Souris
Le Tramadol possède-t-il des effets ergogéniques ?
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Pour savoir si le tramadol améliore les performances physiques, 96 souris d'une lignée au phénotype anxieux sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever muscles, plasma et cerveau. Elles courent sur tapis roulant cinq jours par semaine pendant six semaines, la moitié recevant du tramadol, avant des mesures de capacité physique et un test d'activité spontanée. Le porteur ne signale comme effet indésirable possible que des "dommages physiques pendant l'entrainement". Les bénéfices annoncés relèvent de la lutte antidopage et de la "compétition loyale" dans le sport, et le porteur affirme que la réponse du tissu musculaire à l'effort ne peut être appréhendée qu'au sein d'un "organisme vivant entier".
Objectifs
Mettre en évidence les effets périphériques musculaires ergogeniques et centraux du traitement tramadol en analysant les performances physiques, les paramètres métaboliques musculaires et la modulation des systèmes opiodergic et non opiodergiques, chez la souris BALB/cJ de phénotype anxieux. Cette première expérimentation doit montrer un éventuel effet musculaire ergogène du tramadol. Il s’agira ensuite de préciser l’origine centrale ou périphérique de cet effet.
Bénéfices attendus
Santé et sécurité des athlètes: Le tramadol est connu pour avoir divers effets secondaires, y compris des étourdissements, des nausées et une altération de la fonction cognitive. Comprendre ses effets dopants pourrait aider à identifier les risques potentiels associés à son utilisation abusive dans le sport. En sensibilisant aux risques pour la santé, les athlètes peuvent prendre des décisions éclairées sur l’utilisation du tramadol comme médicament améliorant la performance. Compétition loyale et l’intégrité de sports : Le tramadol a été interdit par plusieurs organisations sportives, dont l’Agence mondiale antidopage (AMA), en raison de ses propriétés potentielles d’amélioration de la performance. L’étude de ses effets peut aider à faire respecter les règlements antidopage, garantissant ainsi une compétition équitable entre les athlètes. En détectant et en dissuadant l’abus de tramadol, l’étude peut contribuer à maintenir l’intégrité des sports. Politique et réglementation : Une étude approfondie sur les effets du dopage du tramadol peut fournir des données précieuses pour éclairer les décisions politiques concernant son utilisation dans le sport.Les résultats peuvent contribuer à la mise à jour et à l’amélioration des politiques et des règlements antidopage, en renforçant le cadre des contrôles antidopage et des sanctions. Ceci, à son tour, peut aider à maintenir la crédibilité et la fiabilité des instances dirigeantes du sport. Perception du public et efforts antidopage : En étudiant les effets dopants du tramadol, l’étude peut contribuer à sensibiliser le grand public à l’utilisation abusive des médicaments d’ordonnance dans le sport. Cela peut aider à combattre la perception selon laquelle le dopage se limite aux substances illicites et à souligner l’importance de mesures antidopage strictes dans divers domaines.
Procédures
1- Habituation au tapis roulant : 84 souris au total, pendant une semaine avant les premiers tests, 2- Mesures des capacités physiques avant entrainement: 84 souris au total, durée entre 20 min et 35 min. 3- Entrainement sur tapis roulant : 6 semaines, durée 5 jours par semaine. 4- Traitements : 42 souris Tramadol, 42 souris sans aucun traitement. 5- Mesure des capacités physiques après entrainement: 84 souris au total, durée entre 20 min et 35 min. 6- Test d'activité spontanée, 84 souris au total, durée 30 min. 7- Mise à mort et prélèvements des animaux.
Impact sur les animaux
Effets indesirables possibles : dommages physiques pendant l'entrainement.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires.
Remplacement
L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui iduisent une réponse comportementale n'est à ce jour pas modélisable. La réponse globale du tissu musculaire, incluant la quantification de paramètres liés à l'effort musculaire, ne peut être appréhendée qu’in vivo, au sein d’un organisme vivant entier.
Réduction
L'objectif principal est d'observer l’effet ergogénique musculaire du tramadol chez des souris qui subissent un exercice physique sur tapis roulant. Pour observer les changements biochimiques induits par l'exercice au niveau musculaire, nous envisageons des groupes de 21 animaux. L'objectif de réduction est atteint grâce à la réalisation de prélèvements multiples (plasma, tissu musculaire, cerveau) pour chaque animal et à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées.
Raffinement
Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées pour limiter la souffrance animale. Une habituation au tapis roulant est réalisée au départ pour limiter le stress. L’isolement des animaux est évité. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne est effectuée pour verifier le comportement et l'état général des animaux. Des soins locaux sont prévus en cas d'irritation des pattes. Les animaux pour lesquels une habituation est impossible sont retirés de l'expérimentation, afin que l'exercice ne soit pas associé à un stress important.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans nos procédures appartiennent aux espèces dont la liste est fixée réglementairement et ils proviennent d’éleveurs ou de fournisseurs agréés. Ces animaux sont de petite taille pour faciliter la manipulation pendant l’exercice physique sur tapis roulant et les tests neurocomportementaux. De plus de nombreux outils sont disponibles chez la souris pour les études moléculaires. Les souris sont souvent considérées comme un choix plus acceptable sur le plan éthique pour la recherche que les animaux plus gros. Leur petite taille et leur capacité à être logées en groupe facilitent la prestation de soins appropriés et minimisent les souffrances. Animaux jeunes adultes de 8 semaines, age pour lequel l'entrainement physique en aérobie aura le plus d'effet sur le système musculaire.
Rôle du système d’activation du plasminogène dans le lait maternel et de son importance au cours du développement post-natal.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Anesthésiées cinq fois en huit jours pour une ponction de lait précédée d'une injection d'ocytocine, 70 femelles allaitantes sont au centre de ce projet, qui déclare 420 souris au total dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le porteur veut doser les protéines du système d'activation du plasminogène dans le lait de souris normales et de souris privées du gène tPA, pour comprendre leur rôle dans le développement du cerveau. Aucune souris ne sera tuée à l'issue, toutes doivent être réutilisées dans d'autres projets, ce que le porteur avance comme un argument en faveur du protocole. Il répète trois fois, dans les mêmes termes, que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées par des méthodes sans animaux.
Objectifs
Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (i.e. tPA, uPA, PAI-1, neuroserpine, thrombine) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central (cellules gliales, neurones) et pouvant jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, le tPA, considéré comme un neuromodulateur, joue un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral et de la lignée oligodendrocytaire. Son absence au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de ces protéines présentes dans le lait maternel dans le développement cérébral et de pouvoir par la suite, effectuer un enrichissement du lait maternel en ces protéines pour corriger d’éventuelles anomalies neurodéveloppementales. La première étape du projet consistera au dosage des divers acteurs du système d’activation du plasminogène chez des souris contrôle et déficientes pour un de ces acteurs (tPA). Pour ce faire, le lait des souris allaitantes sera prélevé manuellement, tous les 2 jours, du 7ème au 15ème jour post-partum afin d’analyser sa composition grâce à des techniques de biologie moléculaire.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude de la composition de lait maternel implique que celui-ci soit prélevé sur des mères allaitantes, in vivo. De plus, les méthodes de ce projet seront de classe légère et les animaux ne seront pas mis à mort, ce qui leur permettra d’être réutilisés dans d’autres projets.
Procédures
Seules les femelles allaitantes seront soumises à l’anesthésie et au prélèvement de lait un jour sur deux du 7ème jour post-partum au 15ème post-partum (soit 5 anesthésies / prélèvements par femelle ; n = 70 ; durée de la procédure = 20 minutes). Chacun de ces prélèvements nécessitera une injection d'ocytocine en bolus au préalable (2 secondes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-anesthésies, du stress. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être, grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
Les procédures subies par les animaux ne dépassant pas la classe légère et n’ayant pas le besoin de récupérer des tissus, les animaux pourront être gardés en vie et réutilisés dans un autre protocole à l’issu de ce projet.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, sur l’implication du lait maternel dans le développement du système nerveux central.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, une procédure de mise au point permettra l'élaboration d'un protocole efficace pour prélever un maximum de lait sur chaque mère allaitante, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés par la suite. Le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour l’étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards aux normes européennes. Le bien-être des animaux est contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne et hebdomadaire permettra de détecter tous signes cliniques de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à cette détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne s'isolent pas de leurs congénères. Les femelles allaitantes seront également placées dans un environnement enrichi : 2 souris par cage, coton, paillettes, petite maison. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser. Durant le prélèvement, les souris seront sous anesthésie générale selon le mode identifié comme le plus adapté au moment de la mise au point (gazeuse ou injectable). Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de prévenir de la déshydratation. Les animaux seront manipulés progressivement tous les jours. Cette habituation à l’expérimentateur et à leur environnement permettra de limiter le stress possiblement occasionné lors des phases de manipulations.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches transgéniques disponibles au laboratoire. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les 2 procédures concernent le prélèvement de lait maternel chez des souris allaitantes, tous les deux jours, du 7ème au 15ème jour post-partum (période où la production de lait est la plus importante). De plus, le dosage des différentes protéines à plusieurs stades post-partum permettra de mettre en évidence leur cinétique et pic d’expression en fonction de la période de développement post-natal des souriceaux.
Modèles de douleur viscérale (induction et traitement)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
Rats : 4060
Cochons d'Inde : 1220
8 990 souris, rats et cobayes vont être utilisés dans des procédures de douleur viscérale, dont 5 640 dans celles classées au niveau de souffrance le plus élevé. Les équipes leur induisent la douleur par administration d'un réactif ou par chirurgie, puis mesurent leur réaction à des stimulations tactiles ou thermiques appliquées sur la zone rendue douloureuse, et prélèvent sang et urine. 270 rongeurs seulement seront réutilisés, tous les autres tués, le porteur indiquant que les animaux modélisant une douleur chronique ne peuvent pas être maintenus en vie dans de bonnes conditions. L'objectif déclaré reste de tester l'efficacité analgésique ou anti-inflammatoire de nouveaux traitements, et le porteur affirme que les approches in vitro, ex vivo ou in silico ne reproduisent pas les interactions au sein du "corps entier".
Objectifs
En France, la douleur est la première cause de consultation en médecine générale et dans les services d’accueil d’urgence. Parmi les douleurs fréquemment observées, les douleurs viscérales (et autres troubles digestifs) sont très représentées. Un sondage IFOP de 2021 relevait que près de la moitié de la population française (45%) était concernée par des troubles digestifs, les principaux troubles représentés étant les douleurs abdominales et le transit irrégulier. Globalement, tout le monde (ou presque) a ressenti, au cours de sa vie, des douleurs abdominales, qui peuvent se traduire par des crampes, des brûlures, des élancements, des torsions... Apparaissant de manière soudaine ou progressive, d'une durée qui peut être courte ou très longue, et d'intensité variable. Tous les tissus abdominaux peuvent être à l'origine du mal de ventre (intestins, reins, vaisseaux, muscles...) et les douleurs abdominales peuvent également être présentes en cas de maladies des organes du thorax (cœur, plèvre...) ou du pelvis (organes génitaux, vessie...). Dans la majorité des cas, ces douleurs sont liés à une mauvaise digestion, un mauvais transit, ou une colopathie fonctionnelle (syndrome du colon irritable), mais les causes potentielles sont multiples (gastrite, ulcères, cystite, endométriose, maladie de Crohn...). La prise en charge doit donc être adaptée à l'origine de la douleur, et la nature des traitements est multiple (antispasmodiques, pansements digestifs, anti-inflammatoires...). Certaines maladies (notamment chroniques) n'ont à ce jour pas de traitement permettant de les guérir (par exemple, la maladie de Crohn, l'endométriose...). Il apparait donc nécessaire de poursuivre la recherche de traitements permettant de traiter les causes et les symptômes des douleurs abdominales. Egalement, il est parfois nécessaire de vérifier l'absence d'effet algésiques (douloureux) causés par de nouveaux candidats médicaments. Ce projet met en place différents modèles de douleur viscérale, permettant d'étudier l'efficacité (analgésique, anti-inflammatoire, etc) ou d'évaluer l'absence d'effets secondaires de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Les douleurs viscérales sont extrêmement répandues, d'origines diverses et leur prise en charge est parfois compliquée, notamment dans le cadre de douleurs chroniques. La recherche de traitements permettant de traiter les causes et les symptômes des douleurs abdominales se poursuit donc. Ce projet permettra d'étudier l'efficacité (analgésique, anti-inflammatoire, etc) ou d'évaluer l'absence d'effets secondaires de nouveaux traitements dans différents modèles de douleur viscérale chez le rongeur.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). L'induction sera réalisée par administration d'un réactif (environ 1 minute, sous contention ou sous anesthésie) ou par chirurgie (quelques minutes, sous anesthésie). Le comportement général des animaux sera évalué (observation avec ou sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de quelques secondes à 5 minutes). Des prélèvements sanguins (en général 2 maximum par animal) pourront être réalisés (durée de l'ordre de la minute, sous anesthésie légère ou non). Un prélèvement d'urine (après isolement 24 h max) pourra être réalisé dans le modèle de cystite.
Impact sur les animaux
Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress le temps de l'administration de réactif, de substance, ou lors d'un prélèvement sanguin, notamment du fait de la contention. Le cas échéant, la phase d'isolement ou de mise à jeun peut également causer un stress. En cas de phase chirurgicale, il est possible qu'elle entraîne une douleur post-opératoire au site concerné. Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone potentiellement douloureuse peuvent entraîner une douleur aigue au moment du test (la stimulation est arrêtée dès la réaction de retrait de l'animal). Les modèles décrits ici sont des modèles de douleur viscérale. En fonction du modèle étudié, l'animal peut présenter une douleur abdominale, des crampes, ou une altération de l'état général (baisse de l'activité locomotrice, perte transitoire de poids, voire difficulté à uriner dans le modèle de cystite).
Devenir
Les animaux de ce projet (sauf animaux sham) seront tous euthanasiés à la fin de l'étude car ils modélisent des douleurs chroniques viscérales, et leur maintien en vie ne peut être assuré dans de bonnes conditions. De plus, dans la plupart des cas, des organes seront collectés en fin d'étude afin d'analyser les tissus (marqueurs d'inflammation, histologie...). Les animaux Sham (c'est-à-dire soumis aux mêmes manipulations (injections, tests...) que les animaux modélisant une pathologie, mais sans que la pathologie/les symptômes ne soient induits) pourront être maintenus en vie à la fin de ce projet s'il n'y a pas de prélèvement d'organe nécessaire, et à la condition qu'ils ne présentent aucun signe de douleur ou de mal être.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ces modèles car les douleurs abdominales sont d'origines diverses (pouvant provenir de multiples organes) et peuvent faire intervenir le système immunitaire, notamment dans le cas des maladies inflammatoires. Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité des traitements (analgésiques, anti-inflammatoires...) nécessite l'utilisation d'animaux vivants (étude de l'efficacité contre la douleur, ou encore réduction de l'inflammation...). Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés, les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude et des prélèvements d'organe en fin d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). En cas de phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Si pertinent, une anesthésie légère sera appliquée pour certaines administrations ou prélèvements sanguins.
Choix des espèces
Rats, souris et cobayes sont bien décrits dans la littérature comme modèles de douleurs viscérales de différents types. Principalement animaux sevrés (à partir de 21 jours, jusqu'à l'âge adulte) car les troubles étudiés dans ce projet commencent plutôt à être détectés et soignés à partir de l'adolescence ou l'âge adulte (ne sont pas principalement des maladies pédiatriques).
Induction d’une tolérance immunitaire au Facteur VIII dans un modèle murin d’hémophilie A grâce à des nanoparticules contenant du Facteur VIII modifié
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à des injections répétées sous anesthésie gazeuse, sous la peau tous les deux jours puis dans la veine chaque semaine, 770 souris hémophiles sont toutes tuées pour la collecte de leurs organes lymphoïdes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 610 d'entre elles et léger pour 160. Leur phénotype hémophile les expose à des hémorragies en cas de blessure, et elles subissent en plus des prélèvements sanguins hebdomadaires pendant trois semaines. Le projet vise à induire une tolérance immunitaire au Facteur VIII par des nanoparticules, pour éviter la réaction immunitaire qui apparaît chez environ trente pour cent des patients hémophiles A traités. Sur le choix de l'espèce, le porteur ne cite comme seule alternative connue qu'un modèle canin hémophile, et retient la souris pour l'homogénéité des génotypes et la disponibilité des outils d'analyse.
Objectifs
L’hémophilie A est une maladie génétique rare liée au chromosome X et caractérisée par un déficit en Facteur VIII (FVIII) de la coagulation. Afin de corriger le saignement, du FVIII dit ‘thérapeutique’ est administré par voie intraveineuse aux patients. Malheureusement, une réponse immunitaire spécifiquement dirigée contre le FVIII thérapeutique est observée chez trente pour cent des patients. Le développement d’anticorps anti-FVIII chez ces patients mène à une impasse thérapeutique. L’objectif de ce projet est de développer une nouvelle stratégie thérapeutique permettant d’induire une tolérance du système immunitaire au FVIII afin d’empêcher la production d’anticorps anti-FVIII chez les patients hémophiles A. Cette avancée scientifique majeure permettrait une amélioration conséquente de la qualité de vie des patients et un gain financier pour les systèmes publics de Santé.
Bénéfices attendus
Environ trente pour cent des patients hémophiles A traités avec du FVIII thérapeutique, développent une réponse immunitaire neutralisante. L’apparition de cette réponse immunitaire complique énormément la prise en charge clinique (traitement lourd et couteux) et la qualité de vie du patient. Si nous parvenons à induire une tolérance avec notre stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation de peptides immuno-dominants sialylés du FVIII, cela permettrait d’envisager des essais cliniques afin de prévenir la réponse immunitaire anti-FVIII chez les patients hémophiles A.
Procédures
Les animaux utilisés ont un phénotype hémophile A (risque de saignement lors de blessure ou traumatisme). Ils subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse. La fréquence la plus élevée sera d’une injection tous les 2 jours, puis d'1 injection par semaine pendant 4 semaines. Ces interventions (injection) ne durent que 10 à 20 secondes et se feront sous anesthésie pour limiter le stress et la contention. Ils subiront également 4 à 6 injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse. Ces injections seront réalisées à une fréquence d'une injection par semaine et ne nécessitent que 10 à 20 secondes d'immobilisation de l'animal anesthésié. Dans certaines conditions expérimentales, des prélèvements sanguins sont prévus. Ces prélèvements seront également réalisés sous anesthésie gazeuse et ne nécessitent que 20 secondes d'immobilisation maximum de l'animal anesthésié. La fréquence maximale de prélèvement sera d'un prélèvement par semaine pendant 3 semaines.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé est un modèle préclinique de l'hémophilie A, des risques hémorragiques liés à l'absence du FVIII de la coagulation sont possibles en cas de blessure ou traumatisme et demandent donc une adaptation de certaines procédures. Les injections sous-cutanée, intraveineuse et prélèvement sont réalisés sous anesthésie gazeuse. L'induction d'un stress au moment de la préhension ou d'une détresse respiratoire ou difficulté de mouvement au réveil lors de l'anesthésie gazeuse est possible mais reste limitée. Une douleur induite lors des injections intraveineuse ou une inflammation au niveau des sites d'injection lors des injections sous-cutanée sont possibles
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les organes lymphoïdes seront collectés pour l' évaluation de la réponse immunitaire anti FVIII ou pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Des analyses in sillico de prédiction de peptides ont été réalisées, néanmoins, le projet fera appel à différents modèles expérimentaux chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment l’induction de tolérance au FVIII). Toutefois, toute information obtenue in vivo sera immédiatement transposée à des systèmes in vitro pour analyses ultérieures.
Réduction
Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle : si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs avec une puissance appropriée, elle ne sera pas répétée, sinon elle sera répétée une à deux fois maximum. Les organes, sérum et cellules des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés; ainsi, aucune expérience supplémentaire ne doit-elle être faite si des questions nouvelles surviennent. Un total maximum de 770 animaux est prévu pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux disposent de nourriture et de l’eau ad libitum. L’environnement est enrichi par ajout de nids végétaux et de tunnels en carton. Les souris seront hébergées avec un maximum de 5 souris par cage. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Les conditions de vie seront améliorées au maximum (ajout de nids végétaux et de tunnels en carton). Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
La seule alternative connue est l’utilisation d’un modèle canin hémophile. Néanmoins, la souris est la seule espèce qui permettent d’avoir un nombre d’individus de même âge suffisant, et de génotype homogène, qui permette l’obtention de résultats statistiquement fiables, et pour lequel les outils nécessaires à l’étude de la réponse immunitaire sont disponibles sans restriction. L’élevage des souris hémophiles A est homozygote. Des souris adultes, âgées de 7-12 semaines en début d’expérimentation (système immunitaire mature) seront utilisées.
Évaluer le rôle des anticorps et de leurs interactions avec leurs cibles dans les maladies inflammatoires et dans l’allergie
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 190 d'entre elles et modéré pour 80. Le porteur leur induit trois maladies, une arthrite par injection d'anticorps anti-collagène puis de LPS, un lupus par injection de pristane suivie de recueils d'urine chaque semaine à partir de la vingtième semaine, et un choc anaphylactique après implantation sous la peau d'une sonde de température. Il décrit une inflammation aiguë des articulations avec gonflement, rougeur et "probablement douleur", une chute de la température corporelle et une atteinte rénale, tout en écrivant que "le phénotype de l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet est non dommageable". Chaque souris subit aussi l'amputation de trois millimètres de queue pour son identification.
Objectifs
Les récepteurs d'immunoglobuline sont des acteurs clés dans un certain nombre de maladies inflammatoires, telles que les arthrites (inflammation invalidante des articulations qui devient rouges, gonflent et sont douleureuses) ou les allergies. Ces maladies représentent un problème majeur de santé publique, et dans chacune d'entre elles, l'inflammation est une étape clé initiée par les récepteurs aux immunoglobulines. Le but de notre projet est d'identifier les molécules responsables de l'inflammation exacerbée dans ces maladies, ce qui pourrait conduire au développement d'approches thérapeutiques plus spécifiques et moins coûteuses pour ajuster les traitements actuels et améliorer la prise en charge des patients souffrant de ces maladies. Plus précisément, grâce à des expériences de laboratoire n'utilisant pas de modèles animaux, nous avons identifié deux protéines qui sont de nouveaux acteurs impliqués dans la réponse inflammatoire déclenchée par les récepteurs aux immunoglobulines. Nos expériences sur des lignées cellulaires dans lesquelles nous avons inactivé ces protéines montrent qu'elles sont en effet d'excellents candidats pour moduler la réponse inflammatoire. Nous étudions actuellement la pertinence de ces deux protéines dans des maladies inflammatoires telles que l'arthrite (inflammation des articulations), le lupus (inflammation de la peau et des organes tels que les reins) et le choc anaphylactique (la forme la plus grave des allergies). En raison de la complexité des maladies que nous étudions, il n'y a pas d'autre solution que d'utiliser des modèles animaux qui développent eux-mêmes ces maladies. Nous induirons un modèle d'arthrite qui récapitule la maladie humaine en injectant des anticorps anti-collagène (un composant majeur des articulations), et un modèle de lupus en injectant une molécule qui induit l'inflammation. Le choc anaphylactique sera induit en deux étapes : une première injection d'anticorps de lapin chez la souris, qui induira des anticorps anti-lapin chez la souris. Ensuite, une seconde injection d'anticorps de lapin déclenche le choc anaphylactique qui est la plus grave forme d'allergie connue.
Bénéfices attendus
Nous avons identifié deux nouvelles protéines qui, selon nos données in vitro, semblent contrôler la réponse inflammatoire déclenchée par les récepteurs aux immunoglobulines. Sachant que la réponse inflammatoire déclenchée par les récepteurs aux immunoglobulines est à la base de la physiopathologie de maladies graves telles que l'arthrite (inflammation invalidante des articulations), le lupus (inflammation de la peau et de plusieurs organes, en principal le rein) et les allergies (dont la forme très sévère est le choc anaphylactique), la compréhension des facteurs qui contrôlent cette réponse inflammatoire est un véritable défi pour la science fondamentale et la médecine. Nous disposons de résultats obtenus in vitro, sur des lignées cellulaires, qui démontrent que ces deux nouvelles protéines sont impliquées dans ces réactions inflammatoires, mais le seul moyen d'étudier leur rôle dans le contexte complexe de la maladie est d'utiliser un modèle animal. Suite aux expériences in vivo proposées dans ce projet, sur trois modèles de maladies inflammatoires, nous aurons des preuves solides de l'implication de ces molécules dans la pathologie, et pourrons à l'avenir développer des projets visant à utiliser ces molécules comme cibles thérapeutiques dans ces maladies.
Procédures
Les souris auront un seul prélèvement de 3 mm du bout de la queue pour les identifier. En ce qui concerne l’arthrite, les souris auront le jour 1, une injection intraveineuse d’anticorps anti-Collagène dans la veine de la queue et le jour 4 une injection intrapéritonéale d’une substance inflammatoire (LPS). Aucun prélèvement sera effectué sur l’animal vivant dans l’étude de l’arthrite. En ce qui concerne le lupus, les souris auront une injection intrapéritonéale d’une substance inflammatoire (pristane) et un prélèvement des urines sera réalisé à partir de la semaine 20 tous les semaines. Pour l’étude de l’allergie grave nommée choc anaphylactique, les souris auront : le jour 1, une injection intrapéritonéale des anticorps anti-lapin ; le jour 6, un placement dans la peau d’une sonde de mesure de la température (sous anesthésie isoflurane) et le jour 7, une injection intraveineuse dans la veine de la queue des anticorps anti-lapin.
Impact sur les animaux
Le modèle d'arthrite peut provoquer une inflammation aiguë des articulations, avec gonflement, rougeur et probablement douleur. Le modèle de choc anaphylactique provoque une baisse de la température corporelle, tandis que le modèle de lupus provoque une atteinte rénale.
Devenir
La totalité des animaux seront euthanasiés. Il n'est pas possible de les réutiliser car nous avons besoin d'analyser leurs organes post-mortem (articulations, reins, organes lymphoides, sang et plasma).
Remplacement
Nous avons développé des lignées cellulaires qui sur-expriment les différentes molécules que nous allons étudier dans le cadre de l’activation des cellules par les anticorps. Ces lignées vont permettre d'étudier le rôle de ces molécules dans la régulation de l'inflammation lors de ces maladies. Cependant, pour étudier le rôle de ces molécules dans l’induction de l’inflammation dans un contexte physiologique, nous aurons besoin d'un modèle animal puisqu’aucun autre modèle (cellulaire) ne permet aujourd’hui d'évaluer le niveau de la destruction de l’articulation lors de l’arthrite ou des insuffisances rénales lors du lupus (maladie inflammatoire), ou encore, le risque vital lors d’une réaction anaphylactique (la forme la plus grave de l'allergie).
Réduction
Les études déjà réalisées au sein de notre laboratoire nous ont permis d’optimiser le nombre d’animaux minimum permettant l’exploitation de résultats statistiquement valables. Les modèle que nous allons utiliser sont : le modèle d’arthrite, le modèle de lupus (maladie inflammatoire) et le modèle d’anaphylaxie (allergie grave). Selon la littérature, le taux de mortalité dans ces modèles chez la souris est nul et le phénotype de l’ensemble des animaux utilisés dans ce projet est non dommageable.
Raffinement
Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 tube, des cotons et du kraft. Une anesthésie sera effectuée lors du placement en sous-cutanée de la sonde de température pour le modèle d'allergie nommé anaphylaxie et l'utilisation d'antalgiques sera systématique si l'animal présente des signes de douleur (articulations rouges, très gonflés, diminution des deéplacements) au cours de l'expérimentation dans le modèle d’arthrite. Les souris seront surveillées chaque jour. Les signes extérieurs de souffrance (perte de poids par rapport au groupe contrôle, prostration, poil hérissé) seront les critères de point limites à partir desquels nous procéderons à l'euthanasie de l'animal. Les souris sont suivies chaque jour.
Choix des espèces
La souris est un modèle pertinent pour étudier et comprendre l'évolution des maladies auto-immunes et inflammatoires chez l'homme. Pour permettre le développement et l'étude des maladies médiées par les anticorps chez la souris, nous injecterons des anticorps spécifiques dans les modèles d'arthrite et d'anaphylaxie (forme grave d'allergie). Pour le modèle de lupus (maladie inflammatoire grave) nous utilisons l'injection d'une substance pro-inflammatoire. Ces méthodes, bien établies, nous permettent d'étudier le rôle des molécules que nous avons découvert sans avoir à croiser des souris déficientes pour ces molécules avec des souris qui développent spontanément les maladies étudiées. Ce point nous semble très important pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Les trois types de maladies que nous étudions se développent chez l’homme à l’âge adulte. En conséquence, les souris seront utilisées entre 2 et 4 mois, un âge qui est équivalent à l’âge adulte chez l’humain.
Role de la nutrition dans les réponses immunitaires anti-tumorales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Pour savoir si l'alimentation modifie l'efficacité des immunothérapies anticancéreuses, 1 602 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent sous la peau des cellules tumorales alors qu'elles sont éveillées, développent une tumeur mesurée régulièrement, puis trois injections intrapéritonéales de traitement. Le porteur écrit que les groupes comptent dix-huit souris "sans recours à un test statistique pour définir ce nombre", en se fondant sur son expérience antérieure. Il indique que l'hypothèse testée, le rôle de nutriments végétaux dans la réponse immunitaire anti-tumorale, a d'abord été formulée en culture cellulaire, et affirme que le recours à la souris reste "indispensable" pour envisager une application clinique.
Objectifs
Ces dernières années, l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur, a ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques. Cependant, seule une partie des patients répondent au traitement par immunothérapie, et de nombreux paramètres peuvent impacter l’efficacité du traitement. En particulier, les aliments peuvent avoir un impact important, en fournissant des nutriments qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire et en modifiant les bactéries de la flore intestinale. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’effet de la nutrition dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester des traitements permettant d’augmenter l’efficacité de l’immunothérapie via des interventions nutritionnelles.
Bénéfices attendus
Des études suggèrent que des modifications de l’alimentation pourraient apporter un bénéfice aux patients traités par immunothérapie. Cependant, l'effet sur les cellules immunitaires des tumeurs des produits dérivés de la nourriture demeure mal connu. Ce projet permettra donc d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour mieux comprendre l’interaction entre nourriture et cellules immunitaires, et plus particulièrement dans les réponses immunitaires anti-tumorales au cours des immunothérapies. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des immunothérapies par point de contrôle immunitaire.
Procédures
Les expériences visant à évaluer l’effet d’un traitement sur la progression tumorale, des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience, durée du geste inférieur à 20 sec). Les animaux seront ensuite traités à 3 reprises à raison d’1 fois par jour (administration des traitements par injection intrapéritonéale sur animaux vigiles, durée du geste inférieur à 10 sec), tous les 2-3 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. Nos résultats précédents montrent que le régime spécial utilisé n’affecte pas l’état général des animaux et ne modifie pas leur poids.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que des nutriments présents dans certains végétaux jouent un rôle dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo. Le projet doit étudier l’influence de ces nutriments sur la croissance tumorale et les réponses immunitaires anti-tumorales dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent être représentatifs, sans recours à un test statistique pour définir ce nombre. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Nous limiterons le nombre de souris utilisées en restreignant le nombre de lignées tumorales étudiées et en étudiant un seul type de thérapie pour l’analyse des mécanismes moléculaires. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, y compris le week-end lorsque cela est nécessaire. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux sont mis à mort dès l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.
Hébergement de rongeurs génétiquement altérés présentant une altération de la réponse immunitaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Réutilisées pour 2 700 d'entre elles dans des projets sur le cancer ou le système nerveux central, tuées pour les 620 autres, 3 320 souris génétiquement modifiées sont déclarées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans intervention prévue. Le projet porte sur leur hébergement en cages ventilées et matériels stérilisés, l'immunodéficience de ces lignées les rendant vulnérables aux infections. Parmi elles, 320 souris "sentinelles" servent de détecteurs du statut sanitaire de l'animalerie, précisément parce que leur déficit immunitaire prononcé les rend très sensibles aux agents infectieux, et sont tuées entre quatre et cinq mois après lecture des contrôles. Les 300 reproductrices sont tuées à six mois, et le porteur présente l'ensemble du dispositif comme un objectif de raffinement destiné à empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable".
Objectifs
Le projet est porté par une plateforme qui élève des souris génétiquement modifiées au service de laboratoires qui les utilisent dans différents projets autorisés. Les animaux en élevage sont particulièrement fragiles ; différentes mesures sont mises en place pour les protéger en particulier des infections. Parmi ces mesures, en accord avec le vétérinaire référent de notre structure, nous utilisons des souris "sentinelles" du statut sanitaire, qui, du fait de leur déficit immunitaire prononcé, ont une grande sensibilité aux agents infectieux. De plus, parmi les souris élevées, certaines ont un déficit immunitaire modéré ; ces souris sont utilisées dans des projets d'études des cancers ou de maladies du système nerveux central qui nécessitent d'avoir recours à des greffes de cellules dites "étrangères". Les souris avec une immunodéficience modérée ne rejettent pas les cellules étrangères greffées. Le projet consiste à mettre en place des conditions environnementales adaptées pour héberger des souris présentant une immunodéficience et empêcher que l'immunodéficience ne conduisent à un état de mal-être. L'objectif du projet est donc d'empêcher l'apparition d'un "phénotype dommageable" dans le respect des 3R.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : la réduction du nombre d'animaux élevés par maitrise du statut sanitaire et le raffinement des conditions d'hébergement permettant de minimiser au maximum les situations de mal être des souris hébergées.
Procédures
Aucune intervention prévue sur les animaux.
Impact sur les animaux
Aucun effet indésirable prévus sur les animaux dans les conditions d’hébergement mises en place dans le projet.
Devenir
La plupart des animaux (2700) seront réutilisés dans des projets scientifiques en cancérologie ou étudiant des maladies du système nerveux central. Les animaux reproducteurs seront mis à mort après 6 mois d'âge (300). Les animaux sentinelles pour la gestion sanitaire de l'animalerie seront mis à mort après obtention des résultats des contrôles sanitaires soit entre 4 et 5 mois d'âge (320).
Remplacement
Les animaux hébergés dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents experts scientifiques, projets pour lesquels il n'existe à ce jour aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Les animaux sentinelles étaient initialement utilisés dans l'ensemble de l'animalerie pour surveiller le statut sanitaire ; nous les utilisons maintenant uniquement dans la zone d'élevage où les animaux sont particulièrement fragiles. Pour les élevages, l'utilisation d'animaux sentinelles est considérée comme le moyen le plus efficace de repérer des agents infectieux.
Réduction
La mise en œuvre de conditions d'hébergement limitant la contamination des souris immunodéficientes par des micro-organismes permet de réduire le nombre d'animaux utilisés en limitant les infections qui pourraient avoir un impact sur la viabilité de ces souris. De plus, pour les lignées en élevage sur site, la stratégie d’accouplement à la demande et non en continue (présence d'un mâle en continu dans la cage des femelles) permet de limiter également la production d'animaux surnuméraires. L'utilisation des animaux sentinelles permet de contrôler la qualité du statut sanitaire et la bonne santé de l'ensemble des animaux dans la zone d'élevage ; les animaux sentinelles contribuent ainsi à une meilleure maitrise du nombre d'animaux élevés sur site.
Raffinement
Le raffinement des conditions d'hébergement passe par un hébergement en cage ventilée avec filtration de l'air sur filtre à haute efficacité de filtration pour exclure toute contamination dans l'air entrant et sortant cage à cage ; l'air de la zone d'élevage étant lui-même filtré et renouvelé à haute fréquence. Cette approche est couplée à une décontamination/stérilisation de l'ensemble des matériels pouvant être au contact des animaux (matériels d'hébergement, aliments, litière, matériel d'enrichissement, eau de boisson...etc): décontamination thermique,chimique, par irradiation aux rayons gamma ou par ultrafiltration avec stérilisation aux ultra-violets pour l'eau d'abreuvement. Enfin, le port d'équipements de protection individuelle pour les manipulateurs permet également de renforcer la barrière sanitaire mise en oeuvre pour éviter une contamination de l'animalerie et l'apparition de situations de mal-être chez les souris immunodéficientes en particulier. Le suivi des animaux est réalisé quotidiennement par des personnels expérimentés formé à l’utilisation d’un outil développé par le centre national 3R en Angleterre : l’échelle de la grimace de la souris qui permet d’identifier la douleur de façon précoce. Cette échelle est basée sur l’observation fine des yeux, du nez, des joues, des oreilles et des moustaches avec 3 niveaux d’expression. Les expressions faciales s’intensifient en réponse à une douleur, et peuvent être utilisées comme un élément de l’évaluation clinique. Des critères stricts et précoces de prise en charge de la douleur ont été définis.
Choix des espèces
La pertinence de l'espèce choisie a été justifiée dans les projets de recherche réalisés dans notre l'animalerie. Pour les animaux élevés sur site, ils sont transférés aux laboratoires pour une inclusion dans les projets de recherche à l'âge adulte soit entre 2 et 3 mois. Pour les animaux non élevés sur site, les animaux arrivent en provenance d'élevages agréés juste après leur sevrage. Pour les animaux sentinelles, ils sont remplacés à l'âge de 5 mois par des animaux dits "naifs". Le délai de 4 mois au sein de notre animalerie est un compromis pour repérer rapidement des contaminations récentes tout en utilisant un minimum d'animaux.
Etude du recrutement des monocytes et leur différentiation en macrophages dans le tissu adipeux brun.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées quotidiennement et, pour une partie d'entre elles, exposées à 4 degrés pendant une semaine, 1 944 souris sont toutes tuées pour prélever leur tissu adipeux brun, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 1 296 d'entre elles et modéré pour 648. Le porteur indique qu'une exposition prolongée au froid risque de provoquer une hypothermie pouvant aller jusqu'à la perte du réflexe de redressement, la prostration ou la léthargie, et qu'un gavage mal placé peut entraîner une détresse respiratoire. Il écrit par ailleurs que les souris de ce projet "ne présentent pas de phénotype dommageable", alors que 1 296 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère. L'objet du projet est de comprendre le rôle des monocytes dans la graisse brune, avec l'espoir déclaré d'identifier des cibles contre l'obésité et le diabète.
Objectifs
Il existe deux types de graisse corporelle (tissu adipeux) chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc stocke les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun, au contraire, est spécialisé dans la dépense énergétique : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. Ce phénomène permet ainsi de maintenir la température corporelle lors de l’exposition au froid mais aussi de réguler la quantité de graisses et de sucre dans l’organisme. L’activation du tissu adipeux brun a donc émergé comme une stratégie thérapeutique pour lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète. En plus des cellules adipeuses, le tissu adipeux contient aussi de nombreuses cellules immunitaires, dont certaines s’appellent monocytes. Ce projet a pour objectif de comprendre le rôle des monocytes présents dans les tissus adipeux et dans la régulation de son activité métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment les macrophages du tissu adipeux brun régulent le métabolisme énergétique. Chez l'homme l'activité du tissu adipeux brun est corrélée à un indice de masse corporelle (IMC) bas. Stimuler l'expansion et l'activité du tissu aidpeux brun pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour brûler les graisses et le sucre et lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète.
Procédures
Au cours de ce projet les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : des gavages quotidiens pendant 4 jours (la durée de cet acte est de 20 secondes), une injection intrapéritonéale unique (environ 10secondes), 1 ou 2 prélèvements de sang espacés d’une semaine (moins d'une minute par prélèvement).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les animaux seront soumis à des contentions afin de réaliser : une injection intrapéritonéale (moins d'une minute pour réaliser ce geste), ce qui pourrait développer une inflammation au niveau du site d'injection, des gavages au cours desquels une introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons pourrait se produire entrainant une détresse respiratoire. De plus ceratins animaux seront hébergés dans une enceinte climatique dédiée à l'hébergement des souris et soumis à une exposition au froid (4°C, pendant une semaine maximum). Une longue exposition au froid risque d'entrainer une hypothermie. Une hypothermie sévère peut s’accompagner d’une perte du réflexe de redressement, d’une prostration ou d’une léthargie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l’analyser in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre la diversité, l’origine et les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons pour les élevages des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Les animaux seront hébergés dans une pièce ou une enceinte climatique à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage contiendra une tige en papier, un igloo et une brique de peuplier.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Dans l’ensemble des procédures nous utiliserons des animaux adultes âgés de 6 semaines au minimum afin de leur laisser le temps d’atteindre leur maturité et leur maturité du système immunitaire
Développement d’une thérapie combinatoire basée sur l’injection d’exosome et d’IL-2 dans un modèle murin de brûlure radiologique musculo-cutanée
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour tester un traitement des brûlures par irradiation, 3 108 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 2 528 d'entre elles et léger pour 580, toutes tuées à l'issue. Leur membre inférieur est irradié pendant vingt-cinq minutes sous anesthésie, ce qui provoque une lésion du muscle et de la peau, puis elles reçoivent jusqu'à sept injections et subissent jusqu'à onze analyses fonctionnelles du muscle de trente minutes chacune. Le porteur indique que certaines souris pourront avoir des difficultés à se déplacer et présenter un dos rond, une piloérection ou un amaigrissement. Sur le raffinement, il annonce un suivi quotidien et une mise à mort anticipée en cas de signes de souffrance, sans décrire d'analgésie ni de soin de la lésion.
Objectifs
Le but du projet est de proposer un traitement des brûlures radiologiques par des approches de médecine alternative basée sur l’injection des vésicules issues de cellules souches mésenchymateuses améliorant la création de nouveaux vaisseaux et cicatrisation cutanée et d’une protéine pour favoriser la régénération musculaire afin d’obtenir un effet combiné des deux produits.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet est de contribuer à la proposition d’une nouvelle approche thérapeutique innovante, qui pourrait permettre la prise en charge d’un grand nombre de patients avec une amélioration de leur qualité de vie.
Procédures
Prélèvement sanguin 1 fois sous anesthésie avant euthanasie : environ 30 secondes Irradiation du membre inférieur sous anesthésie (1 fois) : 25 min Injection intra-musculaire sous anesthésie (max 4 injections i.m.) : environ 1 min par injection Injection i.p. sous anesthésie (max 3 injections i.p.) : environ 1 min par injection Analyse musculaire fonctionnelle (11 fois au max) : sous anesthésie, environ 30 min par test
Impact sur les animaux
Après irradiation, un animal va développer une lésion musculo-cutanée localisée au site d’irradiation. Il est possible que certains animaux aient des difficultés à se déplacer et aient une apparence extérieure modifiée telle que piloérection, dos rond ou amaigri Après injection musculaire, l’animal peut présenter transitoirement une patte gonflée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de réaliser les prélèvements pour les analyses nécessaires.
Remplacement
Le nouveau développement de stratégie thérapeutique doit être validé sur des modèles pré-cliniques (modèles animaux). De plus, les modèles in vitro (culture isolée de cellules en boîte de pétri) ne permettent d’évaluer le réseau vasculaire ni la régénération musculaire. Par conséquent, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour valider notre approche thérapeutique.
Réduction
Les conditions d’expérimentation animal présentent une certaine variabilité de réponse. De plus, le retour d’expérience des médecins, chercheurs et biostatisticien déterminent qu’un nombre de 10 animaux comptabilisés dans chaque condition expérimentale est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement robustes afin de valider notre nouvelle thérapie.
Raffinement
Un suivi des animaux quotidien sera réalisé par les personnes compétentes impliquées dans ce projet, afin d’appliquer les points limites pour réduire la souffrance des animaux. Si un animal présente des signes de souffrance son euthanasie anticipée sera réalisée.
Choix des espèces
Afin de développer et proposer des thérapies, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle in vivo. Le modèle murin sélectionné pour ce travail est le plus pertinent puisqu’il est le plus utilisé dans les études précliniques. Également, nous avons déjà démontré dans différents modèles murins soumis aux rayonnements ionisants l’efficacité thérapeutique des VE-CSM dans les processus de néovascularisation et la réparation tissulaire. Enfin, nous maîtrisons les techniques indispensables afin d’évaluer les paramètres vasculaires, inflammatoires et cognitifs pour démontrer l’efficacité de notre traitement. Les animaux seront utilisés entre 8/12 semaines, correspondant au stade adulte. Ce stade a été choisi afin d’éviter une hétérogénéité liée à l’âge qui pourrait modifier les paramètres étudiés.
Etudes de toxicologie rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 20000
40 000 animaux non-humains, 20 000 souris et 20 000 rats, vont être utilisés et tous tués pour analyse histopathologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament, un vaccin ou un produit chimique par voie orale ou par injection, chaque jour ou chaque semaine, sur des études pouvant durer un, trois ou douze mois, avec jusqu'à une vingtaine d'interventions par animal et par semaine, des prises de sang en tube de contention sur animal vigile, une mise à jeun et jusqu'à seize heures en cage à diurèse. Le porteur retient comme effets attendus l'inconfort, le stress, la douleur transitoire et la perte de poids, et parle de "sacrifices" pour désigner les mises à mort intermédiaires. Il indique que ces essais répondent à une exigence réglementaire et affirme qu'il n'existe pas encore de méthode in vitro pour certains effets, en raison de la complexité des organismes vivants.
Objectifs
L’objectif de ce projet est l’évaluation des caractéristiques toxiques chez le rongeur d’un candidat médicament, d’un vaccin ou d’un produit chimique, conformément aux lignes directrices du médicament ou de l'OCDE. Ces études interviennent lors de plusieurs phases du développement (précocément pour les études préliminaires, en prérequis avant tout essai clinique chez l’Homme pour les études subchroniques, ou dans les dernières étapes du développement d’un médicament avant sa mise sur le marché pour les études chroniques). Ces études permettent l’évaluation du risque pour l’Homme ou l’animal, en fournissant des informations sur les organes cibles et sur les effets toxiques majeurs, en déterminant notamment une dose sans effet adverse intégrée dans les critères de marge de sécurité pour l’utilisation ou l’exposition humaine ou pour un usage vétérinaire.
Bénéfices attendus
Le nombre minimal d’animaux par groupe et ou/sexe suit les recommandations des lignes directrices dans le but de garantir suffisamment d’animaux pour permettre la détection des signes de toxicité au début des premiers essais chez l’Homme ou l’animal). Ces effectifs minimums sont aussi recommandés pour garantir le succès des tests statistiques [tests de normalité variance , comparaison de moyennes par exemple] afin d'interpréter les résultats. L'ensemble des études du projet vise à identifier la tolérance locale des produits, une toxicité d'organe, un potentiel clastogène et aneugène d'une substance, un profil métabolique et pharmacocinétique, et/ou des seuils de toxicité (dose maximale tolérée, dose sans effet...) permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine (industrie pharmaceutique), la sécurité d’utilisateurs (industrie chimique) ou le bénéfice pour l’animal (industrie vétérinaire).
Procédures
Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi injection intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire avec le produit d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3, ou 12 mois pour les études règlementaires]. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.
Devenir
Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus ; à ce titre les animaux seront euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments/produits chimiques selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.
Raffinement
L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène...) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout isolement d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.
Choix des espèces
Au-delà des aspects pratiques (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent cité car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou connue pour plus de sensibilité à certaines molécules) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’Homme (exemple paramètres immunologiques), le Hamster pour son métabolisme, le cobaye pour la voie dermale ou pour paramètres immunologiques. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux. Les animaux ont 5 à 6 semaines d’âge en début de traitement car ils sont en âge de croissance. Dans certains modes d'administration, il est possible d'augmenter légèrement l'âge (voie dermale, souris) pour des contraintes techniques ou pour des raisons scientifiques (maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.
Thérapie cellulaire dans la gestion du diabète et de ses complications
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 232
Rendus diabétiques par une injection unique puis greffés d'îlots pancréatiques sous anesthésie, 232 souris et 232 rats sont tous tués pour des prélèvements terminaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ une heure suivie d'une semaine d'isolement, des tests de tolérance au glucose avec jusqu'à dix prélèvements sanguins sur trois à six heures, des prises de sang jusqu'à trois fois par semaine pendant six mois, et une évaluation de la neuropathie par stimulation tactile et thermique des pattes. Alors que la gravité déclarée est sévère, le porteur ne décrit que des "effets indésirables légers", perte de poids, épisodes d'hypoglycémie, jeûne de seize heures et stress lié aux administrations. Il affirme que les modèles animaux "restent indispensables" pour valider la tolérance et l'efficacité du dispositif chez l'humain.
Objectifs
Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.
Procédures
Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires, (4) à un stress lié à l'administration de substance. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).
Devenir
Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.
Etude systémique entre les os et les reins, par analyses morphologiques et fonctionnelles, après une exposition chronique à faible dose d’uranium chez des souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent de l'uranium dans leur eau de boisson pendant six mois, passent jusqu'à seize heures seules en cage à métabolisme pour le recueil des urines et des fèces, et subissent des échographies doppler de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever le sang, les reins et les os. Le projet dispose déjà de sphéroïdes, d'organoïdes rénaux et de modèles osseux biomimétiques, et le porteur indique que les souris servent d'abord à évaluer la robustesse de ces modèles sans animaux, puis à observer la relation entre os et rein qu'il juge irréalisable in vitro. Il présente la mutualisation des prélèvements entre partenaires du projet comme sa mesure de réduction.
Objectifs
L’uranium est un métal lourd radioactif naturellement présent dans l’environnement. Du fait de cette présence naturelle mais également de ses propriétés de radioéléments il est utilisé par l’Homme pour diverses applications civiles et militaires. La population générale peut y être exposée par ingestion d’eau de boisson et/ou d’aliments contaminés. Diverses études épidémiologiques et expérimentales ont auparavant montré qu’une exposition environnementale, ou professionnelle à l’uranium peut induire des effets délétères sur les reins et les os connues comme étant les organes cibles de la toxicité aiguë de ce radioélément. Cependant d’importantes lacunes subsistent sur la compréhension des mécanismes à l’origine de cette toxicité ; de plus l’impact de cette toxicité sur la relation qui existe entre ces deux organes est très peu documenté - notamment dans le cadre d’une exposition chronique à faible dose qui correspond au risque d’exposition professionnelle ou de la population générale. Le présent projet permettra de comprendre les réponses biologiques et biochimiques existantes après une exposition chronique à de faible dose d’uranium au niveau des reins et des os ainsi qu’entre ces deux organes qui possèdent une relation physiologique importante. Le projet s’appuiera sur un modèle in vivo de souris non modifiées génétiquement qui a déjà prouvé être un modèle pertinent lors de précédentes études de toxicologie rénale. De plus, afin de limiter l’utilisation d’organismes vivants, le projet s’appuiera également sur différents modèles cellulaires 3D innovants (osseux et rénaux). Ils permettront d’évaluer en amont les mécanismes toxicologiques mis en jeu au cours d’une exposition chronique à faibles doses d’uranium. Les mécanismes et les voies cellulaires altérées au cours des études de toxicologie cellulaire seront par la suite analysés plus finement à l’aide du modèle in vivo dont il est fait mention. L’étude de ces réponses et de ces interactions physiologiques sera effectuée en collaboration avec des spécialistes du tissu osseux ainsi que des spécialistes des interactions protéines-ligands.
Bénéfices attendus
A court terme ce projet a pour objectif de mieux comprendre le comportement et le devenir de l’uranium (séparation en différence espèce chimique, interaction, distribution spatiale) dans les compartiments intra et extra-cellulaires des différents modèles osseux et rénaux chez l’animal, d’identifier les voies de signalisations cellulaires impactées, et différents biomarqueurs au sein et entre ces deux organes après une exposition chronique à faible dose. A plus long terme, ce projet a pour objectif de permettre une meilleure compréhension et une meilleure prise en charge des risques pour les populations et la santé humaine à la suite d’une contamination interne aux radionucléides.
Procédures
L’exposition par eau de boisson sera faite avec une surveillance du poids des biberons et du poids des animaux ; il n’est pas attendu de nuisance importante par rapport à l’exposition en cohérence avec les précédentes études publiées ; l’exposition interne à l’uranium doit conduire à une irradiation dans le domaine des faibles doses. Les animaux seront hébergés pendant un maximum de 16 heures individuellement en cage à métabolisme à 2 mois et/ou, 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Les analyses échographiques sont non-invasives et effectuées sous anesthésie : l’échographie aura lieu sous anesthésie légère pendant 30 à 45 minutes sous monitoring cardiaque et respiratoire. Elles seront réalisées avant l’exposition et à 2 mois et/ou 4 mois et/ou 6 mois selon la procédure expérimentale. Un prélèvement de sang est réalisé sur animal anesthésié juste avant son euthanasie de l’animal (2 min).
Impact sur les animaux
L’étude est susceptible de provoquer un léger stress chez les animaux qui seront amenés à être manipulé notamment lors du passage en cage spécifique pour la collecte d’urines et de fèces ; ainsi que pour le suivi par échographie doppler qui nécessitera une anesthésie préalable.
Devenir
Les animaux seront anesthésiés avant d’être mis à mort à la fin de l’exposition pour prélèvement terminaux (sang, reins, os) qui seront par la suite utilisés à des fins histologiques (marquages des tissus pour localisation de biomarqueurs cibles au sein des tissus), ainsi qu’en biochimie et biologie moléculaire (expression de gènes cibles, quantification de protéines et de marqueurs d’atteintes toxicologiques/pathologiques).
Remplacement
Le projet comprend l’utilisation de modèles cellulaires innovants dont des sphéroïdes et organoïdes rénaux ainsi que des modèles osseux biomimétiques qui permettront d’évaluer une réponse toxicologique et de mettre en avant des voies de signalisation propres à l’organe d’intérêt du modèle utilisé (reins ou os). L’utilisation d’animaux au sein de ce projet permettra dans un premier temps d’évaluer la robustesse du développement de nos nouveaux modèles 3D (application des principes de remplacement) ; mais également d’analyser les réponses biologiques et biochimiques à l’uranium au niveau systémique et donc d’intégrer les relations hormonales existantes entre les os et le rein ce qui n’est pas réalisable à l’heure actuelle avec des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé à l’aide de calcul statistique afin d’aboutir à un effectif minimal qui permettra un traitement des données statistiques à la suite de la procédure expérimentale. Les souris euthanasiées permettront de fournir des échantillons biologiques de façon mutualisées (os, reins, fluides biologiques etc) pour tous les partenaires impliqués dans le projet et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés si les études in vivo avaient été divisés entre les partenaires du projet.
Raffinement
Pendant toute la durée de l’étude, les animaux seront hébergés en groupe maximum de 5, avec un enrichissement supplémentaire (ouates, maisons…) comme mesure de raffinement. L’isolement pourra être fait uniquement en cas d’agression entre congénères. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé. Les points d’arrêt définis dans le projet seront appliqués à tous les animaux de l’étude présentant des signes comportementaux ou cliniques d’atteinte et conduiront à la mise à mort anticipée de l’animal (application du principe de raffinement).
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J est un modèle bien décrit dans la littérature. De plus les précédentes études sur la physiopathologie rénale effectuées au laboratoire après exposition interne à l’uranium ont permis à l’équipe porteuse des procédures d’expérimentation animale d’acquérir une expertise sur ce modèle de souris. Les animaux seront des adultes de 6-8 semaines au moment du début de l’exposition chronique. A cet âge, la physiologie rénale et osseuse est mature. Les animaux seront hébergés et mis en groupe à l’âge de 5 semaines afin de limiter les agressions entre congénères.