Souris

Pour vérifier in vivo des résultats déjà obtenus en culture cellulaire, 280 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Elles reçoivent soit une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie, soit une injection dans la veine de la queue, sur animal vigile en contention, pour créer des foyers tumoraux dans les poumons. Le porteur conclut à l'impossibilité de modéliser la réponse immunitaire antitumorale en dehors d'un organisme vivant, et prévoit d'analyser rates et tumeurs sur les mêmes animaux au titre de la réduction. Les seuls effets qu'il retient sont le stress de la manipulation et de la contention, avec la mention que les injections "ne sont pas décrites pour être douloureuses", rien n'étant dit de ce que produit une tumeur pulmonaire chez une souris.

Objectifs

Des résultats contradictoires sur l’effet de certaines cellules immunitaires sur la croissance tumorale reposent sur le fait que 2 types de cellules peuvent être observés : les cellules protumorales et les anti tumorales. Le mécanisme qui contrôle la transformation entre certaines cellules protumorales et anti tumorales reste encore inconnu mais pourrait être un outil majeur dans la lutte contre l’immunosuppression médiée par le cancer. L’élucidation de ce mécanisme pourrait nous aider à trouver des médicaments qui pourraient favoriser in vivo la conversion des cellules pro tumorales en cellules anti tumorales. Au regard de nos expériences précédentes réalisées in vitro montrant un rôle essentiel d’un récepteur aux signaux de danger dans la balance entre pro et anti tumorales, il nous paraît aujourd’hui essentiel de les valider in vivo. En effet, la culture de cellules ne permet pas d’appréhender la complexité des organismes vivants, et d’autant plus lorsqu’il s’agit d’immunité. C’est pourquoi, nous souhaitons poursuivre ce projet par des expériences réalisées chez la souris. L’utilisation de modèles animaux nous permettra de mener à bien ce projet et de répondre aux questions suivantes : Les modifications observées in vitro sont-elles vraies in vivo ? Comment s’effectue leur activité antitumorale ? Le récepteur aux signaux de danger peut-il servir de cible thérapeutique ?

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir montrer que NLRP3 (récepteur des signaux de danger ) au sein des cellules immunitaires peut servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Procédures

Dans le cas des tumeurs sous cutanées les souris recevront une injection de cellules tumorales. Le geste dure +/- 10 secondes. Dans le modèle de foyers tumoraux pulmonaires les souris recevront les cellules par une injection dans la veine caudale dans un système de contention. La procédure dure 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane. Dans le modèle de foyers tumoraux pulmonaires les souris vigiles recevront les cellules par injections dans la veine caudale, dans un système de contention. Les injections ne sont pas décrites pour être douloureuses. Sur la durée de l’expérience, ces modèles de tumeurs ne provoquent pas de nécrose. Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisées in vitro. La réponse immunitaire anti-tumorale étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible d’en modéliser l’entièreté en dehors d’un organisme vivant.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront répétées que deux fois et les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, nous avons fait appel à une méthodologiste afin de déterminer au mieux le nombre minimal de souris requis pour que nos tests statistiques soient suffisamment puissants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. En cas de signes de douleur ou de souffrance les souris seront mises à mort. Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles sous forme génétiquement modifiée.

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome au flanc droit puis un gavage quotidien pendant deux semaines, soit quatorze gavages, certaines subissant en plus trois injections dans l'abdomen. Le porteur indique que la tumeur pourra les gêner dans leurs déplacements et leur causer de la douleur, et que le gavage peut irriter l'oesophage jusqu'à entraîner des difficultés pour s'alimenter, sa réponse étant de déposer de l'aliment au sol. Il affirme que le recours aux animaux est "nécessaire" parce que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier le système immunitaire, alors que l'efficacité de la molécule a déjà été démontrée sur ces mêmes modèles cellulaires.

Objectifs

Le mélanome malin cutané est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Aujourd'hui, le seul traitement efficace reste la chirurgie pratiquée à un stade précoce car une fois disséminées, les cellules de mélanome deviennent résistantes aux chimiothérapies conventionnelles. Les espoirs apportés par l'essor des thérapies ciblées et de l’immunothérapies ont été fortement nuancés par des cas de non-réponse ou rechutes rapides. Nous avons identifié, à travers l’étude de cellules de patient, une molécule capable resensibiliser les cellules tumorales de patients, initialement résistantes, aux traitements conventionnels. Ce projet a pour but de démontrer chez la souris l’efficacité de cette molécule sur la sensibilité des cellules de mélanome, dans un organisme vivant complexe.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra potentiellement de mettre en évidence l’effet thérapeutique de notre molécule sur le mélanome et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteint de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec un mélanome résistant.

Procédures

Tous les animaux subiront une injection sous-cutanée de cellules tumorales ainsi qu'un gavage par jour pendant deux semaines (soit 14 gavages). Certains subiront aussi 3 injections de traitement dans l'abdomen. Tous les animaux seront soumis à de la contention, qui durera moins d'1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra potentiellement les gèner dans leur déplacement et leur générer de la douleur. Le gavage peut provoquer une irritation de l'oesophage, entrainant des difficultés pour l'alimentation. La contention va également leur générer du stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car les souris ne rentreront pas dans un nouveau protocole, au maximum 1 mois après injection, si aucun point limite n'est atteint avant cette date. Les tumeurs seront récupérées pour être analysées.

Remplacement

Des études préliminaires sur des modèles cellulaires ont été réalisées et ont permis de démontrer l'efficacité de notre molécule. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé grâce à des outils statistiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (pousse tumorale, analyse histologique et moléculaire de la tumeur). Enfin, les groupes contrôles étant communs aux 2 procédures, nous allons les réaliser qu'une seule fois.

Raffinement

Des points limites précis ont été définis pour identifier le plus précocément possible toute souffrance de l'animal. Un analgésique sera utilisé si une souris présente l'un de ces points limites. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine, et tous les jours lorsque le traitement par gavage débutera. Après traitement, les souris seront suivies 3fois par semaine jusqu'à leur mise à mort. Pour le gavage, nous utiliserons l’excipient CornOil, le moins irritant et le mieux toléré pour la souris. Nous avons également choisi des lignées non métastatiques car nous n'évaluerons pas cette donnée dans nos procédure. De l'aliment sera mis sur le sol si une souris a des difficultés pour s'alimenter.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études du mélanome car c'est un modèle proche de la pathologie humaine reproduisant les caractéristiques histologiques. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, âge standard pour l'étude du système immunitaire.

Pour tester un peptide anticancéreux sur une leucémie lymphoïde aiguë, 100 souris immunodéficientes sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit une greffe de cellules leucémiques, jusqu'à seize séances d'imagerie hebdomadaires et autant d'injections sous anesthésie générale, jusqu'à trente injections de traitement et deux prélèvements sanguins, sur une durée pouvant atteindre seize semaines. Le porteur affirme qu'aucune nuisance spécifique n'est attendue de l'injection de cellules tumorales dans le sang "vu la durée de maintien des animaux en procédure", tout en indiquant plus loin que tous les animaux seront porteurs de tumeurs au moment de leur mise à mort. Il écrit être arrivé au stade où l'évaluation du peptide chez la souris devient "indispensable", alors que la molécule a déjà montré son efficacité chez l'être humain sur des tumeurs solides.

Objectifs

Le laboratoire développe des peptides, petites molécules qui ont la capacité de perturber les mécanismes de mort cellulaire. L'un de ces peptides a déjà montré son efficacité sur des tumeurs solides chez la souris mais également chez l'être humain et son mode d'action et les premiers résultats in vitro nous amènent à envisager une efficacité sur les cancers du sang, telles que les leucémies lymphoïdes aiguês. Après avoir mis en place le modèle de croissance tumorale et le suivi en imagerie d'une lignée cellulaire de leucémies lymphoïde aiguê, nous sommes arrivés au stade où l'évaluation du peptide sur un modèle de souris de la maladie est indispensable. Ceci pourra potentiellement améliorer la stratégie de prise en charge de ce type de cancer en élargissant l'éventail thérapeutique proposé aux patients.

Bénéfices attendus

Si une efficacité de notre peptide est établie sur ce modèle in vivo, cela permettra d'élargir son utilisation aux tumeurs liquides et d'orienter son développement clinique, au bénéfice des patients concernés par cette maladie.

Procédures

Injection : 1 par souris, durée 1 min sous anesthésie. Suivi en imagerie 1 fois par semaine pendant 16 semaines maximum, soit 16 séances/souris. Elles durent entre 5 et 15 min. Injection pour imagerie: 1 fois par semaine pendant 16 semaines soit 16 injections/animal sous anesthésie générale. Ce geste dure moins de 30 sec. Traitement médicamenteux par injection, sous anesthésie locale, 5 fois par semaine pendant 4 à 6 semaines (selon l'efficacité du traitement), soit 30 injections/souris max. Cette injection dure moins de 30 secondes. Prélèvements de sang: n=2, durée 2 minutes, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang entraîneront un stress physique léger et transitoire (préhension) et une douleur et une contrainte légères et transitoires (injections sous anesthésie locale ou générale). Les séances d'imagerie entraineront une contrainte légère et transitoire (anesthésie générale). Aucune nuisance spécifique n'est attendue de l'injection de cellules tumorales dans le sang (tumeurs hémtatologiques) vu la durée de maintien des animaux en procédure.

Devenir

En fin de procédures, tous les animaux sont euthanasiés car ils seront tous porteurs de tumeurs et pour examen sur cellules et tissus post-mortem.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier, les interactions avec le microenvironnement, la dissémination métastatique, ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ce modèle animal va permettre d'étudier l’efficacité de la molécule testée sur la leucémie lymphoïde aiguë afin de proposer le meilleur traitement aux patients lors d’études cliniques.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, d'après les données bibliographiques et nos connaissances sur ces types cellulaires, 2 concentrations cellulaires sont suffisantes pour optimiser le schéma de croissance tumorale. Cette étape permettra également d'optimiser le protocole de bioluminescence, non décrits dans la littérature. De même, 2 doses de la molécule d'intérêt seront suffisantes pour évaluer l'efficacité du traitement, car notre molécule a déjà montré son efficacité sur d'autres types tumoraux. Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficacité anti-tumorale, une étude statistique préliminaire a permis d'établir le nombre d'animaux greffés pour chaque étape du projet.

Raffinement

Le suivi par imagerie permet une évaluation précise et précoce de la croissance tumorale. Les souris sont greffées sous anesthésie générale par inhalation ou par anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les administrations intraveineuses et intrapéritonéales seront réalisées sous anesthésie locale par application cutanée d'un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement afin de détecter précocement le développement de la tumeur ou l'apparition de signes cliniques. Des points limite précis ont été définis et seront strictement respectés. Si des signes de douleurs sont détectés un analgésique adapté sera administré. Les animaux seront stabulés en groupe, aliment et eau ad libitum. Un enrichissement adapté sera présent dans toutes les cages. En cas de suspicion de mal-être, un enrichissement supplémentaire sera ajouté. L'atteinte d'un point limite entraînera l'euthanasie de l'animal sous 24h.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches immunodéficientes permettant le développement de tumeur d'origine humaine. La leucémie lymphoïde aiguë est un cancer qui touche essentiellement les enfants. Les animaux seront utilisés à partir de 4-5 semaines.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fibrose pulmonaire leur est induite par injection intranasale de lipopolysaccharides, de bléomycine ou d'élastase sous anesthésie, puis elles reçoivent des candidats médicaments dont le mode d'administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du "sponsor". Le porteur écrit que l'injection intranasale "ne provoquera pas de nuisance" et que le principal effet indésirable se limite à une modification de la respiration, alors qu'il décrit par ailleurs une maladie d'issue fatale par insuffisance respiratoire. Il annonce aussi que l'administration des candidats médicaments "aura des conséquences bénéfiques sur le développement de la maladie", ce qui pose comme acquis le résultat que l'étude est censée établir.

Objectifs

Les maladies pulmonaires sont généralement associées à une inflammation des voies respiratoires. Parmi les plus graves on retrouve la fibrose pulmonaire, caractérisée par une détérioration progressive du tissu pulmonaire conduisant à une inflammation généralisée et à la formation de cicatrices pulmonaires. Cette pathologie perturbe les échanges gazeux du poumon entraînant une insuffisance respiratoire à l'issue fatale. Elle affecte environ 3 millions de personnes dans le monde, et son taux moyen de survie est de 3 à 5 ans avec un âge moyen de début de 66 ans (75% ont plus de 65 ans). De nombreux facteurs de risque sont décrits, à commencer par la fumée de cigarette, les maladies de reflux gastro-œsophagien, ou certains agents infectieux. Si les risques sont identifiés, les causes sont encore inconnues. Le diagnostic de la fibrose est souvent difficile. Il nécessite la corrélation de plusieurs observations issues des examens physiques et de l’historique physiopathologique précis du patient, parfois associés à une biopsie pulmonaire ou à un lavage broncho-alvéolaire. Aucun traitement n’est actuellement disponible. Seuls certains médicaments sont utilisés pour freiner l’avancée de la maladie, mais ils ne sont que de faible efficacité. L’ultime recours est la greffe pulmonaire mais ne permet, en cas de succès, qu'un léger rallongement de l’espérance de vie. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments sur des modèles murins de fibrose pulmonaire induits par un agent inflammatoire (lipopolysaccharides ou bléomycine ou élastase) injecté par voie intranasale. Les candidats médicaments à tester seront administrés en curatif ou préventif et plusieurs voies d’administration seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés dans le modèle murin utilisé. Ce projet prévoit 240 souris par an soit 1200 animaux sur la totalité du projet.

Bénéfices attendus

Ces pathologies étant incurables, il est donc nécessaire de pouvoir évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques ou cellulaires pour mieux traiter ces pathologies. Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le processus inflammatoire de la fibrose pulmonaire afin de répondre à un besoin important de santé. Plusieurs voies d’administration des candidats médicaments seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression des manifestations cliniques de la fibrose pulmonaire.

Procédures

L'injection intranasale permettant l'induction de la fibrose pulmonaire sera réalisée sous anesthésie générale. Au moment du réveil de l'anesthésie, tous les animaux seront réhydratés. Le jour de l'euthanasie, un analgésique sera injecté au moins 30 minutes avant la mise à mort. Un prélèvement de sang pourra être réalisé 1 fois par semaine, selon la demande du sponsor. Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor. En point final, un prélèvement de sang, un lavage bronchoalvéolaire et d'autres organes/fluides pourront être collectés après euthanasie de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex-vivo.

Impact sur les animaux

L'injection intranasale ne nécessitant pas l'introduction de corps étranger dans la cavité nasale, ce mode d'administration ne provoquera pas de nuisance. Le principal effet indésirable induit par ce modèle murin est une modification de la respiration des animaux. L'administration des candidats médicaments aura des conséquences bénéfiques sur le développement de la maladie.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin de l'étude et des prélèvements seront réalisés post-mortem.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la fibrose pulmonaire. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de l'inflammation sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non- paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience. Une étude se composera de 5 groupes de 12 souris, soit 60 souris par étude. Au sein de chaque groupe, la moitié des souris (n=6) sera dédiée à une étude histologique et l'autre moitié (n=6) à une étude cellulaire, biochimique, moléculaire sur les différents prélèvements effectués. A raison de 4 études par an, ce projet nécessitera donc 240 souris par an, soit 1200 souris pour la durée totale du projet.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Nous utiliserons un tapis chauffant pour maintenir la température corporelle des animaux suite à l'anesthésie. Lors du réveil de l'anesthésie, les souris seront réhydratées par voie sous-cutanée avec une injection de NaCl chauffée à température corporelle. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs ayant connaissance du modèle afin d'apporter les meilleurs soins aux animaux. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle murin dans l’étude des maladies pulmonaires est très fortement documentée. Il est impossible d’explorer l’ensemble de ces évènements par une approche substitutive de culture cellulaire. L’approche cellulaire reste cependant absolument nécessaire pour la validation des cibles et la mise en évidence de la première preuve de concept d’efficacité. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 7 semaines car leur système immunitaire est mature.

Tous tués à l'issue d'une opération unique, 190 souris et 20 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques d'un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des personnels à la chirurgie expérimentale. Chaque animal reçoit d'un stagiaire une injection d'anesthésique et une injection d'analgésique, subit une intervention pouvant durer deux heures trente, avec un risque d'hémorragie en cas de mauvaise hémostase ou de souffrance en cas de monitoring insuffisant de l'anesthésie, puis est mis à mort. Le porteur justifie cette mise à mort par le fait que le suivi post-opératoire ne peut pas être intégré à la formation et qu'aucun autre projet ne prévoit d'utiliser les animaux opérés. Il décrit cinq heures de travaux pratiques préalables sur substituts synthétiques, cuisses de poulet et cadavres de rongeurs, avant de conclure que l'apprentissage sur tissus vivants reste "indispensable" et que la Commission nationale de l'expérimentation animale impose le recours à des animaux vivants.

Objectifs

L’objectif du projet est la formation obligatoire des personnes amenées à concevoir ou à réaliser des interventions chirurgicales dans le cadre des projets scientifiques, plus précisément la partie travaux pratiques (8h) de cette formation d’une durée totale de 22h. Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le bon niveau de formation des personnes réalisant des procédures chirurgicales sur l’animal de laboratoire, le respect des dispositions réglementaires relatives aux compétences des personnels, ainsi que la diffusion d’une culture de la bientraitance des animaux.

Procédures

Les animaux sont d’abord soumis à une anesthésie : Après contention de l’animal, le stagiaire effectue une injection intrapéritonéale unique d’un anesthésique, et une injection sous-cutanée unique d’un analgésique afin de raffiner au mieux la technique et d’éviter toute douleur à l’animal. La durée de la chirurgie, depuis l’induction de l’anesthésie jusqu’au réveil est de 2h30 maximum. Chaque animal subit une seule intervention et à l'issue de la procédure l'animal est mise à mort

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles pour les animaux sont :- une hémorragie en cas de mauvaise réalisation de l’hémostase - une souffrance liée à une monitoring insuffisant de l’anesthésie Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure en cours sera immédiatement interrompue et l’encadrant prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire)

Devenir

Mise à mort Cela est justifié par le fait que le suivi post-opératoire sur plusieurs jours ne peut pas être intégré à la formation et que l’utilisation d’animaux ovariectomisés n’est pas prévue dans un autre projet.

Remplacement

Diverses méthodes ont été mises en œuvre au cours de notre formation pour remplacer l’animal. Ainsi, la première et majeure partie des travaux pratiques (les 5 premières heures) se déroule sur substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie (cuisses de poulets) et cadavres de rongeurs préférentiellement issus d’euthanasies indépendantes des besoins de la formation (A chaque session : au maximum 2 animaux euthanasiés /stagiaire peuvent être requis pour le TP d’anatomie et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). L’utilisation de substituts synthétiques inertes ou pièces de boucherie est un atout pour les participants et les intervenants qui peuvent ainsi rapidement se concentrer sur les gestes chirurgicaux, sans avoir à gérer les contraintes inhérentes à l’accès en animalerie et au suivi d’animaux opérés, disposer aisément de leurs notes et supports vidéo ou Power point. En outre, les participants peuvent s’entraîner et répéter, à leur rythme, les gestes chirurgicaux, sans avoir le stress de la surveillance du respect de l’asepsie, de l’anesthésie et des fonctions vitales de l’animal vivant. Cela favorise la sérénité et la confiance dans l’apprentissage de la chirurgie expérimentale. Néanmoins, l’observation des réactions physiologiques lors de l’anesthésie et l’apprentissage de la chirurgie des tissus vivants et vascularisés ne peuvent être reproduits par des méthodes alternatives et restent indispensables pour finaliser une formation efficiente. La Commission Nationale de l’Expérimentation Animale (CNEA) impose donc l’utilisation d’animaux vivants pour cette partie pédagogique de l’enseignement dans les formations à la chirurgie expérimentale. C’est pourquoi le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour cette partie des travaux pratiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre total d’animaux utilisés à des fins scientifiques, nous utilisons préférentiellement des animaux de réforme (sortis de procédures expérimentales légères ou modérées et dont l’état général n’est pas affecté, ou surnuméraires) ou de surplus d’élevage, qu’il est prévu d’euthanasier dans la semaine, issus de l’établissement d’accueil. Dans le cas où de tels animaux ne seraient pas disponibles en quantité suffisante dans cet établissement, des animaux de réforme étant alors demandés à un élevage agréé. Nous réduisons également au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chaque stagiaire : Pour la première partie des travaux pratiques, sur cadavres, au maximum 2 animaux euthanasiés /stagiaire peuvent être requis pour le TP d’anatomie et pour s’entraîner à la chirurgie sur animal mort). Pour la partie sur animal vivant, un seul rongeur par participant (rat ou souris, choix de l’espèce en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation et des besoins pédagogiques exprimés par les participants) est utilisé pour la réalisation d’une chirurgie complète. 2 animaux supplémentaires sont prévus à chaque session, dans le cas où un décès surviendrait avant la réalisation complète de la chirurgie par un ou 2 stagiaires (problème lors de l’anesthésie ou atteinte d’un point limite lors de la chirurgie). Afin de limiter également le nombre de participants, nos formations ne sont dispensées qu’aux personnes ayant l’obligation réglementaire de la suivre du fait de leurs missions professionnelles.

Raffinement

En termes de raffinement, nous nous efforçons toujours de limiter au maximum le stress des animaux en commençant les travaux pratiques sur animaux en dernière partie de formation. Dans l’attente, les animaux sont gardés dans une salle d’hébergement et ne sont amenés en salle de travaux pratiques qu’au dernier moment. Toutes les techniques enseignées font d’abord l’objet d’une démonstration et d’un apprentissage sur support inerte ou animal mort afin de remplacer l’animal vivant par des méthodes alternatives tant que l’apprentissage des gestes n’est pas suffisamment bien maîtrisé pour pratiquer sur animal vivant. Pour limiter toute douleur per-opératoire, un analgésique adapté est administré aux animaux opérés dès l’induction de l’anesthésie et sa durée d’action couvre la totalité de la procédure chirurgicale. Les animaux sont euthanasiés dès la fin de la chirurgie et observation des phases du réveil, leur évitant ainsi toute douleur post-opératoire. Enfin, l’encadrant veille tout au long de la séance de travaux pratiques au respect de l’éthique et de la bientraitance des animaux, il sensibilise en continu les stagiaires au raffinement des techniques (manipulation atraumatique et aseptique des tissus, lutte contre l’hypothermie, soins post-opératoires…) Les personnes encadrant les travaux pratiques sont particulièrement attentives à tout signe de douleur ou de détresse. Si un animal présente des signes de souffrance, la procédure chirurgicale en cours sera immédiatement interrompue et une personne compétente prendra la décision adéquate pour l’animal (euthanasie si nécessaire).

Choix des espèces

Cette formation a pour vocation de dispenser tous les concepts inhérents et indispensables à toute chirurgie expérimentale (asepsie, anesthésie, analgésie, respect des structures anatomiques, choix du matériel, principe des sutures, suivi des animaux…). Les notions enseignées sont applicables à toutes les espèces de mammifères utilisés à des fins scientifiques. Néanmoins, les rongeurs étant très majoritairement utilisés dans la recherche in vivo, certains concepts sont particulièrement développés pour les rongeurs, et les travaux pratiques sont réalisés sur rongeurs également. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est fait en fonction de l’agrément de l’établissement d’accueil de la formation, et des besoins pédagogiques exprimés par les participants. Les animaux sont au stade adulte, à partir de 8 semaines ou au delà, leur âge n’a pas d’importance pour ce projet.

Greffées sous la peau du dos d'un fragment de tumeur nasopharyngée, puis traitées chaque jour pendant deux semaines par voie intraveineuse ou par gavage, 2 700 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres sont dépourvues du gène p53 et développent des cancers spontanés en vieillissant, avec les douleurs et les difficultés de déplacement que le porteur décrit. Il indique que la tumeur greffée peut gêner les déplacements et se nécroser, et que les administrations répétées peuvent ulcérer le point d'injection ou irriter le tube digestif. Le projet teste six composés déjà utilisés en clinique humaine contre d'autres cancers, et le porteur affirme que seul un animal "vivant, entier" permet d'étudier la réponse antitumorale.

Objectifs

La protéine p53, appelée gardienne du génome, a pour rôle d’empêcher l’émergence et la prolifération de cellules cancéreuses lorsque des évènements favorisant leur apparition surviennent. En effet, dans de nombreux cancers cette protéine est modifié ou absente. Une autre protéine, MDM2, est décrite comme empêchant l’activité protectrice de p53 et jouerait donc un rôle dans l’apparition de cancers. Des composés thérapeutiques visant à empêcher la fonction de régulation de MDM2 sur p53 ont été développés, mais sans réel succès. Ceci signifie que MDM2 pourrait avoir un rôle plus important que ce qui est actuellement connu et agir sur d’autres molécules. Ce projet cherche à définir plus précisément l’implication de MDM2 dans le développement des cancers.

Bénéfices attendus

Les connaissances obtenues grâce à ce projet de recherche seront bénéfiques pour la communauté scientifique à court terme, afin de permettre d’appréhender la complexité du rôle de notre molécule d’intérêt dans la progression tumorale. A moyen terme, si l’un des composés que nous testons sur les différents types de cancers est efficace (composés déjà indiqués pour un autre type de cancer en médecine humaine), cela pourra alors donner lieu à un essai clinique (dont l’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité du médicament) pour ce type de pathologie.

Procédures

Pour mener à bien ce projet, nous réaliserons trois types de protocoles expérimentaux utilisant des souris. Dans le premier axe, nous testerons l’effet de composés thérapeutiques déjà validés chez le patient pour certains cancers sur des tumeurs nasopharyngés (cancer où l’action protectrice de la molécule p53 est empêchée par notre molécule d’intérêt) qui auront été greffées sous la peau du dos de souris. Cette implantation se fait par chirurgie (petite incision de la peau) sous anesthésie générale et traitement anti-douleur (durée de la procédure maximum 10 minutes). Un mois plus tard, le traitement (6 composés différents administrés seul soit par voie intraveineuse soit par gavage) débute avec une administration quotidienne pendant 2 semaines. Chaque administration est réalisée sur souris éveillée et après contention et dure moins d’une minute. Dans le second axe, nous utiliserons des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53. Cela nous permettra de caractériser l’effet des composés thérapeutiques en absence de l’action de notre molécule d’intérêt sur la protéine protectrice du cancer. Pour cela ces souris recevront les traitements comme décrits pour l’autre modèle. Chaque semaine pendant un mois, un prélèvement de sang au niveau de la joue (geste réalisé sans anesthésie et d’une durée de 10 secondes) permettra de suivre l’effet des traitements sur la composition du sang. Enfin, nous testerons 3 des 6 drogues sur un autre modèle de cancer qui sera mis en place en injectant sous la peau une suspension de cellules tumorales (sous anesthésie; durée 3 min). Les traitements seront administrés par gavage à l'aide d'une sonde (sans anesthésie; durée 1 min) lorsque les tumeurs seront palpables (environ 3 mm) et à raison d'une fois par jour pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Dans la mise en place du premier axe de recherche, l’implantation chirurgicale du fragment tumoral va impliquer une suture avec un risque de mauvaise cicatrisation. Lorsque le fragment tumoral greffé va croître, sa taille pourra donc entraîner une gêne dans le déplacement des souris et une nécrose pourrait également apparaître. L’administration répétée des composés thérapeutiques (une fois par jour pendant deux semaines) pourrait entrainer une ulcération au site d’injection (pour les administrations dans la veine) et une irritation du tube digestif (dans le cas de l’administration orale avec une sonde de gavage). Enfin les souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53 peuvent développer plus facilement des cancers spontanés en vieillissant (apparition de tumeurs affectant le bien-être de l'animal: difficulté de déplacement, douleur liée à la présence de la tumeur). Dans la troisième partie du projet, il y a un risque de nécrose des tumeurs pouvant générer une douleur à l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Dans le cas du modèle de greffe d’un tissu tumoral sous la peau, cela permettra de faire l’analyse de ce tissu après le traitement avec nos différents composés thérapeutiques. Dans le cas des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule pouvant jouer un rôle dans le développement du cancer, nous récupérerons la moelle osseuse après l’euthanasie afin d’en faire une fine caractérisation (effet des thérapies sur les différentes types de cellules présentes).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale (caractérisée par une régression de la tumeur), ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte normal ou pathologique. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels n'utilisant pas d'animaux. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux.

Réduction

Nous utilisons le nombre minimal de souris nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement interprétables. Des expériences in vitro, n'utilisant pas d'animaux, ont été réalisées au préalable.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement mis en place, les procédures de chirurgie seront réalisées sous anesthésie générale et avec une analgésie adaptée. Nous surveillerons dans les premiers jours la suture (absence d’infection, bonne cicatrisation). Une surveillance quotidienne (visuelle) sera mise en place et complétée par un suivi clinique toutes les 48h. Nous avons établi une grille d’évaluation clinique prenant en compte la croissance de la tumeur et l’état général de la souris nous permettra de mettre en place des actions correctives nécessaires (analgésie, euthanasie). Dans le cas de douleur liée à l’administration répétée des composés thérapeutiques, une analgésie sera administrée. Si aucune amélioration n'est observée dans les 24h, la souris sera euthanasiée. Enfin, les souris seront hébergées en groupe et dans des cages contenant un enrichissement (papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d’utiliser un modèle transgénique bien établi. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes (7 semaines au début du projet) car cette maladie touche essentiellement des sujets adultes. Dans le cas des souris transgéniques, nous les utiliserons avant l’âge de 16 semaines afin de ne pas être confrontées à l’apparition de tumeurs spontanées.

324 souris seront tuées et 36 gardées pour entretenir les lignées, dans un projet qui teste le resvératrol contre une maladie génétique rare, la maladie CblG, à un niveau de souffrance modéré. Le gavage commence avant leur naissance, sur les mères gestantes, et se poursuit jusqu'au sevrage. Les souriceaux passent ensuite un examen d'imagerie sous anesthésie ou des tests comportementaux que le porteur qualifie de non douloureux, parmi lesquels un test de suspension, un test d'acuité visuelle et un labyrinthe aquatique. Les mises à mort sont programmées à 21 jours, 8 semaines et 6 mois, et les souris surnuméraires dépourvues de la mutation sont tuées dès le sevrage ou utilisées pour des dissections de formation.

Objectifs

La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.

Procédures

Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.

Impact sur les animaux

Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.

Devenir

Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).

Remplacement

tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.

Réduction

Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Choix des espèces

La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.