Souris
Approche thérapeutique pour prévenir le développement de maladie neurodégénérative : évaluation de l’efficacité de candidats médicaments à un stade pré-symptomatique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour tester un candidat médicament avant l'apparition des symptômes, 792 souris porteuses d'une maladie neurodégénérative génétique sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le traitement est injecté sous la peau des souriceaux une à deux fois par jour pendant sept ou vingt-huit jours, avec un risque de rejet par la mère, puis neuf prélèvements sanguins sont faits à l'extrémité de la queue au fil de leur vie. Le porteur ne nomme ni la maladie ni la molécule, et annonce que les premiers symptômes, stress, angoisse et troubles moteurs, peuvent apparaître vers huit à neuf mois. Il écrit qu'un traitement efficace dès les stades précoces constituerait une "révolution" dans la prise en charge, alors que le projet en reste au stade préclinique.
Objectifs
Le projet de recherche vise à développer un médicament dont le traitement serait démarré précocement afin de stopper l’évolution d’une maladie neurodégénérative liée à un défaut génétique bien identifié. En effet, il a été montré qu’un traitement sous cutané avec cette molécule permettait d’améliorer les troubles du mouvements et psychiatriques de la souris atteinte de la maladie. Afin de développer un médicament pour les patients atteints de cette maladie à partir de cette molécule, nous allons dans ce projet démontrer qu’en intervenant très tôt dans le développement, bien en amont de l’apparition des symptômes, nous pouvons retarder voire bloquer l’apparition de la maladie.
Bénéfices attendus
Il a été démontré que notre candidat médicament peut améliorer les troubles du mouvement et psychiatriques dans des modèles souris de la maladie à des stades symptomatiques. Il s’agit d’une maladie familiale dont le diagnostic génétique peut être connu bien avant l’apparition des symptômes mais pour lequel aucun traitement curatif n’existe. Disposer d’un médicament efficace dès les stades précoces de la maladie permettrait de bloquer le développement de cette dernière et consistuerait une révolution dans la prise en charge de cette maladie.
Procédures
Le traitement sera réalisé par voie sous cutanée une ou deux fois par jour pendant 7 ou 28 jours (
Impact sur les animaux
Le traitement sera réalisé chez des souriceaux dont le principal effet indésirable est un éventuel rejet par la mère (exclusion du nid). Une toxicité liée à l’excipient est possible. Un léger stress et une fatigue liés à la réalisation de tests comportementaux sont possibles, ainsi qu’un léger stress lié au prélèvement sanguin chez l’animal adulte. Les premiers symptômes de la maladie peuvent apparaitre en fin de vie autour de 8-9 mois d’âge (stress, angoisse et/ou symptômes moteurs).
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin de prélever les cerveaux sur lesquels seront réalisées des analyses biologiques qui nous permettront de comprendre les mécanismes du traitement.
Remplacement
Nous cherchons à étudier les effets d’un traitement précoce avec notre molécule sur l’apparition des symptômes de la maladie à long terme. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de cette maladie.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu notre projet de façon progressive. Ainsi, le projet est constitué de 4 expériences indépendantes : l’expérience 2 ne sera réalisé que si l’expérience 2 a montré des résultats satisfaisants et ainsi de suite. Si dès l’expérience 1 les résultats ne sont pas satisfaisants, l’étude sera arrêtée et les expériences 2, 3 et 4 ne seront pas réalisées.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les animaux seront hébergés dans des cages en respectant les normes en vigueur. Les cages sont équipées de litière (avec possibilité de faire un nid) et d’un accès illimité à l’eau et à la nourriture standard, le tout changé toutes les semaines. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites (poils hérissés, prostration, isolement dans la cage), et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement sera administré par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ce geste.
Choix des espèces
Les études précédemment réalisées avec cette molécule ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter nos données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à montrer qu’un traitement à un âge précoce peut retarder voire bloquer l’apparition de la maladie, notre étude sera réalisée sur des souriceaux et des souris adultes.
Etude des pathologies liées à l’âge associées à une dérégulation de SHP2 (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles musculosquelettiques
1 664 souris vont être utilisées pour étudier un vieillissement accéléré lié au syndrome de Noonan, toutes tuées à l'issue, dont 1 184 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun, injectées à l'insuline, gavées cinq jours sur sept pendant vingt-huit jours, piquées huit fois pour mesurer leur glycémie, irradiées puis greffées en moelle osseuse. Leur force est mesurée en les étirant par traction de la queue, leur équilibre par des tests hors de leur cage. Le porteur indique que certaines lignées créées pour le projet développeront des tumeurs, et affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du syndrome de Noonan (SN), une maladie génétique relativement fréquente principalement causée par des mutations sur le gène codant la proteine tyrosine phosphatase SHP2, qui causent une trop forte activation de cette protéine. Les patients présentent de multiples atteintes développementales (malformations du cœur, du crâne, du squelette, retard de croissance), mais aussi des troubles communément retrouvés chez l’individu âgé dans la population générale : syndrome métabolique, ostéoporose, cancers du sang, inflammation systémique, faiblesse musculaire. A l’appui de ces observations cliniques, de premières données in vitro révèlent un phénomène de vieillissement accéléré (appelé sénescence) dans des cellules exprimant des formes mutées de SHP2. De même, un modèle de la maladie développé chez la souris, en mutant le gène codant SHP2 pour introduire la mutation responsable de la maladie chez l’Homme, présente ce même vieillissement dans ses tissus dès son plus jeune âge. Ces données suggèrent que l’hyperactivation de SHP2 associée au SN pourrait provoquer un phénotype de vieillissement précoce dont nous souhaitons élucider les mécanismes, et qu’en miroir, l’inhibition de SHP2 pourrait freiner le développement de maladies liées à l’âge. Les objectifs du projet sont donc - de caractériser un modèle murin du SN du point de vue des pathologies liées à l’âge et de la longévité. - d’identifier les mécanismes responsables de ce phénotype, en explorant le rôle de la sénescence, des cellules du système immunitaires et de certaines hormones, dont on sait déjà qu’elles présentent des anomalies dans le SN. - d’évaluer si l’inhibition de SHP2 permet d’améliorer les pathologies liées à l’âge.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux comprendre la physiopathologie du SN afin de proposer des stratégies thérapeutiques et un suivi adapté aux patients. Au-delà des maladies rares, ce projet pourrait permettre d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le développement des pathologies liées à l’âge.
Procédures
-La mise à jeun des animaux pendant 6h pour normaliser la glycémie. -L’injection d’insuline et la contention associée sont réalisées une fois, durée max 15s. -Le gavage et la contention associée (durée
Impact sur les animaux
-Effets indésirables liées à l’établissement de nouvelles lignées : Certaines lignées générées dans le cadre de ce projet pourraient développer des tumeurs ce qui peut être source de douleur et de perte de poids mais pourra être anticipé par le suivi de l’expression précoce d’un marqueur fluorescent dans les cellules cancéreuses. -La mise à jeun des animaux représente un stress. -L’injection d’insuline et la contention associée sont source d’inconfort et de douleur légère au point d’injection. -Le gavage et la contention associée (durée
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
Le syndrome de Noonan (SN) est une maladie génétique pour laquelle les patients portent dans toutes leurs cellules une mutation dite « gain-de-fonction » sur le gène codant pour SHP2, c’est-à-dire qui rend la protéine plus active. Les souris modèles de cette maladie développent les principaux symptômes de la maladie et représentent en ce sens le meilleur modèle d’étude de cette pathologie. Ce projet vise à mieux comprendre la physiopathologie du SN au regard du développement de pathologies liées à l’âge, ce qui nécessite un modèle intégré permettant une étude à l'échelle de l'organisme entier prenant en compte notamment des échanges hormonaux, du dialogue inter-organe et la contribution de cellules sanguines. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les procédures expérimentales présentées à l’appui de ce projet ne peuvent donc pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Toutefois, des tests in vitro sur cellules en culture ont été préalablement réalisés pour limiter au maximum l'expérimentation sur l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour répondre aux différentes questions scientifiques exposées dans ce projet a été déterminé en se basant à la fois sur les données bibliographiques et sur des études préliminaires déjà réalisées par le porteur du projet au cours des précédents projets. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène, des groupes de 8 animaux seront nécessaires afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour les suivis tout au long de la vie des animaux, 20% d’animaux supplémentaires seront prévus pour pallier des pertes d’animaux en cours de protocole. Dans un souci de réduction, le projet a été designé afin de réaliser plusieurs expériences sur les mêmes groupes dès lors qu’elles ne sont pas susceptibles d’interférer les unes avec les autres. Les tissus et organes prélevés seront collectés afin de pouvoir réaliser différents types d’analyses.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (igloo, frisure, papier) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause de bagarres ou pour certaines expériences). Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 2 fois par semaine pour repérer les blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal, maigreur, problème de dentition), et pesés 1 fois par semaine. De plus, toutes les procédures engendrant de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera utilisé en parallèle de ces procédures pour minimiser toute douleur.Les points limites sont: émaciation ou perte de poids > 20% en moins d’une semaine, hypothermie, cumul de signes de souffrance (prostration, poil hirsute, dos rond, perte d'activité, ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté comme indiquant un état de souffrance auquel nous ne serions pas en mesure de remédier dans les 24h) atteignant un scoring >9. Ceux-ci permettront d’écarter précocement les animaux du protocole ou de les mettre à mort immédiatement en fonction de l’intensité des comportements observés et donc du niveau de souffrance. Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience.
Choix des espèces
Les modèles murins utilisés dans ce projet représentent les seuls modèles de mammifères génétiquement modifiés pour reproduire la maladie humaine SN. De plus, les souris représentent un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques, endocriniennes et cardiaques. Pour la caractérisation d’un éventuel phénotype dommageable des lignées, les animaux seront suivis dès la période de croissance (3-8 semaines). Le reste des expériences, s’agissant de suivre des pathologies liées à l’âge, sera réalisé sur des animaux adultes de 3 à 24 mois.
Evaluation chez le rongeur, de la biodistribution de composés chimiques ou biologiques par des méthodes froides ou radioactives, avec placement des animaux en cage métabolique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1250
Placés en cage à métabolisme sur sol grillagé, mis à jeun jusqu'à seize heures et privés d'eau jusqu'à quatre heures, 1 250 souris et 1 250 rats seront tous tués pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques, parfois radiomarqués, par voie orale, intranasale, intratrachéale, intravésicale ou intracérébrale, certaines administrations passant par une minipompe implantée chirurgicalement. La phase sur animaux vivants peut durer douze mois. Le porteur reconnaît que le sol ajouré gêne la locomotion et que ces cages sont plus petites que les cages standard, et conclut que la pharmacocinétique réelle des molécules "devra donc être vérifiée chez le rongeur".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo l’absorption, la distribution, la métabolisation et l’excrétion de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Les paramètres de distribution et d’excrétion des composés seront si possible déterminés préalablement in vitro, ce qui conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat) et de la souche à utiliser pour évaluer la biodistribution in vivo dans le sang, les urines, et les différents organes. Dans certains cas, il sera possible d’avoir recours à une forme radiomarquée des composés afin de faciliter leur dosage et l’identification de leur distribution. La première procédure de ce projet permettra de révéler la pharmacocinétique des composés testés in vivo, par administration unique ou répétée (dans le respect des recommandations vétérinaires concernant les voies, volumes et fréquences) de la molécule froide ou radioactive, avec placement en cage à métabolisme d’une durée maximale de 72h. La deuxième procédure traitera le cas particulier où des placements longs ou répétés en cage à métabolisme seront nécessaires, uniquement pour les souris. Pour les deux procédures et dans certains cas, les administrations nécessiteront une pose chirurgicale d’implant (de diffusion prolongée sous cutanée, intraveineuse ou intrapéritonéale). Ces chirurgies seront réalisées stérilement, sous anesthésie avec analgésie couvrant toute la durée de la chirurgie et dans le respect des recommandations du comité d’éthique. Des prélèvements divers (sang, urines, fèces, liquide cérébro spinal etc, dans le respect des recommandations vétérinaires) pourront être effectués in vivo afin de doser le composé dans ces fluides, et des prélèvements d’organes pourront avoir lieu, exclusivement post mortem.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la pharmacocinétique in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 12 mois. Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.
Procédures
Des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon ); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Pour les administrations orales où l’alimentation pourrait biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Ils seront pesés et éventuellement réhydratés après le jeûne. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 mois dans le cas de composés froids et 2 mois pour les composés radiomarqués. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure . Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages à métabolisme au maximum 168h ou 7 fois 24h espacées de 24h sur 2 semaines glissantes si une mise à jeun n’est pas prévue. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.
Impact sur les animaux
Afin de réaliser certains tests de biodistribution, il pourra être nécessaire de mettre les animaux à jeun d’alimentation, au maximum 16 heures. Pour certaines administration intravésicales, il pourra être nécessaire de les priver d’eau au maximum 4h. Cela pourra générer une sensation de faim, de soif et une légère déshydratation, et une perte de poids légère. Des pertes de poids liées aux composés administrés pourraient être observées. Dans le cas des placements en cage à métabolisme, les animaux pourront être hébergés individuellement (avec les congénères visibles), dans des cages plus petites que les cages standard, avec un fond ajouré gênant modérément la locomotion. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat. Dans le cas du placement en cages à métabolisme, les animaux seront sur un sol grillagé ce qui pourrait gêner leur locomotion.
Devenir
Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques dont la pharmacocinétique sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (tests sur hépatocytes, microsomes etc) afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules. La pharmacocinétique réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été déterminé sur la base des expériences passées dans notre centre, pour choisir le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Dans le cas de screening de nouvelles molécules, au maximum 5 animaux par groupe seront inclus. Le nombre sera adapté en fonction de la variabilité attendue de la pharmacocinétique du composé. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux par groupe devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux. Des analyses statistiques seront effectuées
Raffinement
Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : 10% de perte du poids : animaux pesés quotidiennement et des capsules d’eau gélifiées seront mises à disposition dans les cages. 10-15%: animaux réhydratés une fois par jour. > 15% ou se maintenant plus de 3 jours au-delà de 10% : point limite. En cas de suspicion de toxicité, un arbre décisionnel validé par la SBEA et le comité d’éthique sera utilisé pour décider de l’arrêt du traitement, de traitements de support et/ou de l’euthanasie de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront mis en suivi clinique. Ces animaux seront examinés tous les jours et recevront si nécessaire un traitement pharmacologique avec l’objectif de l’étude. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. Toute opération chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie en matinée afin d’assurer un meilleur suivi post-chirurgical (observation toutes les 2 heures durant les 6 heures post opératoires puis au moins 1 fois par jour). La couverture analgésique débutera avant le début de la chirurgie pour une durée minimale de 48h pouvant être rallongée en cas de besoin selon les recommandations du comité d’éthique. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : • Les administrations IV, IM, IP, SC, ID de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Les administrations IN, IT, intravésicale, intrathécale, intracérébrale (avec cadre stéréotaxique) de composés tests se feront sous anesthésie générale à l’Isoflurane. • Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID et avant les administrations intravésicales, intracérébrales et intrathécales. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermales, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermales se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur.• L’implantation d’une mini pompe (IP, IV ou SC) ou la pose d’implants sous-cutanés seront réalisées sous anesthésie générale Isoflurane et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique 30 min avant l’anesthésie, puis jusqu’à 48 heures post chirurgie si besoin. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées si nécessaire.
Choix des espèces
Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera utilisée pour évaluer la pharmacocinétique des nouveaux composés in vivo, du fait de son faible poids et car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Dans le cas contraire, le rat sera utilisé. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Toutefois, le rat sera aussi très utilisé en particulier du fait des études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée car il est imposé par la règlementation de réaliser des études sur le rat. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.
Hétérogénéité des astrocytes dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées à douze mois pour analyse de leurs tissus, 808 souris subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, une fenêtre implantée dans le crâne et des séances mensuelles d'imagerie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 720 d'entre elles. Le projet porte sur des sous-populations d'astrocytes chez des souris modèles de la maladie d'Alzheimer et de la maladie de Huntington. Le porteur détaille huit tests comportementaux qu'il qualifie de "peu stressants", auxquels s'ajoutent des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine sur les femelles, puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Soixante souris ne servent que de stimulus social ou de source d'urine pour les tests des autres, et seront transférées vers d'autres projets ou tuées.
Objectifs
Les astrocytes sont des partenaires clés pour les neurones dans le cerveau. Ils remplissent des fonctions importantes pour le bon fonctionnement des neurones. Les astrocytes sont des cellules hétérogènes, qui sont impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (MA), dans lesquelles ils présentent des changements importants et peuvent avoir des effets délétères ou bénéfiques. Des études récentes montrent que des populations distinctes d'astrocytes coexistent dans les cerveaux atteints de la MA mais leurs impacts sur les neurones sont encore inconnus. Nous avons développé des outils qui permettent de mettre en évidence des sous-populations d'astrocytes dans le cortex d'un modèle murin de la MA et de les analyser fonctionnellement. Ce projet vise à 1) compléter la caractérisation des ces sous-populations dans un modèle plus progressif et reproduisant plus fidèlement les atteintes moléculaires de la MA, 2) analyser leur dynamique d’apparition, 3) comparer ces sous-populations à celles présentes dans le cerveau de souris modèles de la maladie de Huntington, une autre maladie neurodégénérative, 4) cibler une sous-population identifiée comme délétère pour l’inhiber et en évaluer les effets thérapeutiques sur les altérations typiques de la MA dans une souris modèle.
Bénéfices attendus
La MA touche plus de 900 000 personnes en France et représente un fardeau sociétal majeur. Jusqu'à présent, la plupart des stratégies thérapeutiques ont ciblé directement les neurones et ont malheureusement échoué en clinique. Les astrocytes assurent des fonctions clés dans le cerveau qui peuvent être perturbées dans la MA, lorsque les astrocytes sont réactifs. Manipuler ces cellules de soutien pour les rendre plus favorables aux neurones apparaît comme une stratégie alternative potentielle. Les astrocytes sont des cellules hétérogènes qui changent de manière spécifique lors de maladies. Ces changements doivent être définis avec des techniques dédiées. Notre approche permet la caractérisation fonctionnelle des sous-populations d’astrocytes et leur manipulation. Si elle une sous-population d'astrocytes réactifs du cortex de souris est identifiée comme défectueuse en 1ère partie du projet, nous la ciblerons dans la 2e partie de ce projet. Notre approche thérapeutique basée sur le ciblage spécifique de sous-populations d'astrocytes pourrait être plus efficace que des stratégies centrées sur les neurones. En se focalisant sur les astrocytes, ce projet générera de nouvelles connaissances sur la MA et sera facilement transférable à d'autres maladies cérébrales.
Procédures
Les souris recevront une injection intracérébrale sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris). Après 1 mois, certaines souris recevront une injection sous anesthésie gazeuse de 5 minutes. D’autres souris passeront 8 tests de comportement, 4 mois après une injection unique. Ces tests durent entre 5 min et 1h chacun et seront réalisés sur 6-7 semaines en laissant 2-3j de repos entre chaque test. Ces tests sont peu stressants et se basent principalement sur des comportements naturels (exploration, interactions avec congénères). Certaines souris seront implantées avec une fenêtre crânienne sous anesthésie générale et analgésie, pour réaliser de l’imagerie cérébrale sur souris habituées à la contention. Huit sessions de 30 min maximum, seront réalisées chaque mois de l’âge de 5 mois jusqu’à leur euthanasie à 12 mois. Certaines femelles seront prises en contention pendant quelques minutes pour réaliser un frottis vaginal (1 fois par souris) et prélever leur urine (4 fois à 4 jours d’intervalle). Enfin, certaines souris auront un prélèvement de liquide céphalorachidien sous anesthésie et analgésie avant leur euthanasie (prélèvement de 30 min maximum). Les changements comportementaux liés à la modélisation de la maladie d’Alzheimer (réduction fine de la mémoire, légère anxiété mesurées sur des dispositifs dédiés et sensibles) et de la maladie de Huntington (changements légers de motricité mesurés par des dispositifs sensibles, et moins de gain de poids) représentent des nuisances extrêmement légères, qui n’entravent pas la capacité des souris à se nourrir, déplacer, et réaliser leurs comportements habituels en captivité
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris utilisées dans ce protocole sont les suivantes : douleur liée à la chirurgie et l’implantation d’une fenêtre crânienne pendant les quelques jours suivants la chirurgie et faible stress ponctuel lié à la contention lors de l’imagerie biphotonique et aux tests comportementaux (qui durent moins d’1h chacun).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’âge de 12 mois, pour analyse post mortem complète des tissus. Les 20 souris femelles et 40 souris mâles naïves servant de stimulus pour les tests de comportement d’interaction sociale et d’exposition à l’urine de femelle, n’ayant pas reçu d’injection ou de chirurgie seront proposées pour utilisation dans d’autres projets et dans le cas contraire seront euthanasiés.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones (les cellules vulnérables dans la maladie d’Alzheimer) et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes. Ces interactions cellulaires ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. De plus, la vulnérabilité de certaines régions cérébrales nécessite de comparer sur l’organe entier les différentes régions cérébrales qui ont parfois des connections anatomiques et fonctionnelles cruciales pour expliquer cette vulnérabilité sélective, et ne sont pas reproduites in vitro dans toute leur complexité. En particulier, il existe des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui possèdent des mutations génétiques impliquées dans les formes familiales de la maladie d’Alzheimer et reproduisent de nombreux altérations typiques de la maladie d’Alzheimer. Ces modèles permettent d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement cérébral, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui a un rôle clé pour moduler l’inflammation cérébrale. Ces souris modèles ont également l’avantage de permettre d’évaluer des symptômes cliniques typiques de la maladie d’Alzheimer (ex. déficits mnésiques, anxiété), ainsi que leur potentielle restauration par notre stratégie thérapeutique. Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre d’identifier le rôle de sous-populations d’astrocytes dans les déficits caractéristiques de la maladie d’Alzheimer, en les ciblant par des stratégies thérapeutiques adaptées.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 868 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris. Par example, certaines souris auront une évaluation de leur comportement puis seront analysées au niveau biochimique, histologique ou transcriptomique. Les analyses de types « omiques » permettent d’obtenir un grand nombre d’informations à partir d’une souris, de même l’imagerie longitudinale permet d’analyser la même souris au cours du temps au lieu de devoir euthanasier des souris différentes à chaque temps d’analyse. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation (points limites évalués par une grille de suivi), permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liée aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris. L’habituation des souris à la contention et à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant les tests comportementaux permet de réduire le stress des souris. Seules les souris hétérozygotes modèles de la maldie de Huntington seront générées et utilisées dans ce projet, qui ne présentent pas de perte de poids.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère. Les souris modèles de la maladie d’Alzheimer utilisée dans ce projet permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes corticaux dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Elles présentent aussi des altérations cognitives et comportementales caractéristiques de cette maladie. La maladie d’Alzheimer se déclare chez l’adulte. Les altérations histologiques, biochimiques, transcriptionnelles ainsi que les altérations fines du comportement apparaissant dans ce modèle de la maladie d’Alzheimer vers 6-9 mois. Les souris seront analysées entre 5 et 12 mois en fonction du décours des symptômes analysés.
Evaluation de phénotype dommageable lors de la création par croisement ou de la réception de lignées de souris sur le plateau d’élevage. Elevage de lignées de souris génétiquement modifiées.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
122 000 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage de lignées génétiquement modifiées, 12 000 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'activité déclarée tient en une biopsie d'oreille pour génotypage et en la surveillance des lignées dont la modification génétique altère la santé, par exemple par une susceptibilité accrue aux tumeurs. Environ 107 800 souris seront tuées, 12 200 gardées pour la reproduction et 2 000 réutilisées, le porteur indiquant que les souris au génotype sans intérêt sont mises à mort quand aucun autre projet ne peut les prendre. Sur les 122 000 déclarées, la très grande majorité n'existe donc que pour faire naître les quelques individus porteurs du bon génotype.
Objectifs
Il s'agit de définir et de détecter des lignées de souris pouvant altérer leur bien-être dans un élevage de souris génétiquement modifiées et de produire des souris génétiquement modifiées nécessitant une caractérisation génétique.
Bénéfices attendus
Ceci permet de produire et de maintenir des lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à des projets de recherche en raffinant les techniques d'élevage de ces lignées. Ceci permet à la fois de détecter et de prendre en charge l'apparition de caractères dommageables. Ce projet permet d'anticiper la prise en charge des signes nécessitant des soins et de permettre une réaction immédiate en cas d'apparition de ces signes.
Procédures
Identification et prélèvements pour caractérisation des souris (moins d'une minute). Biopsie pour génotypage qui concerne les souris du projet. Conditions d'élevage spécifique des modèles adaptés en fonction de l'évaluation de l'impact du modèle sur le bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés au caractère dommageable des lignées entretenues : par exemple, une susceptibilité plus grande à l'apparition de tumeurs... La biopsie pour génotypage qui sera faite à l’oreille.
Devenir
Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures expérimentales dans d'autres établissements utilisateurs ou peuvent servir en tant que reproducteur. Les animaux dont le génotype n’a pas d’intérêt pour les projets expérimentaux initiaux sont soit utilisés pour d’autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs quand c’est possible, soit euthanasiés s’il n’y a pas de possibilité de les utiliser dans d’autres procédures.
Remplacement
Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques).
Réduction
La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire (d'une part pour l'évaluation du phénotype dommageable et d'autre part la production de lots expérimentaux). La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc).
Raffinement
Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des signes attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (frisottis, batonnet de coton, maison en carton si besoin, mise à disposition si besoin de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière, etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions sanitairess sont élevées afin de réduire le risque de caractère dommageable lié au statut sanitaire. La biopsie pour le génotypage se fait à l'oreille.
Choix des espèces
Souris, car on peut facilement créer et produire de nouveaux modèles pour répondre à une question scientifique. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.
Rôle d’une activation chronique de la voie STING dans les fonctions lymphocytaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour entretenir une lignée de souris porteuses d'une mutation qui affaiblit leur système immunitaire et enflamme leurs poumons, 545 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent un prélèvement au bout de la queue pour le génotypage, et chaque adulte destiné aux expériences une prise de sang sans anesthésie, juste avant sa mise à mort pour le prélèvement des organes. Les souris mutantes grandissent moins et meurent davantage à partir de six mois, et une grille de score hebdomadaire fixe le point limite qui déclenche leur mise à mort. Le porteur juge la règle du remplacement "pas applicable ici", faute de pouvoir étudier in vitro les coopérations entre cellules immunitaires. Les souris gardées pour l'entretien de la lignée et les croisements restent en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions des lymphocytes (cellules incluses dans les globules blancs et impliquées dans la réponse du système immunitaire) ce qui conduit à induire un déficit immunitaire (baisse de la fonction d’une partie au moins des cellules du système immunitaire) chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris portant cette mutation ainsi que l’identification de la mutation par analyse génétique pour identifier les animaux.
Bénéfices attendus
Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire. Un prélèvement tissulaire et un prélèvement sanguin seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.
Impact sur les animaux
Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire à phénotype dommageable avec une croissance moins importante et une mortalité accrue à partir de l’âge de 6 mois. Les souriceaux seront prélevés à la queue pour le génotypage, et un prélèvement sanguin sera réalisé sur chaque animal adulte utilisé dans les expériences, juste avant la mise à mort. Ces gestes peuvent générer de la douleur, cependant les gestes réalisés sont des gestes de base, rapides (moins de 2 minute par geste), pour lesquels nous sommes expérimentés, donc ils ne nécessitent pas d'anesthésie. De plus les animaux sont habitués à la contention réalisés pendant ces gestes, ce qui réduit leur stress.
Devenir
Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.
Remplacement
La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.
Réduction
Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.
Raffinement
Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.
Choix des espèces
En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.
Rôle du remodelage de la matrice extracellulaire dans la fibrose associée au lymphoedeme secondaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Section du réseau lymphatique de la peau et ablation des ganglions de l'aisselle et du bras : 256 souris femelles sont opérées sous anesthésie pour provoquer un lymphœdème, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent ensuite, éveillées, une injection quotidienne d'une substance non nommée, cinq jours par semaine, pendant deux à huit semaines selon les groupes, puis une lymphographie sous anesthésie générale. Le porteur décrit le lymphœdème comme "une pathologie douloureuse et handicapante", puis annonce chez ces souris un seul effet indésirable, un gonflement de la patte opérée de 10 à 15 %. À l'issue de la lymphographie, elles sont tuées sans réveil pour récolter leurs tissus.
Objectifs
La principale fonction du système lymphatique est de collecter la lymphe, ce fluide riche en protéines et en lipides, afin de le ramener à la circulation sanguine par le biais de la veine sous-clavière. Ces deux systèmes travaillent en étroite collaboration afin de maintenir l’équilibre homéostasique de l’organisme. En cas de perturbation de ce système, lors du traitement du cancer (ablation des ganglions lymphatiques, radiothérapies, chimiothérapies), on observe la formation d’oedèmes massifs qui peuvent, à long terme, devenir douloureux et handicapants: les lymphoedèmes. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Pour ce projet, nous allons utiliser un modèle murin de lymphoedème secondaire induit pas une section cutanée du réseau lymphatique associé à un curage ganglionnaire axillaire et brachial chez la souris. Les vaisseaux lymphatiques interagissent étroitement avec la matrice extracellulaire les environnant. Des changements dans la composition ou les propriétés biomécaniques de cette matrice sont donc susceptibles d’inhiber leurs fonctions. Nous étudierons dans ce modèle le développement de la fibrose (accumulation et remodelage pathologique de matrice), les régulations moléculaires des facteurs de croissance lymphangiogéniques et des protéines impliquées dans le remodelage de la matrice ainsi que les propriétés bio mécaniques de cette matrice afin d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction endothéliale lymphatique en normalisant la matrice extracellulaire et ainsi de pouvoir proposer un traitement pour le lymphoedème
Bénéfices attendus
Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal.. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure
Impact sur les animaux
L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet
Remplacement
Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.
Raffinement
Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA).
Choix des espèces
L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.
Caractérisation génétique et fonctionnelle des réseaux neuronaux recrutés pendant et pour le sommeil paradoxal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier les neurones qui commandent la paralysie musculaire du sommeil paradoxal, 60 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Chacune subit une ou deux chirurgies de quatre-vingt-dix minutes pour l'infusion de substances dans le cerveau et la pose d'un dispositif d'enregistrement, puis vit isolée dans un baril individuel pendant les quatre semaines d'expérimentation. Le porteur compte parmi les nuisances le stress de cet isolement et le dérèglement provoqué du sommeil, l'objectif étant de reproduire chez la souris les mouvements violents du trouble comportemental humain. Il écarte la mouche, le poisson zèbre et le ver C. elegans faute de sommeil paradoxal, et juge que les organoïdes cérébraux ne constituent "pas encore" une alternative crédible.
Objectifs
Le sommeil paradoxal (SP) pendant lequel nous rêvons se caractérise au niveau physiologique par une forte activité cérébrale et une paralysie musculaire. Plusieurs pathologies sont associées à une défaillance de cette paralysie comme les apnées/ronflement, la narcolepsie-cataplexie et les troubles comportementaux en SP (TCSP). Le patient souffrant de TCSP extériorise ses rêves sous la forme de mouvements involontaires violents (bagarres, coups, cris, paroles). Le TCSP est un trouble neurologique annonciateur de maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et serait dû à la mort des cellules nerveuses contrôlant la paralysie du SP. Nos travaux antérieurs chez le rat ont permis d’identifier ces neurones et de montrer expérimentalement que lorsqu’on les lèse, on est capable de reproduire un tableau symptomatique proche du TCSP humain alors que le SP lui-même est par ailleurs normal. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes cérébraux responsables du SP qui sont largement inconnues. Pour aborder cette question, nous proposons d’affiner les connaissances physiologiques et fonctionnelles des cellules nerveuses contrôlant la paralysie du SP chez la souris par l’utilisation d’un éventail d’approches génétiques et moléculaires et ainsi mieux comprendre les causes neurologiques du TCSP. Si nos modèles d’étude nous permettent d’induire des signes de TCSP, nous aurons réussi à créer un nouveau modèle animal de cette pathologie qui nous permettra ensuite de comprendre l’origine des mouvements anormaux du TCSP et d’élaborer des traitements ciblés efficaces.
Bénéfices attendus
Malgré le nombre croissant d’études tentant de comprendre le sommeil paradoxal et ses fonctions physiologiques et cognitives, de nombreuses zones d’ombre persistent. A ce jour, une seule aire cérébrale a été définie comme directement impliquée dans le SP sans que son rôle exact soit clairement établi. Ce présent projet de recherche expérimentale vise donc à approfondir nos connaissances fondamentales sur le SP et préciser sa contribution fonctionnelle. Notre objectif translationel est également de développer de nouveaux modèles de souris mimant au plus près le tableau symptomatique du TCSP humain, plus pertinents pour la recherche de traitements que ceux actuellement disponibles. Le TCSP étant un biomarqueur avant courreur de la maladie de Parkinson, la compréhension de ses mécanismes neuro-pathologiques est un réel enjeu de santé publique pour tenter d’intervenir précocement chez les patients et empêcher ou à défaut retarder l’apparition de la maladie de Parkinson.
Procédures
Selon la procédure considérée, les souris seront soumises à 1 ou 2 intervention(s) chirurgicale(s) d’une durée moyenne de 90 minutes chacune, sous anesthésie réversible, pour l’infusion intracérébrale de substances pharmacologiques et la pose du dispositif d’enregistrement chronique du sommeil. Pendant toute la durée des procédures (4 semaines consécutives), les souris seront hébergées individuellement avec enrichissements. A la fin d’un protocole permettant la visualisation des neurones actifs pendant le SP (2 jours), toutes les souris seront euthanasiées sous anesthésie létale et leur cerveau prélevé pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
Les 3 procédures peuvent être classifiées de sévérité modérée. Les nuisances et effets indésirables envisagés sont : - Stress lié à l’isolement - Stress léger lié aux manipulations par l’expérimentateur - Dérèglement du SP sous la forme de TCSP - Inconfort au réveil à la suite des différentes chirurgies - Gêne dans les premiers jours lié au dispositif d’enregistrement des états de vigilence - Inconfort transitoire due au protocole permettant de marquer les neurones actifs lors du SP - Gêne transitoire liées à l’administration des molécules permettant de moduler l’activité des neurones
Devenir
Toutes les souris incluses dans chacune des 3 procédures seront euthanasiées afin de collecter les biopsies cérébrales pour analyses post-mortem.
Remplacement
Des animaux comme la mouche, le poisson rouge ou le vers C. elegans sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal spécifique aux mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour étudier des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques liées à des pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson. Il s’agit de recherche fondamentale supposant l’utilisation d’animaux vivants et en bonne santé. La dissection fine des réseaux neuronaux ne peut être réalisée chez l’homme par les techniques globale mises en œuvre en recherche clinique (imagerie cérébrale et polysomnographie). Dans ce contexte, l’utilisation de la souris reste essentielle car elle est adaptée aux études physiologiques et comportementales longitudinales.
Réduction
La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Sur la base de nos nombreux travaux précédents publiés, nous avons ainsi calculé une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe, avec 6 groupes expérimentaux, pour un total de 60 souris mâles et femelles. Ce nombre d’animaux tient compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données, des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales, de la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés et de la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps pouvant rendre leur interprétation aléatoire. De facto, le retrait de ces animaux sera requis pour garantir la validité de l’ensemble de l’étude.
Raffinement
Pour minimiser le stress et maintenir les interactions sociales, les souris seront autant que possible hébergées groupées. Durant chacune des procédures, des enrichissements seront systématiquement ajoutés pour contribuer à leur bien-être. Après chaque chirurgie, elles seront hébergées en cage double pour faciliter le suivi post-opératoire (traitements médicamenteux et analgésiques si besoin) avant de les isoler dans un baril individuel pour toute la durée des expérimentations. Les produits chimiques testés seront utilisés aux plus faibles doses en se basant sur la littérature et notre expertise. Notre préoccupation quotidienne sera de détecter si l’état de santé général se dégrade subitement au cours des expérimentations. Ceci sera facilité par l’utilisation d’une grille de score de bien-être établie sur la base de critères classiques comme le poids, la mobilité, l’aspect du nid et le toilettage. Si un point limite est atteint, l’animal sera retiré des expérimentations et euthanasiés sans délai.
Choix des espèces
Le SP est une caractéristique commune aux mammifères incluant la souris, le rat et l’homme, avec une organisation anatomique cérébrale globalement très similaire. Les modèles animaux alternatifs (drosophile, poisson zèbre, Caenorhabditis elegans) de plus en plus utilisés dans ce domaine de recherche sont cependant dépourvus de SP et donc sans pertinence pour nos travaux. Le rat a été largement utilisé dans la recherche sur le SP en raison de sa capacité à imiter les caractéristiques clés des pathologies humaines mais avec des limitations en particulier pour l’utilisation des nouveaux outils de biologie moléculaires et cellulaires. La souris permet de contourner ces limites et est de fait un modèle de choix pour la mise en œuvre d’approches génétiques et moléculaires afin de confirmer et d’approfondir nos connaissances sur le SP et ses pathologies. Des souris C57bl6 jeunes adultes de 10-12 semaines au début des procédures seront utilisées. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale, possédant un système locomoteur mature, un cycle circadien veille-sommeil jour/nuit consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et dans la littérature chez la souris. Enfin, l’efficacité de la transfection neuronale par AAVs est maximale chez les souris jeunes adultes. Il s’agira de souris sauvages, mâles, jeunes adultes âgées 10-12 semaines au début des procédures. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale, possédant un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris. De plus, l’efficacité de la transfection neuronales par AAVs est maximale chez les souris juvéniles et jeunes adultes et décroit rapidement avec l’âge.
Rôle des sous-populations de macrophages dans l’homéostasie et l’adaptation métabolique du tissu adipeux brun chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Soumises à des séries de gavages, d'injections dans l'abdomen, de jeûnes de douze heures et d'expositions au froid, 5 240 souris seront toutes tuées pour prélever leur tissu adipeux brun, dont 2 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Certains protocoles cumulent sur le même animal douze semaines de régime gras, vingt-six gavages, deux injections et vingt prélèvements sanguins. Le porteur indique que l'insuline peut provoquer une hypoglycémie et le froid une hypothermie allant jusqu'à la perte du réflexe de redressement et la prostration. Il affirme qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée, la souris permettant d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses.
Objectifs
Il existe deux types de graisse corporelle (tissu adipeux) chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc stocke les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun, au contraire, est spécialisé dans la dépense énergétique : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. Ce phénomène permet ainsi de maintenir la température corporelle lors de l’exposition au froid mais aussi de réguler la quantité de graisses et de sucre dans l’organisme. L’activation du tissu adipeux brun a donc émergé comme une stratégie thérapeutique pour lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète. En plus des cellules adipeuses, le tissu adipeux contient aussi de nombreuses cellules immunitaires, dont certaines s’appellent macrophages. Alors que le rôle des macrophages dans le tissu adipeux blanc est largement étudié, leur rôle dans le tissu adipeux brun est mal connu. Ce projet a pour objectif de comprendre le rôle des différentes populations de macrophages présentes dans le tissu adipeux brun dans la régulation de son activité métabolique et le développement de l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment les macrophages du tissu adipeux brun régulent le métabolisme énergétique. Cela pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour brûler les graisses et le sucre et lutter contre les maladies métaboliques comme l'obésité et le diabète.
Procédures
Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : - 2 gavages + 1 prélèvement sanguin - régime spécial pendant 2 semaines + 1 prélèvement sanguin - 2 injections intrapéritonéales + 1 prélèvement sanguin - 2 gavages + 2 injections intrapéritonéales + 1 prélèvement sanguin - régime spécial pendant maximum 3 semaines + 2 injections intrapéritonéales + 1 prélèvement sanguin - 3 injections intrapéritonéales + exposition de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 3 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 2 gavages + 3 injections intrapéritonéales + exposition de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin ou régime spécial pendant 2 semaines + 6 injections intrapéritonéales + exposition de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 2 gavages + 3 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin ou régime spécial pendant 2 semaines + 6 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 1 semaine de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 1 prélèvement sanguin - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 2 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins - 1 semaine de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 4 gavages + 1 prélèvement sanguin - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 26 gavages + 2 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 17 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins - 12 semaines de régime standard ou riche en graisses à des températures expérimentales + 10 gavages + 2 injections intrapéritonéales + jeûne de 12h + 20 prélèvements sanguins
Impact sur les animaux
La contention pour effectuer les injections intrapéritonéales, gavages et prélèvements sanguins peut entraîner un stress. Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales répétées et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. L’utilisation d’un régime spécial peut entrainer une perte de poids transitoire. La mise à jeun entraine une perte de poids. Le régime riche en graisses entraîne une prise de poids. L’injection d’insuline peut provoquer une hypoglycémie. L’exposition au froid peut entrainer une hypothermie. Une hypothermie sévère peut s’accompagner d’une perte du réflexe de redressement, d’une prostration ou d’une léthargie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l'analyser in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour comprendre la diversité, l’origine et les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons pour les élevages des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles dans certaines procédures. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous utiliserons des aiguilles très fines et nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injections. Le suivi sanitaire quotidien assuré par le personnel de l’animalerie et les visites régulières par les personnes participant au projet (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’ensemble des procédures se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 7 semaines).
Comprendre une maladie rare du sang, la maladie de Vaquez, grâce à deux modèles de souris génétiquement modifiées.
- Recherche appliquée
- Cancers
16 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À trois semaines, les souriceaux reçoivent une bague métallique dans l'oreille et se font couper deux millimètres de queue sur animal éveillé, puis une partie est rendue anémique par injection, une autre irradiée avant une greffe de moelle osseuse, avec prélèvement de sang chaque semaine. Le porteur indique que les lignées génétiquement modifiées présentent un risque accru de caillots et de cancer du sang, et que l'irradiation provoque diarrhées et infections. Le nombre déclaré tient à l'élevage requis pour obtenir les génotypes voulus, le porteur justifiant la réduction par le seul recours à des tests statistiques.
Objectifs
La maladie de Vaquez est une maladie qui se caractérise principalement par ses complications de caillots sanguins liées à une production excessive de globules rouges et de plaquettes. Elle survient vers 55-60 ans en moyenne chez l'homme et peut se compliquer dans environ 20% des cas en cancer du sang impactant directement le pronostic vital. Les approches thérapeutiques actuelles demeurent palliatives pour la plupart. Depuis plusieurs années, les travaux de recherche ont permis d'identifier une modification au niveau d'un gène présente chez environ 85 % des maladies de Vaquez. Un modèle souris exprimant cette modification génétique permet de disposer d'un modèle d'étude reproduisant la pathologie humaine. Notre projet aura pour but de comprendre les mécanismes qui entrainent l'apparition d'un cancer et de tester de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
L'analyse fine des mécanismes impliqués dans l'apparition d'un cancer du sang dans la maladie de Vasquez et le développement d'un nouveau modèle de souris doit permettre d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes qui pourront être testées dans des essais cliniques chez l’Homme afin d’espérer éradiquer les cellules initiatrices de cette maladie. Ces nouvelles approches thérapeutiques permettront d’améliorer l’espérance de vie et la qualité de vie des patients atteints de ce type de cancer du sang.
Procédures
Pour réaliser ce projet, nous réaliserons dans un premier temps l'élevage de plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Cela nous permettra d'avoir à disposition un modèle reproduisant la pathologie humaine. Cet élevage consiste à mettre en accouplement des souris mâles et femelles et lorsque les souriceaux seront âgés de 3 semaines, nous réaliserons une identification (pose d'une bague métallique numérotée au niveau d'une oreille, réalisée sur souris éveillée; durée: 30 secondes) et le prélèvement de 2 mm de l'extrémité de la queue (sur souris éveillée; durée: 5 secondes). Ce fragment de tissu permettra d identifier les animaux qui présentent la ou les mutations génétiques d'intérêt. Nous utiliserons ensuite une partie de ces souris pour créer une anémie. Pour cela les souris seront injectées dans l'abdomen avec une substance induisant la destruction des globules rouges (durée de l'injection: 10 secondes sur souris éveillées). 29 jours après cette injection, les souris recevront (injection dans l'abdomen sur souris éveillées) une injection d'une molécule permettant de mesurer la prolifération des cellules sanguines. 24h plus tard, les souris seront euthanasiées. Une autre partie des souris produites seront irradiées (étape réalisée sur souris éveillées permettant d'éliminer les cellules de la moelle osseuse avant de réaliser une greffe; durée: 15 minutes). Ces souris recevront ensuite la greffe (injection par voie intraveineuse; durée 1 min) de cellules de la moelle osseuse de souris non génétiquement modifiées. Chaque semaine, un prélèvement de sang (durée 20 sec) sera réalisé afin de suivre la prolifération et le développement des cellules greffées. Un partie de ces souris recevront un traitement médicamenteux minant ce qui est fait chez l'homme lors de protocole de thérapie.
Impact sur les animaux
Une partie des souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet présenteront des altérations affectant leur bien-être (modification de la composition sanguine entrainant de risque de coagulation et de formation de caillots, risque accrue de développer un cancer du sang). Les autres nuisances sont directement liées au protocoles expérimentaux mise en place: destruction des globules rouges (= anémie) entrainant un affaiblissement de l'état général de la souris; irradiation provoquant des troubles digestifs (diarrhées) et une plus forte susceptibilité aux infections; la répétition des prélèvements sanguins entrainant une douleur passagère (piqure) et un stress à l’animal; injection des drogues associés à des effets secondaires d’ordre digestifs en général (diarrhées, nausées…); injections répétées des traitements pouvant entrainer des lésions au site d’injection et une irritation du tube digestif dans le cas du gavage.
Devenir
L’évaluation de l’efficacité du traitement nécessite la mise à mort de l’animal, notamment en point final. Ils seront donc tous euthanasiés. La moelle osseuse, la rate et le sang seront récupérés en post-mortem pour l’évaluation en point final à l’issue des expériences menées (mesure de l’efficacité d’un traitement, récupération et étude des cellules du système sanguin).
Remplacement
Le remplacement sera proposé à chaque fois que cela sera possible (évaluation en première intention des nouvelles thérapies par des tests en milieu artificiel dans des plaques de culture cellulaire). Cependant, certaines questions nécessitent d’avoir recours à des approches utilisant un organisme vivant entier. L'évaluation des nouvelles stratégies thérapeutiques nécessitent en effet d'avoir une vision d'ensemble (biodisponibilité du médicament, rôle de l'environnement à proximité des cellules sanguines, interaction entre les différentes populations de cellules sanguines).
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à ce projet, nous nous sommes appuyés sur l'utilisation de tests statistiques, afin d'obtenir des données interprétables statistiquement tout en utilisant le nombre minimum de souris.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En cas de signes de souffrance, une administration d'anti-douleur sera réalisée. Si aucune amélioration n'apparaît, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement et la génétique est bien connu et proche de l’humain. En effet, il existe des souris génétiquement modifiées pour le gène trouvé comme étant anomal chez les patients atteints de la maladie de Vasquez. De plus, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. Dans la partie élevage, les souris sont mises en accouplement à l'âge de 8 semaines (maturité sexuelle) et l'identification des souriceaux se fera à l'âge de 4 semaines (âge où il est facile d'identifier les souris mâles des souris femelles et de les séparer de leurs parents). Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (modèle de greffe ou injection de traitement), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.
Comprendre le rôle du CD36 intestinal dans l’apparition des maladies métaboliques et de l’inflammation associée : utilisation de « faux lipides » bio-sourcés et dérivés d’acides gras naturels chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées à l'issue pour prélever intestin, foie et tissu adipeux, 448 souris sont mises à jeun douze heures, gavées à l'huile puis saignées par ponction intracardiaque, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le projet cherche à établir si le récepteur CD36 de l'intestin contribue à l'obésité, en comparant des souris normales et deux lignées génétiquement modifiées. Le porteur reconnaît que le jeûne tombe sur la phase nocturne d'alimentation des souris et devient donc plus stressant, tout en classant l'ensemble en gravité légère. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir au modèle animal pour une approche intégrée, tout en menant en parallèle un volet sur cultures cellulaires qu'il compte comme une démarche de remplacement.
Objectifs
L’obésité est caractérisée par un excès de graisse corporelle et est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’au diabète de type 2. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité. En effet, des altérations du fonctionnement de CD36 chez l’Homme sont associés à une augmentation du risque d’obésité. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité tels que la lipémie et l’inflammation postprandiales. Ces effets sont d’autant plus importants qu’un être humain passe plus de la moitié de son temps en phase postprandiale. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36, or ce récepteur est ubiquitaire. La contribution physiologique spécifique de CD36 au niveau intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur cellulaire CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques postprandiales (procédure 1). Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation (procédure 2). Pour ce projet, nous utiliserons des souris sauvages et deux modèles de souris génétiquement modifiées : des souris n’exprimant pas du tout le récepteur CD36 dans la totalité de leur organisme et des souris n’exprimant pas le récepteur CD36 uniquement au niveau intestinal. Nous utiliserons deux molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité
Bénéfices attendus
Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être utilisés comme éventuelles molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire la lipémie et l’inflammation postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.
Procédures
Procédure 1 Trois interventions : une mise à jeun de 12h, le gavage et le prélèvement sanguin (intracardiaque sous anesthésie générale). L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une (agonistes seulement) ou deux fois (d’abord agonistes, puis huile). C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui se fait sur souris vigile. Il consiste à introduire la canule de gavage dans l’œsophage des souris correctement et habilement contentionnées par un expérimentateur habitué à ce geste, qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin (intracardique), puis euthanasiées, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt (intestin, tissu adipeux péri-épididymaire et foie). Procédure 2 Une intervention : une mise à jeun de 12h. Les souris sont ensuite anesthésiées puis euthanasiées sous anesthésie, pour réaliser les prélèvements d’intestin.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures avant le gavage à l’huile ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. La mise à jeun nécessaire de 12h se fait sur la nuit lors de leur phase de nourriture nocturne et s’avère donc plus stressante pour les animaux qui auront toutefois un accès ad libitum au biberon d’eau pendant cette période. L’étude de l’hypertriglycéridémie postprandiale nécessite une préhension des animaux afin de les gaver ce qui peut être invasif pour les souris (maîtrise du geste par un expérimentateur formé).
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.
Remplacement
Le remplacement total est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée. Toutefois, ce projet de recherche intègre un versant culture cellulaire pour appréhender de façon plus fine les voies de signalisation intracellulaire. Cette approche s’intègre donc dans une démarche de remplacement car tout ce qui est réalisé sur cellules ne nécessite pas l’utilisation d’animaux.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : - réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires a été calculée grâce au site (http://www.biomath.info/power/ index.html). Utiliser une approche ex vivo des segments intestinaux qui permet de réaliser trois échantillons indépendants par souris.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis (signes généraux de souffrance, perte de poids supérieure à 20% en 7 jours). En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet et euthanasié sous anesthésie générale. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des souris wild-type et des lignées de souris génétiquement modifiées présentant une délétion totale ou spécifique au niveau intestinal du récepteur CD36,. Ces souris n’ont pas un phénotype dommageable, elles se portent bien, se comportent bien et ont un état de santé général identique à des souris non génétiquement modifiées. Les animaux seront utilisés au stade adulte mature et d’âge moyen (3 à 12 mois) afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.
Induction de maladie démyélinisante chez le petit animal de laboratoire à la Cuprizone. Et évaluation de l’action de cellules thérapeutiques par injection intracérébrale dans ce modèle animal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 1125
Nourris quotidiennement à la cuprizone pour provoquer une dégénérescence du cerveau, puis injectés dans le cerveau sous anesthésie, 1 125 souris et 1 125 rats seront tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet évalue pour un donneur d'ordre extérieur des cellules thérapeutiques dont la nature n'est pas précisée, avec mise à mort d'animaux à des temps intermédiaires et autopsie systématique. Interrogé sur le remplacement, le porteur ne mentionne aucune alternative sans animaux et recopie mot pour mot son paragraphe sur la surveillance des effets indésirables. Il justifie le choix du rongeur par la transposition des doses aux "premiers patients", et présente l'injection intracérébrale comme porteuse de "grands espoirs thérapeutiques sur le long terme".
Objectifs
Ce projet a pour but d'évaluer les effets d’une injection intracérébrale de cellules thérapeutiques fournies par notre client, chez le petit animal de laboratoire atteint de dégénérescence cérébrale. Ce mode d’administration intracérébrale d’agents thérapeutiques vient bousculer aujourd’hui les schémas thérapeutiques classiques de faible efficacité dans le traitement de certaines maladies induisant la dégénérescence du système nerveux central. De nombreux essais d’administration intracérébrale se multiplient aujourd’hui au stade préclinique voire pour certains au stade clinique, car ils représentent de grands espoirs thérapeutiques sur le long terme. Des études pilotes seront réalisées pour chaque type de cellules thérapeutiques étudiées. Dans ce contexte, il est prévu de réaliser le suivi de ces cellules ainsi que tout marqueur physiologique et/ou physiopathologique identifié dans le sang. De même, l’analyse de certains organes préalablement choisis sera réalisée afin de confronter les résultats des différentes observations, mesures, dosages spécifiques. Dans le cadre de ce projet, un autre type cellulaire de référence connu pour ses effets sera choisi dans l’axe thérapeutique ciblé et sera administré pour comparaison. La durée des protocoles d’étude variera de 2 jours à 6 mois, en fonction de la durée d’induction de la dégénérescence cérébrale et des cellules thérapeutiques à évaluer. Des animaux seront sacrifiés à différents temps intermédiaires. A chaque sacrifice, une analyse des cadavres et des organes sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - A court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur les processus de dégénérescence cérébrale ainsi que sur la tolérance et l’efficacité des cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central. - A moyen terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur la détection et le suivi des modifications physiologiques apparaissant au cours du développement de maladies dégénérescentes ainsi que sur l’injection intracérébrale de cellules thérapeutiques chez le petit animal de laboratoire. - A plus long terme : ce projet devrait permettre d’établir des plans de prévention et de diagnostic robustes et précoces indispensables à la prise en charge de du système nerveux central (identification de nouvelles cibles thérapeutiques)
Procédures
L’administration de la cuprizone se fera quotidiennement via la nourriture (à raison de 0.2% du poids de la nourriture). Le temps d’administration dépendra du design du protocole et des résultats des études pilotes. Les injections des cellules thérapeutiques dans le système nerveux central seront réalisées sur animaux anesthésiés et maintenus sur tapis chauffant. L’administration sera unique. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés. Quand nécessaire, une analgésie appropriée sera appliquée à l’animal avant le prélèvement. Les prélèvements au niveau de l’aorte abdominale ne se feront qu’en point final avant sacrifice de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifiés, les animaux seront autopsiés minutieusement et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser tout marqueur physiologique/physiopathologique et/ou évaluer une toxicité éventuelle par exemple. Les organes seront également utilisés afin de localiser les cellules thérapeutiques et/ou pour réaliser d’autres dosages spécifiques en parallèle des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations préalablement transmises par les donneurs d’ordre avant toute mise en œuvre du projet. Ces effets indésirables seront évalués en première intention dans le cadre d’études pilotes dont le design sera ajusté aux doses et à la durée des traitements. Plus précisément, le traitement appliqué aux animaux pour induire une dégénérescence cérébrale pouvant induire des effets indésirables, nous surveillerons quotidiennement les animaux. De même, la possible réaction inflammatoire résultant de l’injection de cellules thérapeutiques sera suivie de près. Plus généralement, les différents effets indésirables possibles et les actions correctrices associées sont décrits dans l’Annexe 1.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux différents traitements et en en accord avec le Code rural et de la pêche maritime, 15 animaux par groupe sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Dans le cas ou leur hébergement ne pourra se faire en groupes, un enrichissement adapté sera fourni et un suivi renforcé sera effectué. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par le traitement à la Cuprizone et/ou les différents principes actifs testés afin d’éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’injection stéréotaxique, des traitements antalgiques pré et post chirurgie dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien, et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisis pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les cellules thérapeutiques injectées dans le système nerveux central étant fréquemment évaluées chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats à l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.