Souris
Prélèvements de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés avec ou sans phénotype dommageable à visée de recherche dans diverses thématiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 3000
Un millimètre de queue coupé, une fois par animal, c'est la procédure appliquée à 84 330 souris et 3 000 rats, dans des actes déclarés d'un niveau de souffrance léger. Ce prélèvement sert au génotypage d'animaux génétiquement altérés produits pour la cancérologie, la cardiologie, la neurologie ou les maladies métaboliques, et l'établissement héberge aussi des lignées immunodéprimées. Le porteur écrit que les individus dont le génotype ne présente pas d'intérêt seront mis à mort et que les autres partiront vers d'autres projets, sans jamais indiquer quelle proportion est concernée. Il évoque des méthodes moins invasives, génotypage par la salive ou prélèvement par buvard sur les aérations, en les décrivant comme des pistes encore à l'étude.
Objectifs
Notre établissement utilisateur produit des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, cardiologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées pour certains projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou pour le maintien d’un statut sanitaire SPF avec les sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec (animaux immunodéprimés) ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travailant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).
Procédures
Prélèvement de queue (1mm), une seule fois.
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vu immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue permet le gnéotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études. Ceux dont le génotype ne serait pas d'intérêt seront mis à mort en sachant que les croisements sont réalisés de manière à optimiser au maximum la génération d'animaux à génotypes intéressants.
Remplacement
Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de la salive. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle doit être applicable à tous et implique d'avoir une méthode génotypage standard avec des kits commerciaux, ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Nécessité d’utilisation des animaux pour l’objectif de projets en immuno-oncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Néanmoins nous avons pu observer une baisse de production des animaux d’élevage depuis 2020. Nous réfléchissons à développer des méthodes de génotypage moins invasives tel que le prélèvement par la salive. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à long terme, nous optons de plus en plus pour un arrêt de cette dernière et d’envisager une méthode de conservation autre tel que la cryoconservation.
Raffinement
La biopsie de queue est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vu immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée. Dans toutes les préocédures des points limites précoces sont mis en place afin de minimiser au maximum la douleur des animaux.
Choix des espèces
Nous avons majoritairement des élevages de souris et un petit élevage de rats. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les animaux restent à minima le temps du sevrage de ces deniers, soit 3 semaines (21jours), ils sortent ensuite en fonction des âges utilisés dans les projets pour lesquels ils sont produits. La biopsie de queue quand elle est nécessaire est réalisée entre 1 semaine et 3 semaines d'âge en fonction de l'âge auxquels les animaux seront utilisés dans les études ultérieures.
Rôle de deux gènes dans les tumeurs de lymphome B
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 050 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Poinçonnées à l'oreille pour génotypage, elles sont ensuite palpées chaque jour à partir de trois mois pour détecter les tumeurs, pesées et sondées par voie rectale jusqu'à trois fois par semaine, certaines recevant une injection destinée à déclencher une réaction immunitaire. Le suivi court jusqu'à 24 mois, les souris étant tuées dès 20 % de perte de poids ou une température corporelle sous 34 °C, seuils censés éviter les douleurs sévères liées au développement du lymphome. Le porteur conclut qu'"aucune alternative au modèle animal n'est disponible" pour tester l'effet de deux mutations sur un cancer du sang en présence d'un système immunitaire complet.
Objectifs
Ce projet de recherche a pour but de mieux comprendre le rôle de deux gènes dans le développement du lymphome. Ce sont des cancers du sang qui se forment à partir des globules blancs qui sont les cellules productrices d’anticorps pour défendre les organismes lors des infections. Certains sous-types agressifs de lymphome, malgré des progrès thérapeutiques récents, restent mortels pour 40% des patients qui ont des altérations génétiques pour ces 2 gènes spécifiques. Le projet se développe en deux objectifs principaux : 1/ D'abord, développer une nouvelle lignée transgénique de souris avec des altérations sur les deux gènes puis 2/comprendre comment les altérations de ces deux gènes sont liées et participent à la formation du cancer en analysant le temps de mise en place des tumeurs et le comportement des globules blancs dans les potentielles tumeurs qui se développeront chez les animaux générés
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l'impact de l'altération génétique de ces deux gènes que l'on retrouve chez des patients atteints de lymphome de mauvais pronostic, et d'identifier des mécanismes susceptibles de faire l'objet de développements thérapeutiques pour améliorer la survie et le bien-être des patients atteints par cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: - Prélèvement d’un bout d’oreille pour analyse génétique (fréquence: une seule fois, durée: 5 secondes) - Manipulation et palpation des souris pour surveiller leur état général (surveillance quotidienne à partir de 3 mois, durée : 1minute). - Pesée des animaux (durée : 30sec, fréquence : bimensuel jusqu’à 15 mois, hebdomaire entre 15 et 18 mois et 2fois/sem après 18 mois) - Prise de température (durée : 10sec, fréquence : bimensuel jusqu’à 15 mois, hebdomaire entre 15 et 18 mois et 2fois/sem après 18 mois) - Injection ventrale d'une substance générant une réponse immunitaire chez la souris (durée: 20 secondes, fréquence : une seule fois).
Impact sur les animaux
Pour les souris reproductrices et leurs petits, nous attendons une douleur légère et de courte durée lors des prélèvement de peau de l'oreille par poinçonnage des nouveaux animaux pour déterminer leur profil génétique. Pour les souris qui seront étudiés pour le développement du cancer, un stress et un inconfort léger est attendu liée à la manipulation pour observer l’état de l’animal. La pesée engendrera également un stress léger puisque nécessitant de déplacer l’animal. Quant à la prise de température, elle se fera grâce à une sonde rectale engendrant un incofort et un stress léger chez l’animal. De plus, nous attendons des douleurs légères causées par la palpation des tumeurs à surveiller. Nous attendons aussi des douleurs modérées liées au développement tumoral et au vieillissement des animaux. Les points limites mis en place permettront d’éviter des douleurs sévères causées par le développement des lymphomes. Enfin, une douleur légère et de courte durée est attendu pour les souris qui recevront une injection ventrale d’une substance capable de générer une réaction immunitaire. Par la suite, pour ces souris recevant cette injection une douleur et un stress modéré sont attendus en raison de la réaction immunitaire déclenchée par l'antigène.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. En effet, l'information scientifique sera obtenue à la fin de chaque procédure ne nécessitant alors plus de garder les animaux en vie ce qui pourrait engendrer de potentielles souffrances inutiles liées au développement d'un lymphome.
Remplacement
Pour étudier le développement tumoral, il est nécessaire d'avoir recours à un organisme vivant. De plus, il n'existe pas encore de modèles alternatifs susceptibles de tester à la fois l'effet de mutations génétiques sur le cancer tout en intégrant le comportement cellules cancéreuses avec un système immunitaire complet. Ainsi, aucune alternative au modèle animal n'est disponible pour répondre à notre question scientifique.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, les mesures suivantes seront prises : 1/ Partage des échantillons cellulaires de souris au sein de l'équipe, de sorte qu'un même échantillon puisse servir à plusieurs projets, évitant ainsi d'utiliser plusieurs souris pour des expériences similaires. 2/ Nous avons effectué un calcul de puissance statistique pour déterminer le nombre de souris et donc de reproducteurs nécessaires dans chaque procédure. puis nous ferons des analyses statistiques pour comparer les groupes de souris et éviter de répéter des expériences inutilement, ce qui réduira le besoin d'animaux. 3/ Optimisation de l'utilisation du matériel prélevé sur les tumeurs en le conservant de manière à ce qu'il puisse être utilisé plusieurs fois. Cela inclut la congélation des cellules provenant de différents organes, l'extraction du génôme et la préparation des organes pour des analyses. Cette approche évitera la duplication des expériences. 4/ Utilisation d'animaux mâles et femelles permettant de réduire considérablement le nombre d'animaux à générer par reproduction. 5/ Mise en place de stratégie de croisement des souris pour obtenir les mutations avec le moins de générations successives de souris possible.
Raffinement
Le raffinement se fera en adaptant la fréquence de surveillance et en enrayant une possible perte de poids et de température liée au développement tumoral. Les souris de plus de 3 mois seront surveillées quotidiennement (7jours/7) avec une prise de poids et de température tous les 15 jours jusqu'à l'âge de 15 mois afin de mettre en évidence l'un des points limites qui entraînera alors la mise à mort de la souris. Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée par rapport au maximum mesuré dans les semaines précédentes, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, elles seront placées dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort. Au-delà de 15 mois, les souris entrent dans un protocole de vieillissement et le suivi des animaux sera encore plus raffiné car le vieillissement peut accélérer la formation du lymphome. Ainsi, les souris de 15 à 18 mois seront pesées et une prise de température sera réalisée 1 fois par semaine. Pour les souris de 18 à 24 mois, la pesée et la prise de température seront réalisées 2 fois par semaine et au-delà de 24 mois, 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi). Dès qu'une perte de poids de 10% sera constatée par rapport au maximum mesuré dans les semaines précédentes, il sera ajouté de la gelée et des croquettes mouillées dans la cage. Si une perte de poids de 20% est constatée, la souris sera immédiatement mise à mort. Pour les souris ayant une température entre 34 et 36°C, placer les souris dans une enceinte chauffante pendant 48h. En dessous de 34°C, l’animal devra être mis à mort. Dans tous les cas, les animaux seront mis à mort à 24 mois maximum.
Choix des espèces
La souris est un modèle qui permet d'étudier le rôle de deux mutations génétiques sur deux gènes différents par croisement d'individus. C'est un modèle de choix pour reconstituer un lymphome qui forme des tumeurs avec un système immunitaire complet similaire à ce qu'on retrouve chez l'Homme. Ainsi, la souris est le meilleur modèle pour comprendre l'impact de mutations génétiques qu'on retrouve chez l'Homme sur le développement tumoral. Pour les couples reproducteurs, les souris seront utilisées à partir de 6 à 8 semaines (ce qui correspond à la maturité sexuelle de ces animaux) et jusqu'à l'âge de 6 mois pour éviter l'expression du phénotype dommageable induit par la mutation d'un gène. Pour les souris utilisées à des fins expérimentales, elles seront utilisées à partir 6 semaines, cela afin d'avoir des individus avec un système immunitaire mature et car nous devons utiliser des souris adultes mais jeunes permettant de voir le développement des tumeurs.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1, les souris de ce projet développent une ataxie cérébelleuse et une croissance ralentie par rapport aux témoins. 300 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 24 étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une biopsie d'oreille pour génotypage, puis une anesthésie terminale permettant de prélever le cervelet, à cinq semaines avant l'apparition des symptômes ou à vingt semaines quand ils débutent. Le porteur annonce par ailleurs 400 souris sur cinq ans, cent de plus que l'effectif déclaré, sans expliquer l'écart.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptomes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris controles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparitition des symptomes. Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : - Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. - Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. - Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de l’oreille pour genotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - injection des analgésiques et anesthésie avant l’intervention chirurgicale nécessaire à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris porteuses de la mutation du gène SCA1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de l’oreille ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 400 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les animaux seront surveillés au moins deux fois par semaine et l'état de santé sera évalué par un personnel compétent. Des points limites précis et adaptés au modèle ont été définis. Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d’utiliser les souris car elles présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptomes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptomes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Rôle du catabolisme des acides aminés dans la prolifération intestinale des Enterobacteriaceae en condition inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Les 90 souris de ce projet reçoivent du sulfate de dextran sodique, qui provoque une inflammation de la muqueuse intestinale, puis un gavage oral de bactéries. Elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, avec un point limite fixé à 20 % de perte de poids. Le porteur qualifie le gavage de geste rapide d'environ cinq secondes et affirme que les souris ainsi traitées ne développent "aucun signe pathologique", ce qui laisse de côté la colite chimique qu'il déclenche lui-même. Toutes sont tuées après chaque procédure, l'objet du projet étant de mesurer si des souches d'Escherichia coli isolées de patients atteints de la maladie de Crohn prolifèrent mieux dans un intestin enflammé.
Objectifs
Il est désormais établi que de nombreuses pathologies humaines sont associées à une altération du microbiote intestinal (dysbiose). Ce déséquilibre est souvent caractérisé par une prolifération des bactéries de la famille des Enterobacteriaceae. Comprendre l’origine de cette multiplication et les mécanismes associés permettra d’envisager des solutions thérapeutiques pour réduire la dysbiose et rétablir des conditions d’homéostasie favorables à la santé des patients. Notre projet vise à démontrer le rôle de de la capacité métabolique des souches d’Enterobacteriaceae à proliférer dans le tractus gastro-intestinal des patients lors d’une dysbiose. Suite à des travaux de criblage réalisés in vitro, notre équipe a démontré que les souches d’Escherichia coli isolées de patients atteints de la maladie de Crohn peuvent cataboliser la forme D de l’acide aminé Sérine, alors que les isolats provenant d’individus sains ne le peuvent pas. Cette capacité confère un avantage nutritionnel aux souches issues de patients dans un modèle de co-culture in vitro. L’objectif est désormais d’évaluer si ce déterminisme existe également dans un environnement digestif complexe, et notamment dans un contexte inflammatoire tel que celui observé chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Pour cela, nous prévoyons d’utiliser la souris comme modèle animal pour évaluer le fitness de souches représentatives de celles caractérisées lors de nos travaux in vitro.
Bénéfices attendus
La réalisation du projet permettra de valider les hypothèses formulées suite à la réalisation de travaux in vitro. Comprendre pourquoi et comment les Enterobacteriaceae prolifèrent dans l’intestin des patients constituera une base solide pour imaginer des solutions thérapeutiques et/ou préventives, en particulier via une alimentation adaptée, pour limiter les dysbioses et ainsi rétablir des conditions d’homéostasie favorables à la santé des patients.
Procédures
Les animaux subiront un gavage oral une seule fois lors de la procédure, un geste rapide (~5 sec) qui sera réalisé par du personnel qualifié.
Impact sur les animaux
Notre expérience antérieure a démontré que les souris gavées avec des souches commensales d’E. coli ne développent aucun signe pathologique ou de mal-être. Cependant, un suivi régulier sera réalisé au cours de l’expérimentation et permettra le cas échéant de rapidement identifier l’apparition éventuelle de mal-être ou de souffrance chez les animaux. Le traitement des souris au DSS provoque une inflammation de la muqueuse intestinale. Ce traitement est fréquemment employé dans le cadre de recherche sur les maladies inflammatoires de l’intestin telles que la maladie de Crohn. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée à travers la prise de poids et la recherche de signes de mal-être. Si un animal présente une perte de poids supérieure à 20% de son poids initial et/ou présente des symptômes visibles de souffrance, il sera sorti de l’expérience puis euthanasié si nécessaire selon la réglementation en vigueur.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié après chaque procédure expérimentale
Remplacement
L’hypothèse d’une adaptation métabolique des Enterobacteriaceae pour expliquer leur prolifération dans le tractus gastro-intestinal des patients a été explorée lors de travaux in vitro. Dans une optique de développement de rétablissement de la dysbiose, il est nécessaire de valider le rôle potentiel de de la D-serine dans un organisme entier afin de prendre en compte la complexité du tractus intestinal qui intègre à la fois la réponse immunitaire, la structure du tractus digestif ainsi que la présence du microbiote. Il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la complexité de ces interactions.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques à la fois pour garder une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats, et pour palier l’exclusion de certains animaux au cours de l’expérimentation. Après application d'un test de Grubbs pour repérer et exclure de possibles valeurs aberrantes, un test ANOVA sera appliqué afin d'évaluer l'impact des traitements sur les paramètres mesurés. Il s’agit d’un nombre d’animaux maximal qui sera revu à la baisse en fonction des premiers résultats obtenus qui pourront dans certains cas ne pas nécessiter de répétitions pour valider les observations.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux ont été raffinés à partir des données de la littérature et de notre expérience antérieure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de 5 individus dans des cages transparentes pourvues de litière dépoussiérée. Un enrichissement de l'environnement est prévu par ajout de cylindres de coton utilisés par les souris pour confectionner leur nid. Les cages seront placées dans une pièce régulée à 22°C et respectant une photopériode 12 /12. L’ensemble des animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié selon une grille de suivi clinique claire comprenant 4 stades distincts établis en fonction de la perte de poids et de l'état visuel des animaux (pelage et comportements). Si les points limites tels que définis dans le projet sont atteints, les souris seront sorties du protocole avec arrêt des traitements. En cas de nécessité, les souris seront euthanasiées selon la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris est un modèle fréquemment utilisé dans les études de colonisation du tractus digestif par les Enterobacteriaceae ainsi que pour reproduire une inflammation chronique de l’intestin à travers l’utilisation du DSS. Des souris femelles seront utilisés au cours du projet car il est démontré que les hormones males, en particulier la testostérone, influence la composition du microbiote intestinal. Des souris de 6 semaines seront utilisées pour le projet car le microbiote intestinal est stable à ce stade de développement
Impact du stress in utero sur l’inflammation et la douleur
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Trois séances de contention sous lumière vive par jour, trente minutes chacune, six jours de suite pendant la gestation, voilà ce que subissent une partie des 1 442 souris de ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent des pansements posés sur le dos sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines et des injections intrapéritonéales aux jours embryonnaires 7,5 et 10,5. Le porteur écrit que le modèle murin reste un "élément clé et incontournable" pour étudier l'effet du stress prénatal sur l'inflammation de la peau, faute de modèle cellulaire équivalent. Les mâles reproducteurs seront transférés à d'autres équipes, les femelles gestantes tuées à E18.5 ou après le sevrage, et les fœtus prélevés puis tués pour analyse.
Objectifs
Influencés par une variété de facteurs environnementaux, les maladies allergiques connaissent une augmentation constante de leur prévalence à l'échelle mondiale, tant dans les pays développés que dans les pays en voie de développement. D'une façon intéressante, ces maladies sont souvent déclenchées ou aggravées par le stress chronique, bien que les données biologiques expliquant ces phénomènes restent largement incomplètes. Notre projet a donc pour objectif d'examiner l'effet du stress sur la susceptibilité à développer une inflammation allergique, et le cas échéant, de dévoiler les mécanismes moléculaires responsables de cet effet. En effet, la période prénatale est une période critique durant laquelle tous les systèmes physiologiques, y compris les systèmes nerveux et immunitaire, développent leurs fonctions spécifiques et apprennent à s'adapter aux éventuels stimuli déclencheurs. Nous avons récemment mis en évidence l'existence de ce qu'on appelle 'unités sensorielles' dans la peau, formées par les mastocytes (cellules immunitaires spécialisées) et les neurones sensoriels (responsables de la détection de stimuli sensoriels), qui contribuent au développement de l'inflammation allergique de la peau. Nous éméttons donc l'hypothèse que le stress, plus particulièrement le stress prénatal, pourrait contribuer au développement de l'inflammation de la peau de la descendance in utero, en perturbant, au moins en partie, les phénotypes des mastocytes et des neurones sensoriels, et donc les unités fonctionnelles neuro-immunes cutanées associées.
Bénéfices attendus
Le présent projet aborde une question clé en explorant le rôle de l'exposition du fœtus au stress prénatal et ses conséquences sur la susceptibilité à développer une inflammation après la naissance. Il permettra de dévoiler, pour la première fois, les mécanismes biologiques sous-jacents activés par l'exposition au stress. Cela apportera des informations inestimables sur d'éventuels événements indésirables prénataux associés au développement des caractéristiques classiques de l'eczema pédiatrique, donnant lieu à des publications de haut niveau, protégées par des brevets découvertes et, surtout, de nouvelles options thérapeutiques/préventives potentielles pour les troubles allergiques.
Procédures
- Procédures 1/3: Les souris seront mises en stress de contention sous une lumière vive, 3 fois par jour durant 30 minutes, sur 6 jours consécutifs. Nombre de souris: 140 (P1)+162 (P3) = 302 - Procédure 2: Un pansement imbibé d'une solution physiologique sera déposé sur le dos des souris, sous anésthésie, 2 fois par semaine (lundi et mercredi, 3-5min par souris), pour une durée de 3 semaines (3 cycles au total). Nombre de souris: 504 - Procédure 4: Les souris seront injectées au jour embryonnaire 7.5 ou E10.5 en intra-péritonéal (~1min/souris). Nombre de souris: 360 - Procédure 5: Les souris seront injectées en intra-péritonéal avant chaque session de stress (~1min/souris), voir trois fois par jour, sur 6 jours consécutifs. La génération F1 sera patchée (3-5min par souris). Nombre de souris: 276
Impact sur les animaux
Dans le projet proposé, les souris subiront des procédures de classe modérée qui pourraient avoir des effets indésirables ou des nuisances. Les principales nuisances attendues sur les animaux incluent: (1) comportements anormaux liés au stress comme la prostration, isolement, absence de nettoyage (bien que nous n’ayons pas observé de nuisance qui perturberait le comportement soit de la souris stressée, soit de la descendance dans les expériences que nous avons déjà faites en accord avec le protocole éthique précédent utilisant ce modèle); (2) Irritation cutanée due à l'application du patch: l'application de patch peut causer une légère gêne cutanée, une irritation temporaire sur la zone d'application et une légère inflammation; (3) Les injections pourraient causer une douleur passagère au site d'injection et un stress modéré due à la manipulation répétée. Ces effets indésirables vont être soigneusement surveillés et gérés pour minimiser l'impact sur le bien-être des animaux, en appliquant les mesures de raffinement appropriées décrites dans la section 5.10.3.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure correspondante: - Les souris mâles utilisées pour les accouplements seront séparées et proposées à la communauté scientifique. - Les souris femelles utilisées pour les accouplements et subissant le stress seront euthanasiées ou bien au jour embryonnaire E18.5 ou bien après le sevrage (semaine 3). - Les souris de la descendance seront euthanasiées à E18.5 ou à la semaine 8 avant toute intervention ou après le patch.
Remplacement
Ce projet vise à identifier les mécanismes biologiques, induits par l'exposition au stress durant la gestation. Il n'existe à ce jour aucun modèle cellulaire qui peut substituer l'usage d'animaux pour investiguer cela. La substitution également par l'humain n'est pas évidente, étant donné que le niveau de stress est relatif à chaque personne (ce qui sera source de variabilité pour notre étude), et l'accès à des échantillons de foetus ou de mamans durant la gestation/ou atteints d'éczema n'est pas toujours possible. Le modèle murin est donc un élément clé et incontournable pour étudier l'effet du stress prénatal sur le dialogue entre neurone sensoriel et mastocyte dans le cadre de l'inflammation de la peau.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans le modèle de stress prénatal et de patch de peau (protocoles éthiques obtenus précedemment) et la présence de data préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous utiliserons une moyenne (12 femelles par groupe, par génotype, réparties entre controle et stress). Ce nombre pourra éventuellement varier à la hausse ou à la baisse (+/- 3 animaux par groupe) en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. Ces femelles seront accouplées avec 8 mâles aux génotypes correspondants, pour un rapport 2mâles x 3femelles. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet dans les expériences réalisées.
Raffinement
Jusqu'à présent, le taux de mortalité issu des expériences proposées n'atteint pas les 0.1%. Quant au modèle de patch ou de stress, aucun taux de mortalité n'a été détecté jusqu'à présent. D'autre part, lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera monitoré régulièrement. Nous analyserons les paramètres suivants : poids, température, signes extérieurs de stress tels que le comportement de prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si nécessaire, des antalgiques seront administrés (surtout si des effets indésirables liés au patch surviendront bien qu'aucune manipulation précédente n'a impliqué cela). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien des signes de baisse de température (isolement, mouvement moindre, confirmée par la prise de la tempéraure corporelle et détéction d'une baisse de 3° par rapport à la température d’origine), les animaux seront euthanasiés. Ces cas de figure n’ont encore pas été présentés lors des procédures employées dans d’autres protocoles éthiques déjà validés. Enfin, nous utiliserons des techniques de préhension adaptée (main en coupe ou igloo) aux souriceaux afin d'éviter un stress supplémentaire et maintenir le bien-être des souris. Les injections seront aussi réalisées par un personnel compétent pour éviter la douleur des souris. Les souris mâles mis en accouplement seront réutilisés par d’autres expérimentateurs.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines, surtout l'inflammation de la peau (taux de similarité important). En effet, l’élevage de souris est très productif et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués transgéniques, qui dans notre cas, permettront l'étude du rôle des mastocytes et des neurones sensoriels, et l'effet du stress sur ces cellules. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sont déjà disponibles dans le laboratoire. L'utilisation de méthodes alternatives (ex. avoir recours à des biopsies humaines, etc. sera d'un grand intêret mais cependant limite le projet, étant donné que les niveaux de stress sont relatifs à la personne en question, ce qui apportera une variabilité dans nos analyses. Trois stades/périodes de développement seront d'intêret durant notre projet: 1- Jour embryonnaire E13 à E18: cette période de gestation sera la période durant laquelle les sessions de stress seront conduites. Non seulement cette période est celle décrite pour le modèle, mais elle correspond également à la période de développement des cellules d'intêret, y compris les neurones et les mastocytes. 2-Jour embryonnaire E18.5: les souris gestantes seront euthanasiées et les foetus prélévés, euthanasiés et analysés pour les études à l'état basal. Ce stade représente le dernier jour du protocole de stress ainsi qu'un time-point où les neurones et les cellules immunitaires sont déjà présents dans la peau des souris. 3- Semaine 8: les souris de la génération F1 seront patchées à l'âge de 8 à 12 semaines car elles présentent un système immunitaire mature à ce stade. Le modèle de patch dure 3 semaines, les souris seront euthanasiées à la fin du modèle.
Différences interindividuelles dans la vulnérabilité à la dépression: approche comportementale et neurochimique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, 380 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Pendant un mois, elles subissent des immobilisations de 45 minutes trois fois par jour, des expositions à une lumière intense, douze heures sur litière mouillée, douze heures sur plan incliné et douze heures avec des billes, protocole destiné à provoquer un état dépressif. Le porteur détaille les tests infligés tous les deux jours, labyrinthe en croix surélevé, open field, interaction sociale, test de Porsolt, anhédonie et discrimination olfactive, répétés deux à trois fois. Il annonce enfin une injection intrapéritonéale d'un psychédélique dont il écrit que l'effet est "inconnu chez l'animal", en notant seulement qu'il provoque des hallucinations chez l'être humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif de déterminer des facteurs de vulnérabilité à la dépression induite par le stress chronique chez la souris. Le projet consistera à évaluer des traits comportementaux d'un lot de souris avant et après une période de stress chronique. Ceci permettra d'identifier des sujets manifestant un état dépressif ou des sujets résilients, de déterminer d'éventuels traits comportementaux prédictifs de la vulnérabilité à la dépression, de caractériser les profils neurochimiques des souris en relation avec les manifestations comportementales observées. Par ailleurs, ce projet nous permet d'envisager une approche thérapeutique personnalisée de la dépression.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux identifier les vulnérabilités à l'état dépressif (et éventuellement des facteurs prédictifs), de mieux comprendre les substrats neurochimiques à l'origine de l'état dépressif et donc de mieux cibler les traitements pharmacologiques.
Procédures
Procédure de stress chronique sur 1 mois (répétition de stmulation sur 1 mois : imobilisation: 3x 45 mn lumière intense : 3 x 30 mn litière mouillée: 12h plan incliné: 12h billes 12h Batterie de tests comportementaux (1 test toutes les 48h) : labyrinthe en croix surélevé: 5 mn open field: 10 mn interaction sociale: 6 mn Porsolt test 6 mn Anédonie: 30 mn Discrimination olfactive: 2 fois 5 mn. Répétition de la batterie de test: 2 fois pour expérience 1. 3 fois pour les autres expériences. Injection aigüe intrapéritonéale d'un psychédélique.
Impact sur les animaux
Effets du stress chonique mis en oeuvre pour induire un état dépressif: perturbation mentale et comportementale. Effet de l'injection de psychédélique: stress lié à l'injection. Peut être effet de la molécule (inconnu chez l'animal, hallucinations chez l'humain).
Devenir
Notre étude comporte une analye de paramètres neurochimiques sur le tissu cérébral. Pour prélever le cerveau, il est nécessaire de préalablement euthanasier les animaux sans utilisation de chimie.
Remplacement
Ce projet ne peut en aucun cas être remplacé par une approche in vitro dans la mesure où ce sont les manifestations comportementales que nous étudions.
Réduction
Des données pharmacologiques issues du laboratoire et de la littérature permettront l’administration d’une dose unique efficace sans devoir utiliser d’animaux supplémentaires pour effectuer une courbe dose-réponse. Concernant les effectifs, une étude antérieure a montré que le traitement statistique des données comportementales dans nos conditions nécessitaient 12 animaux par groupe minimum ce qui justifie les effectifs prévus dans ce projet.
Raffinement
Conditions d'hébergement: Les animaux seront hébergés en cages collectives avec enrichissement du milieu (tunnel, matériel de nid, bâton à ronger) par groupe de 4 pour maintenir les contacts sociaux. Habituation aux conditions expérimentales : Les animaux seront manipulés délicatement quotidiennement pour éviter le stress des effets de la manipulation par les expérimentateurs (deux maximum). Une habituation à la salle d'expérimentation sera effectuée avant les tests comportementaux. Etat de santé : Pendant toute la période expérimentale, les animaux seront suivis quotidiennement pour leur état général (pelage, autophagie, fèces, morsures éventuelles) et ils seront pesés chaque semaine pour suivre l'évolution du poids corporel (une perte de 10% du poids sera considérée comme signe de mal être et l'animal sera retiré de la procédure). S’il ne récupère pas des paramètres normaux, le vétérinaire sera contacté pour évaluation de son état. Un fichier de suivi du bien-être des animaux sera réalisé (fichier type joint).
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale la plus adaptée à nos travaux (avec le rat). Le profil neurochimique des souris fait l'objet de multiples travaux dans l'équipe ainsi que les modifications par des agents pharmacologiques susceptibles d'être utilisés dans le traitement de la dépression. Les animaux seront des souris jeunes adultes agées de 2/3 mois à leur arrivée au laboratoire. Cet âge correspond à des animaux dont le développement est achevé et pas encore dans les perturbations liées à l'âge. On parle donc d'adultes jeunes.
Etude d’innocuité et d’efficacité de molécules destinées au traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie-reperfusion chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un filament inséré dans l'artère carotide bouche l'artère cérébrale moyenne pendant environ une heure, l'animal restant éveillé entre la pose et le retrait, avant des séances d'IRM sous anesthésie à J0, J1, J3, J5 et J14 et une thoracotomie terminale pour ponction cardiaque. Le porteur indique que l'accident vasculaire peut provoquer des pertes d'équilibre, une faiblesse musculaire et des difficultés à s'alimenter, et annonce une batterie de tests comportementaux répétée sept fois sans préciser lesquels. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne donne le même niveau d'information et qualifie le recours à la souris d'"incontournable".
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA, comme la survenue de complications hémorragiques lors d’une thrombolyse trop précoce ou trop tardive, ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau de la bifurcation carotidienne dans le cou afin d’induire mécaniquement un AVC ischémique via l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne par un filament inséré dans l’artère carotide externe. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera entre 20 et 30 minutes puis l’animal sera maintenu éveillé environ une heure avant d’être soumis à la deuxième chirurgie permettant le retrait du filament. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J3, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 15 minutes pour chacun des tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique sévère, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales latéralisées au niveau du cortex somatosensoriel, prémoteur et striatal. Les déficits fonctionnels sont suffisamment importants à court, moyen terme et long-terme dans ce modèle d’AVC pour permettre de faire des conclusions sur les tests comportementaux. L’AVC sévère peut occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. Dans les premiers jours après l’AVC, l’animal peut rencontrer des difficultés à s’alimenter normalement, s’abreuver et à se fabriquer un nid avec les enrichissements, c’est pourquoi une attention toute particulière sera mise en œuvre dans la surveillance de ces animaux.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 20 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 26 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 20 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous les bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés individuellement pendant l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et ainsi faciliter la phase de récupération post-opératoire. Les animaux auront toujours accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès ad libidum à la nourriture et à l’eau pendant toute la durée de stabulation. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront régulièrement pesés (2 fois par semaine au minimum). Pendant l’opération chirurgicale, l’animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique à base de buprénorphine administrée en sous-cutanée 15 minutes avant la première incision. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. Chaque site d’incision de peau sera précédé d’une tonte préalable du pelage et d’une désinfection à la chlorhexidine suivie de l’application locale de lidocaïne en spray. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris qui limite les pertes de chaleur. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, l’animal sera placé dans une cage chauffante pendant une heure avant de retrouver sa cage d’hébergement comportant de la nourriture facilement accessible. La surveillance des animaux sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites précédemment fixés et détaillés plus bas dans cette DAP, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivants l’opération. Le lendemain de l’opération chirurgicale, les animaux recevront une nouvelle injection en sous-cutanée de Buprénorphine.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, ainsi que la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 25 à 30g pour les C57BL6N. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Suivi du devenir des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs et de leurs effets sur le système immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
7 324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales, une partie ensuite des injections intraveineuses ou directement dans la tumeur deux fois par semaine pendant neuf semaines au maximum, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires sur trois semaines et une mesure de la tumeur au pied à coulisse deux fois par semaine. Le projet vise à suivre les vésicules émises par les tumeurs et à comprendre comment elles agissent sur les cellules immunitaires, des applications thérapeutiques n'étant évoquées que comme une possibilité ouverte à cinq ans. Le porteur annonce dix souris par groupe expérimental comme règle générale, sans expliquer comment on passe de ce chiffre aux 7 324 animaux du projet.
Objectifs
Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques. Ces vésicules sont sécrétées par toutes les cellules, mais lorsqu’elles sont sécrétées par les cellules tumorales, elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Bon nombre d’études dans ce domaine reposent sur l’utilisation de modèles de culture cellulaire très éloignés d’un contexte physio-pathologique. L’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, est donc une étape cruciale pour comprendre comment les tumeurs communiquent avec notre système immunitaire grâce à ces vésicules extracellulaires. Notre projet de recherche vise à suivre in situ ces vésicules extracellulaires, afin d'étudier leur capacité à interagir avec les cellules du système immunitaire et à en moduler la fonction, de comparer le devenir de différents types de vésicules extracellulaires émises par les cellules tumorales, et d’analyser le mode d’action de ces vésicules dans les cellules réceptrices. Une dernière étape consistera à moduler in vivo la sécrétion de ces vésicules de tumeurs pour moduler leurs effets sur le système immunitaire. Ces travaux permettront d’analyser le rôle de ce mode particulier de communication entre les tumeurs et le système immunitaire. Ils pourraient ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses ciblant spécifiquement ce mode de communication. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre cellules cancéreuses et système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Dans le contexte des immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer, il est essentiel de mieux comprendre les interactions entre les cellules tumorales et le système immunitaire. Ce projet étudie la communication entre les cellules tumorales et les cellules du système immunitaire grâce au développement de nouvelles méthodes de suivi de vésicules extracellulaires. Il a pour objectif d'identifier le type de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires issues des tumeurs et de comprendre le mode d’action de ces vésicules. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques en identifiant les types de cellules immunitaires ciblées par les vésicules extracellulaires. Notons que ces vésicules s’accumulent dans les fluides corporels, elles peuvent donc être aisément ciblées par des stratégies thérapeutiques basées sur des protocoles d’injection .
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées à tous les animaux vigiles (1 fois par expérience, durée du geste inférieure à 10 sec). Certains animaux sont ensuite traités selon 3 protocoles: soit directement dans l’eau de boisson, soit par injections aux animaux vigiles (2 injections à 24h d’intervalle – durée du geste inf à 10sec) soit par eau de boisson et injections. Certains animaux reçoivent un produit préparé au laboratoire par voie intraveineuse (durée du geste inf à 10sec), et d’autres par voie intra-tumorale, ou un produit commercial par voie intra-tumorale, 2 fois par semaine au long de l’expérience (maxi 9 semaines). Des prélèvements sanguins à raison d’1 prélèvement/sem pendant 3 sem) sont réalisés sur une partie de ces animaux (durée de chaque prélèvement inf 20sec – animaux sous anethésie légère). Les animaux sont observés et le développement de la tumeur est mesuré par pied à coulisse 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 20 sec).
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’injection sont limitées à la piqure elle-même : douleur légère immédiate, durée brève. La supplémentation de l’eau de boisson avec de la(Vitamine H, ne devrait pas avoir d’effet sur la quantité d’eau bue par les animaux. Aucun effet délétère n’est attendu y compris en cas de surdosage. Les nuisances attendues lors des injections de « traitement » ou des prélèvements sanguins seront celles liées aux piqures elles-mêmes (douleurs légères immédiates de courte durée)
Devenir
Les animaux seront sacrifiés pour collecte de différents organes puis des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus.
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la validation des méthodes de suivi des vésicules extracellulaires dérivées de tumeur et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles. Le projet, centré sur l’étude d’un mode particulier de communication intercellulaire, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.
Réduction
1. Les tests in vitro nous ont permis de sélectionner les molécules d’intérêt, réduisant donc le nombre d’animaux à utiliser 2. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à notre modèle, notamment le taux d’obtention de tumeur par injection de cellules tumorales, et permettra l’analyse finale de groupes d’au moins 8 animaux. Il se base aussi sur nos connaissances de nos modèles tumoraux et prend en compte la quantité de matériel cellulaire nécessaire pour les 3 types d’analyses biochimiques post-mortem prévues. Toutes les lignées tumorales génétiquement modifiées seront au préalable validées in vitro.
Raffinement
Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle. Les souris seront suivies tous les 3 jours pour surveiller leur état général. Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. En cas d’atteinte des points limite tel que décrit dans la grille de score, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Enfin, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Rôle des hormones thyroïdiennes et du récepteur nucléaire TRa1 dans la physiopathologie intestinale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, et l'une des lignées développe des cancers de l'intestin par mutation d'un gène suppresseur de tumeur. 5 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des hormones thyroïdiennes en injection quotidienne pendant deux jours ou en continu dans l'eau de boisson, et la mise à mort intervient au plus tard huit mois après l'induction tumorale. Le porteur écrit choisir d'interférer le moins possible et, pour cela, de ne pas administrer de traitement contre la douleur, en se limitant à une surveillance quotidienne.
Objectifs
Le but du projet est de réaliser des expériences permettant d’analyser les effets des hormones thyroïdiennes sur la croissance de tumeurs chez la souris. Nous savons par nos travaux antérieurs que ces hormones influent le développement de certains cancers, dont le cancer colorectal. Nous utiliserons des modèles de souris qui nous permettront une analyse détaillée de cette fonction. En parallèle, en collaboration avec des cliniciens nous évaluerons les retombés de nos travaux fondamentaux en clinique.
Bénéfices attendus
Nous serons en mesure d’analyser l’effet des hormones thyroïdiennes sur la croissance tumorale in vivo et de définir l’impact de l'altération de leur récepteur nucléaire dans ce même contexte. Les analyses cellulaires et moléculaires nous permettront d’acquérir des connaissances et de tester des cibles thérapeutiques potentielles pour bloquer la croissance tumorale.
Procédures
Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dont les mutations seront induites expérimentalement et une des lignées de souris développera des cancers dans l’intestin. Pour étudier l’impact de l’hyperthyroïdie sur le développement tumoral les animaux recevront également un traitement aigu avec les hormones thyroïdiennes (une injection par jour, pendant 2 jours) ou subclinique (hormones thyroïdiennes dans l’eau de boisson pendant toute la durée de la procédure). Toutes injections de produits se feront en quelques seconds sur animal vigile.
Impact sur les animaux
La mutation du gène suppresseur de tumeur Apc induit la croissance tumorale dans l’intestin. La cinétique du développement tumoral est bien connue, permettant de maitriser le suivi des animaux et la mise à mort interviendra au plus tard 8 mois après induction tumorale, limitant la taille et l’agressivité des tumeurs. Il est possible que les phénotypes et la vitesse du développement tumorale varie d’un animal à un autre. On choisit d’interférer le moins possible et pour cela de ne pas effectuer de traitement pour soulager la douleur de l’animale, mais on veillera quotidiennement chaque animal. Les injections par voie intra-péritonéale induisent une douleur de classe légère. Elles seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries, mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration. Le traitement avec les hormones thyroïdiennes provoque une hyperthyroïdie légère, qui n’aura pas d’effets majeures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Notre but est de mener des analyses sur plusieurs tissus (tumeurs et organes) prélevés après la mise à mort de chaque animal.
Remplacement
Nous étudions la physiopathologie intestinale et plus spécifiquement les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans le maintien de l’épithélium intestinal et les altérations conduisant à la transformation cellulaire et aux tumeurs. Nous utilisons la souris comme organisme modèle pour reproduire chez l'animal des pathologies (cancer) à des fins cognitives et dans le but d’établir une recherche translationnelle. Il est évident que l'animal du point de vue physiologique intégratif est absolument nécessaire pour les observations de base et pour valider leur relevance dans la pathologie étudiée.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
L'expertise du laboratoire dans l'étude de la physiopathologie intestinale permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et avec des points critiques étroitement surveillés. Durant la durée de l'étude, les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des dans des cages agrémentées disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Les animaux sont surveillés quotidiennement. Un suivi régulier comprenant l’observation de critères définis (poids, posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif) sera effectué. Des points limites (poids et état de maigreur, contrôle du site d’injection) ont été établis permettant de soustraire l’animal au protocole, limitant ainsi dans le temps une souffrance et un stress potentiels.
Choix des espèces
La physiologie intestinale chez la souris est bien caractérisée et la souris reste le modèle animal de choix pour effectuer des expériences de modifications génétiques in vivo qui recapitulent la pathologie humaine. Spécifiquement, nous étudions les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans le maintien de l’épithélium intestinal et les altérations conduisant à la transformation cellulaire et aux tumeurs. Il s’agit de processus complexes qui impliquent non seulement les cellules épithéliales intestinales mais également les cellules du microenvironnement (stromale et immunitaire). Dans ce cadre, l'animal du point de vue physiologique intégratif est absolument nécessaire. La souris est idéale car les processus précédemment cités sont très conservés entre l'Homme et la souris. Cela a une valeur translationnelle directe. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines afin de mener notre projet sur des stades adultes. Nous utiliserons les animaux à des stades différents après altérations génétiques ou traitement hormonale (2 jours, un mois et deux mois), pour étudier les effets à court-terme (2 jours) ou a moyen-terme (un mois) sur l’altération de la physiologie intestinale et son rétablissement (2 mois) après traitement. Nous analyserons également la cinétique de l’induction tumorale dès les stades précoces (un mois et deux mois) jusqu’au développement des lésions précancéreuse et cancéreuses (3,5,6 et 8 mois).
Implication des cellules lymphoïdes innées de type 2 dans la réponse allergique.
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une perte de poids supérieure à 20 %, une hyperventilation, une perte de poils, un isolement social ou une baisse d'activité en cage font sortir la souris du protocole. 1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 840 d'entre elles subissent une trachéotomie d'une vingtaine de minutes pour mesurer leur fonction pulmonaire et prélever un lavage broncho-alvéolaire, 320 des prises de sang à la queue ou à la joue, après deux à quatre semaines d'instillations nasales d'extrait d'acarien. Le porteur cherche à décrire le comportement de certaines cellules immunitaires dans le poumon asthmatique et ne situe qu'à long terme d'éventuelles retombées thérapeutiques.
Objectifs
Ce projet se focalise sur le rôle des populations immunitaires localisées aux interfaces épithéliales des bronches en conditions physiologiques et en conditions inflammatoires. L’inflammation asthmatique se caractérise par l’activation et le recrutement (local et périphérique) de cellules immunitaires connues pour provoquer des altérations physiologiques au niveau des parois bronchiques suite à une stimulation par des allergènes inhalés. Afin de comprendre la régulation de la réponse immunitaire médiée par ces cellules dans un contexte inflammatoire, les souris sont mises dans des conditions d’induction d’asthme allergique via une exposition à différents extraits d’allergènes comme la papaïne et l’extrait d’acarien (House Dust Mite, HDM), et des molécules stimulantes (IL-33). Ainsi nous étudierons les modifications à court-terme (induites par la papaïne et IL-33) et à long-terme (induites par le HDM) du comportement des cellules immunitaires. Nous effectuerons plus particulièrement des études sur l’activation, la prolifération, la motilité, et les altérations morphologique de ces cellules immunitaires au cours de l’inflammation. Ces études permettront de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires orchestrés par ces cellules immunitaires, en plus des modifications physiologiques observées.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours de l’inflammation du poumon dans un contexte d’asthme allergique. À court terme, ce projet permettra d’établir les différences de comportement des cellules immunitaires en inflammation dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées, engendrées par les différents modèles d’induction d’asthme. Les résultats de ce projet devraient communiquer la nature des mécanismes moléculaires et cellulaires entre certaines protéine et cellules immunitaires dans le poumon asthmatique. Cela permettra de déterminer si ces mécanismes contribuent à la progression vers une pathologie chronique, ou à un rétablissement à l’homéostasie. À long terme, ces résultats pourraient participer à de futures recherches sur des stratégies thérapeutiques ciblées contre ces mécanismes moléculaires, afin de lutter contre l’exacerbation de l’inflammation et d’atténuer les dommages physiologiques, au vu de l’impact important de cette maladie en santé publique.
Procédures
Les interventions prévues sont les suivantes : 320 animaux subiront des prélèvements sanguins venant de la veine caudale latérale ou de la veine submandibulaire. 840 animaux subiront une procédure chirurgicale (maximum 20 minutes) permettant d’accéder à la trachée afin d’effectuer des trachéotomies pour les mesures de fonctions pulmonaires et ensuite prélèvements de lavage broncho-alvéolaires.
Impact sur les animaux
La stimulation par certaines molécules en 3 jours consécutifs peut induire une inflammation des poumons à court-terme. Le modèle d'instillations intranasales d’extrait d’acarien sera appliqué pour une plus longue durée allant à 2 semaines dans certaines expériences pour simuler une inflammation asthmatique aigüe, et à 4 semaines dans d’autres expériences afin d’induire une chronicité. Ces inflammations des voies respiratoires peuvent provoquer les nuisances suivantes : des irritations et constrictions aux niveau des bronches, et possiblement une augmentation du rythme respiratoire. Nous nous attendons donc à ce que les animaux utilisés dans ce projet présentent un rythme respiratoire augmenté à l’œil nu. Mis à part cette nuisance, la littérature ne décrit pas d’autres signe de nuisance apparente, Il n’y aucune difficulté d’alimentation/d’abreuvement, ni de mortalité causée par l’inflammation pulmonaire induite par ces modèles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils sont tous utilisés à pour un accès à leurs organes et à l’isolement des populations immunitaires dans les différents tissus.
Remplacement
La réponse des populations immunes à des signaux inflammatoires tissulaires, donc provenant du dialogue entre divers sous-types cellulaires dans différents organes est très contrôlée. Les cellules passent par une circulation sanguine et lymphatique qui sont des environnements complexes et impossibles à mimer sur des tests in vitro. Afin de pouvoir conclure sur des fonctions différentielles de nos cellules et de comprendre les mécanismes moléculaires en jeu, les expériences in vivo sont absolument essentielles et aucun système in vitro assez complexe n’existe pour obtenir ces résultats. Toutes les simulations d’activation cellulaire par des cytokines seront néanmoins entreprises en culture 2 dimensions afin d’éviter l’utilisation d’animaux dans le cas de questions mécanistiques.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet ne prendra en compte que des points de temps bien précis pour la cinétique d’inflammation car les effets des modèles d’asthme allergique sont déjà décrits dans la littérature. Par exemple, nous savons que les changements de comportement des cellules immunitaires ne sont à tester qu’à partir de 24 heures après la dernière instillation de la molécule testée. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, ainsi que leurs modulations ne seront analysés qu’à des points de temps précis où des différences significatives des populations immunitaires sont détectées. De plus, la compilation de données de la littérature et de données déjà générées au laboratoire, ainsi que des expériences de culture cellulaire nous permettent de limiter le nombre d’hypothèses à tester. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Seulement après la validation des altérations de mécanismes moléculaires impliqués dans les changements de comportement des cellules immunitaires (prolifération, activation, motilité) chez les souris génétiquement modifiées, une étude du blocage des molécules concernées se fera par l’injection de molécules inhibitrices. Ainsi, nous vérifierons dans les organes cibles si les molécules bloquées avaient un effet favorisant ces changements de comportement. L’application de ces molécules bloquantes uniquement dans le cas d’une prolifération/ activation/ motilité statistiquement significative permet de réduire les effectifs requis et visera à réduire le nombre de souris nécessaires pour maintenir une interprétation biologique robuste. Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’analyser les différents organes pour les populations immunitaires.
Raffinement
Les animaux sont manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences. Certains seront évalués pour leurs capacités respiratoires et leurs sérologies à des points de temps spécifiques. Une fiche d’observation tout au long des conditions permettra de vérifier leur état (pelage, poids, interactions, mobilité) et des scores seront tenus afin de vérifier que les modèles décrits n’induisent pas de modifications des habitudes et du bien-être animal. En cas de changement des scores, des points limites sont établis : perte de poids importante (>20%), hyperventilation, modification d’état du pelage/alopécie, isolement social, et diminution de l’activité dans les cages. Le suivi rapproché des animaux permettra de définir s’il est nécessaire de diminuer la dose des stimulants et/ou d’administrer un analgésique selon la gravité des changements de comportement. Dans le cas des anesthésies par voie gazeuse, nous veillerons à chauffer les animaux anesthésiés à l’aide d’un tapis chauffant lors des inoculations intranasales. Nous appliquerons également du gel hydratant sur les yeux des animaux anesthésiés afin d’éviter les dessèchements. Ces conditions s’appliquent à toutes les procédures. Quand les animaux sont conservés en vie, un suivi quotidien s’assurera de leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress selon la grille de score précédemment décrite dans ce paragraphe.
Choix des espèces
La souris de laboratoire, mammifère modèle, comporte tous les composants moléculaires et cellulaires clés du système immunitaire : l’analyse des nombreux lignages qui contribuent à la structure et aux fonctions complexes du système immunitaire des souris est précieuse pour appréhender la structure et les fonctions du système immunitaire humain. En outre, il existe un grand nombre de lignées de souris génétiquement modifiés dont l’utilisation permettra la réalisation d’études sur les dynamiques et mécanistiques des cellules immunitaires impliquées dans l’asthme allergique. Le détail du nombre de souris dans chaque procédure est décrit dans le protocole. Toutes les souris seront analysées à l’âge adulte, et la mise en place des modèles d’induction de l’inflammation asthmatique débutera à 6 semaines. Dans une de nos procédures, nous analyserons l’effet de l’inflammation asthmatique à partir de 14 jours (2 semaines). Ces âges ont été retenus comme les plus significatifs pour observer la mise en place et le suivi de l’inflammation allergique des voies respiratoires chez la souris. De plus, comme le modèle HDM se pratique sur 4 semaines dans certaines expériences, les souris doivent être analysées à un stade qui évite qu’elles ne soient trop vieilles après les inoculations intranasales et que l’on ne se situe pas sur l’interprétation d’un facteur de vieillissement.
Effet de l’entrainement aérobie sur l’initiation, le développement et l’évolution de la fibrose pulmonaire dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris courent une heure par jour, cinq jours par semaine pendant quatre semaines, sur un tapis roulant qui les y pousse par un stimulus aversif. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers, modérés et sévères, avant qu'on leur instille de la bléomycine dans la trachée pour provoquer une fibrose pulmonaire sur vingt et un jours. Le porteur affirme que cette administration n'entraîne "aucune lésion ni douleur particulière" et que la fibrose est indolore faute d'innervation sensitive dans le poumon, tout en annonçant une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 %. Les survivantes sont tuées pour prélever les poumons, le sang et le liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une pneumopathie interstitielle fibrosante caractérisée par l’accumulation de tissu conjonctifs dans les poumons conduisant à une insuffisante respiratoire restrictive d’évolution fatale. En l’absence de traitement efficace, la médiane de survie à partir du diagnostique est d’environ 3 ans avec une évolution variable selon les patients. L’hypothèse physiopathologique actuelle suggère une dérégulation du dialogue entre les cellules épithéliales alvéolaires et les fibroblastes sous-jacent. Cette dérégulation jouerait un rôle essentiel dans le processus de développement de la fibrose en conduisant à une cicatrisation aberrante de l'épithélium alvéolaire suite à des micro-lésions alvéolaires répétées, et un dépôt excessif de collagène. L’activité physique a des effets bénéfiques sur la santé tant sur le plan préventif que curatif. En effet la pratique d’une activité physique améliore la condition physique et agit sur la santé et le maintien de l’autonomie. En outre il est maintenant admis que l’activité physique joue un rôle primordiale dans la prévention de pathologies tels que certains cancer, maladie cardio-vasculaire, maladies osteo-articulaires et dégénératives, etc.. Notre hypothèse est que l’entrainement aérobie pourrait prévenir la mise en place et l’évolution de la fibrose pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’activité physique semble améliorer la condition physique et la qualité de vie des patients porteurs de pneumopathies interstitielles diffuses (PID). Notre hypothèse est que l’entrainement aérobie aurait un effet protecteur sur la survenue de la fibrose pulmonaire en modifiant le métabolisme, en limitant l’inflammation et en diminuant les marqueurs pro-fibrosant. Notre projet, conduit en parallèle d’une étude clinique, à pour objet de valider ces théories sur un modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et ainsi permettre d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes sous jacent. Ce projet permettra de montrer par quels mécanismes l’activité physique contribue à la prévention (ou limite) le développement de la fibrose pulmonaire. In fine la combinaisons des études clinique et in vivo chez l’animal permettront de mieux comprendre les effets de l’activité physique sur cette pathologie et de pouvoir tenir un discours de santé publique et de promotion de l'activité physique dans le cadre de la prévention des pathologies respiratoires fibrosante.
Procédures
La réalisation de ce projet nécessite la réalisation d'un entrainement sur tapis roulant (1h/jour, 5jours par semaine pendant 4 semaines) et l'induction d'une fibrose pulmonaire (21jours). Pour cela, après les 4 semaines d'entrainement, l’induction de la fibrose pulmonaire sera assurée par l’administration d’un agent pro-fibrosant sous anesthésie générale (durée 10 min). Au sein de chaque groupe la ventilation (inspiration/expiration) sera évaluée sur des souris vigiles (durée 1h). Suite à cela la capacité du poumon à se rétracter et à se distendre sera réalisée après anesthésie (durée 10 min). Enfin les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.
Impact sur les animaux
L’administration de bléomycine par la trachée n'entraîne aucune lésion ni douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le tissu fonctionnel pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30 pour cent. Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux d’anesthésie seront ajustés en temps réels en fonction des réactions de l’animal afin d’éviter les risques anesthésiques. Pour inciter les souris à courir, le tapis est doté d’un système utilisant un stimulus aversif. L’entrainement est stoppé dés lors que la souris refuse de courir. Lentrainement et l'évaluation de la ventilation peuvent occasionner un stress.
Devenir
A la fin de la période de maintien ou en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Remplacement
La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes induit par l’activité physique sur la fibrose pulmonaire peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Le nombre total d'animaux impliqué est de 400. Le modèle murin de fibrose pulmonaire utilisé dans ce projet est à l’heure actuelle le mieux décrit dans la littérature et le plus utilisé. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes donc basé sur la littérature existante ainsi que sur nos résultats précédent afin de prendre en compte les effet du traitement pro-fibrosant et la potentielle variabilité des variables physiologiques entre les différents individus. Ainsi La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront maintenues par groupes sociaux de 4 individus dans des conditions réglementaires d'hébergement. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'instillation intra-trachéale de bléomycine, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'à leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale de Bléomycine et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé aux animaux afin de faciliter l’alimentation et leurs récupérations dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: relâchement musculaire, perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, perte du réflexe palpébral et respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance que pourrait ressentir les animaux. En cas d'atteinte des points limites, les animaux seront euthanaisés.
Choix des espèces
Ce projet nécessite de réaliser un entrainement aérobie, d'induire une fibrose pulmonaire, de réaliser des explorations fonctionelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Notre choix c'est porté sur la souris car le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instilation intratrachéale de bléomycine est un modèle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et il a permis la description de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques. Pour réaliser nottre projet, nous avons besoin que le système respiratoire soit mature et fonctionnel. D'autre part, les souris jeunes sont peu sensibles à la bléomycine comparées aux souris âgées et il est bien décrit dans la littérature que les souris C56Bl/6J âgées développent une fibrose pulmonaire sévère avec un risque de surmortalité important. En tenant compte de ces informations, le compromis qui a été choisi est un âge de 8 semaines.
Evaluation de l’éfficacité d’immunotherapies à base de cellules CAR-T innovantes contre cellules tumorales.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Deux injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T sous anesthésie ouvrent le protocole, suivies chaque semaine d'une injection dans l'abdomen et de huit minutes d'anesthésie gazeuse pour photographier la tumeur, pendant quatre à six semaines. 5 600 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec un prélèvement sanguin trois semaines après l'injection des cellules CAR-T et des pesées hebdomadaires. La tumeur peut provoquer douleur, mobilité réduite, perte de poids et prostration. Les souris jugées inaptes lors de la constitution des groupes sont tuées aussitôt, les autres au gaz carbonique avant tout point limite, à la fin de la période ou dès que l'objectif scientifique est atteint.
Objectifs
L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, exploite les mécanismes naturels du système immunitaire pour combattre diverses maladies, notamment le cancer. Une approche importante de cette thérapie consiste à isoler des cellules du système immunitaire du patient (les lymphocytes T) et à les modifier génétiquement pour les rendre capables de reconnaitre et cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après culture et expansion en laboratoire, ces cellules modifiées connues sur le nom de CAR-T, sont réintroduites dans le patient, où elles traquent et détruisent sélectivement les cellules cancéreuses, constituant ainsi une approche innovante et un espoir dans le traitement du cancer. En effet, les cellules CAR-T sont désormais un élément essentiel de la prise en charge des patients atteints de cancers, tout comme la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et autres thérapies ciblées. Et pour cause, elles ont démontré des résultats cliniques remarquables dans le traitement des cancers du sang en rechute ou résistants aux traitements classiques, et sont en cours de développement pour les tumeurs solides. Malgré leurs succès, les cellules CAR-T présentent des défis et des limites. Des recherches actuelles visent à améliorer ces cellules en utilisant des manipulations génétiques pour réduire leur toxicité, les rendre plus durables dans le corps et prévenir leur perte d’efficacité anti-tumorale au fil de temps. De nombreux partenaires, faisant appel à notre expertise, s'efforcent à comprendre et à évaluer les conséquences des modifications génétiques spécifiques introduites dans les cellules CAR-T sur leur efficacité dans la lutte contre les tumeurs. Ils cherchent également à étudier comment les cellules CAR-T interagissent avec d'autres traitements potentiels tels que des médicaments ou des anticorps pour contrôler la progression des tumeurs. Pour ce faire, après la conception et la modification génétique de variants spécifiques de cellules CAR-T, nous évaluerons leur réponse anticancéreuse en les caractérisant d'abord dans le laboratoire (in vitro), puis en suivant leur évolution et en étudiant leur fonctionnement dans un modèle ronger (in vivo) greffé avec des lignées cancéreuses d’origine humaine. L’évaluation fonctionnelle in vivo est cruciale pour valider l'efficacité thérapeutique préclinique des différents variants de cellules CAR-T dans le traitement de différents types de cancers chez l'homme.
Bénéfices attendus
Bien que les cellules CAR-T, approche thérapeutique en plein essor, offrent des avantages significatifs dans le traitement de certains types de cancer, elles font face à plusieurs défis et limitations. Pour mieux comprendre le fonctionnement de ces cellules, des études expérimentales approfondies et des essais précliniques sont nécessaires Les traitements ciblant spécifiquement les tumeurs avec des cellules CAR-T peuvent parfois entraîner des effets secondaires sérieux, comme une réponse inflammatoire sévère et des problèmes neurologiques. De plus, ces thérapies peuvent être limitées par la durée pendant laquelle les cellules CAR-T restent actives dans le corps, la complexité de l'environnement autour de la tumeur et le manque d'antigènes spécifiques aux tissus cancéreux et n’étant pas exprimés sur les tissus sains du patient. Malgré les avancées dans le développement de différentes générations de cellules CAR-T, les progrès technologiques offrent de nouvelles possibilités pour améliorer encore leur efficacité et leur tolérance chez les patients. Dans le domaine de la recherche sur les cellules CAR-T, les modèles murins de greffes de cellules tumorales humaines sont extrêmement importants. Ils fournissent une plateforme pour étudier différents aspects, tels que la façon dont les cellules CAR-T reconnaissent les cibles tumorales, comment elles s'activent, leurs mécanismes d'action, leur durée d'activité, et comment elles sont tolérées. En recréant des conditions similaires à celles des patients atteints de cancer, ces modèles offrent un environnement expérimental précieux. En outre, ils reproduisent la diffusion et la migration des cellules CAR-T dans tout le corps, contribuant ainsi à une meilleure compréhension des réponses thérapeutiques et des interactions complexes entre cellules dans le contexte du traitement du cancer.
Procédures
Les souris seront soumises à divers actes de manipulation tout au long de ce projet, à savoir : 2 injections uniques de cellules par voie intraveineuse sur animal anesthésié au début de projet (
Impact sur les animaux
La durée de chaque étude inscrite dans ce projet est de 4-6 semaines, en fonction du type de tumeur ciblée et du temps nécessaire à sa croissance. Au cours de cette période, les animaux seront soumis à plusieurs procédures techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress, tels que : injections de cellules tumorales, injection de cellules CAR-T, suivi tumorale par imagerie ou par pied au coulisses, prélèvement sanguin (1 seul prélèvement de sang 3 semaines après l’injection de cellules CAR-T) et des pesées hebdomadaires. Des effets indésirables liés à la croissance tumorale pourraient apparaître : douleur, mobilité réduite, perte de poids, prostration. Cependant, nous avons mis en place des points limites pour minimiser la gêne et l'inconfort des animaux causéx par la présence de la tumeur. En cas de persistance de ces signes l’animal sera mis à mort. Tous les actes techniques sur les souris seront réalisés par du personnel expérimenté et spécialisé dans ces techniques afin de limiter les contraintes subies par l’animal, ce qui garantit leur bien-être tout au long des étapes expérimentales
Devenir
Au début de notre étude, lors de la constitution des différents groupes d’animaux en expérimentation (randomisation), ceux qui ne remplissent pas les conditions requises pour que la tumeur se développe correctement seront euthanasiés immédiatement. L'euthanasie par inhalation de CO2 sera appliquée à tous les animaux de l'étude avant d'atteindre tout point limite éthique, à la fin de la période expérimentale, ou dès que l'objectif scientifique est accompli.
Remplacement
Nous étudions attentivement comment différents modèles de cellules CAR-T, qui sont des cellules immunitaires modifiées pour combattre les cellules cancéreuses, fonctionnent. Pour ce faire, nous effectuons plusieurs tests pour comprendre à quoi elles ressemblent (leur phénotype) et comment elles agissent (leur fonction). Cependant, ces tests ont leurs limites car ils sont réalisés dans des conditions de laboratoire, en utilisant des plaques de culture où les cellules CAR-T sont mises en contact avec des cellules tumorales. Malgré toute l’information qu’il nous apporte, ce système en laboratoire est très simplifié et ne prend pas en compte de nombreux éléments importants qui existent dans le corps humain, notamment l'environnement complexe autour des tumeurs. Pour vraiment comprendre comment ces cellules CAR-T pourraient fonctionner chez les personnes, en l’occurrence chez les patients atteins de cancers, il est nécessaire de les étudier dans un organisme vivant, tel quel un modèle murin, qui reproduit de manière plus réaliste les conditions que l'on trouve chez les humains. En utilisant des souris, nous pouvons confirmer comment les cellules CAR-T agissent et si elles peuvent surmonter les défis rencontrés dans l'environnement autour des tumeurs. Ces défis incluent un réseau complexe de différentes cellules, de signaux moléculaires, de vaisseaux sanguins, et d'autres éléments qui interagissent de manière dynamique et qui peuvent limiter l'efficacité des cellules CAR-T. Ces interactions sont difficiles à reproduire de manière réaliste en laboratoire. En résumé, étudier ces cellules dans des organismes vivants nous aide à choisir les cellules CAR-T qui sont les plus prometteuses pour le traitement du cancer, en éliminant celles qui ne montrent pas d'activité anticancéreuse. Cela nous donne une base solide pour continuer notre recherche et pouvoir apporter ainsi du rationnel scientifique pour le développement des traitements plus efficaces contre le cancer.
Réduction
Dans la première étape de ce projet, nous étudions et vérifions l’activité anti-tumorale des diverses versions de cellules CAR-T face à un ou plusieurs modèles de tumeur, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations sur des souris. Cela signifie que nous essayons de faire le moins d'essais possible et d'utiliser le moins d'animaux nécessaires, tout en faisant en sorte de garantir la fiabilité de nos résultats. Nous considérons également d’autres éléments nous permettant de réduire le nombre de souris en expérimentation, notamment : a) l’analyse de plusieurs groupes d’étude en même temps avec un seul groupe témoin ; b) le suivi de la croissance de tumeurs chez les souris par imagerie spécial (bioluminescence), ce qui permet de réduire le nombre d'animaux étudiés, car les images peuvent être extraites des mêmes sujets au fil du temps sans avoir à sacrifier l’animal pour mesurer la croissance des tumeurs ; c) les types de lignées de cellules cancéreuses que nous utilisons ont été étudiés en détail, ce qui nous permet de déterminer la quantité optimale de cellules à injecter pour que la tumeur se développe, réduisant ainsi le nombre de groupes d’animaux nécessaires pour tester différentes quantités de cellules tumorales.
Raffinement
Les animaux utilisés dans les expériences seront hébergés dans un environnement dédié, appelé zone EOPS, dans des cages par groupes de 5 au maximum, du même sexe, avec suffisamment d'espace pour se déplacer librement et un accès libre à la nourriture et à l'eau. Pour rendre leur habitat plus agréable, nous enrichirons leurs cages en ajoutant de la litière en copeaux de bois stérilisée, une maisonnette en carton pour qu'ils aient un endroit où se cacher, ainsi que des morceaux de papier Kraft ou "Sizzle Pad" qu'ils pourront grignoter pour construire un nid. Un temps d’adaptation d’une semaine minimum sera également respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Pour limiter les effets de stress et de douleur des animaux, les interventions telle que les injections de cellules tumorales et de cellules CAR-T seront réalisées sous anesthésie. Une surveillance quotidienne sera effectuée pour repérer tout signe de détresse ou de souffrance chez les souris, et des mesures appropriées seront immédiatement prises Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons une grille de notation qui prend en compte leur comportement naturel, leur comportement en réponse à certaines situations, les changements de poids, ainsi que les caractéristiques expérimentales, comme l'apparence et la taille des tumeurs. Si les scores atteignent des seuils critiques préétablis, cela pourrait entraîner l'euthanasie de l'animal. Toutes les personnes impliquées dans ce projet ont les qualifications nécessaires et ont démontré les compétences requises pour manipuler les animaux de manière éthique. Pour suivre la croissance des tumeurs, nous utiliserons principalement une méthode non invasive appelée bioluminescence in vivo sous anesthésie gazeuse. Si nécessaire, nous effectuerons des mesures régulières à l'aide d'un pied à coulisse.
Choix des espèces
Le projet nécessite l'utilisation d'une espèce animale dont le fonctionnement interne (physiologie) se rapproche le plus de celui de l'Homme ce qui justifie notre choix d'utiliser des souris comme modèle. Les souris présentent une similitude génétique élevée avec les humains, avec 99% de leurs gènes correspondants à ceux de l'homme. Cela signifie que les résultats obtenus lors des études sur les souris sont plus susceptibles de refléter les réponses biologiques humaines. Actuellement, l'utilisation de souris immunodéficientes (agées de 8 semaines), répresent un avantage majeur pour notre approche, en raison de leur déficit immunitaire profond, facilitant ainsi la prise de greffe de cellules immunitaire et de cellules tumorales, toutes les deux d’origine humaine. Ceci offre la possibilité d'évaluer les immunothérapies avec des cellules CAR-T humaines dans un modèle de souris. En outre, les souris sont des animaux de petite taille, qui se reproduisent rapidement et sont faciles à élever en laboratoire.