Souris
Développement d’un nouveau système de régulation génique contrôlé par la nutrition. Application à un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des métastases hépatiques implantées par chirurgie, un jeûne de dix à douze heures suivi d'une nuit de régime carencé en un acide aminé indispensable, l'isolement en cage individuelle pour contrôler les prises alimentaires, deux séances d'imagerie par semaine avec un trajet de quatorze kilomètres à chaque fois: 1 845 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 686 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La rubrique consacrée aux atteintes ne dit rien des métastases elles-mêmes. Elle décrit des piqûres qui "génèrent des douleurs courtes et légères", une opération de trente minutes après laquelle "les souris récupèrent rapidement", et un isolement compensé par un tube rouge et une bille métallique. Toutes sont tuées, celles qui portent des métastases ou des tumeurs pour que le foie ou la tumeur soit analysé, les autres parce qu'elles ne peuvent pas être réutilisées.
Objectifs
Nos recherches ont pour but d’étudier les mécanismes d’adaptation à un stress nutritionnel chez les mammifères. Au cours de la dernière décade, nous avons démontré, dans des cellules en culture, le rôle clé joué par une voie de signalisation endogène dans la réponse à différents stress incluant la carence en acides aminés. En particulier, nous avons mis en évidence que cette réponse nécessite la fixation d'un facteur de transcription à un élément ADN de régulation. Ce mécanisme entraîne l’activation de la transcription de gènes cibles spécifiques. L’ensemble de ces résultats nous a permis de concevoir un système d’expression génique inductible (comprenant plusieurs copies d’éléments ADN de régulation) contrôlable par une manipulation nutritionnelle. Nous avons mis au point (i) un promoteur artificiel fortement inductible par une carence en un Acide Aminé Indispensable (AAI) encapsulé dans un vecteur de thérapie génique et (ii) une nourriture déséquilibrée en AAI qui entraîne une forte baisse de la concentration sanguine de l’AAI limitant et qui permet l’induction du transgène. En utilisant le gène rapporteur luciférase, nous avons apporté la preuve de concept de la fonctionnalité de ce système d’expression inductible. Notre technologie a permis de lever une limitation majeure à l'utilisation de la thérapie génique qui est la nécessité de moduler de manière non toxique l'expression d’un transgène en termes de durée et de niveau d'expression. ll est maintenant nécessaire de valider notre système de régulation génique dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Pour son intérêt médical, sa faisabilité, et son transfert rapide en médecine humaine, nous avons choisi le modèle des Métastases Hépatiques du Cancer Colorectal (MHCC). En effet, (1) elles concernent 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans, (2) nous avons montré que notre voie de régulation est très réactive dans le foie et (3) l’utilisation de notre technologie apportée par un vecteur viral nous a déjà permis de valider l’efficacité de l’expression d’un gène pro-apoptotique ciblant les tumeurs sur des xénogreffes de souris. Notre objectif est donc de montrer que l’induction contrôlée du gène pro-apoptotique permet de traiter les MHCC et de montrer l’effet synergique avec les molécules de chimiothérapie déjà utilisées en clinique.
Bénéfices attendus
La validation de la fonctionnalité de notre technologie dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal est une étape importante dans le transfert de cette technologie à l’Homme. In fine, les bénéfices attendus sont le traitement des patients qui ont subi des chimiothérapies inefficaces et qui ne répondent malheureusement pas aux immunothérapies actuelles.
Procédures
Les souris seront soumises à des prises de sang (sur animal vigile, 2 à 3 fois au cours de l’expérimentation, et jusqu’à 10 fois par an et demi pour les souris qui seront suivies sur le long cours). Elles auront également une injection de vecteurs de thérapie génique sur animal vigile, et elles seront soumises à un protocole nutritionnel impliquant une phase de jeûne sur la journée (période de repos chez les souris), suivi d’une période de consommation d’un régime carencé en un acide aminé indispensable sur la nuit (période active), et enfin consommation d’un régime contrôle de récupération sur 24h, ceci de façon à pouvoir induire la production de la protéine médicament. Ce traitement sera complété par des injections sur animal vigile d’un anticorps (3 à 5 injections par souris) et/ou d’un traitement de chimiothérapie (1 à 3 injections par souris) afin d’en évaluer l’effet combiné. Selon le modèle d’expérimentation, une procédure chirurgicale sera réalisée pour implanter les métastases hépatiques (sous anesthésie et analgésie, l’opération dure environ 30 min) ou une injection de cellules cancéreuses sous la peau sera réalisée sur animal vigile. Si l’état général des souris le permet, 2 analyses bioluminescentes par semaine seront effectuées grâce à un bioimageur. Ces mesures permettront de suivre le développement des métastases bioluminescentes de manière non invasive. Elles nécessitent un transport depuis leur lieu d’hébergement vers le plateau d’imagerie situé à 14 km, une double injection d’une protéine nécessaire à l’émission de bioluminescence sur animal vigile 10 minutes avant la mesure (au total 300 µL injectés), et une anesthésie afin qu'elles restent immobiles pendant la mesure.
Impact sur les animaux
(1) Afin de faire un contrôle individuel de la consommation du régime carencé, il est nécessaire d’isoler les animaux (un animal par cage). Une période d’habituation et un enrichissement du milieu sont mis en place pour réduire le stress qui peut survenir en cas d’isolement des congénères. (2) L’induction de la protéine médicament nécessite une période de jeûne de 10h à 12h (qui a lieu sur la journée, période où les souris sont en phase de repos) suivi d’une période de consommation du régime carencé de 12 à 14h (sur la nuit, pendant leur période active). (3) La chirurgie nécessaire à l’implantation des métastases pouvant causer de la douleur, elle est réalisée sous anesthésie et analgésie. L’opération dure 30 min et les souris récupèrent rapidement (comportement normal dans les heures qui suivent). (4) Les piqûres (prises de sang, injections) génèrent des douleurs courtes et légères. Ces gestes techniques rapides sont réalisés par du personnel expérimenté afin de réduire stress ou douleur et sont réalisés dans le respect de la réglementation pour ce qui concerne les volumes et la fréquence de prélèvement ou d’injection.
Devenir
Chaque procédure impliquera une mise à mort des animaux, à plus ou moins long terme, selon les expérimentations. En effet, pour les procédures impliquant des métastases ou des tumeurs sous-cutanées, il est nécessaire de mettre à mort à l’animal afin d’étudier soit le foie soit les tumeurs sous-cutanées, et d’évaluer ainsi l’efficacité du traitement. Les procédures ne nécessitant pas de générer des métastases ou des tumeurs sous-cutanées nous permettent de garder les animaux en vie plus longtemps, afin d’étudier la stabilité de l’inductibilité du transgène. Néanmoins, nous ne pourrions pas les réutiliser pour d’autres projets, aussi, ils seront mis à mort à l’issue des expérimentations.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires ont été réalisées in vitro sur plusieurs lignées de carcinome colique. Elles ont permis tout d'abord de tester l'efficacité de TRAIL pour induire la mort cellulaire des cellules d’intérêt, puis de tester l’effet de la combinaison de TRAIL avec l'anticorps MD5 (dirigé contre le récepteur de TRAIL), et enfin de sélectionner une série de molécules capables de faciliter l'action apoptotique de TRAIL couplé à MD5, dont celles utilisées en clinique (5-Fu + Oxaliplatine). Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons choisi de faire des études pilotes avec un petit nombre d’animaux, de manière à valider ou infirmer des paramètres clés qui seront décisifs pour les études à plus grande échelle. Les nombres d’animaux indiqués dans les procédures sont néanmoins évalués au maximum, si toutefois les premiers essais n’étaient pas concluants et que nous étions amenés à en faire de nouveaux avec d’autres doses notamment. Pour ce qui concerne les procédures impliquant des métastases, celles-ci ayant une grande diversité inter-individuelle, nous ne pouvons pas réduire le nombre d’animaux par groupe, en effet, un trop faible nombre d’animaux ne nous permettrait pas de conclure de manière fiable. En revanche, nous avons choisi de transformer les cellules afin qu’elles expriment la luciférase de manière constitutive. Une imagerie in vivo nous permet de suivre le développement des métastases sans sacrifier l’animal, grâce à une méthode non invasive, permettant ainsi d’obtenir plus d’information sans augmenter le nombre d’animaux. Pour ce qui concerne les études de clairance ou encore d’évaluation de la stabilité de l'inductibilité de du transgène, nous avons choisi de faire une étude longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Afin de diminuer le stress dû à l’isolement des animaux, une période d’habituation et un enrichissement du milieu sont mis en place (tube rouge, bille métallique, et/ou coton pour nidification). La chirurgie pour la génération du modèle de MHCC est réalisée en prenant plusieurs dispositions pour diminuer l’inconfort et la douleur et augmenter le bien-être animal : elle est réalisée 1) sous anesthésie et analgésie afin de limiter la douleur, 2) sur une peau précédemment tondue et désinfectée afin de limiter toute infection, 3) sur un tapis chauffant de manière à pallier au manque de thermorégulation qui se produit sous anesthésie, 4) en appliquant un collyre pour éviter le dessèchement des yeux pour pallier à l’absence de clignement des yeux qui se produit également sous anesthésie. Si un animal présentait un état douloureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en œuvre du projet, et mis à mort si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Il existe en effet un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal décrit dans la littérature, qui mime relativement bien ce qui se passe chez l’Homme. Ce modèle permet d’obtenir rapidement des métastases, dont on peut suivre la croissance par mesure de bioluminescence. Stade adulte (3-4 mois) afin de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.
Imagerie cellulaire et moléculaire in vivo pour l’évaluation de thérapies visant à moduler l’inflammation dans des modèles rongeurs (souris et rat) d’accident vasculaire cérébral (AVC)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 84
L'introduction d'un filament dans la carotide pour provoquer un accident vasculaire cérébral tue moins de dix pour cent des animaux opérés dans les soixante-douze heures, par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne. 126 souris et 84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux gardés en vie jusqu'à six semaines avant une imagerie terminale. Les chirurgies d'une heure sous anesthésie générale injectent dans le cerveau soit un lipopolysaccharide bactérien pour déclencher une neuroinflammation, soit un peptide vasoconstricteur pour rétrécir les vaisseaux, et certains animaux subissent une seconde opération deux semaines plus tard. Le choix des espèces tient à la résolution d'imagerie pour les rats, dont le cerveau est plus gros, et pour les souris au coût des nanoparticules d'oxyde de fer et des anticorps.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. L’AVC induit une réaction inflammatoire qui contribue de manière importante aux lésions cérébrales. Le suivi par imagerie in vivo de cette réaction inflammatoire permettrait de mieux comprendre sa dynamique spatio-temporelle et d’évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à la moduler. Pour cela, nous proposons de développer une approche en imagerie cellulaire et moléculaire in-vivo. L’objectif de l’imagerie cellulaire est de pouvoir suivre des cellules d’intérêt dans le cerveau : soit des cellules ayant des propriétés thérapeutiques visant à moduler l’inflammation (telles que les cellules souches issues du tissu adipeux) soit des cellules du système immunitaire (telles que les macrophages). L’imagerie moléculaire vise à suivre l’expression de récepteurs impliqués dans la réponse inflammatoire à un AVC, telles que les molécules d’adhésion qui permettent l’entrée de cellules immunitaires dans le cerveau. Les modalités d’imagerie utilisées pour ces développement méthodologiques seront les mêmes que celles qui peuvent être utilisées chez l’humain : imagerie par résonance magnétique (IRM) et scanner X. Le développement de telles techniques d’imagerie ouvrirait la voie à un suivi non-invasif des cellules et des récepteurs de l’inflammation, qui pourrait être répété dans le temps. Le but à plus long terme est de transférer ces méthodes chez l’humain, pour une meilleure prise en charge des patients présentant un AVC.
Bénéfices attendus
L’accident vasculaire cérébral est une maladie invalidante chez l’adulte. Ce projet permettra de mieux comprendre la réaction inflammatoire associée ainsi que le devenir des cellules thérapeutiques, dans des modèles rongeurs (rats et souris) plus simples à mettre en oeuvre et à standardiser que le modèle classique qui procède via une occlusion artérielle mécanique avec un filament. Ces aspects inexplorés du modèle animal permettront ensuite de définir des biomarqueurs d’imagerie utiles pour évaluer les approches thérapeutiques visant à moduler l’inflammation. Ces biomarqueurs seront à terme utilisables chez l’humain puisque le transfert en clinique des techniques d’imagerie utilisées dans ce projet est à l’étude.
Procédures
L’infusion locale du LPS (solution de lipopolysaccharide, molécule d’origine bactérienne provoquant une inflammation) induisant la neuroinflammation ou du peptide vasoconstricteur spécifique (rétrécissant le diamètre des vaisseaux sanguins) mimant l’ischémie cérébrale nécessite une injection stéréotaxique. Le modèle d’AVC transitoire nécessite l’introduction d’un filament par la carotide. Ces chirurgies, permettant de réaliser ces différents modèles d'AVC, sont réalisées sous anesthésie générale et dure au maximum une heure. Chaque animal subit une seule chirurgie de durée maximale d'une heure. Certains animaux recevront les cellules thérapeutiques par voie intracérébrale et subiront pour cela une deuxième chirurgie sous anesthésie générale deux semaines après la réalisation du modèle. Cette seconde chirurgie dure au maximum une heure.
Impact sur les animaux
Suite à cette chirurgie permettant de réaliser ces différents modèles, une perte de poids minime (
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever le cerveau et réaliser des analyses post-mortem (imagerie ex vivo, microscopie).
Remplacement
Les agents de contraste seront d’abord testés dans des modèles in-vitro : les cellules thérapeutiques sont marquées avec les nanoparticules par incubation puis placée dans un tube Eppendorf et imagées en IRM et en imagerie X. Cela permettra de réaliser une première sélection des agents de contraste d’intérêt. Néanmoins le contraste va dépendre également du microenvironnement (inflammatoire) et de la métabolisation des agents de contraste in-vivo : il nous apparaît donc indispensable de tester les cellules marquées avec les meilleurs agents de contraste (4 au maximum) chez l’animal vivant. Les cerveaux des animaux des cinq procédures seront prélevés pour l’imagerie post-mortem à l’aide de techniques innovantes basées sur les rayons X (scanner spectral à comptage de photon, imagerie de contraste de phase, de champ sombre et du k-edge avec le rayonnement synchrotron). Ces imageries ex-vivo viendront apporter des informations précieuses avant le développement in-vivo de ces nouvelles approches. Par ailleurs, les images issues de ces expérimentations seront mises en ligne à disposition de la communauté de manière anonyme sur une plateforme collaborative, afin de pouvoir être exploitées plus largement.
Réduction
L’avantage de l’imagerie in-vivo est qu’elle permet des études sur l’animal vivant plutôt que d’avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude bibliographique de la variabilité du modèle. Des groupes expérimentaux de 6 animaux (3 mâles et 3 femelles) seront typiquement utilisés pour ce projet à caractère exploratoire. Si certaines conditions expérimentales ne fournissent pas un signal suffisant pour être détecté (problème de sensibilité), alors l’inclusion sera stoppée. Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus que les cerveaux pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
Le modèle animal d’inflammation cérébrale focale provoquée par l’injection intracérébrale de lipopolysaccharide (LPS) est utilisé car il est moins invalidant pour les animaux que le modèle d’AVC et il est bien approprié pour les études d’imagerie. Il crée une lésion cortico-striatale qui occasionne des troubles sensori-moteurs mineurs et transitoires du côté contralatéral à la lésion (faiblesse des pattes, perte de sensibilité des vibrisses). Néanmoins les animaux continuent de s’alimenter normalement (récupération du poids pré-opératoire dans les 3 jours qui suivent la chirurgie, pas de perte de poids en comparaison avec les animaux sains à plus long terme) et à avoir une activité normale. Dans un second temps, nous allons évaluer si les modèles d’injection intracérébrale de peptide vasoconstricteur et de LPS peuvent nous fournir des informations pertinentes du point de vue de l’imagerie et donc se substituer aux modèles d’AVC, car ils ont l’avantage de limiter le handicap et la mortalité des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane) avec un traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), une thermorégulation continue, et une hydratation sous-cutanée. Une grille dédiée au codage des expressions faciales spécifique à un modèle animal (souris ou rat) permet d’identifier les signes de la souffrance post-opératoire afin de la traiter. La salle d’évaluation neurofonctionnelle a été installée dans un endroit dédié et calme avec une lumière rouge afin de ne pas agresser les yeux des animaux albinos. En soins post-opératoires, nourriture et boisson sous forme gélifiée sont mises à disposition de l'animal pour faciliter leur hydratation, en plus de la nourriture et boisson habituelles. Les groupes sociaux sont conservés (isolement limité au réveil complet de l’animal, sauf en cas d’agressivité constatée). L’évaluation de l’état des animaux est réalisé une heure après la chirurgie et pendant une semaine suivant la chirurgie. Un score de l’état de l’animal est déterminé à l’aide d’une grille de score inspirée des études de raffinement de la procédure post-opératoire d’une chirurgie stéréotaxique, qui permet une évaluation de l’état de l’animal et l’identification des points limites.
Choix des espèces
Les rats sont utilisés car l’imagerie cérébrale de cette espèce a une meilleure résolution en comparaison avec celui de la souris, en raison de la plus grosse taille de cerveau. Nous allons travailler avec des rats Sprague Dawley chez qui le modèle de LPS est bien maîtrisé par notre équipe. Les souris sont utilisées en raison en raison du coût des certaines particules d'oxyde de fer (marquées à la rhodamine fluorescente) et du coût des anticorps (pour la fonctionnalisation des particules d’oxyde de Fer). Les souris utilisées pour cette étude seront des souris C57Bl6 car notre équipe a une expérience extensive de l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVC. Des souris Swiss pourront être utilisées afin de faciliter la pose d'un cathéter veineux. Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (jeunes adultes) : la maturité cérébrale sera atteinte et le poids sera suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste. Rats : 250-300 g à T0 et souris : 25-30 g à T0.
Effet de substances psychoactives sur le comportement de souris face à un nouvel environnement
- Enseignement supérieur
Gardées vivantes entre deux séances espacées de quinze jours, avec inversion des rôles entre les souris témoins et celles qui reçoivent une substance psychoactive, puis tuées à la fin du projet: 62 souris vont être utilisées dans des travaux pratiques d'enseignement supérieur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. 48 d'entre elles proviennent d'un autre projet pédagogique. Chaque séance les expose à quatre tests de cinq minutes, exploration d'un environnement inconnu et exposition au vide, sous l'effet d'une substance sédative ou excitante. Cette demande est un report: les souris prévues pour la séance précédente ont été tuées après la contamination de l'animalerie par un virus, et le porteur indique qu'à l'issue des manipulations les animaux seront soit gardés en vie pour un autre projet, soit tués.
Objectifs
Demande de prolongement d'autorisation suite à une contamination de l'animalerie par le virus MPV1. Projet émanant de l'AP n°33890-2021111201246907 v6 se terminant le 25/02/2024 : suite à une contamination de l'animalerie par le virus MPV1, les animaux prévus pour ce TP ont été euthanasiés et le temps de la décontamination, de la semaine de quarantaine / d'adaptation et de l'habituation ne permet pas de réaliser cet enseignement dans le calendrier prévu initialement. Il est donc demander un report de l'AP donnée initialement : aucun changement de protocole n'a été apporté par rapport la DAP initiale hormis le nombre d'animaux qui a été mis à jour. souris face à un nouvel environnement. Elle s’inscrit dans la continuité d’une séance de formation ayant montrée l’influences de variations de facteurs environnementaux sur des paramètres physiologiques pour les bonnes pratiques dans l’expérimentation animale sur animaux vigiles. Les comportements étudiés sont : • Les capacités naturelles d’exploration de l’animal • Sa réaction d’explorer ou non un espace exposé au vide Plusieurs tests comportementaux sont utilisés sur des durées de 5 minutes. Pour la mise en place de cette expérimentation, les animaux suivront une période préalable d’une semaine d’habituation à la préhension. Les animaux sont stabulés en groupe dans une cage enrichie en copeaux de cartons, dôme et tunnel. Les limites de ces manipulations sont définies par des signes tels qu’une agitation importante, une agressivité, une diminution de la ventilation, une prostration. Dans ce cas l’animal ne sera plus manipulé. Un nombre total de 62 souris sur 2 ans seront manipulées dont 48 sont issues d’un autre projet (2021111120255612). A la fin de la procédure, les animaux seront soit gardés en vie pour un autre projet pédagogique ou de recherche ou dans le cas contraire euthanasiés.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de montrer que des substances psychoactives peuvent influencer le comportement exploratoire des souris. Cette manipulation vise à mettre en pratique des méthodes d’études comportementales, à acquérir les compétences ou les éléments de qualification professionnelle, des méthodes de travail et de se sensibiliser à la recherche.
Procédures
Les animaux seront exposés à des stimuli désagréables (exposition au vide, à des environnements inconnus) qui seront brièvement associés à une angoisse légère tout en gardant la possibilité de progresser ou non à ces nouveaux environnements. Nombre : 4 tests Durée de chaque test : 5 min
Impact sur les animaux
Les animaux seront exposés à des stimuli désagréables (exposition au vide, à des environnements inconnus) qui seront brièvement associés à une angoisse légère tout en gardant la possibilité de progresser ou non dans ces nouveaux environnements. Durant les tests, une vigilance particulière sera portée : • Sur les modifications de comportement : les limites de ces manipulations seront définies par des signes tels qu’une agressivité, de la stéréotypie ou une prostration. Dans ce cas l’animal ne sera plus manipulé et remis en cage sous surveillance. • Sur le calme dans les salles de manipulation tant au bruit de fond sonore qu’aux mouvements des personnes.
Devenir
Les animaux sont gardés vivants pour un seconde période de manipulation à 2 semaines d'intervalle dans le même projet avec inversion des statuts des souris : les contrôles deviennent les animaux exposés à des substances psychoactives et réciproquement A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les tests in silico ne peuvent pas prendre en compte les comportements exploratoires de la souris soumis ou non à différentes substances psychoactives ainsi que les méthodes et précautions indispensables à ces approches.
Réduction
Une seule souris sera manipulée par binôme. Les manipulations seront renouvelées par d’autres étudiants de la même cohorte au cours d’une autre séance dans un délai minimum de 2 semaines, temps nécessaire à l’oubli des tests précédemment réalisés. De plus il y aura inversion des statuts : les sujets contrôles de la 1ère séance deviendront les sujets soumis à une substance psychoactive et réciproquement. Tous les résultats seront mis en commun afin d’augmenter la valeur statistique de l’expérimentation tout en réduisant le nombre d’animaux. Pour ce projet 2/3 des animaux proviennent d’un autre projet pédagogique en cours d’autorisation (2021111120255612).
Raffinement
Durant une période d’une semaine les souris seront habituées aux manipulations nécessaires à l’étude comportementale. Cette habituation sera réalisée par le zootechnicien et le porteur du projet. Elle comprend : • la préhension, • le déplacement en salle • Après chaque manipulation la souris recevra une récompense (céréales) afin d’établir le renforcement positif et non une sensibilisation. Les animaux seront stabulés en groupe dans une cage enrichie en copeaux de cartons, dôme. Les animaux sont transportés en salle de manipulation 2h avant l’expérimentation, période d’acclimatation à ce nouvel environnement. Les souris utilisées, pour le 2/3 auront déjà eu un contact avec les mêmes étudiants ainsi que dans les salles d’enseignements ce qui diminue l’influences des variations des facteurs environnementaux. Par séance, 1 souris en plus des 8 manipulées restera en cage dans le cas où une des souris manipulées montrerait des signes d’angoisse aigüe justifiant de l’arrêt de leur manipulation. Ces tests impliquant l’absence de contraintes importantes ainsi que le nombre d’individus testés par séance (2 contrôles, 6 soumises à une substance psychoactive) justifie cet unique animal surnuméraire. Lors des tests les précautions suivantes seront prises : • Alternance de test d’exposition au vide avec un test d’exploration. • Les structures des tests seront nettoyées à l’éthanol Le marquage individuel permet la mise en place d’un programme de rotation afin que chaque animal bénéficie d’un repos de 2 semaines entre 2 séances. Les animaux ayant été soumis à la substance sédative seront soit contrôles soit soumis à la substance excitante.
Choix des espèces
La souris faisant partie des animaux de laboratoire couramment utilisés, le choix de cette espèce s’impose pour la formation des futurs chercheurs. Animaux de même âge de 30 à 40g diminuant la variabilité de l'échantillon
Rôle des segments initiaux d’axones des neurones sérotoninergiques dans les troubles affectifs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Comprendre le rôle d'un segment de l'axone dans la régulation de la sérotonine, pour identifier une cible antidépressive: 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 320 un niveau sévère. Elles subissent un génotypage, une ou deux chirurgies cérébrales de trente minutes sous anesthésie générale, des injections de LSD qui provoquent des ébrouements, des injections d'hormone adrénocorticotrope et sept semaines d'hébergement individuel. Les tests sont détaillés, trois tests d'anxiété de cinq à trente minutes, un test d'apathie de dix minutes, deux tests de six minutes dont une suspension par la queue que le porteur décrit comme un stress important, trois jours de mesure d'anhédonie et une privation de nourriture de douze heures. L'isolement de sept semaines est présenté comme un "facteur indispensable" à l'induction de la résistance aux antidépresseurs, et le choix des rongeurs justifié par le fait qu'il s'agit des plus petits mammifères dont le cerveau reste "suffisamment homologue" à celui de l'être humain.
Objectifs
Avec un taux de 15 à 20 % pour la population générale, la dépression majeure est le trouble psychiatrique le plus fréquent. L’Organisation Mondiale de la Santé prédit que la dépression majeure va devenir la première cause d’handicap d’ici 2030. Cependant, malgré la grande variété de médicaments disponibles pour traiter cette maladie, deux problèmes majeurs restent encore non résolus : un tiers des patients ne répondent à aucun traitement, et il existe un délai de 3-8 semaines avant le début de la réponse thérapeutique. Ces questions mettent l’accent sur la nécessité d’intensifier les recherches afin de développer des traitements plus efficaces et d’accélérer la réponse antidépressive. Un déficit de sérotonine dans le cerveau serait une des causes neurobiologiques de cette maladie psychiatrique. L’objectif principal des traitements actuels est donc de rétablir des taux normaux de sérotonine. Le segment initial de l’axone (AIS) est un élément clé de régulation de l’activité électriques des neurones. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de l'AIS dans la régulation des neurones qui produisent la sérotonine. Ceci pourrait permettre de découvrir un rôle crucial de l’AIS dans la régulation de l’humeur et ainsi identifier une nouvelle cible pour le développement de stratégies thérapeutiques antidépressives innovantes.
Bénéfices attendus
Ces études devraient permettre de mettre en évidence le rôle du segment initial de l’axone (AIS) dans la régulation d'un neurotransmetteur, la sérotonine et des comportements émotionnels associés. La perspective à plus long terme sera de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles en agissant sur l’AIS. Enfin, nous croyons que les résultats du présent projet aideront à orienter les recherches futures axées sur les causes de la dépression.
Procédures
Ils subiront : 1 génotypage (30 secondes), 1 ou 2 chirurgies sous anesthésie générale d'environ 30 minutes. l'hébergement en individuel de 24 heures suite à une chirurgie. 7 semaines d’l'hébergement en individuel lors du modèle de l’hormone adrénocorticotrope suivi des tests comportementaux, 1 à 3 injections (10-20 secondes). Une suspension par la queue pendant 6 minutes. Les tests comportementaux utilisés ont pour finalité l’évaluation des conséquences de type anxieux (3 tests de 5 à 30 min), d’apathie (10 min), dépressif (2 tests de 6 min) et d’anhédonie (3 jours) chez un modèle de dépression résistante.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) après un génotypage et après l’injection des virus, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu pendant une semaine. Par la suite ils seront regroupés 4 par cage. 2) Les animaux subiront des administrations de substances actives comme le LSD entrainant des ébrouements. 3) Certains seront un par cage et recevront des injections de l’hormone adrénocorticotrope (substance dépressiogène). 4) Certains animaux seront exposés au test de suspension caudale qui induit un stress important pendant 6 minutes et au test d'éclaboussure qui induit un stress léger pendant 5 minutes. Certains animaux seront exposés au test d'alimentation induit par la nouveauté qui implique une privation de nourriture de 12h, ce qui peut engendrer du stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour vérifier l'efficacité de la stratégie de perturbation de l'AIS grâce des approches histologiques.
Remplacement
Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogenèse et de la synaptogenèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmacorésistants. Les souris génétiquement modifiées sont aujourd’hui le principal modèle animal pour l’étude du rôle de certaines protéines dans différentes fonctions biologiques. Dans ce projet, l’utilisation d’un modèle original de souris privées de l’ANK3 spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques permettra de déterminer le rôle de cette protéine sur le comportement émotionnel. Il n'existe pas d'outil équivalent dans une autre espèce. Ce rôle sera notamment déterminé dans un modèle validé d’exposition à l’hormone adrénocorticotrope. Ce modèle présente la particularité de conduire à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques. Les génotypes et traitements seront répartis de façon aléatoire dans les cages. La zone ciblée par les AAV étant très petite, nous prévoyons un maximum 20% d'animaux devant être exclus des analyses pour cause d'un défaut de ciblage de la zone d'injection. Pour les analyses comportementales nous comptons donc 10 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 8 dans l'analyse. Pour les expériences d'électrophysiologie, nous comptons 10 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 8 dans l'analyse. Pour les expériences ex vivo, les échantillons issus des seront regroupés et nous comptons 10 animaux par groupe pour pouvoir en inclure au moins 8 dans l'analyse. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes d'anxiété et de dépression seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de limiter le nombre total de tests à 3.
Raffinement
Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générales (Rompun+Kétamine) et l'analgésie est assurée par une injection de Bupracare. En cas de signes de douleur dans les heures/jours qui suivent, les animaux sont traités avec un anti-inflammatoire non stéroïdien (Metacam). Pour pallier à l'hébergement en individuel des animaux, facteur indispensable à l’induction du modèle de résistance, plusieurs enrichissements sont apportés dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton, igloo et buchette). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du modèle. Un monitoring du poids sera entrepris. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupe dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci (une grille de score et des points limites seront mis en place).
Choix des espèces
Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie Les souris génétiquement modifiées sont aujourd’hui le principal modèle animal pour l’étude du rôle de certaines protéines dans différentes fonctions biologiques. Dans ce projet, l’utilisation d’un modèle original de souris privées de l’ANK3 spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques permettra de déterminer le rôle de cette protéine sur le comportement émotionnel. Il n'existe pas d'outil équivalent dans une autre espèce. Ce rôle sera notamment déterminé dans un modèle validé d’exposition à l'hormone adrénocorticotrope. Ce modèle présente la particularité de conduire à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte. De plus, nous envisageons l’utilisation d’un modèle de résistance aux antidépresseurs chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.
Effets de différents candidats médicaments sur l’électroencéphalogramme et le comportement du rongeur vigile et instrumenté
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 2600
Opérés pour l'implantation d'un émetteur de télémétrie, deux heures de chirurgie, parfois d'un cathéter, puis isolés en cage individuelle de la fin de l'opération jusqu'à la fin des expériences, 1 150 souris et 2 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 600 d'entre eux seront tués, les 1 150 autres réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire. Le protocole mesure l'effet de candidats médicaments sur l'électroencéphalogramme d'animaux vigiles, avec des injections de phencyclidine qui provoquent des stéréotypies et des tests comportementaux dont la durée va de dix minutes à vingt-quatre heures, sans qu'aucun soit nommé. Parmi les bénéfices attendus, le porteur inscrit ceux qui reviendraient aux rats et aux souris eux-mêmes, sous la forme d'une "acquisition de connaissances sur l'espèce utilisée".
Objectifs
Le développement de médicaments pour le traitement des maladies du cerveau constitue un défi majeur du fait du manque de prédictivité des modèles comportementaux. Cela pourrait être amélioré par l'utilisation de techniques plus prédictives comme l’enregistrement de l'électroencéphalographie (EEG). L’enregistrement de l’EEG permet d'évaluer l'activité cérébrale via des électrodes. De plus, différentes études publiées montrent que l'EEG est altéré dans différentes pathologies du cerveau chez l'homme. La possibilité d'évaluer l'EEG chez le rongeur confère une valeur predictive importante à cette technique dans le cadre du développement de médicaments pour les maladies du cerveau. La combinaison de mesures EEG avec des mesures comportementales représente donc un intérêt important pour la recherche en neuroscience. Le but de ce projet est d'évaluer l'effet pharmacologique de candidat-médicaments sur l'EEG de repos ou lors de stimulations (visuelles/auditives) chez le rongeur vigile. Elles pourront éventuellement être complétées par des tests de comportement permettant d'évaluer l'activité locomotrice, l'intéraction sociale ou encore la mémoire. Ces mesures auront des applications majeures telles que l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité du médicament.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter diverses pathologies neurologiques (par exemple la schizophrénie, une pathologie humaine touchant 1% de la population mondiale). En fonction de leur mécanisme d'action, certains composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que les composés testés sont actifs ou d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat et souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.
Procédures
Les animaux seront sujets à une ou deux chirurgies pour implanter l'émetteur de télémétrie (2h) et le cathéter (20 minutes). Ces animaux seront isolés à partir de la fin de la chirurgie et ce jusqu'à la fin des expériences. Les animaux pourront être sujets à différentes administrations par voie intrapéritonéale (ip), sous-cutanée (sc) ou orale (po) (~1 min), intraveineuse (iv) (bolus: 1-2 min ou perfusion: 2min-4h) et également à des tests comportementaux (entre 10 min et 24h en fonction du test).
Impact sur les animaux
Les animaux seront susceptibles d'éprouver les nuisances suivantes : effets liés aux chirurgies d'implantation de l'émetteur ou du cathéter comme la perte de poids; stress ou douleurs liés aux injections par différentes voies (ip, po, sc, iv ...); effets indésirables (e.g. stéréotypies) liés à l'injection d'agents pharmacologiques de référence comme la phencyclidine (PCP), stress associé à la manipulation des animaux par les opérateurs; stress lié à l'isolement post-opératoire ou aux tests comportementaux.
Devenir
Les animaux pourront soit être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire, soit euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal, soit euthanasiés à la suite des effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ ou le modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat et/ou la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les ondes cérébrales par EEG. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité et la toxicité d’un candidat médicament. A ce jour, le rat et la souris représentent les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques pour tirer des conclusions pertinentes. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 8-12 / par groupe. Une réutilisation des animaux, après avis du vétérinaire, est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses • la formation du personnel • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux • le recours à des procédures les moins invasives possibles • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur l’électroencéphalogramme et ces animaux sont capables d’apprendre et de réaliser les tâches comportementales complexes utilisées dans ce projet. De plus, il existe ainsi une possibilité de confronter les résultats avec une littérature abondante. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets de produits sur l'EEG de l’animal à d’autres stades de développement.
Immunisation de souris au système immunitaire humanisé
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 500 souris au système immunitaire humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de souffrance légère. Elles reçoivent jusqu'à deux injections hydrodynamiques de plasmides dans la veine, des administrations de composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques, des prélèvements sanguins répétés à la veine saphène, au sinus rétro-orbital ou à la queue, puis un prélèvement terminal par ponction intracardiaque sous isoflurane. Le porteur décrit pourtant des atteintes qui peuvent se traduire par une perte de poids, une hypoactivité ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, et justifie la mise à mort par le fait que les animaux "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général". Sur le remplacement, il envisage des tests in vitro "si ceux-ci sont appropriés", et conclut que la souris humanisée reste "indispensable".
Objectifs
Le système immunitaire joue un rôle central dans la mise en place d’une réponse protectrice efficace et durable contre les agressions extérieures. Pour mieux comprendre ce tissu et s’en servir pour développer des thérapies innovantes, les chercheurs ont besoin de modèles précliniques prédictifs. En greffant des cellules souches à des souris immunodéprimées, nous pouvons reconstituer un système immunitaire fonctionnel exprimant des cellules blanches humaines. Cette caractéristique permet, par exemple, de conduire des tests précliniques plus prédictifs des effets prophylactiques et thérapeutiques qu’aura une vaccination chez l’homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.
Procédures
Injection hydrodynamique par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Des composés seront administrés par voie intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire. Les injections dureront quelques secondes. Les prélèvements de sang seront réalisés dans la veine saphène, le sinus rétro-orbital ou à la veine caudale. Un prélèvement terminal sans réveil pourra être réalisé par voie intracardiaque ou par voie rétro-orbitale si l’intracardiaque n’est pas réalisable pour raisons scientifiques. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie à l’isoflurane à une concentration comprise entre 3.5 % et 4.5 %. Les volumes maximaux d'injections et de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) hydrodynamique(s) intraveineuse de plasmides, l'administration des composés immunogènes, pathogènes ou thérapeutiques, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvement s sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, lorsqu’il n’est pas possible de recréer, in vitro, une séroconversion et d’évaluer son impact protecteur sur un organisme vivant, la souris au système immunitaire humanisé constitue une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise à disposition des patients de thérapies innovantes.
Réduction
Un total de 1500 souris adultes seront utilisées, couvrant une période 5 ans, permettant de réaliser 50 études précliniques, soit 4 groupes (1 placebo et 3 traitements) de 5 à 10 individus. Le nombre exact d’animaux par étude sera réduit en fonction d’études statistiques adaptées aux effets attendus des agents immunogènes et des éventuels traitements.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Un morceau de bois, permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Celle-ci sera objectivée par une échelle de score adaptée. Les animaux seront pesés deux à trois fois par semaine, la fréquence pouvant être adaptée au stade de l’étude si nécessaire. Le vétérinaire aura pleine autorité pour envisager un traitement anti-douleur ou euthanasier une souris pour raison éthique, s’il le juge nécessaire. Un anesthésie sera mise en place pour les prélèvements terminaux par voie intracardiaque ou rétro-orbitale.
Choix des espèces
La procédure expérimentale d’humanisation a été mise au point et est actuellement maîtrisée chez la souris. Les souches NOG et NCG sont particulièrement réceptives à la greffe du système immunitaire ce qui va permettre à cette espèce d’exprimer des lignées lymphocytaires humaines. Cette particularité permet d’étudier les effets prophylactiques d’une vaccination en condition in vivo, et d’extrapoler, avec davantage de sécurité, les effets qu’auront les traitements chez l’utilisateur final : l’homme. D’autres souches de souris, en particulier non-humanisées, pourront être utilisées dans le cadre d’études préliminaires. Les animaux seront intégrés aux études à partir de l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non humanisés, et à partir de 18 semaines pour ceux humanisés.
Rôle de la sénescence embryonnaire programmée dans la compaction cardiaque
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
552 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 504 femelles gestantes tuées pour que leurs embryons soient prélevés à treize jours et demi puis seize jours et demi de gestation, tandis que 24 mâles et 24 femelles reproducteurs sont gardés vivants et réutilisés jusqu'à la fin du projet. Le geste infligé aux mères tient en trente secondes, un gavage unique. Les souriceaux, eux, sont anesthésiés par le froid pendant dix minutes puis décapités. Le laboratoire développe en parallèle des organoïdes cardiaques humains en trois dimensions qui reproduisent déjà le début de la trabéculation, et le bénéfice annoncé pour les patients tient en une ligne, comprendre le mécanisme "permettra d'agir pharmacologiquement".
Objectifs
Le syndrome de non compaction cardiaque est une malformation congénitale d’origine diverse. La non compaction s’observe souvent dans les maladies métaboliques. Le cœur en développement forme à partir des parois ventriculaires et auriculaires des trabécules se projetant dans les chambres afin d’augmenter la surface d’échange entre les cardiomyocytes et le sang avant que le système coronaire ne soit mis en place. On parle alors de trabéculation Vers le stade embryonnaire E13.5 (milieu de la gestation) chez la souris, les trabécules régressent et les parois ventriculaires s’épaississent. On parle alors de compaction. Nous connaissons assez bien les mécanismes cellulaires de la trabéculation mais très mal l’origine incluant le signal de la compaction. Nous avons déjà des nombreuses données incluant des données d 'expression génique montrant que la régression des trabécules est due à une sénescence des cellules cardiaques bordant le trabécules puis par leur élimination par des macrophages. De plus, le changement du métabolisme cardiaque au mileu de la gestation semble impliqué dans le processus de sénéscence. Pour valider ces données, nous délèterons un gène essentiel pour la sortie des cellules du cycle prolifératif et un gène impliqué dans le changement métabolique preferentiellement dans les cardiomyocytes embryonnaires et étudierons le phenotype des cœurs à différentes étapes du développement cardiaque.
Bénéfices attendus
La non compaction impacte l’hémodynamique cardiaque et est à l’origine de défaillance cardiaque. Elle ne peut pas contrairement aux autres malformations cardiaques être réparée par chirurgie. Comprendre ce mécanisme permettra d’agir pharmacologiquement
Procédures
gavage 30 s une seule fois dans leur vie. Anesthésie par le froid pour les souriceaux (10 min) avant mise à mort par décapitation
Impact sur les animaux
Le gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiqué par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Il permet la diffusion de la molécule à chaque embryon et sera appliqué qu’une seule fois pour chaque souris.
Devenir
504 animaux femelles utilisés dans le projet seront mis à mort au moment de la collection d 'embryons à E13.5 et E16.5 . Les mâles (24) et les femelles (24) ayant donné naissance aux souriceaux seront conservés et pouront être réutiilisés juque la fin du projet .
Remplacement
Nous etablissons un modèle cellulaire d'organoides cardiaques en 3D in vitro. Nous utilisons en effet en parallele des cellules souches embryonnaires humaines differenciées en different types de cellules cardiovasculaires au sein de cardioides en 3D. Ce modèle humain montre des trabecules naissant mais requiert encore une optimisation pour mimer la trabéculation et la compaction.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour mettre en évidence une apparition d un phénotype lié à l’utilisation de notre modèle avec une significativité statistique. il existe une variabilité inter-portée c'est pourquoi il nous faut 6 portées par condition expérimentale. Nous effectuerons un test statistique de comparaison de la variance à 2 facteurs pour comparaison inter groupes . Les données acquises sur le modèle cellulaire d'organoides cardiaques humains en 3D in vitro validant des données acquises chez les souris permettront de diminuer les effectifs de souris par groupe.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum , cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le laboratoire de stabulation est éclairé par cycle de 12H. Des points limites clairs et spécifiques seront définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu’ils atteindront les critères d’interruption. L'enrichissement de cages sera multiple (papier kraft, dômes, petits batonnets). Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle de développement cardiaque reflétant les étapes du développement cardiaque humain y compris les phénomènes étudiés dans ce projet ( trabéculaton et compaction). Les stades de développement E13.5, E16.5 et nouveau-nés ont été choisis de part les phenomènes biologiques se déroulant à ces stades (trabéculation versus compaction et changement de métabolisme cardiaque, respiration de l 'O2...)
Réponse au traitement et nouvelles thérapies contre l’infection par le VHD (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Les souris utilisées portent un foie humain greffé, et celles chez qui la greffe échoue, environ une sur dix, développent une insuffisance hépatique aiguë en deux à trois semaines. 98 souris vont ainsi être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 78 d'entre elles et léger pour les 20 autres. Elles subissent une injection intraveineuse, une chirurgie de greffe de cellules de foie humain dans la rate, une inoculation des virus des hépatites B et D dans le péritoine, des traitements quotidiens par injection sous-cutanée ou par gavage qui peut perforer l'œsophage ou l'estomac, huit prélèvements sanguins en seize semaines pouvant provoquer inflammation et cécité, et des transports en véhicule entre deux sites. Le porteur indique que les reproducteurs de la colonie sont tués lorsque la qualité de reproduction décline, qu'un couple sans portée depuis plus de trois mois est tué, et que les souris greffées sans succès sont tuées faute de pouvoir être utilisées ailleurs.
Objectifs
Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération de la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le cancer du foie. Si certains traitements permettent aujourd’hui le contrôle de l’infection par le VHB, les traitements disponibles contre le VHD sont non satisfaisants, malgré le développement récent de nouvelles molécules. Notamment, le bulevirtide, inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules, bénéficie d’une autorisation conditionnelle d’utilisation en Europe depuis 2020. Cependant, tous les patients ne répondent pas au traitement bulevirtide et les causes de cette variation entre patients est inconnue. De nouvelles stratégies de traitements contre le VHD et la compréhension de la réponse au traitement par bulevirtide sont indispensables. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé l’activité anivirale d’une molécule utilisée dans le traitement contre l’arthrite rhumatoïde, l’upadacitinib, contre le VHD. Ce projet combine à la fois une analyse de la réponse au traitement par bulevirtide chez les souris co-infectées par le VHD et le VHB, à la recherche de marqueurs de la réponse au traitement, et le test in vivo de l’upadacitinib. Il s'agit d'un projet multisites.
Bénéfices attendus
La thérapie antivirale de dernière génération pour l'infection par le VHD est le bulevirtide, qui conduit à une diminution significative de la charge virale dans les études cliniques chez 70% des patients. Cependant, aucun marqueur de réponse au traitement n'est disponible et des antiviraux plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la durée de vie et la qualité de vie des patients infectés par le VHD. Cette étude vise à identifier des marqueurs pour la réponse au traitement par le bulevirtide et le risque de cancer. De plus, l'étude fournira une preuve de concept préclinique en utilisant une nouvelle molécule antivirale comme candidat médicament.
Procédures
Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigils après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Cette injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les traitements seront administrés de façon quotidienne par injection sous-cutanée après désinfection à l’alcool, ou par gavage oral sur animaux vigils. Injections et gavages oraux sont réalisés en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 16 semaines, soit un total de 8 prélèvements. Ces prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prennent moins d’une minute à être réalisés. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes. Les animaux seront transportés en véhicule motorisé d'un site à l'autre .
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelles la prise de greffe sera infructueuse (environ 10% des animaux) vont développer une insuffisance hépatique aigüe en 2-3 semaines du fait de la mort des cellules du foie murin, qui se traduit par une perte de poids rapide. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer inflammation et cécité. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une inflammation et/ou d’une induration. Le gavage oral pourrait également entrainer une inflammation et plus rarement des saignements/perforation de l’œsophage ou de l’estomac. Les traitements peuvent entrainer une augmentation temporaire de la concentration en acides biliaires dans le sang, qui est asymptomatique et sans conséquence sur la santé. Les traitements peuvent également être associés à une élévation de niveau des enzymes du foie dans le sang ainsi qu’à une augmentation des lipidiques et cholestérol dans le sang. Le transport d'un site à un autre peut générer un stress léger de courte durée.
Devenir
Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenue depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et D ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont sur des lignées cellulaires et sur des cellules du foie humain afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses et présentent de nombreuses modifications de leur ADN par rapport à des cellules normales du foie. De plus l’utilisation de cellules du foie issues de patients nécessiteraient un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation et la quantité de tissu n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser les modifications de l’ADN. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce aux données d’une étude précédente sur des souris humanisées. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables. Pour réduire le stress engendrer par le transport des animaux d'un site à l'autre , les cages de transport seront enrichies avec un baton et du coton ou de la frisure pour que les animaux puissent faire un nid. La température sera maintenue suffisamment élevée pour que les souris puissent maintenir leur température corporelle. Les cages seront équipées de couvercles filtrants afin de garantir leur protection des pathogènes extérieurs. A leur arrivée, une période d'acclimatation de 2 semaines serra respectée afin de permettre aux animaux de s'habituer au nouvel environnement.
Choix des espèces
Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies du foie et virales sur les cellules du foie humain et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe, afin de faciliter l’intervention, et à un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus, la prise de greffe optimale étant à 3 mois post-greffe.
Evaluation de l’efficacité de thérapies cellulaires et/ou géniques pour le traitement des déficits immunitaires dans un modèle murin – Amendement n°1
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Quatre injections dans le péritoine, une injection dans la veine rétro-orbitale, une injection directement dans le foie, cinq anesthésies gazeuses suivies de séances d'imagerie et deux anesthésies générales profondes: 2 138 souris génétiquement immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris reçoivent des cellules souches ou des progéniteurs sanguins humains, corrigés ou non, pour vérifier que ces cellules se développent dans un organisme vivant. Le porteur indique que cette étape est exigée par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant toute demande d'essai clinique chez l'être humain. L'effectif de 2 138 animaux n'est adossé à aucun calcul de puissance statistique, il a été dimensionné "en fonction de notre expérience du modèle" et de la variabilité observée lors de projets antérieurs.
Objectifs
Le but de ce projet est de tester in vivo dans un modèle murin l’innocuité et l’efficacité de nouveaux protocoles thérapeutiques pour des déficits immunitaires sévères. Ces déficits sont des pathologies très graves qui touchent les cellules sanguines et immunitaires, indispensables à la lutte contre les agents infectieux. Ils sont dûs, soit à une mutation dans un gène indispensable au développement ou à la fonction des cellules sanguines, soit à des traitements contre le cancer du sang, dans le cas de leucémie par exemple. Pour toutes ces pathologies, la greffe de moelle osseuse provenant d’un donneur sain est une option thérapeutique largement utilisée, mais la survie après greffe est très hétérogène et peut être inférieure à 30%. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être absolument développées pour augmenter la survie de patients greffés. Notre objectif est d’explorer l’efficacité de trois nouveaux traitements de thérapie cellulaire (injection de progéniteurs des cellules sanguines), et de thérapie génique (injection de progéniteurs des cellules sanguines ou cellules souches, génétiquement modifiés). L’efficacité de ces approches innovantes doit absolument être validée dans un modèle animal car cette étape est exigée par l’Agence Nationale de la Santé et du Médicament avant tout essai clinique chez l’homme. Il existe un modèle de souris génétiquement modifiée pour être atteinte de déficience immunitaire et qui peut recevoir des cellules sanguines humaines pour qu'elles se développent sans effet délétère. Selon l’âge des souris receveuses, les cellules humaines seront injectées en intraveineuse ou en intrahépatique et la reconstitution immunitaire sera suivie par des prélèvements d’organes lymphoïdes après la mise à mort.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place de nouvelles thérapies dans le cas de déficits immunitaires sévères. Plus spécifiquement, les différentes études sur les progéniteurs de cellules sanguines nous permettront de choisir le protocole de production le plus optimisé pour leur capacité à se développer dans le corps. Par ailleurs, les protocoles impliquant la modification génétique des progéniteurs ou cellules souches visent à évaluer l’efficacité de telles stratégies de remplacement de gènes défectueux et notamment en vérifiant la bonne évolution des cellules génétiquement corrigées chez la souris, et ce durant leur développement. A terme, l’ensemble de ce projet permettra la mise au point jusqu’au stade clinique de protocoles thérapeutiques personnalisés avec une survie améliorée pour tous les patients atteints de déficits immunitaires.
Procédures
Les animaux subiront selon leur utilisation, soit 1 ou 2 : Injection intrapéritonéale (4X), 10s par intervention. Injection intraveineuse rétro-orbitale (1X), 30s par intervention. Anesthésie générale profonde (2X), 2min par intervention. Injection intrapéritonéale (1X), 10s par intervention. Injection intrahépatique (1X), 10s par intervention. Anesthésie gazeuse (5X), 10min à 30min. Imagerie optique (5X), 10min à 30min par intervention. Anesthésie générale profonde (1X), 2min par intervention.
Impact sur les animaux
Les altérations génétiques des animaux provoquent une immunodéficience sévère qui les rend vulnérables aux infections microbiennes. A la dose utilisée, l'agent de conditionnement n'induit pas d'effet indésirable majeur mais une douleur transitoire durant les heures post-injectio. L’anesthésie légère gazeuse ou profonde générale par injection de produits anesthésiants peut provoquer une baisse de la température corporelle et un assèchement des yeux. Les cellules souches et progéniteurs lymphoïdes ne provoquent pas d'effets indésirables et sont très bien tolérés chez les animaux. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée légère et un stress transitoire.
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort à la fin de cette procédure car nous avons besoin de prélever leurs organes afin de réaliser plusieurs analyses moléculaires et biochimiques.
Remplacement
La mise en place d’essais précliniques sur modèles animaux, quand ceux-ci existent, est exigée par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés sur les cellules seront testés chez l’animal. Notre protocole de production de progéniteurs de cellules sanguines est déjà une méthode de remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches pour produire et expandre des cellules qui normalement se différencient en plusieurs mois dans la moelle osseuse. Nous utilisons un système de culture cellulaire, en évitant la maturation des cellules humaines chez la souris sur plusieurs stades. De même, la modification génétique des cellules sera faite dans la culture puis validée (efficacité de l’incorporation du gène sain, expression protéique du gène sain…) avant l’injection chez les animaux. En outre, la capacité des progéniteurs ou cellules souches, corrigées ou non, à se développer correctement, notamment en certains sous-type de cellules sanguines, sera également évaluée dans une culture cellulaire grâce à des tests déjà validés dans la littérature. Ils serviront à statuer sur la fonctionnalité potentielle des cellules avant leur injection chez les souris. Les expériences chez l’animal interviendront au terme d’un long développement et d’une caractérisation des produits cellulaires qui seront utilisés afin de ne traiter les animaux qu’avec les cellules dont les résultats sur les cellules seront suffisamment satisfaisants pour poursuivre chez l’animal. Ces expérimentations s’inscrivent dans le cadre d’une validation de la capacité de ces cellules, dans un organisme complet, à se développer. En effet, les expériences sur les cellules ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, la capacité à migrer et la persistance de nos cellules therapeutique.
Réduction
Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé en fonction de notre expérience du modèle en question, en prenant en compte la variabilité observée lors de précédents projets du laboratoire. De par la faible taille de nos groupes, nous nous attendons à ne pas pouvoir valider une distribution gaussienne de nos données et donc à privilégier des tests non paramétriques. Cependant, nous raisonnerons de manière méthodique en testant la possibilité d’une répartition en loi normale de nos jeux de données. Un premier test sera utilisé pour évaluer la répartition gaussienne de chaque groupe, suivi d'un test pour comparer les variances. Pour la comparaison entre deux groupes, si les données suivent une distribution gaussienne, nous aurons recours aux tests paramétriques. En cas de répartition non gaussienne, un test non paramétrique sera utilisé. Pour les comparaisons entre plus de 2 groupes, nous utiliserons soit un test d'analyse de la variance pour les données normales avec comparaisons multiples ou son équivalent non paramétrique en cas de répartition non gaussienne. Par ailleurs, afin de réduire au maximum la production de notre élevage de souris immunodéficientes, nous aurons recours à la synchronisation des trios en amont de chaque expérience de manière à utiliser au maximum les animaux de chaque portée.
Raffinement
Les animaux immunodéficients seront hébergés au sein d'un établissement dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité permettant d’éviter toute souffrance dues à leur phénotype immunodéficient. Les souris seront hébergées à raison de 5 par cage sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson à leur volonté, la nourriture et l’eau sont stériles. Chaque cage bénéficie d’un enrichissement matérialisé par un tunnels de polycarbonate rouge translucide (pour les activités journalières) destiné à diminuer le stress et stimuler leur activité, des carrés de cellulose afin de favoriser la nidification et un bâtonnet en bois pour répondre aux besoins naturels des rongeurs. Des gels riches en nutriments pourront être ajoutés dans la cage si le besoin s'en fait sentir (animal chétif ou faible). La souffrance des animaux sera surveillée régulièrement et la décision de leur mise à mort encadrée par une grille de score définissant des points limites spécifiques. Une surveillance quotidienne sera réalisée par le personnel compétent de l’animalerie ainsi qu’une surveillance hebdomadaire par les responsables du projet. Chaque procédure invasive sera précédée d’une anesthésie générale profonde accompagnée d’une analgésie. Lors des anesthésies gazeuses, les animaux seront placés sur un plateau thermostaté permettant de maintenir leur température corporelle. La mise à mort de l'animal sera faite sous anesthésie générale afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente que nous avons choisie constitue le modèle de référence pour tester l’efficacité de nouvelles approches de thérapie cellulaire et génique des déficits immunitaires. En effet, ces souris immunodéficientes sont capables de soutenir le développement des différentes cellules sanguines humaines à partir de cellules souches. Nous utiliserons soit des souris femelles ou mâles de 4 à 8 semaines soit des souris nouveau-nés (moins de 4 jours). Les souris de 4 à 8 semaines supportent bien le traitement permettant de les “vider” de leur globules blanc les 2 jours précédant la greffe. Ce traitement à la dose choisie est sans toxicité majeure et permet d’une part de mimer la situation clinique de greffe, et d’autre part de « vider » la moelle des animaux afin de faire de la place pour les cellules humaines et faciliter leur différenciation dans toutes les lignées sanguines. La prise de greffe des cellules humaines est bonne chez les animaux âgés de 4 à 8 semaines. Les souris nouveau-nées (
Formation et maintien des compétences du personnel pour la réalisation des administrations et prélèvements chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 630
840 souris et 630 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des gestes techniques répétés jusqu'à deux fois par jour pendant six à huit semaines, gavages, injections dans le péritoine, sous la peau et dans la veine caudale, prélèvements au sinus rétro-orbital, à la veine submandibulaire, à l'aorte abdominale et par ponction intracardiaque, avec les incidents que le porteur énumère lui-même, fausse route, perçage de l'œsophage, injection dans le cæcum ou la vessie, hémorragie nasopharyngée, lésion de la cornée. Ces séances ne produisent aucune connaissance et répondent à l'exigence réglementaire de formation continue du personnel d'une société de recherche préclinique. Le porteur indique que les premières séances d'apprentissage peuvent se faire sur des animaux morts, puis conclut que l'animal vivant est "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques, la force et les réactions de celui qui est manipulé.
Objectifs
L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures faiblement invasives et invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Dans notre société, chaque technicien doit maitriser les techniques d’administration et de prélèvement utilisées, chez le rat et la souris. L’objectif de ce projet est de répondre à l’exigence règlementaire concernant la formation continue et le maintien des compétences du personnel. Ce projet vise à améliorer les pratiques expérimentales, à assurer la qualité scientifique et le bien-être des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les gestes techniques de type administration et prélèvement, chez le rat et la souris. L’apprentissage et le maintien des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal.
Procédures
Les gestes techniques traités dans ce projet se pratiquent sur rats et /ou souris, vigiles ou anesthésiés, avec une solution physiologique ou neutre n’engendrant pas d’effet indésirable. • Les administrations par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée sont réalisées sur animaux vigiles, une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines, au maximum. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 10 sec de contention. • Les administrations par voie intraveineuse sont réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés, en contention dans un tube, après désinfection de l’organe caudale, une à deux fois par semaine, pendant 3 à 4 semaines, au maximum. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 30 sec de contention. • Les prélèvements au sinus rétro orbital ou à la veine submandibulaire sont réalisés sur animaux anesthésiés, en respectant les limites de volume, de nombre (trois maximum) et de temps de récupération ; soit 7,5% du volume sanguin circulant maximum une fois par semaine ou 10% du volume sanguin circulant maximum une fois toutes les deux semaines ou 15% du volume sanguin circulant maximum une fois toutes les quatre semaines ou 20% du volume sanguin circulant pour un prélèvement terminal. Cette technique concerne les rats et les souris et nécessite environ 20 sec de contention. • Les prélèvements sanguins à l’aorte abdominale sont réalisés uniquement chez le rat sous anesthésie générale, avec une couverture analgésique de type buprénorphine. Ce geste technique dure environ 1 minute. • Les prélèvements par ponction intracardiaque sont réalisés chez le rat et la souris sous anesthésie générale et nécessite environ 20 sec de contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances décrites ci-dessous représentent des cas extrêmes et rares qui sont évités par la réalisation d’un bon tutorat et d’un apprentissage progressif. • Administrations par voie orale : fausse-route, perçage de l’œsophage • Administrations par voie intrapéritonéale : passage dans la vessie, injection dans le caecum • Administrations par voie intraveineuse : lésions cutanées possibles en cas d‘injection en dehors de la veine. • Prélèvements sanguins au sinus rétro orbitaire ou à la veine submandibulaire : hémorragie dans les voies naso/oropharyngée si réalisés à trop grande profondeur, lésion de la cornée en cas de frottement avec la pipette. Afin de limiter le nombre d’animaux inclus, ils pourront être utilisés à plusieurs reprises, au maximum 2 gestes par jour pendant 6 à 8 semaines sous réserve de ne pas présenter d’altération de leur bien-être. Ces manipulations répétées peuvent engendrer un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
Avant toute manipulation des animaux, le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Si nécessaire, les premières séances d’apprentissage et d’entraînement sont réalisées sur des animaux morts. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci.
Réduction
Nous utilisons en priorité des animaux surnuméraires des études, des animaux issus de nos élevages non entrés en expérimentation plutôt que des animaux achetés à cette fin, chez des fournisseurs agréés. Afin de réduire le nombre d’animaux inclus, les gestes techniques décrits ci-dessous sont réalisés plusieurs fois sur les mêmes animaux dans le respect des limites maximales recommandées par le GIRCOR et des temps de récupération adaptés entre chaque geste. • Administrations par voie orale et intrapéritonéales: maximum 2 par jour pendant 8 semaines • Administrations par voie intraveineuse : maximum 2 par semaine pendant 8 semaines • Prélèvements sanguins : maximum 1 par semaine pendant 4 semaines
Raffinement
Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée avant toutes manipulations des animaux. La majorité des gestes techniques sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress liés à la réalisation de ces gestes. Certains types de prélèvements sanguins sont réalisés sous couverture analgésique. L’état clinique des animaux est évalué quotidiennement par les personnes impliquées dans ces formations ou maintien des compétences (tuteurs, soignant, etc.). Un carnet de santé, traçant précisément tous les gestes réalisés, le cas échéant les signes cliniques observés ainsi que les soins apportés, est mis en place. L’atteinte des points limites conduit à la mise en place de complément au bien-être ou à la mise à mort des animaux concernés. La taille des aiguilles et des cathéters et sondes est adaptée à la taille de l’animal afin d’éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les espèces utilisées pour mener à bien nos programmes de recherche précliniques. A ce jour, de par leurs similarités physiologiques avec l’homme, ces deux espèces de rongeurs sont les plus adaptées pour évaluer les propriétés pharmacologiques de molécules d’intérêt et d’en connaître les risques de toxicité avant les premiers essais chez l'homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car les études réalisées au sein de notre établissement le sont sur des individus adultes.
Effet inducteur d’un facteur de croissance , de son agoniste et d’un analogue de la kisspeptine sur l’ovulation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Remplacer une hormone extraite du sang de juments gravides saignées à répétition, pour mieux contrôler la reproduction des brebis et des chèvres d'élevage: 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart, modéré pour vingt d'entre elles, vingt autres étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Elles reçoivent jusqu'à trois injections et des prélèvements de sang à la queue, avant d'être tuées pour que leurs voies génitales et leurs cerveaux soient prélevés. Le porteur affirme que l'ovulation ne peut s'étudier qu'in vivo et que tester un bloqueur d'un système physiologique complexe exige "l'animal entier". Il présente le projet comme un gain de bien-être pour les juments, alors que la finalité immédiate reste d'améliorer le contrôle de la reproduction dans les élevages.
Objectifs
Chez les mammifères existent deux types d'ovulations : spontanée et induite. Une substance nommé b-NGF est considérée responsable du déclenchement de l'ovulation chez les espèces à ovulation induite. Notre projet vise à comprendre si aussi chez les espèces à ovulation spontanée cette molécule est capable d'induire l'ovulation. Nos résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes qui sont à la base de l'induction de l'ovulation et seront utiles pour améliorer le contrôle de la reproduction chez les animaux domestiques.
Bénéfices attendus
Une des produits utilisé pour contrôler la reproduction chez les animaux domestique, tel que les brebis et les chèvres, est une molécule appelée PMSG. Cette molécule est extraite du sang de juments gravides qui sont saignées très souvent. La production de cette molécule pose donc un problème de bien être animale. La molécule (b-NGF) que nous sommes en train d’étudier peut, à différence de la PMSG, être synthétisée en laboratoire. Si nous arrivons à démontrer que le b-NGF peut induire l’ovulation il sera envisageable de l’utiliser à la place de la PMSG avec un bénéfice pour le bien être animale.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélévements de sang. Pour chaque prélévement seront collecté 3 µL dans l'espèce de 3-5 seconds
Impact sur les animaux
Les prises des sang à la queue peuvent engendre une légère douleur et la contention de l'animale pour réaliser la prise de sang un stress leger.
Devenir
Pour pouvoir détecter les oocytes dans le système génital des femelles et analyser l'expression des protéines d'intérêt dans les cerveaux il est nécessaire d'euthanasier toutes les souris.
Remplacement
L’ovulation est un phénomène complexe qui ne peut être étudiée qu’in vivo. Nous avons recours à un protocole classiquement utilisé qui est réalisé sur la souris prépubère. Avenant: Le test d'efficacité d'un bloqueur d'un système physiologique complexe ne peut se faire que sur l'animal entier.
Réduction
Le choix du nombre d’individus par lots a été statistiquement déterminé. Les paramètres suivant ont été pris en compte : pour un taux d’ovulation attendu de 80% dans nos conditions de traitement et un taux d’ovulation basal de 20% avec un intervalle de confiance à 95%, il faut 5 souris par lot. Si l’effet de nos molécules est moins important que notre témoin positif et que le taux d’ovulation observé n’est que de 60% alors il faut 11 souris par lots. Par sécurité, nous avons choisi un effectif de 10 souris par lot afin de pouvoir exploiter les résultats. Dans un autre projet ce nombre d’individus avait permis l’obtention de résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Les souris seront hébergées par quatre en présence d’igloos en carton. Les animaux recevront au maximun 3 injections de 0.1mL (2 IP et 1 IM) : de eCG et « traitements ». Aucun des produits que nous souhaitons utiliser ne sont connus pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux. Une surveillance des animaux sera instaurée avec un passage deux fois dans la journée de l’injection. Un massage local après chaque injection, sera effectué pour diminuer les sensations douloureuses. Lors des procédures expérimentales qui demandent une intervention chirurgicale les souris est anesthésiée. En outre un analgésique est injecté par voie sous-cutanée au début de la chirurgie. Suite à la chirurgie les animaux seront surveillés régulièrement et leur état évalué selon un’échelle permettant d’établir un score de bienêtre. Dans le cas le score indique une perte de bienêtre important l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
C’est l’espèce de référence du protocole utilisé en routine par de nombreux laboratoires L’utilisation de la souris prépubère est aussi celle qui permet d’obtenir des résultats les plus facilement interprétable tout en utilisant un minimum d’animaux. En effet, ces souris permettent d’éviter la commande de mères gestantes chez lesquelles les mâles n’auraient pas d’utilité dans cette expérience (l’ovulation est un phénomène spécifique au sexe femelle). L’utilisation de souris adultes impliquerait que nos résultats seraient parasités par les ovulations naturelles des individus réduisant donc notre discrimination entre ce phénomène et l’efficacité de notre traitement. Assurer dans ce cadre des résultats viables passerait automatiquement par une augmentation du nombre d’animaux par lot. Avenant 03-21: 20 souris adultes seront utilisées dans ce protocole. En effet, nous souhaitons caractériser les cellules exprimant le recepteur p75 chez l'adulte.
Rôle des macrophages dans l’insuffisance hépatite aiguë chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
3 520 souris vont être utilisées, toutes tuées six heures après une injection qui déclenche une insuffisance hépatique aiguë, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune passe par une biopsie de la queue avant quatorze jours de vie, éveillée, pour le génotypage, puis selon les groupes par une injection intraveineuse sous anesthésie, un régime alimentaire particulier et deux prises de sang à une heure d'intervalle. La destruction massive des cellules du foie doit provoquer une réaction inflammatoire, avec poils hérissés, animal recroquevillé, respiration accélérée et mobilité réduite. Le porteur écrit qu'aucune manifestation de souffrance n'a été rapportée dans ce modèle, dans un projet qu'il classe pourtant entièrement en gravité sévère.
Objectifs
L’insuffisance hépatique aiguë est une pathologie survenant lorsque la mort des hépatocytes excède les capacités de régénération du foie. Elle demeure une affection de mauvais pronostic et une cause importante de greffe hépatique. L’un des principaux facteurs de risque de survenue de l’insuffisance hépatique aiguë est la présence sous-jacente d’une pathologie hépatique chronique. Dans ce contexte, le foie étant fragilisé, la survenue d’un événement inflammatoire peut conduire à une insuffisance hépatique aiguë. Ce projet a pour but d’étudier le rôle des macrophages résidents du foie, les cellules de Kupffer, dans la physiopathologie de l’insuffisance hépatique aiguë, notamment lorsqu’elle survient dans un contexte de pathologie hépatique chronique. Ce projet permettra d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques plus efficaces et ciblées, limitant ainsi le recours à la transplantation hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’améliorer la connaissance de la physiopathologie de l’insuffisance hépatique aiguë, notamment lorsqu’elle survient dans un contexte de pathologie hépatique chronique. Chez l’Homme, le traitement demeure aujourd’hui encore limité et repose sur l’identification et l’éviction de l’agent causal ainsi que, le cas échéant, le recours à la transplantation hépatique. En déterminant le rôle des cellules de Kupffer (KCs) dans ce processus, nos résultats contribueront à identifier les mécanismes impliqués permettant ainsi le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à une biopsie pour génotypage. Elle sera effectuée sur des animaux vigiles 7 à 14 jours après leur naissance et ne durera pas plus de quelques secondes. Certains de ces animaux seront soumis à une injection intraveineuse, réalisée sous anesthésie générale en 3 minutes. Un délai de récupération d'une semaine sera observé avant les interventions suivantes. Certains animaux seront ensuite nourris ad libitum par un régime spécifique avant d'être soumis à un premier prélèvement sanguin, effectué en vigile et d'une durée moyenne 4 minutes. Ces animaux seront ensuite injectés en vigile par voie intrapéritonéale. Ce geste sera réalisé en quelques secondes puis suivi d'un second prélèvement sanguin une heure après. Ce prélèvement sera également effectué en vigile et d'une durée similaire au premier. D'autres animaux seront directement soumis à deux injections intrapéritonéales successives, sans mise sous régime préalable, réalisées en vigile en quelques secondes et suivies d'un unique prélèvement sanguin une heure après. Ce prélèvement sera effectué dans les mêmes conditions que précédemment décrit. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire six heures après l’injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Avant le début des procédures, une biopsie (moins de 1mm) sera effectuée chez les souriceaux vigiles de moins de 14 jours, permettant l’identification génétique des animaux et qui pourra être génératrice de stress, d’inconfort et d’une douleur de courte durée. Au cours des différentes procédures, certains animaux subiront une anesthésie qui pourra engendrer un stress thermique et, dans des cas rares, une détresse respiratoire. Une fois anesthésiés, ces animaux subiront une injection intra-veineuse pouvant induire une douleur brève à leur réveil. Tous les animaux seront soumis aux mêmes nuisances et effets indésirables décrits ensuite. Ils subiront une contention pouvant occasionner du stress et une injection pouvant induire une brève douleur. Les animaux subiront également un prélèvement de sang au cours de la procédure, occasionnant de la douleur et du stress. L'insuffisance hépatique aiguë induite par la mort massive des hépatocytes se traduit par une réaction inflammatoire aiguë et pourra générer une douleur. Des modifications de l'apparence des animaux (pilo-érection et recroquevillement), des modifications de leurs signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire) ainsi que de leur comportement (animal peu mobile) sont attendues. Les animaux nourris ad libitum avec différents régimes pourront subir une prise ou une perte de poids pouvant modifier leur mobilité et leur comportement.
Devenir
En vue des différents prélèvements nécessaires et de l'analyse des différents types cellulaires hépatiques, l'euthanasie de l'ensemble des animaux à l'issue des procédures est indispensable.
Remplacement
Notre projet, portant sur l'étude des phénomènes inflammatoires et des communications intercellulaires survenant dans le foie au cours de l'insuffisance hépatique aiguë, justifie l'utilisation impérative d'un modèle intégré comme la souris. Le foie, par la complexité de sa structure et par la diversité de ses types cellulaires, ne pas être reproduit fidèlement en utilisant des cultures de cellules isolées. De plus, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés déjà existants facilite l'étude de divers gènes candidats.
Réduction
Au total 3520 animaux seront utilisés pour ce projet et répartis en différents groupes expérimentaux (mâles et femelles) de 10 souris a minima. Afin d'obtenir des résultats interprétables et significatifs, les effectifs des groupes ont été établis grâce à un calcul de puissant. Nous comparerons et interpréterons les résultats des différents groupes et conditions expérimentales avec fiabilité grâce à l'utilisation de tests statistiques. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude. D’autre part, en fonction des données obtenues au cours du projet, nous évaluerons la pertinence et la nécessité de réaliser ou non certaines expériences, permettant ainsi de limiter le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés à l’animalerie pendant 2 semaines et habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. Ceux issus des mêmes portées et de même sexe seront regroupés par cage de 5 maximum. Les souris disposeront de lanières de kraft, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Si des mâles se battent ou se blessent, ils seront immédiatement pris en charge avec l’avis de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) et/ou du vétérinaire de l’établissement utilisateur qui validera leur isolement. Chaque animal isolé disposera d'un double enrichissement (lanières de kraft et maisonnette en carton). Certains animaux seront soumis à une injection intra-veineuse. Or, pour limiter le stress et la douleur, ils seront préalablement anesthésiés. Afin de limiter le risque de lésion et de douleur, l’expérimentateur s’assurera de la qualité de l’anesthésie avant l’injection. Les animaux seront placés jusqu’à leur réveil sur une table chauffante pour limiter le risque d’hypothermie. Leur bien-être sera évalué dès leur réveil puis une heure, 24 heures et une semaine après l'injection. Aucune manifestation de souffrance n’a été rapportée dans ce modèle, cependant un gel ophtalmique sera systématiquement appliqué au site d’injection pour améliorer la récupération. Pour les animaux mis sous régime, une pesée hebdomadaire sera effectuée et permettra de s’assurer du bien-être des animaux. Une détérioration de l’état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entraînera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Les injections seront réalisées par un expérimentateur formé, maîtrisant le geste et avec un matériel adapté afin de réduire le stress et la douleur des animaux. Après chaque prélèvement sanguin, une compression de la veine caudale sera réalisée afin de limiter la perte de sang. Leur état général sera évalué toutes les heures afin d’éviter toute souffrance prolongée. Si les points limites sont atteints, les animaux en souffrance seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être facilement réalisées. De plus, de nombreuses lignées ont été déjà développés et sont donc disponibles pour les chercheurs. La physiologie murine est proche de celle de l’Homme, justifiant ainsi l’utilisation de cette espèce à des fins de recherche thérapeutique en médecine humaine. Pour notre étude, nous aurons recours à des lignées génétiquement modifiées utilisant un système d'expression constitutive. Ce système permet notamment l'exploration fonctionnelle approfondie et est très largement utilisé. L'utilisation de lignées transgéniques pour ce projet est nécessaire car elles permettent d'étudier spécifiquement l'implication de divers gènes codant pour des protéines impliquées dans l'insuffisance hépatique aiguë. Notre projet se basant sur l'étude d'un foie et d'un système immunitaire mature, il nécessite d'avoir recours à des souris adultes. De plus, des différences de réponses métaboliques et inflammatoires en fonction du sexe ont été démontrées. C'est pourquoi nous utiliserons des animaux mâles et femelles adultes, âgés de 8 à 15 semaines.