Souris

Irradiées 90 secondes sans anesthésie, 1 860 souris dépourvues de système immunitaire reçoivent le lendemain des cellules de leucémie humaine, par la veine de la queue ou directement dans la moelle osseuse de la patte. Chacune peut ensuite subir jusqu'à dix ponctions de moelle osseuse et douze prélèvements de sang à la joue, plus un gavage ou une injection quotidiens par cycles de 28 jours répétés jusqu'à trois fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, non invasives et maîtrisées", tout en décrivant la prolifération leucémique comme une source de souffrance annoncée par une perte de poids et des diarrhées. Toutes sont tuées, au plus tard douze mois après la greffe, pour prélever la rate et la moelle osseuse et conserver les cellules leucémiques en vue d'"utilisations mutualisées".

Objectifs

Les leucémies aiguës (LA) sont des cancers agressifs du sang affectant les différents types de cellules de notre système immunitaire. Notre objectif est de générer des modèles d’étude de ces leucémies humaines en injectant les cellules leucémiques humaines provenant des prélèvements faits sur les patients dans des souris dépourvus de système immunitaire (absence de rejet de greffe). L’établissement de ces modèles nous permettra d’élucider les mécanismes biologiques de ces leucémies et de tester l’efficacité thérapeutique de molécules déjà utilisées en médecine humaine dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la transformation des cellules normales en cellules leucémiques mais aussi des mécanismes responsables des résistances aux traitements par la chimiothérapie et des rechutes. L’amélioration de ces connaissances devrait nous permettre d’identifier des molécules déjà utilisées en médecine humaine pour d’autres pathologies qui pourraient présenter un avantage thérapeutique aussi pour le traitement des leucémies. A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer les thérapeutiques futures en proposant des traitements ciblés plus efficaces et moins toxiques dans le but d’améliorer le devenir des patients.

Procédures

Pour mettre en place le modèle d’étude, des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à une irradiation de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules leucémiques humaines injectées. Le lendemain les cellules leucémiques humaines seront injectées en une fois soit par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 30 secondes) soit directement dans la moelle osseuse au niveau de la patte des souris anesthésiées et analgésiées. (durée 3 min maximum). Afin de suivre le développement du cancer, des prélèvements de moelle osseuse dans la patte des souris anesthésiées et analgésiées (3 minutes maximum) seront réalisés une fois par mois et au maximum 10 fois ; en alternant la patte prélevée. En complément, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris (30 secondes maximum) sans anesthésie seront réalisés 2 fois par mois et au maximum 12 fois. La dose, la fréquence et la voie d’administration des molécules thérapeutiques testées peuvent être variables. Les molécules thérapeutiques seront administrées quotidiennement aux souris sans anesthésie soit oralement (avec une sonde de gavage ; durée 1 min) soit par voie intraveineuse (dans la veine de la queue ; durée 30 sec) soit par voie intrapéritonéale (dans la cavité abdominale ; durée 30 sec). Des cycles de traitement d’une durée de 28 jours seront réalisés et pourront être répétés au maximum 3 fois De l’imagerie non invasive sur souris anesthésiées (ayant reçu une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant la visualisation des cellules leucémiques) pourra dans certains cas remplacer les prélèvements de sang ou de moelle osseuse pour le suivi de la réponse aux molécules thérapeutiques testées (durée de l’imagerie= 15 min).

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides, non invasives et maîtrisées par l’ensemble du personnel. Cependant, l’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. Les prélèvements de sang et moelle osseuse peuvent causer une douleur légère et brève au niveau du site de prélèvement. L’implantation et le prélèvement dans la moelle osseuse peut potentiellement entrainer une perte de mobilité sur une très courte durée. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. L’administration répétée de molécule thérapeutique par gavage peut potentiellement causer une irritation. La prolifération des cellules leucémiques peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage ; le plus souvent une perte de poids et des diarrhées précéderont ces évènements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales (et au plus tard 12 mois après l’implantation des cellules leucémiques humaines ou l’arrêt du traitement en cas d’absence de greffe) afin de collecter les différents organes tels que la rate et la moelle osseuse. Cela permettra de réaliser des analyses complémentaires sur les cellules leucémiques mais également de les conserver afin de permettre des utilisations mutualisées.

Remplacement

Les lignées de cellules leucémiques existantes ne permettent pas de représenter la diversité des leucémies observées chez les patients ni de modéliser les étapes de transformation de cellules normales en cellules cancéreuses ni les mécanismes biologiques responsables des résistances aux traitements et des rechutes. De plus à ce jour il n’existe que quelques modèles de culture en milieu artificiel (in vitro) qui permettent seulement de maintenir temporairement des cellules leucémiques humaines mais leur pertinence reste partielle car cela ne récapitule pas la complexité de l’environnement physiologique ou pathologique des cellules humaines. Au contraire, l’utilisation d’un modèle animal entier vivant assure la présence d’un environnement complexe récapitulant les conditions retrouvées chez les patients. Ainsi l’utilisation d’un modèle utilisant un animal entier vivant est donc nécessaire et indispensable pour étudier la biologie des leucémies et tester des molécules thérapeutiques dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients.

Réduction

Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Pour certains modèles, de l’imagerie in vivo non invasive sera réalisée permettant de faire un suivi en direct de l’évolution de la maladie et de l’efficacité des traitements. De plus cela permettra d’anticiper les signes cliniques visibles.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou les expérimentateurs. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux dépourvus de système immunitaire seront hébergés dans des conditions permettant d’éviter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du comportement, de l’apparence physique, du poids sera effectuée par les expérimentateurs dès l’implantation des cellules leucémiques humaines et jusqu’à la fin de la procédure (ou au plus tard 12 mois après l’implantation en cas d’échec de greffe). Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de moelle osseuse et bimensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter et quantifier la prolifération des cellules leucémiques humaines implantées. Le suivi des animaux se fera en à l’aide d’une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs avec un système de scores. Toute souris présentant des signes de souffrance ou atteignant les points limites pendant la durée de l’expérience sera euthanasiée sans attendre et analysée. Néanmoins certains signes cliniques observés pourront entraîner des actions comme le renforcement du suivi clinique pendant 1 semaine, une réhydratation. De plus, le recours à de l’imagerie in vivo non invasive permettra de suivre en direct l’évolution de la maladie et d’anticiper les signes cliniques visibles.

Choix des espèces

L’utilisation de souris adultes dépourvues de système immunitaire est largement décrite dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour la greffe de cellules leucémiques humaines. Ce modèle permet également d’étudier la biologie des leucémies humaines, et de servir de modèles précliniques permettant de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un environnement tumoral complexe se rapprochant de ce qui se passe chez les patients. De plus, nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et de souffrance des souris et donc de leur prise en charge Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 12 semaines, afin de garantir une prise de greffe maximale des cellules leucémiques humaines.

Quinze minutes : une injection d'anesthésique dans l'abdomen, puis une chirurgie qui ne se termine pas par un réveil. 800 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées pour que leur cerveau soit prélevé, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet cartographie l'innervation de l'hypothalamus, centre de régulation du comportement alimentaire et social, en comparant des souris sans flore intestinale et des souris de souche classique à 14, 21 et 56 jours de vie. Le porteur annonce des lots de 10 souris par condition, ce qui laisse l'essentiel des 800 animaux sans justification chiffrée, et écrit par ailleurs que la procédure "n'induit pas de nuisances sur les animaux".

Objectifs

Le cerveau est divisé en différentes régions, noyaux et sous-noyaux produisant de nombreux neuropeptides avec son rôle propre dans le comportement de l’hôte. L’hypothalamus est le centre de régulation du comportement motivationnel : alimentaire, social. Il produit des neuropeptides et des récepteurs qui vont influencer le comportement motivationnel de l'hôte. Des mutations des gènes produisant ces neuropeptides ou récepteurs peuvent influencer ces comportements. L'objectif du projet est d'étudier l'innervation de l'hypothalamus par différentes populations neuronales impliquées dans le comportement motivationnel (comportement alimentaire, comportement social notamment), en conditions normale et pathologiques.

Bénéfices attendus

Une meilleure visualisation et l’établissement d’une cartographie des cellules nerveuses exprimant ces différents peptides et récepteurs permettra de mieux appréhender les mécanismes de communication neuronale, et ce chez différentes espèces ayant des métabolismes et comportements différents (sociaux, alimentaires). Une quantification des neurones positifs peut être faite pour comparer l’expression entre les souches. Une quantification de l’expression des peptides et récepteurs permettra de compléter ces datas et de comparer entre les souches l’expression des ARN messagers.

Procédures

Les animaux soumis à la procédure 1 recevront une injection intra-péritonéale d'anesthésique/analgésique, suivie d'une chirirgie terminale sous anesthésie générale. La procédure complète dure 15 minutes à compter de l'injection. cette procédure n'induit pas de nuisances sur les animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une douleur au niveau du site d'injection et a un éventuel stress dû à la contention nécessaire à la réalisation des injections. Cependant, les gestes étant réalisés par des personnes habilités et habitués à ces procédures, la durée et l'intensité de ces effets sera minime, 2 minutes maximum.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements d'organes pour des études histologies

Remplacement

Les techniques de prélèvement du cerveau pour des etudes d'histologie et d'imagerie sont à ce jour irremplaçables pour observer les projections neuronales entre les différentes régions cérébrales. Ce sont des techniques classiques utilisées en neurosciences, tant pour observer l’expression génique que l’expression protéique. Des méthodes in vitro existent pour étudier la structure et le fonctionnement d'un organe en condition physiologique et pathologique. Nous pouvons notamment citer les techniques d'organes sur puce (organ on chip), qui sont tout à fait pertinentes pour étudier les effets de molécules / médicaments sur l'organe ainsi que réaliser des tests de toxicité sur le tissu. Cependant, dans le cadre de ce projet, nous souhaitons observer les différentes structures anatomiques (noyaux neuronaux) et l'architecture mise en place dans le cerveau pour relier les différents noyaux (fibres), ce qui n'est pas reproductible in vitro. De plus, nous souhaitons également voir l'impact du microbiote intestinal sur le développement du cerveau (souris axéniques vs souris C57Bl6), impliquant 2 organes, ce qui est actuellement pas reproductible in vitro.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, des marquages multiples seront réalisés sur un même tissu. De plus, l’utilisation de ce type de modèles animaux permet de réduire le nombre de souris utilisées puisque le génotype est plus garanti que via des mutations spontanées. De mêle pour les études d'expression génique, plusieurs marqueurs peuvent être ciblés par tissu. Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les marquages seront analysés sur des lots de 10 souris par condition. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement comparables. Nous allons quantifier le nombre de cellules positives par région, et comparer les différences entre les conditions (age et sexe). Nous évaluerons aussi la densité des fibres nerveuses positives, chaque noyau possédant plusieurs projections neuronales. Les 30 animaux par sexe correspondent donc à 10 souris à P14, 10 à P21 et 10 à P56.

Raffinement

Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à trois à cinq par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale). Bien que la mise au point de ces modèles animaux soit couteuse, cela permet d’éviter la souffrance des animaux induite par l’administration des toxines.

Choix des espèces

Seule l’utilisation d’un modèle mammifère entier, donc in vivo chez l’animal, peut nous permettre de comprendre de façon globale l’organisation des neuropeptides dans un tissu entier. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques liées à la prise alimentaire, le comportement social, permettant ainsi une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. Nous étudierons les animaux avant le sevrage (P14) ainsi qu’au sevrage à P21 et à l'age adule P56, afin d’observer le processus de développement chez les jeunes animaux et comparer les circuits hypothalamiques qui se développement principalement après le sevrage.

Pour mesurer l'hypersensibilité viscérale liée au stress et chercher des cibles contre les douleurs de l'intestin irritable, 1 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trois distensions colorectales d'une heure dix étalées sur une semaine, des administrations de molécules ou de bactéries par l'abdomen, le colon ou la bouche, et un prélèvement de sang hebdomadaire à la joue. Le porteur décrit une possible perforation du colon, repérée à la présence de sang sur le ballonnet ou à l'anus. Les souris atteignant un point limite sont mises à mort, et le recours à l'animal est justifié par une douleur induite par le stress présentée comme une réaction de l'"organisme entier" impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

La douleur viscérale chronique atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients atteints de syndrome de l’intestin irritable. Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception (douleur) est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. A ce jour, il a été mis en évidence le rôle de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéro-neurones et responsables de douleur nociceptive. Comprendre comment ces médiateurs sont modulés au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier l’hypersensibilité viscérale. Le stress est un facteur important prédisposant à une hypersensibilité viscérale, incluant chez les patients atteints de syndrome de l’intestin irritable. Notre projet vise (1) à évaluer l’effet du stress sur la production et l’activation de médiateurs d'intérêt au niveau de l’intestin et de leur contribution au développement d’une hypersensibilité viscérale ; et (2) à moduler leur activité par l’utilisation de molécules pharmacologiques ainsi que de l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale.

Bénéfices attendus

Les méthodes alternatives permettant l’évaluation de la sensibilité viscérale de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. De plus, l'implication du stress entrainant une augmentation de la douleur est une réaction intégrée de l'organisme entier impossible a reproduire in vitro en intégralité. De plus, ce projet permettra de mieux comprendre la régulation de l’équilibre protéolytique intestinal et de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales.

Procédures

- distension colorectale 3 fois par souris étalée sur 1 semaine (la distension colorectale dure 1h10) - Administration intrapéritonéale (i.p), intracolique (i.c) ou per os (p.o) de molécules d’intérêts ou bactéries -prélèvement de sang à la veine mandibulaire 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale. La motilité et la perméabilité intestinales peuvent être modifiées dès 15 min après un stress aigu par administration d’hormone, mais elles sont toutes deux restaurées entre 1h à 2h suivant l’injection. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal. Si une présence de sang est décelée en fin de distension, les animaux sont surveillés dans les heures qui suivent ainsi que le lendemain pour vérifier une éventuelle perforation du colon.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de chaque procédure car des prélèvements de tissus et d'organes doivent être réalisés

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur induite par le stress est une des réaction intégrée de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans son intégralité.

Réduction

Tout au long du projet, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps (au minimum 1 fois par semaine) par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test Hémoccult II® et de de façon plus spécifique par l'observation grâce à un endoscope pour la tumorigenèse. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles que nous utiliserons dans ce projet. Les souris seront âgées d'au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures et pesant minimum 20g.

360 souris descendantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 36 d'entre elles étant conservées pour maintenir la lignée et les autres tuées, une partie dès le sevrage. Les mères gestantes sont gavées chaque jour de resvératrol ou d'un placebo, du huitième jour de gestation au sevrage, et leurs petits passent un test de suspension, un champ ouvert, un test d'acuité visuelle, une reconnaissance d'odeurs et un labyrinthe aquatique, l'ensemble étant qualifié de non douloureux. Ces souris portent une déficience génétique de la méthionine synthase limitée au cœur ou au cerveau, pour reproduire la maladie CblG, qui touche moins d'un enfant sur un million. Le porteur reconnaît que des études in vitro sur biopsies de peau de patients ont déjà montré l'effet des activateurs de SIRT1, et affirme qu'il est "indispensable" de tester les organes atteints chez l'animal.

Objectifs

La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.

Procédures

Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.

Impact sur les animaux

Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.

Devenir

Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).

Remplacement

tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.

Réduction

Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Choix des espèces

La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.

Immunodéficientes puis greffées avec des cellules souches de sang de cordon humain, 480 souris femelles portent un système immunitaire humain reconstitué, ce qui les expose à une maladie du greffon contre l'hôte, à des pertes de poids et à des plaies cutanées. Toutes seront tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasées sur le flanc, elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine sous la peau, deux injections dans l'abdomen par semaine et deux mesures de la tumeur au pied à coulisse, sans anesthésie. Le porteur écarte les analgésiques, susceptibles selon lui d'interférer avec les résultats, et prévoit la mise à mort 35 jours après la greffe, ou plus tôt si un point limite est atteint, pour analyses cellulaires et moléculaires.

Objectifs

Le cancer est la seconde cause de mortalité en France après les maladies cardio-vasculaires. Le cancer du sein est la première cause de décès par cancer chez la femme. Malgré d'importants progrès, il reste encore de nombreux traitements à tester, en particulier dans le champs des immunothérapies. Dans le cadre général de notre projet d'immunothérapie du cancer, nous cherchons à valider des anticorps thérapeutiques dans un modèle de cancer du sein implanté par la voie sous cutanée chez la souris humanisée. Les souris humanisées sont des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain après transfert de cellules souches de sang de cordon ombilical. Avec ce protocole, les souris régénerent un système immunitaire humain complet et fonctionnel quelques semaines après la greffe. Les objectifs du projet sont donc d'évaluer l'effet thérapeutique de différents anticorps sur la croissance de la lignée tumorale en l'absence ou en présence d'un système immunitaire humain. Le choix de la lignée de souris utilisée dans chaque expérience dépend de la cible de la thérapie, ces lignées de souris présentant des caractéristiques de reconstitution immunitaire particulières. La comparaison de la croissance des tumeurs avec ou sans traitement dans des souris humanisées ou non va nous renseigner sur l'efficacité des anticorps à aider le système immunitaire à contrôler la croissance de la tumeur. Ces informations pourraient être importantes pour développer de nouveaux traitements pour le cancer du sein.

Bénéfices attendus

La comparaison des croissances tumorales dans différents groupes de souris traitées nous renseignera sur la qualité de la réponse immunitaire contre le cancer du sein dans un modèle proche de la physiologie humaine donc plus pertinent que les études in vitro ou des études dans des modèles purement murin. Nous testerons des combinaisons thérapeutiques originales de médicaments destinés à la clinique humaine, susceptibles d'être transposées chez l'homme. Les bénéfices potentiels du projet sont donc nombreux, justifiant le recours à l'expérimentation animale.

Procédures

Les animaux humanisés vigiles sont prélevés à la veine mandibulaire une semaine après leur arrivée pour mesurer la qualité de la reconstitution en cellules humaines. Ce geste dure deux minutes par souris. Les animaux vigiles sont rasés sur le flanc droit avec une tondeuse dédiée puis greffés avec une lignée tumorale humaine par injection sous cutané avec une aiguille adaptée. Ce geste dure cinq minutes par souris. Les animaux sont traités deux fois par semaine avec les médicaments à tester avec une injection dans le péritoine avec une aiguille adaptée et pesées simultanément, avec contention appropriée. La taille de la tumeur est mesurée deux fois par semaine avec un pied à coulisses, sans anesthésie, avec contention appropriée. Les animaux sont euthanasiés pour analyses complémentaires soit à la fin de l'expérience (35 jours après la greffe de la tumeur), soit si un point limite est atteint.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles sont injectés par la voie sous cutanée. La croissance des tumeurs sous la peau pourrait conduire à une gêne dans les déplacements, des infections des plaies pouvant conduire à des nécroses, ou encore des douleurs. L'immunodéficience des animaux pourraient conduire à leur infection par des agents opportunistes, conduisant à des atteintes oculaires ou pulmonaires. Le prélèvement sanguin pourrait conduire à une hémorragie incontrôlée. Les injections répétées des traitements par la voie intra péritonéale pourraient conduire à des douleurs locales ou à des infections opportunistes. L'humanisation des souris immunodéficientes pourraient induire une maladie du greffon contre l'hôte, entrainant une perte de poids et/ou des plaies cutanées et/ou une diarrhée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure par une méthode réglementaire pour analyses cellulaires et moléculaires complémentaires, si ils ont atteint un des points limites définis ou si la durée de la croissance de la tumeur dépasse 35 jours.

Remplacement

Ce projet repose sur la mesure chez la souris des croissances tumorales d'une lignée de cancer du sein humain dans différentes conditions expérimentales et en présence d'un système immunitaire humain. Dans ce cas précis de recherches pré cliniques visant à évaluer l'efficacité de traitements expérimentaux, il n'est pas possible de remplacer l'expérimentation animale par des expériences in vitro, incapables de reproduire la complexité physiologique de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. De plus, seul le modèle des souris humanisées permet de répondre aux questions du projet et d'obtenir des résultats potentiellement transposables à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans le projet (480) est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Le groupe contrôle recoit les véhicules des deux molécules testées en combinaison. La taille des effectifs a été fixée à 6 animaux / groupe pour détecter une différence de 20 pour cent dans la croissance tumorale avec une puissance de 80 pour cent. Du fait de la variabilité de croissance tumorale entre souris, nous répéterons l’expérience pour chaque condition testée. Les groupes expérimentaux tests et contrôles seront réalisés simultanément, réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Chaque souris sera inclus dans un protocole d'analyse complet, allant de la mesure de la croissance tumorale aux analyses cellulaires et moléculaires subséquentes.

Raffinement

L’état général des animaux sera suivi quotidiennement par les membres de l'équipe et/ou par le personnel qualifié de l'animalerie. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en oeuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Il n'est pas prévu d'utiliser des analgésiques, ceux ci pouvant interférer avec les résultats de l'étude. Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu sera enrichi avec du papier et une maison pour permettre aux souris de faire un nid. Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. Les animaux reçoivent nourriture et eau en quantité non limité. Des points limites basés sur différents critères extérieurs (poids, comportement, aspect général,...) ont été établis.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes humanisées représentent le seul modèle d'une réponse immunitaire humaine contre une tumeur humaine in vivo. A ce titre, elles représentent le seul modèle vivant dans lequel des drogues à destination d'un usage clinique peuvent être testées. Il devient ainsi possible d'apprécier l'efficacité de telle ou telle drogue sur la réponse immunitaire contre la tumeur. Cette hypothèse est développé depuis de nombreuses années par l'équipe et le modèle nous a permis de proposer une nouvelle stratégie de traitement pour le cancer du sein. Le présent projet vise à utiliser les souris humanisées pour développer 5 nouveaux traitements contre le cancer du sein. Les souris humanisées sont livrées par le fournisseur entre 15 et 18 semaines d'âge. Ce temps est nécessaire pour le développement complet des lymphocytes T humains chez la souris à partir des progéniteurs humains greffés dans les souris à l'âge de 3 semaines environ. Les animaux non humanisés sont livrés à l'âge de 6 à 10 semaines. Seules des souris femelles sont utilisées dans ce projet.

Des souriceaux de 7 à 10 jours ont l'extrémité de la queue coupée sur moins de 2 mm, à vif, pour être génotypés. D'autres, nouveau-nés, sont endormis par hypothermie dans la glace avant un geste chirurgical sans réveil. 11 712 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comprendre comment trois gènes provoquent les mouvements miroirs congénitaux, une maladie humaine rare sans traitement. Le porteur chiffre à dix le nombre d'animaux par génotype, sans préciser en quoi consiste le geste chirurgical pratiqué sur les nouveau-nés.

Objectifs

Le syndrome des mouvements miroirs congénitaux (MMC) induit chez le sujet un mouvement incontrôlé d'une main qui mime le mouvement volontaire réalisé par la main opposée. Les personnes présentant des mouvements miroirs ne sont pas capables d'effectuer des tâches motrices unimanuelles pures, comme écrire et ont des difficultés pour les tâches bimanuelles nécessitant un contrôle indépendant des deux mains, comme ouvrir un pot de confiture. Il s'agit d'une maladie génétique rare dans laquelle les mouvements miroirs sont la seule manifestation clinique. Trois gènes sont connus à ce jour pour être impliqués dans cette maladie mais leur rôle n'est pas clairement identifié. L’objectif de ce projet sera d'identifier le mécanisme par lequel ils influent sur l'apparition de cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes de mise en place des axones des neurones impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires et des fonctions dans le système nerveux central d’une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN (constituant principal des chromosomes). A plus long terme et au-delà des connaissances fondamentales sur le développement du système permettant la réalisation des mouvements volontaires, nous espérons clarifier la pathogenèse des Mouvements en Miroir Congénitaux (MMC) et proposer de nouvelles hypothèses de travail pour la recherche clinique dans le champ des maladies du mouvement. En effet, l'étude de modèles animaux et cellulaires reproduisant les défauts génétiques impliqués dans les MMC clarifiera la pathogenèse de ce trouble. Cela est important car il n'existe actuellement aucun traitement, et certains patients ont une incapacité significative dans les activités de la vie quotidienne, des douleurs aux membres supérieurs, une inhibition psychosociale et une perte d'estime de soi en raison de la maladie. Enfin, l’étude des mutations détectées chez les patients atteints de MMC de la protéine connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN pourrait également intéresser le domaine de la réparation de l'ADN et du cancer.

Procédures

Un prélèvement de moins de 2mm de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles entre leur 7ème et leur 10ème jour de vie postnatale pour identification génique. Ce geste sera réalisé une seule fois et n’excèdera pas 2 minutes par animal. Certains animaux de ce projet présentent une ataxie (altération de la coordination des mouvements), ils seront euthanasiés dès l'apparition des signes. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire. Les nouveau-nés recevront un antalgique avant d’être profondément endormis par hypothermie dans la glace et d’être soumis à un geste chirurgical sans réveil (durée moins de 2 minutes). Ils ne seront pas en contact direct de la glace. Certains mâles seront isolés entre deux accouplements (4 mois maximum, isolement intermittent avec mise en accouplement 1 fois par semaine au moment de la génération des petits), cela pourra générer un stress.

Impact sur les animaux

Lors de la génération des animaux expérimentaux, l’isolement des mâles pour la réalisation des accouplements contrôlés pourra générer un stress. Le prélèvement de l’extrémité de la queue, pour connaitre le patrimoine génétique des animaux, peut générer une légère et brève douleur. Certains animaux de ce projet présentent une ataxie (altération de la coordination des mouvements). Ils ont ainsi des difficultés à maintenir leur posture et à se déplacer, ce qui peut générer un stress. Ils seront euthanasiés dès l’apparition des signes. L’anesthésie par le froid même sous analgésie pourra générer un stress. Toutes les contentions des animaux lors des manipulations engendreront un stress pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet soit parce que ce sont : i) des animaux non porteurs des génotypes d’intérêt pour notre étude, des reproducteurs qui atteindront un âge avancé (12 mois) et ne pourront donc plus être des reproducteurs, iii) des animaux expérimentaux pour l’analyse de leur cerveau.

Remplacement

Les neurones impliqués dans ce syndrome et qui contrôlent les mouvements volontaires ont leur corps cellulaire dans le cortex et leur axone va jusque dans la moelle épinière. Pendant le développement, ces axones traversent de nombreuses régions du cerveau. Il n’est pas possible d’étudier un faisceau qui traverse d’aussi nombreuses régions dans des modèles de culture cellulaire. Une fois les acteurs déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures cellulaires pour limiter le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Le nombre total d’animaux du projet sera de 11712. Pour le maintien de lignées et l’expérimentation, nous avons adapté les croisements en fonction de la complexité des lignées et des objectifs pour générer le moins d’animaux possible. Dès le nombre d’animaux reproducteurs ou expérimentaux atteint, nous arrêterons de générer de nouveaux animaux. Pour la partie expérimentale, des expériences préliminaires ont permis d’estimer à 10 le nombre d’animaux par génotype (calcul de puissance) pour obtenir des résultats statistiquement concluants. Nous optimisons ainsi la composition des groupes d'animaux en restreignant leur effectif tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement concluants. Par exemple dès que nous aurons obtenus le nombre de 10 petits par génotype et par âge, nous ne générerons plus d’animaux pour la partie expérimentale. Nous avons calculé un nombre théorique d’animaux pour le rafraîchissement en suivant les bonnes pratiques en élevage. Les souris d’une même lignée sont comme une grande famille avec des caractéristiques spécifiques héritées. Si une mutation génétique survient dans cette famille, elle peut devenir plus importante à cause des croisements entre membres de cette famille. Pour éviter cela, nous ajoutons de nouveaux membres à la famille avec un patrimoine génétique connu. Pour chaque croisement, le calcul du nombre de petits à générer a été optimisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés sous la surveillance de zootechniciens et du vétérinaire désigné. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d’espace et d’environnement, à savoir pas plus de 5 souris adultes par cage, la température et l’hygrométrie sont contrôlées journellement, les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h avec transitions progressives avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Pour l’enrichissement, du matériel pour réaliser un nid végétal sera placé dans la cage ainsi que du matériel à ronger (bâtonnet en bois). Pour les accouplements, une maisonnette est ajoutée. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Dans le cadre des mâles isolés des maisonnettes voire du kraft seront ajoutés comme enrichissement complémentaire. Les 2 manipulations pour l’identification et le prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux sont réalisées au même moment pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Elles seront sont réalisés par des personnes compétentes dans un endroit calme et dédié. Les souriceaux des portées de la lignée présentant un phénotype dommageable seront surveillés plus spécifiquement au moment de la mise en place de la locomotion. En effet, certains petits de cette souche mutante peuvent présenter un problème de coordination de leur mouvement qui les empêchent de se déplacer correctement. Les petits présentant ce signe clinique seront systématiquement euthanasiés. Les souriceaux endormis par le froid ne seront pas en contact direct avec la glace, ils seront dans un gant nitrile et recevront au préalable une injection d’analgésique. Pour assurer la reproductibilité et la validité de nos études, nous rafraîchirons régulièrement le patrimoine génétique de nos lignées afin de les garder aussi génétiquement similaire que possible aux lignées contrôles.

Choix des espèces

Les souris sont des rongeurs, et comme les écureuils, elles utilisent leurs deux pattes avant pour effectuer des tâches complexes, comme manipuler de la nourriture. Les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins chez les souris sont similaires à ceux que nous avons chez les humains. L’étude de ces neurones chez la souris représente un bon modèle pour mieux comprendre le syndrome des mouvements en miroir. Chez les souris, nous pouvons créer des modèles génétiques spéciaux qui nous permettent de comprendre comment certains gènes influencent certaines parties de leur cerveau. Ces modèles sont utiles car ils nous aident à éviter des mutations génétiques trop graves, tout en nous permettant d'analyser précisément comment un gène particulier fonctionne dans une région spécifique du cerveau. Dans cette étude, des souris femelles ou mâles seront étudiées à 3 stades. Pendant la période embryonnaire, moment où les premiers axones du faisceau que nous étudions traversent des régions importantes du cerveau pour leur développement. A la naissance l’âge où ces premiers axones traversent la ligne médiane et arrivent dans la moelle épinière. A l’âge adulte entre 3-4 mois. Les animaux reproducteurs auront entre 3 et 12 mois (maximum).

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de parasites du paludisme, puis un médicament dans l'eau de boisson ou par voie orale, et une goutte de sang prélevée à la queue tous les un à deux jours pendant sept à vingt-et-un jours. Un groupe est anesthésié puis exposé quarante-cinq minutes aux piqûres de moustiques, sans réveil. L'affaiblissement et l'anémie liés à l'infection figurent parmi les contraintes annoncées, et le porteur affirme qu'aucun système de culture continue de Plasmodium berghei ne permet de remplacer la souris pour les manipulations génétiques du parasite.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser les mécanismes d'infection par Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei. Ce parasite peut être étudié à tous les stades du cycle parasitaire, notamment après infection de moustiques Anopheles à partir de souris infectées. Le modèle d’infection de la souris par P. berghei reproduit de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permet d’étudier le rôle de facteurs parasitaires au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet vise à caractériser la fonction de protéines candidates à différents stades du cycle parasitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'améliorer notre connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, en identifiant des protéines essentielles à différents stades du cycle parasitaire. Les résultats pourraient permettre d'identifier de potentielles cibles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le paludisme.

Procédures

Un premier groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 10 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés). Un deuxième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 21 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Un troisième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 4 à 5 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes) suivie de l’exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes, sans réveil a posteriori). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 5 à 8 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales ou intraveineuses sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'approches génétiques. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les manipulations génétiques du parasite et pour les études fonctionnelles (étude de la croissance parasitaire dans le sang et transmission aux moustiques). Par contre, nous utiliserons des systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires) pour l'analyse de l'infection des cellules du foie par les parasites mutants (obtenus à partir de moustiques infectés).

Réduction

Au total ce projet utilisera 980 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites lors de l'infection in vivo, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie parce qu'ils ont reçu des substances dont les effets à long terme sont inconnus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées qui forment une poche d'air sous la peau de leur dos, poche ensuite regonflée, et chaque animal peut recevoir jusqu'à 224 administrations et subir jusqu'à 72 prélèvements sanguins sur cinquante-six jours. Le modèle sert à tester des anti-inflammatoires et la biocompatibilité de biomatériaux, de nanoparticules ou d'implants, y compris des molécules déjà commercialisées, pour des industriels. Le porteur écrit qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico, les réponses globales de l'organisme étant selon lui difficiles à simuler.

Objectifs

L’inflammation est un processus complexe en réponse à diverses agressions du corps. Cette réaction qui vise à éliminer l'agent agresseur, à réparer les tissus endommagés et à favoriser la guérison, se caractérise par des symptômes tels que le gonflement, la douleur et la rougeur au niveau des zones touchées. La crise inflammatoire est un mécanisme de défense vital qui aide à éliminer l'agresseur et à limiter les dommages. Cependant lorsque l'inflammation devient excessive ou persiste pendant de longues périodes, elle peut conduire à une inflammation chronique pathologique. Il est alors essentiel de disposer de traitements anti-inflammatoires pour éviter les complications à long terme. Actuellement il existe plusieurs médicaments anti-inflammatoires qui sont couramment utilisés pour contrôler l'inflammation et atténuer les symptômes de la crise inflammatoire. Cependant, ils présentent des effets secondaires parfois importants, ce qui limitent leur utilisation, et dans certains cas, l’inflammation résiste à ces traitements. Pour ces deux raisons le développement de nouvelles molécules reste un défi important. L’inflammation peut aussi avoir pour origine l’utilisation de biomatériaux, de nanoparticules ou d’implant dans le traitement de pathologies. Dans ce cadre il est important de tester la biocompatibilité des produits utilisés afin de sélectionner ceux qui seront le mieux tolérés par le corps.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements anti-inflammatoires et au développement de produits biocompatibles lorsque l’utilisation de biomatériaux est nécessaire. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique dans ce modèle, nous participons à une meilleure connaissance de sa prédictivité.

Procédures

Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir la formation d’une poche air. Les animaux auront un maximum de 224 administrations et un maximum de 72 prélèvements sanguins sur la période de maximum 56j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes. En cas injection intraveineuse, durée est d’environ 5 min. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Chacune des étapes de la formation de la poche prend moins de 3 min avec le temps de l’anesthésie et le temps l’injection. Le prélèvement du liquide de la poche prend moins de 5 min en tenant compte du temps d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les procédures mises en œuvre peuvent induire des douleurs chez l’animal notamment lors de la création de la poche, lors de l’inflammation induite ou si le produit testé induit une inflammation.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux seront utilisées pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes anti- et pro-inflammatoires in vitro, les réponses globales à court et moyen terme sont difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer nos modèles in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Néanmoins, les molécules et produits testés dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, plusieurs types de prélèvements seront associés. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous testons plusieurs molécules ou produits en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes contrôles. Comme aucune inflammation n’est attendue en l’absence d’injection de molécule immunostimulante dans la poche, le groupe sans injection de molécules immunostimulantes ne sera, en général, pas mis en œuvre. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, il comporte un tunnel en carton pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. La douleur induite par les étapes de création de la poche et de regonflage est prise en charge par un traitement anti-douleur. Les prélèvements de sang en cours d’expérience se font sous anesthésie et tous les autres prélèvements (ponction de la poche, prélèvement sanguin terminal) se font en phase terminale, sous anesthésie sans réveil. De plus nous avons établi des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études utilisant le modèle de la poche d’air. De plus ce modèle répond favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permet aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les besoins d’anti-inflammatoire et de matériaux biocompatibles peuvent apparaitre à tout âge, cependant comme beaucoup de ces phénomènes impliquent également le système immunitaire, l’utilisation de jeunes adultes au système immunitaire mature nous parait pertinent. De plus chez la souris il nous faut également des animaux pas trop petits pour des questions techniques de place dans le dos pour former une poche exploitable. Nous utiliserons donc des souris d’environ 12 semaines et rats d’environ 10 semaines au début de l’expérience.