de comportement, la réalisation de contention et d’injection de molécules anesthésiques avant la chirurgie sans réveil, l’induction d’un état fébrile passager suite aux injections. Pour l’anesthésie une détresse respiratoire et l’hypothermie des animaux est possible.
Devenir
Le projet décrit est réalisé sur des souris. L’ensemble des 1380 animaux sera euthanasié en fin de projet afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie combiné à une perturbation inflammatoire précoce, sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 1380 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et ou la réalisation de séries de coupes pour les cerveaux prélevés, ce qui nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les échantillons prélevés seront envoyés à différentes équipes dans le cadre de collaborations. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement de manière classique. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et à la suite de tout signal d’alerte une grille de suivi est mise en place. Les paramètres environnementaux comprennent une humidité de 50 pour cent plus ou moins 20 pour cent, une température constante entre 20 et 24 degrés Celsius. L’éclairage est circadien (8h-20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et disposent de matériel de nidification ainsi que d’une maison rouge. Des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de troubles moteur ou comportements aberrants, les animaux feront l’objet d’une surveillance accrue, à l’aide d’une grille de suivi. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), les animaux seront euthanasiés. Les injections intramusculaires sont réalisées sous anesthésie gazeuse. Le stress induit par la séparation est minimisé en réduisant au maximum le temps de séparation. Les travaux antérieurs menés au laboratoire ou par d’autres équipes indiquent que l’injection intramusculaire des molécules pro-inflammatoires d’intérêt n’induit pas de trouble majeur évident chez la souris. Les injections sont susceptibles d’entrainer un état fébrile passager chez l’animal. La manifestation d’une gêne peut se traduire par un animal moins mobile. Les portées seront particulièrement observées après les injections. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique est souvent complexe et long à mettre en œuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle qui nous intéresse existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement. Plusieurs stades de développement seront analysés pour comprendre les conséquences de la mutation impactant potentiellement l’élagage synaptique et la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, seront étudiés : néonatal (test à 9 jours de vie), jeune (test à 20 jours de vie), adolescent (test à 33 jours de vie) et adulte (tests avant 90 jours de vie). Les injections seront réalisées pendant les deux premières semaines de vie de l’animal, de manière à modéliser une situation d’exposition réaliste chez l’enfant pendant sa 1ère année de vie.
Elevage et hébergement de souris immunodéprimées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Dépourvues de système immunitaire par construction génétique, ces souris contractent facilement des infections, ce que le porteur qualifie lui-même de phénotype dommageable. 3 286 d'entre elles vont être élevées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger, la seule opération prévue étant la mise en accouplement des géniteurs. Elles serviront ensuite à recevoir des greffes de tumeurs pulmonaires prélevées sur des patients, l'élevage sur place évitant d'acheter des animaux à des fournisseurs commerciaux. Le porteur écrit que les conditions d'hébergement "justifient, de notre point de vue le classement léger", et affirme ailleurs que ces mêmes conditions justifient "le classement modéré".
Objectifs
Le cancer du poumon est la première cause de décès par cancer dans le monde et la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques est un challenge majeur. A l’heure actuelle, des traitements existent, mais présentent des récidives quasi systématiques à moins de 5 ans. Notre équipe cherche à identifier une nouvelle cible thérapeutique dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC). Nous souhaitons utiliser une lignée murine spécifique, ne présentant pas de système immunitaire et ayant une bonne tolérance aux greffes. Ces animaux seraient utilisés pour nos modèles tumoraux puis traités avec différents inhibiteurs afin de vérifier leur effet thérapeutique. Afin de faciliter la gestion de ces projets, notamment pour les pièces opératoires humaines sans pour autant stocker de façon inutile des animaux provenant de sociétés commerciales, nous souhaitons mettre en place un élevage de ces souris afin de générer les animaux nécessaires à nos expérimentations.
Bénéfices attendus
Cet élevage nous permettra de disposer des animaux sur notre site de recherche afin de pouvoir implanter rapidement les tumeurs de patients obtenues après lobectomie. Ces animaux permettrons de répondre aux questions soulevées dans des autorisations précédement demandées et accordées; à savoir l'étude et le développement de thérapies dans le cancer bronchique.
Procédures
Dans cette DAP, seule la mise en accouplement des animaux géniteurs sera pratiquée. Aucune autre intervention n'aura lieu. Les animaux seront hébergés dans une zone exempt de pathogènes et opportunistes spécifiques. Les cages seront positionnées sur un portoir ventilé. En utilisant ce type de portoir, chaque cage peut être considérée comme une unité microbiologique. Des contrôles sanitaires seront réalisés trimestriellement, en alternant l'analyse des filtres d'unité de ventilation et celle des souris sentinelles. De telles conditions d'hébergement permettent d'empêcher le développement d'un phénotype dommageable chez les souris immunodéficientes et justifient, de notre point de vue le classement léger.
Impact sur les animaux
Les animaux immunodéprimés portent des mutations génétiques causant une perte partielle ou totale de leur système immunitaire entraînant un risque accru de contracter des infections ce qui constitue un phénotype dommageable. Une attention particulière sera portée à cela. Ainsi, ces animaux seront systématiquement manipulés sous atmosphère contrôlée et/ou dans des zones portant un statut sanitaire strict afin de ne pas les exposer à des pathogènes pouvant leur causer des infections.
Devenir
Ces animaux seront sujet à une utilisation continue. En effet, à l'issue de cette procédure, les animaux ainsi générés seront utilisés à des fins scientifiques afin de satisfaire les besoins expérimentaux liés aux projets disposant déjà d'une autorisation.
Remplacement
« Remplacer ». Nous avons remplacé dès que possible le modèle vivo par des modèles de cultures cellulaires. En effet, nous disposons au laboratoire de différentes lignées cellulaires provenant d’adénocarcinome humain sur lesquelles nous avons testé nos molécules d'intérêt. Nos résultats se sont montrés concluants et nous ont permis de déterminer les conditions adéquates d’administration (concentration, durée de traitement). Il nous reste à prouver leur efficacité sur tumeur en son site anatomique. Cette procédure expérimentale ne peut être remplacée par une autre stratégie ou procédure expérimentale n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et capable d’amener le même niveau d’information.
Réduction
« Réduire ». L’hétérogénéité apportée par le vivant, dues aux différences physiologiques propres à chacun, nécessite un nombre d’individus suffisamment grand afin d’apporter une puissance statistique forte. Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux tout en gardant en tête les objectifs scientifiques, nous nous rapprocherons d’un statisticien pour chaque projet afin d’évaluer le nombre d’animaux nécessaire. Nous exploiterons au maximum le potentiel de ces animaux (analyse et prélèvement multiples pour analyse moléculaire ex vivo). Les accouplements seront adaptés en fonction des besoins expérimentaux. Ils devront être mis en pause si les projets ne nécessitent pas d'animaux sur les temps à venir. Cela évitera la naissance d'animaux surnuméraires.
Raffinement
« Raffiner ». Les souris seront hébergées dans des cages d’une superficie supérieure à 500cm2. La litière est faite à base de copeaux de peuplier et le milieu est enrichi avec des bûchettes de bois et des frisottis. Nous porterons une attention particulière au bien-être des animaux et nous prendrons en charge la contrainte que les animaux subissent au cours des procédures expérimentales par l'administration d'analgésique lorsque cela se montrera nécessaire. Les animaux seront hébergés dans une zone exempt de pathogènes et orpotunistes spécifiques. Des contrôles sanitaires sont réalisés régulièrement en alternant l’analyse des filtres d’unité de ventilation et celle des souris sentinelles. De telles conditions d’hébergement permettent d’empêcher le développement d’un phénotype dommageable chez les souris immunodéficientes et justifient de notre point de vue le classement modéré. Les animaux seront observés quotidiennement (y compris week-end et jours fériés)aussi fréquemment qu’il le faut. Si un signe clinique est observé, il fera l’objet de l’ouverture d’une fiche de suivi scorée. Si rien ne peut rapidement être fait pour soulager la souffrance de l’animal ou si l’un des signes cliniques est trop important, alors ils sera euthanasié.
Choix des espèces
Des modèles de souris développant des cancers bronchiques ont déjà été utilisés dans des études précliniques et se sont montrés être un bon modèle de la pathologie humaine tant sur le plan anatomopathologique que biomoléculaire. La greffe de cellules humaines entraine la nécessité de travailler sur un organisme immunodéficient afin d'exclure tout risque de rejet. D’un point de vue expérimental, nous attendrons que les souris aient au moins 6 semaines pour les utiliser. Ainsi, il s’agira d’animaux déjà adultes mais suffisamment jeunes pour que le processus de vieillissement n’impacte pas les courbes de survie. Nous utiliserons seulement des animaux de moins de 6 mois (jeunes) afin qu’ils récupèrent plus facilement après la chirurgie.
Etude de l’efficacité anticancéreuse de la synergie entre un traitement aux ultrasons et un traitement de référence en immunothérapie, dans un modèle murin de cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées pour prélever leur tumeur, 78 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses au flanc gauche fait pousser une tumeur pancréatique, suivie de trois séances d'ultrasons sous anesthésie et de trois injections intrapéritonéales d'immunothérapie, à raison d'une par semaine. Le porteur prévoit des mesures de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine pendant trois mois au plus, et signale que des métastases pulmonaires provoqueraient un affaiblissement et des difficultés respiratoires. Il justifie le choix de la souris en écrivant qu'elle est la plus petite espèce dont les tumeurs deviennent assez grosses pour être traitées par ultrasons.
Objectifs
Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie cavitation + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible.
Procédures
- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 3 injections intrapéritonéales à raison d’une par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 3 injections sous cutanée d’antidouleur (30 secondes) à raison d’une par semaine– Autant de pesées que nécessaires seront réalisées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de trois par semaines aussi longtemps que nécessaire (3 mois maximum si traitement efficace).
Impact sur les animaux
Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Si le modèle métastase, il entraînera une perte de poids et un affaiblissement chez les souris avec notamment difficultés respiratoires (si métastases aux poumons). Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine. Les ultrasons peuvent induire des pétéchies (présence de petites taches rouges sur la peau) dues à la cavitation, résorbées entre 2 traitements. Le traitement par immunothérapie n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris.
Devenir
Tous les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs.
Remplacement
Plusieurs informations ont été données via des études sur des sphéroïdes : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons, ce qui a permis de designer cette étude sur animal et de l’affiner. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.
Réduction
Dans cette étude 78 animaux seront utilisés. L’utilisation de l’outil de calcul d’effectif de l’EDA (Experimental Design Assistant, NC3R) nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaire afin de conclure quant à l’efficacité de notre traitement. De plus, nous collecterons un nombre maximal de données par animal afin de répondre aux différentes questions de notre étude en utilisant le nombre d’animaux minimal mais suffisant.
Raffinement
Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles douleurs les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute ulcération, irritation ou nécrose des tumeurs, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera une crème localement sur 7 jours. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de score et via la palpation on administrera un antidouleur sur 48h. Si la douleur est toujours présente alors on mettra à mort les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux seront mis à mort. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements.
Choix des espèces
La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. Dans notre étude, elle est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent. La souris est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature.
Analyse de l’interaction des Yersinia pathogènes avec leur hôte souris de laboratoire.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Les points limites fixés pour ces infections "surviennent souvent trop tard", et aucun marqueur ne permet de prédire si une souris infectée mourra ou survivra. 12 670 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la peste ou par des Yersinia intestinales, par voie sous-cutanée, intradermique, orale, par ingestion de pain contaminé ou par instillation nasale, puis passent jusqu'à dix séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur écrit que l'infection sera fatale au groupe témoin comme à la moitié des cas testés, et conclut que le modèle animal reste "irremplaçable" pour évaluer la virulence de façon réaliste.
Objectifs
Alors que la peste, causée par la bactérie Yersinia pestis, est une des maladies infectieuses les plus sévères pour l’homme, d’autres Yersinia pathogènes causent seulement une infection intestinale (entéropathogènes : Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica). L’origine de cette différence de virulence n’est pas encore complètement élucidée. Afin de pouvoir lutter le plus efficacement contre ces infections, il est capital de mieux comprendre pourquoi et comment ces bactéries inhibent les processus de contrôle de l’une ou l’autre espèce au sein du genre Yersinia et induisent des dommages systémiques et ou locaux. Il est aussi nécessaire de comprendre l’évolution des espèces au sein des Yersinia ainsi que des lignées au sein des espèces. La virulence est multifactorielle chez les Yersinia. Certains facteurs de virulence ont déjà été identifiés, mais beaucoup restent encore mal connus, voire inconnus. L'objectif principal de ce projet est d'utiliser différentes approches in vitro et in vivo pour identifier ces facteurs, étudier leur mode d'action et mieux comprendre la réponse de l’hôte lors de l’infection. L’étude de l’infection permettra également d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’infection à visée diagnostique. Pour cela, des souches mutantes de bactéries générées au laboratoire seront étudiées in vivo. Nous analyserons les effets que ces bactéries exercent chez des rongeurs modèles, les souris de laboratoire, et identifierons et caractériserons les processus précoces (efficaces ou non), mis en place par l'hôte lors de l'infection. Le projet a donc pour objectifs : - Identifier les facteurs de la bactérie impliqués dans les processus pathologiques dans le cas d'une infection causée par une des espèces pathogènes de Yersinia. - Analyser les interactions entre bactéries invasives et souris de laboratoire. - Caractériser les processus et les routes de progression des bactéries post inoculation /délivrance. - Caractériser les lésions tissulaires et cellulaires induites par l’une ou l’autre espèce et de comparer ces lésions en fonction du niveau de leur pathogénicité. - Mettre en évidence les mécanismes de la réponse immunitaire de l'hôte induits ou inhibés. - Identifier les cellules de l’hôte expérimental avec lesquelles l’une ou l’autre espèce bactérienne interagit à différentes périodes post inoculation / délivrance et dans différents tissus. - Identifier des biomarqueurs précoces d’infection à visée diagnostic.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude nous aideront à acquérir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques induits par les espèces invasives au sein du genre Yersinia chez leur hôte, ainsi que de l’évolution entre les différentes espèces et au sein des lignées d’une même espèce. En effet ils devraient permettre de mieux comprendre pourquoi et comment l’hôte peut (ou non) contrôler l’infection, notamment en inhibant les processus de virulence des Yersinia, ainsi que d’identifier de nouveaux biomarqueurs d’infection. A terme, les résultats obtenus permettront de lutter le plus efficacement contre la peste et les autres Yersinioses.
Procédures
Gestes techniques communs à toutes les procédures: Infection par voie sc : une injection unique, durant 1 minute, sans anesthésie Infection par voie id : une injection unique, durant 4 minutes ; sous anesthésie gazeuse Infection par voie orale : une inoculation unique, durant 1 minute, sans anesthésie Infection par ingestion de pain : une fois, durant environ 10 minutes (selon leur appétit), sans anesthésie Infection par instillation intranasale : une séance d’instillation unique, durant 5 minutes ; avec anesthésie par injection intrapéritonéale Geste technique spécifique à la procédure n°3 : Prélèvements de sang dans la semaine de l’infection : prélèvement unique, durant 3 minutes, sans anesthésie. Geste technique spécifique à la procédure n°4 : Imagerie in vivo de Yersinia bioluminescentes : anesthésie gazeuse quotidienne (sauf peste : injection sc), un maximum de 10 fois. Imagerie in vivo de Yersinia fluorescentes : anesthésie gazeuse, unique, sans réveil.
Impact sur les animaux
Toutes nos expériences incluent des infections de souris par des bactéries. Les nuisances sont donc presque toujours les mêmes, dans l’ordre chronologique : - Infection / inoculation de bactéries : pour toutes les voies d’infection l’animal recevra une injection unique, que ce soit pour de l’anesthésique (intranasale, intradermique) ou directement de la préparation infectieuse (voies sous cutanée ou intraveineuse). L’infection par la méthode de nourissage au pain infecté ou par canulage intragastrique (infection orale) ne nécessite pas d’injection ni d’anesthésie. - - L’infection bactérienne sera fatale pour le groupe témoin recevant la souche sauvage virulente, et aussi quand les mutations testées ne modifient pas la virulence (nous espérons au maximum 50% des cas). Les procédures sont donc classées « sévères ». Les signes cliniques sont ceux des infections bactériennes : fièvre, poil hérissé, prostration, perte de poids. Des points limites sont définis et seront appliqués. Toutefois, ces point limites surviennent souvent trop tard. De notre expérience, même si certains animaux présentent des signes cliniques, il n'est pas rare qu’ils se rétablissent. Nous avons déjà recherché des marqueurs pronostics de l’infection dans les souris infectées par les Yersinia pathogènes, comme la bactériémie, l’hyperthermie, la perte de poids… sans succès (trop de variations inter-individuelles). Nous ne sommes donc actuellement pas en mesure de prédire la mort ou survie d’un animal infecté par l’observation de tels marqueurs. - Prélèvements : en procédure 3 un prélèvement sanguin unique est effectué avant infection (voir procédures).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet les animaux ayant été infectés développent une immunité anti-bactérienne qui interviendra dans le déroulement d’une autre infection et en altèrera les résultats de manière incontrôlée. Les animaux ne peuvent donc être pas être réutilisés.
Remplacement
Une mise au point in vitro ou ex vivo sera réalisée pour les techniques avancées de criblage. Les résultats de criblage dans des conditions ex vivo (sangs de donneurs, cellules, organes sur puce) permettront également d’identifier des facteurs importants pour l’infection. Une étude approfondie de la littérature sera réalisée afin d’identifier les facteurs déjà décrits, les expériences déjà réalisées ainsi que les résultats négatifs ne montrant pas d’effet lors de la mutation d’un facteur particulier. Les données à grande échelle produites par d’autres laboratoire et rassemblées sur des bases de données spécialisées tels que Yersiniomics seront utilisés afin d’évaluer la pertinence des facteurs choisies. Des tests préliminaires in vitro permettront de réduire le nombre de mutants étudiés in vivo : par exemple ceux qui seraient sévèrement affectés dans leur croissance seraient exclus de ce projet. Aussi, l’absence accidentelle de facteurs de virulence (plasmides, éléments chromosomiques mobiles…) peut être évaluée en amont du présent projet et permettra d’écarter les mutants peu intéressants de l’étude. La possibilité de séquencer les génomes des bactéries à moindre coût est un pas important dans ce sens. Toutefois, les infections bactériennes induisent des processus pathologiques complexes impliquant de multiples organes et le système immunitaire dans son ensemble (organes divers, relations entre organes, circulation sanguine et lymphatique, multiples populations cellulaires et mécanismes effecteurs), ce qui fait que le modèle animal est irremplaçable pour une évaluation réaliste de la virulence.
Réduction
Des expériences pilotes seront réalisées sur un petit nombre d’animaux afin d’évaluer la robustesse des techniques utilisées et des résultats obtenues. Les effets confondants tels que les effets cage, date ou expérimentateur seront pris en compte pour les études avancées et sensibles à l’échelle du génome. Les procédures seront optimisées en étudiant simultanément le plus grand nombre possible de paramètres sur chaque animal, et en regroupant les expérimentations de façon à limiter les groupes d'animaux témoins nécessaires. Les groupes (sauvage vs mutant) seront comparés par des tests statistiques adaptés. Un test sera utilisé pour comparer la survie des groupes (sauvage vs mutant) exposés à la peste. Des modèles linéaires à effets mixtes pourront être utilisés afin de prendre en compte d'éventuels effets techniques liés à la cage et aux répétitions. Le détail des statistiques est décrit dans les procédures. Le nombre d’animaux indiqué a été obtenu par un calcul de puissance statistique en collaboration avec un biostatisticien, et est basée sur le nombre minimum d'animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement robustes et reproductibles.
Raffinement
Durant les infections, un suivi quotidien des animaux sera opéré tout au long de l’expérience pour détecter tout changement physique ou comportemental qui précèdent généralement les signes cliniques, tels que : poil ébouriffé, yeux sales, comportement prostré. Les animaux présentant un état pathologique (score de 2 sur la “grille évaluation douleur stress inconfort utilisée) ou stress ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial) seront mis à mort. Dès l’apparition des signes cliniques des actions seront mises en place pour limiter la souffrance et la déshydratation : mise à disposition de gel hydrique, réhydratation sous-cutanée. Si des animaux atteignent les points limites définis, ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats, souris, gerbilles etc.) sont des hôtes idéaux pour l'étude de la peste puisqu'ils y sont très sensibles, et sont les principales cibles et réservoirs de la peste dans la nature. La peste se développe chez la souris sous les formes bubonique et pulmonaire avec des cinétiques, signes cliniques et léthalités comparables à celles de la peste humaine. La souris est le modèle le plus utilisé par les laboratoires étudiant la pathogénèse des Yersinia. De même, les souris sont sensibles aux infections par les Yersinia entériques (Y. pseudotuberculosis et Y. enterocolitica) et sont des modèles usuels de ces infections. La disponibilité d'un grand panel de souris génétiquement modifiées (principalement des fonds génétiques classiques : BALB/c et C57BL/6) permet de tester un certain nombre de voies ou de mécanismes potentiellement impliqués soit dans la résistance de l'hôte à l'infection, soit au contraire servant de cible au pathogène pour induire des lésions et inhiber les défenses immunitaires de l'hôte. Le système immunitaire murin étant extrêmement proche de celui des humains, il permet des analyses immunologiques et cliniques adéquates. Les souris auront au moins 7 - 14 semaines (âge adulte) afin d’être représentatifs de l’espèce à l’âge adulte, et par souci d’utiliser des animaux comparables tout au long du projet. À l’âge adulte leur système immunitaire est complètement fonctionnel. Cela assure l’homogénéité des sujets, nécessaire à la reproductibilité intra- et inter-expérimentale des résultats. Les infections par Yersinia pathogènes ne sont pas sensibles à l’âge. Ces indications d'âge sont ± 1 semaine selon les disponibilités du fournisseur.
Prélèvement de sang pour la caractérisation d’animaux congéniques CD45.1 et CD45.1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immobilisées vigiles, la tête bloquée, piquées perpendiculairement à la veine mandibulaire pour deux ou trois gouttes de sang, 750 souris subissent une procédure d'un niveau de souffrance léger. Le prélèvement dure de cinq à vingt secondes et sert à vérifier des marqueurs de surface sur les cellules sanguines, pour trier des souris destinées à des greffes de moelle osseuse. Le porteur indique qu'environ 187 individus, ceux dont le génotype ne présente pas d'intérêt, seront mis à mort. Les 563 autres restent en vie, 60 pour maintenir la lignée et 503 pour alimenter des expérimentations ultérieures.
Objectifs
Production d’animaux congéniques utilisés dans des expériences de greffes de moelle osseuse pour l’étude de l’hématopoïèse normale et cancéreuse. La caractérisation génétique de ces animaux congéniques est réalisée par l’analyse de marqueurs spécifiques à la surface des cellules sanguines.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des souris permet d’optimiser la gestion de l’élevage et de produire les animaux nécessaires pour les projets scientifiques pour l'étude de l'hématopoïèse normale et leucémique. La compréhension de ces mécanismes permet de développer des traitements thérapeutiques pour les leucémies humaines.
Procédures
Un seul prélèvement sanguin sera effectué à la veine mandibulaire comme suit. 750 souris vigiles sont immobilisées par une contention de base en s’assurant que la tête est bien immobilisée. Puis la veine mandibulaire est piquée perpendiculairement avec une aiguille. 2-3 gouttes de sang sont prélevées directement dans un tube de prélèvement. Le prélèvement dure entre 5 et 20 secondes. Puis une légère pression pour arrêter le saignement est effectuée avec un papier absorbant.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement sanguin unique qui génère un stress et une douleur légère.
Devenir
Parmi les animaux de génotypes utiles soit 75% des souris correspondant à environ 563 animaux, 60 souris utiles seront replacées pour le maintien de la lignée et 503 souris seront utilisées pour les expérimentations en utilisation continue. Les animaux de génotype inutile seront mis à mort soit environ 25% des souris correspondant à environ 187 animaux.
Remplacement
Le prélèvement sanguin pour génotypage ne peut-être remplacer par un autre prélèvement car seules les cellules sanguines expriment le marqueur permettant de génotypage ces souris. Les souris de cet élevage sont générées et utilisées pour réaliser des expériences de greffes de cellules souches afin de tester leurs fonctions dans un individu à long terme (au moins 6 mois). A ma connaissance aucun système de culture in vitro, in silico ou ex-vivo ne permet de tester la fonction à long terme des cellules souches hématopoïétiques dans des conditions physiologiques identiques à celles d’un individu vivant (sans biais, ni stresse cellulaire pouvant altérer la fonction de dormance de ces cellules).
Réduction
Nous allons produire un nombre d’animaux en lien avec nos besoins (environ 150 animaux par an). Le nombre de cages de croissements pour générer les souris nécessaires à nos projets scientifiques est réduit au minimum requis.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances liées aux prélèvements sanguins ceux-ci seront réalisés par un technicien animalier employant une méthodologie éprouvée, rapide, précise et standardisée. Pour rétablir la volémie des animaux vigils prélevés en sang, le même volume d'une solution saline physiologique (NaCl 0,9%) sera injectée à ces animaux en sous-cutané.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires (ex : Anticorps, cytokines…) et permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Les animaux seront caractérisés le plus tôt possible vers l'âge de 4-5 semaines.
Mécanismes neuronaux de la mémoire olfactive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à deux chirurgies crâniennes de une à cinq heures par animal, cinq semaines de restriction hydrique et trois mois de restriction alimentaire, pour 800 souris utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des électrodes implantées dans le cerveau enregistrent l'activité neuronale pendant que les souris cherchent une récompense en eau ou en nourriture, la tête parfois maintenue fixe près d'une source d'odeur. Le porteur signale que les souris modèles de la maladie d'Alzheimer utilisées ici présentent parfois des crises d'épilepsie. L'arrêt des séances est fixé par la dégradation des signaux enregistrés, en général au bout de trois mois, le porteur expliquant vouloir maximiser les données obtenues par animal.
Objectifs
La capacité de former des associations entre des stimuli sensoriels spécifiques et des informations vitales constitue une fonction centrale de la mémoire : elle permet à l’organisme d’adapter ses comportements en fonction de son vécu. L’odorat est une modalité sensorielle majeure chez les rongeurs, nécessaire à l’établissement de comportements cruciaux pour la survie de l’individu (alimentation, reproduction, interactions sociales…). La signification associée aux odeurs rencontrées, qui permet la production de comportements adaptés, est très souvent apprise par expérience. Notre projet a pour but d’identifier les substrats neurophysiologiques qui permettent la formation de traces mnésiques olfactives en conditions physiologiques et pathologiques. Il vise notamment à comprendre le rôle des odeurs dans la mémoire spatiale et la mémoire sociale. Ces deux types de mémoire étant fortement impactés chez les patients touchés par la maladie d’Alzheimer (chez qui des défauts d’olfaction précèdent souvent l’arrivée des symptômes cognitifs) notre étude présente un intérêt pour la santé humaine.
Bénéfices attendus
Notre projet qui vise à comprendre le rôle des odeurs dans la mémoire spatiale et la mémoire sociale ainsi que les mécanismes neuronaux impliqués. Ces deux types de mémoire sont fortement impactés chez les patients touchés par la maladie d’Alzheimer et il a été montré que des défauts d’olfaction précèdent souvent l’arrivée des symptômes cognitifs associés à cette maladie. Ce projet apportera donc des éléments essentiels pour la compréhension du fonctionnement du cerveau en conditions normales mais aussi pathologiques. Une telle compréhension contribuera ainsi, sur le long terme, à améliorer la santé humaine dans nos sociétés vieillissantes.
Procédures
Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence d’odeurs. Elles seront notamment entraînées à associer une odeur et une récompense ou bien une odeur et une trajectoire dans une arène. L’apport en eau ou en nourriture des souris entraînées sera contrôlé pour garantir leur motivation à réaliser les tâches. Cependant, les souris seront pesées quotidiennement (
Impact sur les animaux
Dans cette étude, certaines souris seront soumises à des tests comportementaux de mémoire dans lesquels elles devront trouver une récompense hydrique. Dans ce cas, pour les motiver à effectuer ces tâches, la totalité de l'apport hydrique quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux. Dans un autre type de tâches, un apport de nourriture contrôlé permettra également d’augmenter la motivation des souris qui devront alors trouver des sources de nourriture appétitives dans l’arène de comportement. Le fait de ne pas avoir un accès libre à la nourriture ou à la boisson pendant une partie de la journée peut légèrement incommoder les souris. Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. L’identification et l’étude du rôle de certains sous-types de neurones nécessitera de faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés aussi au préalable. Le placement des implants et les injections cérébrales seront réalisés lors de chirurgies qui pourraient entraîner des douleurs légères sans anesthésie, analgésie et soins post-opératoires adaptés. Les souris pourront ensuite être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La contention qui en résulte peut stresser légèrement les animaux mais n’induit pas de douleur. Enfin, les souris modèles de la maladie d’Alzheimer, nécessaires à l’étude de la pathologie humaine, présentent parfois des crises d’épilepsie qui seront surveillées attentivement.
Devenir
L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette procédure sera réalisée par des expérimentateurs compétents et soucieux du bien-être animal, sous anesthésie profonde avec le degré d’analgésie recommandé par les services vétérinaires. La mise à mort sera ainsi indolore pour les animaux, avec une perte de conscience rapide. Ceci concerne les souris adultes dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : la formation des traces mnésiques olfactives à l’échelle du cerveau entier. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est en train d’apprendre : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. Pour ces raisons, il nous est impossible de conduire cette étude in vitro sur des cultures de neurones dissociés. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent pas être réalisées in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux requis (800 sur 5 ans) sera restreint grâce aux méthodes d’enregistrement utilisées qui permettent de collecter des données extrêmement riches en information (> 100 neurones enregistrés simultanément par session), plusieurs jours durant. Nous utiliserons cependant des études pilotes pour raffiner nos protocoles et ainsi éviter de collecter des données inexploitables (mauvaises coordonnées stéréotaxiques, variabilité comportementale…) tout en limitant leur variance. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires ne peut se baser sur une étude de puissance statistique car notre étude ne vise pas à comparer des groupes d’animaux, mais des neurones individuels via de nombreux tests indépendants. Le nombre d’animaux dépendra du nombre de neurones que nous réussirons à enregistrer à chaque expérience. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique.
Raffinement
Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux expériences qu’ils vont rencontrer (notamment la contention et l’interaction avec l’expérimentateur pour éviter le stress). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères et des points limites définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent.
Choix des espèces
Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. Ce modèle est d’autant plus pertinent que l’olfaction est une modalité sensorielle essentielle chez les rongeurs qui joue un rôle fondamental pour leur survie. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.
Régénération de cellules productrices d’insuline chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris dont la glycémie dépasse 500 mg/dl ou tombe sous 65 mg/dl sont mises à mort, comme celles qui cumulent plus de trois signes sur la grille de douleur du laboratoire. 2 928 souris vont être utilisées, toutes tuées pour examen du pancréas, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées et un régime riche en graisse destiné à provoquer un diabète, puis subissent un jeûne de cinq heures suivi de six ponctions sanguines à la queue étalées sur deux heures. Le porteur qualifie ce diabète de "très modéré" et attribue la nuisance principale aux piqûres, sans détailler le calcul qui aboutit à près de trois mille animaux.
Objectifs
Le diabète résulte de la destruction des cellules fabricant l'insuline dont le rôle est de diminuer le taux de sucre sanguin. Cela conduit une augmentation du taux de sucre sanguin qui peut avoir de graves conséquences. Les traitement actuels consistent en l'injection d'insuline mais le maintien du taux de sucre sanguin n'est pas optimal. Il faut donc développer de meilleurs thérapies. Dans ce but, nous avons identifié des gènes qui induisent la régénération des cellules productrices d'insuline, ce qui est d'intérêt pour les patients diabétiques. Cependant, ces résultats obtenus sur cellules doivent être validés sur l'animal en condition normale mais aussi en condition de diabète (induit par un régime riche en graisse).
Bénéfices attendus
Ce projet se propose de déterminer si nos gènes pourraient induire une augmentation du nombre de cellules beta pancréatiques chez l'animal. Il est clair qu'un tel résultat représenterait un bénéfice d'importance pour les personnes atteintes de diabète chez qui ces cellules sont manquantes (ce qui conduit au diabète).
Procédures
Les animaux recevront des injections (chaque injection durant une dizaine de secondes). Des prélèvements sont prévus pour suivre le taux de sucre sanguin des animaux (1 goutte de sang). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures du taux de sucre sanguin) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 minutes).
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer un diabète très modéré (légère hyperglycémie). La source principale de nuisance est reliée aux piqures des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour examen des organes et du pancréas en particulier.
Remplacement
Le diabète est une maladie ayand plusieurs orgines (génétiques mais aussi environementales). Son apparition et sa gravité résultent donc de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible (calculé grâce à des tests statistiques) mais permettant l’obtention de résultats exploitables sans besoin de répétition des expériences.
Raffinement
Durant toute la procédure, les animaux seront suivis afin d’évaluer d’éventuelles souffrances. L'expérience serait immédiatement arrétée en cas de souffrance mesurée comme suit: -Déplacement difficile -Diminution du comportement exploratoire Posture inhabituelle (dos vouté, prostration) -Agressivité -Amaigrissement > 10% du poids initial -Aspect du poil (piqué, hérissé, mal entretenu) -Déshydratation -Agressivité à la manipulation - Glycémie: >500 ou
Choix des espèces
Ce projet a pour but de déterminer les effets de plusieurs gènes dans le pancréas. Il est donc essentiel d'utiliser la souris comme modèle intégré. 3 ages seront évalués : 1, 3, 6 mois après la naissance. Ces âges furent sélectionnés afin de représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes, matures, âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter nos observations dans ces animaux.