Souris
Impact de mutations humaines du gène GRID1 associées à une déficience intellectuelle sur les propriétés anatomiques et fonctionnelles du cerveau de souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour reproduire des mutations humaines du gène GRID1 liées à une déficience intellectuelle, 324 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 300 d'entre elles, les 24 autres étant opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Selon les groupes, elles subissent une injection intracérébrale de vecteurs viraux de trente à quarante-cinq minutes, un prélèvement de liquide céphalorachidien, un prélèvement sanguin et une amputation de deux millimètres de queue pour génotypage, toutes étant tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit une perte de poids et une douleur de vingt-quatre à quarante-huit heures après chirurgie, ainsi qu'un risque de détresse respiratoire ou d'arrêt cardiaque sous anesthésie, et qualifie ces chirurgies d'"indispensables" à son projet. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour éviter, écrit-il, la souffrance qu'entraînerait leur réveil après la ponction de liquide céphalorachidien.
Objectifs
Les protéines impliquées dans la communication entre les neurones jouent un rôle important dans le fonctionnement du cerveau, et des mutations humaines de ces protéines sont associées à la schizophrénie et à l'autisme. Il a récemment été identifié des mutations de ces protéines liés à une déficience intellectuelle avec paraplégie spastique, avec ou sans glaucome. L'expression de ces mutants dans des cultures neuronales de souris entraîne une altération de la physiologie du neurone et des connexions entre neurones. Il a également été généré une lignée de souris mutantes comportant une de ces mutations. Ce projet vise à : i) caractériser les altérations de ces souris mutantes aux niveaux neurophysiologiques, neurochimiques, anatomiques et génomiques afin de les comparer aux altérations observées par nos collaborateurs chez les patients humains, ii) caractériser l’impact de l’expression à l’âge adulte des récepteurs mutants susmentionnées sur les propriétés anatomiques et électrophysiologiques des neurones de souris sauvages pour en distinguer les effets aigus des effets neurodeveloppementaux. Ce projet permettra de caractériser les signatures pathologiques et les processus physiopathologiques liés aux mutations humaines de ces récepteurs.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des pathologies liées aux variants des récepteurs du glutamate chez l’humain (schizophrénie, autisme, déficience intellectuelle, paraplégie spastique) et à identifier des cibles pour de futures thérapies visant à les soigner.
Procédures
Les animaux subiront une des trois interventions suivantes : 1) Prélèvement sanguin sur animaux adultes de 2 mois sous anesthésie générale gazeuse et sous anesthésie locale. Cette procédure dure 5-10 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 2) Prélèvement de liquide céphalorachidien sur animaux adultes de 2 mois sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30 min et est immédiatement suivie d’une euthanasie des animaux anesthésiés. 3) Injections intracérébrales de vecteurs viraux sur animaux de 4-6 semaines sous analgésie générale et anesthésie générale gazeuse. Cette procédure chirurgicale dure 30-45 min. 4-6 semaines après l’injection, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire (15 min).4) Prélèvement caudal (2mm de long) à des fins de genotypage durée : 15min
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie peuvent être à l’origine d’une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seules ces chirurgies permettent d’exprimer les récepteurs d’intérêt à l’âge adulte dans des régions cérébrales spécifiques afin d’en distinguer les effets aigus et locaux des effets neurodeveloppementaux ou indirects. Durant les phases d’anesthésie, les animaux pourraient subir un stress thermique, une détresse respiratoire ou un arrêt cardiaque. Pour les besoins de genotypage, les souris subiront un prélèvement caudal qui pourrait causer un stress ou une douleur de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques génomiques, anatomiques et fonctionnelles du tissu cérébral, soit afin de valider le protocole de prélèvement post-mortem du liquide céphalorachidien, soit encore afin d’éviter la souffrance au réveil après prélèvement du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale.
Remplacement
Le cerveau est un organe très complexe qui comprend des milliards de neurones de centaines de types différents, dont chacun établit des milliers de connexions avec d’autres neurones, et qui sont rassemblés en structures largement connectées entre elles et/ou avec d’autres organes. En raison de cette complexité, il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative non-animale à l’étude de l’impact sur les structures et les fonctions cérébrales d’une mutation bi-allélique responsable de déficience intellectuelle et de paraplégie spastique chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été calculé considérant l’expérience des utilisateurs de l’équipe en chirurgie, électrophysiologie, histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire et des données de la littérature, et sur la base d’un seuil de significativité et d’un calcul de puissance. Compte tenu de l’expérience des utilisateurs de l’équipe et des taux de succès indiqués dans la littérature, le nombre d’animaux utilisés a été réduit aux besoins minimaux d’apprentissage et de test et à la détection d’une différence significative entre les souris sauvages et mutantes. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Nbre total d'animaux:324
Raffinement
Les animaux sont hébergés en accord avec la directive 2010/63/EU . Ils sont dans un environnement enrichi par la présence de matériau végétal pour édifier un nid. Ils sont visités chaque jour. Ils seront acclimatés 5 à 7 jours dans la zone d’hébergement et manipulés chaque jour pour réduire le stress le jour de la procédure. Pour les procédures avec chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques selon les conseils du vétérinaire référent. Les points limites seront : a) une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire, b) modification du comportement caractéristique d'une douleur, détresse ou souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté), c) perte de poids supérieure ou égale à 20 pour cent. Une pesée sera effectuée avant l’anesthésie puis quotidiennement pendant 3 jours après. Les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie par injection d’une dose létale d’euthanasiant. L’euthanasie des animaux par décapitation, exsanguination ou injection d’une dose létale d’euthanasiant sera effectuée par une personne experte.
Choix des espèces
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système nerveux central avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation du récepteur du glutamate liée à un syndrome associant pathologie nerveuse centrale et périphérique. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Des animaux adultes seront utilisés afin d’évaluer l’impact sur l’animal de la mutation du récepteur du glutamate et de comparer les altérations biochimiques et génomiques avec celles observées par nos collaborateurs sur des patients adultes porteurs de cette mutation et sur des neurones corticaux matures issus de cellules souches pluripotentes humaines portant la même mutation. Des animaux de 4 semaines seront utilisés afin de permettre l’expression des transgènes par les vecteurs viraux (4 à 6 semaines) avant de réaliser les expériences sur les animaux d’âge adulte.
Caractérisation in vivo de plusieurs clones de la lignée de cancer colorectal CT26
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Rasées puis injectées sous la peau avec des cellules de cancer colorectal, 140 souris développent une tumeur et sont toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont contenues trois fois par semaine pour la mesure de la tumeur au pied à coulisse et anesthésiées une fois par semaine pour une imagerie par bioluminescence, soit quatre séances d'anesthésie par animal. Le projet vise à caractériser une lignée cellulaire "maison" destinée à servir de ressource aux équipes de l'établissement, sans évaluer de traitement. Le porteur affirme qu'aucun point limite ne sera atteint, ni sur la taille de la tumeur ni sur une nécrose de la peau, parce qu'il maîtrise le modèle et arrêtera les analyses avant ce stade.
Objectifs
L'immunothérapie ou les agents bispécifiques sont les voies les plus prometteuses de la recherche sur le cancer. Ces thérapies innovantes visent à réactiver le système immunitaire pour qu'il lutte contre les cellules tumorales qui, autrement, développent des stratégies d'évasion pour échapper à son contrôle. Les molécules ciblées dans ces stratégies pourraient être des molécules de point de contrôle inhibant les fonctions effectrices des cellules immunitaires. Déjà utilisés en clinique, le mode d'action précis de ces traitements innovants et leur effet sur le micro-environnement tumoral restent largement inconnus ou sont parcellaires, les modalités d'analyse développées étant limitées à l'expertise du laboratoire menant l'étude. Ce manque de caractérisation approfondie des modèles précliniques constitue un obstacle majeur à l'élaboration de stratégies expérimentales optimales pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle classe de produits thérapeutiques. Parallèlement, il n'existe actuellement aucun modèle de tumeur syngénique qui permettrait de surveiller efficacement la croissance tumorale et d'étudier le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Ce promet va nous permettre de générer un ensemble de données de ressources qui répondrait à ce défi en concevant un nouveau modèle de tumeur syngénique de "nouvelle génération" de cancer colorectal, la lignée CT26 permettant le suivi in vivo de la croissance tumorale par bioluminescence et couplé à la caractérisation phénotypique et fonctionnelle approfondie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) au cours de la progression tumorale et du microbiome.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est de caractériser in vivo une nouvelle lignée CT26 maison qui sera une ressource pour les membres scientifiques. Cette lignée à double rapporteur permettra un suivi longitudinal non invasif de la croissance tumorale par bioluminescence et introduira de l'ovalbumine (OVA) dans la tumeur qui permettra d'étudier le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral utilisé et nous pouvons nous assurer de la bonne mise en place de modèles tumoraux. Cette approche est rare et pourtant elle apporte un énorme bénéfice dans l'analyse longitudinale des projets de recherche fondamentale et appliquée dans le domaine de l'oncologie.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir des meilleurs résultats en imagerie et éviter l’auto fluorescence des poils, les animaux seront rasés et dépilés sous anesthésie générale gazeuse. Cette opération dure une dizaine de minute. Les animaux seront ensuite soumis à une injection de cellules unique le jour même au niveau du flanc gauche avec maintien en contention de la souris, cela peut durer 2 minutes par souris. Tous les animaux seront soumis à une contention 3 fois par semaine pour la mesure de tumeur par calliper et pour l'imagerie par Bioluminescence une fois par semaine. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale (durée 3 à 5 minutes par séance), cela correspond à 4 séances d'anesthésie par animal.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette procédure, nous allons injecter par voie sous-cutanées des cellules tumorales à des souris. L'injection dure quelques secondes et peut entrainer un stress léger de courte durée pour l’animal. Nous n’attendons pas d’effet additionnel lié aux injections des cellules tumorales. Les effets indésirables liés à la présence de tumeurs ou métastases peut provoquer un léger inconfort en fonction de la taille de la tumeur comme une gêne dans le déplacement. Si un problème de respiration suite à des métastases pulmonaires est observé. L’animal sera ainsi surveillé de très près. Notre bonne maitrise du modèle tumoral nous assure de l'absence d'atteinte de points limites liés à la taille de la tumeur, métastases ou à une éventuelle nécrose de la surface de la peau, car nous effectuerons les analyses avant cette période de la croissance tumorale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélévements sanguins et de la tumeur pour le suivi de marqueurs sériques et la caractérisation histologiques.
Remplacement
Ce projet vise à développer un nouveau modèle tumoral qui va nous permettre d'utiliser nos compétences en imagerie pour la recherche en oncologie et à la fois de caractériser le phénotype et la fonction des leucocytes infiltrant la tumeur et engagés dans une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. Après avoir valider nos modèles tumoraux in vitro, nous avons besoin de valider que ses cellules injectées dans un organisme vivant peuvent formés une tumeur solide sur lequel on peut effectuer des traitements et suivre ainsi le volume de la tumeur. Seul le modèle animal vivant permet cet usage et la souris est le modèle de référence pour les recherches en oncologie.
Réduction
Nous prévoyons dans ce protocole d'injecter 20 animaux par clone de cellules et par concentration et 20 animaux pour la lignée contrôles pour un total de 140 animaux afin de permettre de bien caractériser le suivie de la tumorale. Sachant que statistiquement prêt de 5% des animaux peuvent ne pas avoir des tumeurs ou avoir des poussées tardives. Le but du projet vise à réduire le nombre d'animaux employés en recherche préclinique en oncologie plus tard. En effet, l'approche longitudinale remplace les mises à morts à des stades étagés et permet donc une réduction globale dans ces projets
Raffinement
Les animaux seront injectés par voie sous-cutanée, soit un geste de quelques secondes. Ils seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine pour s'assurer de leur bien-être. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral injecté et nous connaissons notamment sa croissance et les éventuelles conséquences sur la santé de l'animal. Nous pouvons affirmer qu'aucun point limite ne sera atteint pour ces animaux en lien avec le modèle tumoral, que ce soit en lien avec la taille de la tumeur ou son état (nécrose par exemple).
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en recherche préclinique en oncologie pour le développement des nouveaux modèles et tester des nouvelles cibles thérapeutiques Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines lors de l'injection, cela correspond à l'âge auquel nous avons généré le plus grand nombre de données sur ce modèle.
Étude de la dysfonction coronaire microvasculaire et de sa prévention par échographie chez le petit animal (½)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une mutation qui les rend diabétiques et obèses, elles reçoivent un gavage quotidien six jours sur sept pendant douze semaines et subissent quatre échographies cardiaques de trente minutes sous anesthésie, avec épilation à la crème et injection intrapéritonéale d'un vasodilatateur. Le porteur affirme que ce protocole d'imagerie n'entraînera "pas de douleur, souffrance ou angoisse", et ne retient comme nuisances que le stress du transport pédestre entre bâtiments et celui du réveil d'anesthésie. Il justifie la mise à mort par la "nécessité" d'objectiver l'atteinte des microvaisseaux coronaires après la mort, pour un médicament déjà largement prescrit en clinique.
Objectifs
Les maladies des artères coronaires sont responsables d’une augmentation de la mortalité cardiovasculaire. L’objectif de cette étude est d’étudier la possibilité de la prévention de ces maladies en utilisant un traitement contre l’insuffisance cardiaque (Entresto) dont les effets coronaires sont inconnus à ce jour, dans un modèle de souris obèse diabétique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra l’évaluation de la capacité de l’Entresto à prévenir la dysfonction coronarienne microvasculaire.
Procédures
Les animaux prendront part à plusieurs imageries échographiques cardiaques réalisées à 8, 12, 16 et 20 semaines d’âge. Elles se feront sous anesthésie volatile et dureront 30 min maximum pour chaque souris. Durant les acquisitions les souris seront épilées au niveau de la zone d’intérêt avec une crème épilatoire pour peaux sensibles, elles seront sur un lit thermostaté pour compenser la chute de température corporelle liée à l’anesthésie et recevront un gel ophtalmique pour prévenir toute sécheresse oculaire. Les échographies auront lieu dans un autre établissement utilisateur que l’hébergement, Le transport des animaux vigiles prendra environ 10 min et se fera par voie pédestre dans des conditions de raffinement maîtrisées en utilisant des cages isolées des stimuli extérieurs. A partir de l’âge de 8 semaines et immédiatement après la 1ère échographie, une solution d’Entresto diluée dans du liquide physiologique sera administrée quotidiennement par gavage aux animaux du groupe traité jusqu’au terme du protocole, c’est-à-dire pendant 12 semaines, soit jusqu’à 20 semaines d’âge. Le volume administré quotidiennement per os sera de l’ordre de 300 µL. Les animaux des groupes diabétiques et contrôles non traités se verront administrer un volume similaire de liquide physiologique. Une trêve dominicale sera observée pour tous les animaux (traitement 6 jours / 7 pendant 12 semaines), compatible avec la pharmacocinétique de l’entresto décrite chez le rongeur. Un prélèvement sanguin caudal sera effectué sur les animaux vigiles à 8 et 20 semaines pour dosage plasmatique d'un marqueur d’efficacité du traitement.
Impact sur les animaux
L’imagerie échographique cardiaque implique l’administration intrapéritonéale d’un agent vasodilatateur qui sera réalisée sous anesthésie volatile afin de limiter le stress aux animaux. Le transport et le changement d’animalerie peuvent aussi induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport, pédestre, sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que les deux prélèvements caudaux peuvent également causer un stress léger. En revanche, aucun effet indésirable n’est attendu comme conséquence de l’administration de l’Entresto, qui est largement utilisé en clinique.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la nécessité d’objectiver la dysfonction coronaire microvasculaire par des études immunohistochimiqes post-mortem.
Remplacement
Les atteintes des microvaisseaux coronaires sont la conséquence de désordres métaboliques et physiologiques qui sont à l'heure actuelle impossible à reproduire in vitro et qui nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. De plus, l’évaluation de l’effet de l’Entresto sur la microcirculation coronaire doit être effectuée in vivo pour que l’on puisse envisager une extrapolation des résultats à la situation clinique.
Réduction
L’utilisation de 24 animaux au total se répartissant en 8 animaux / groupe est un minimum pour l’analyse fiable des résultats. Nous fondons ce dimensionnement sur une étude préalable ayant mis en évidence une dysfonction coronaire microvasculaire par réduction significative de la réserve coronaire in vivo chez des rats obèses avec des effectifs similaires. Nous comptons également sur l’absence de mortalité observée précédemment au décours de ce protocole expérimental pour limiter au maximum la taille initiale des groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec enrichissement du milieu de vie, un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites stricts et spécifiques au modèle animal et aux actes réalisés sont mis en place, via une grille de scoring, afin d’évaluer une potentielle souffrance. Une surveillance accrue de la consommation d’eau de boisson en raison de la polydipsie des animaux diabétiques sera réalisée, et la fréquence de change des cages sera augmentée si nécessaire. Les sessions d’imagerie échographique cardiaque se dérouleront sous anesthésie volatile, avec une anesthésie d’environ 30min. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et les fréquences respiratoire et cardiaque seront monitorées en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Le protocole d’imagerie échographique cardiaque n’entrainera pas de douleur, souffrance ou angoisse.
Choix des espèces
La lignée de souris choisie possède une mutation génétique qui la rend diabétique. Le modèle est très largement utilisé pour l’étude de maladies métaboliques car il reflète bien la maladie humaine , tout en étant moins sévère que d’autres modèles. Ce modèle constitue donc un outil largement utilisé pour l’étude de la maladie coronaire microvasculaire et de sa prévention. Les animaux seront accueillis à 7 semaines d’âge, à un stade de développement précoce de la maladie diabétique entraînée par la mutation dont ils sont porteurs. Le choix de ce stade précoce est guidé par la volonté d’étudier le potentiel de l’Entresto à prévenir la maladie coronaire microvasculaire.
impact d’une exposition alimentaire à des pesticides seuls ou en cocktail sur l’homéostasie métabolique dans des conditions d’alimentation standard et déséquilibrée
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour mesurer l'effet de pesticides alimentaires sur le métabolisme, 256 souris sont utilisées pendant vingt-six semaines dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les organes. Nourries avec un régime riche en graisse contenant des pesticides seuls ou en mélange, elles développent une obésité, un diabète et une accumulation de graisse dans le foie. Le porteur décrit ces perturbations comme survenant "sans souffrance visible des animaux", et retient parmi les nuisances le stress de contention, les piqûres, les gavages et l'isolement de vingt-quatre heures en cage à urines. Le lien entre pesticides et troubles métaboliques a déjà été rapporté chez l'humain par la cohorte NutriNet-Santé, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit le dialogue entre foie, intestin et tissu adipeux.
Objectifs
L’incidence des maladies métaboliques (obésité, diabète de type 2 et stéatose hépatique) a augmenté ces 30 dernières années et constitue un enjeu majeur de santé publique. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation riche en lipides), de nombreuses études appuient l’hypothèse que l’exposition à des contaminants environnementaux, tels que les pesticides, est un facteur de risque au développement de ces pathologies. Dans ce projet nous travaillerons sur un modèle murin d’exposition alimentaire aux pesticides pour mimer l’exposition des consommateurs. Les animaux seront exposés à des pesticides seuls ou en mélange à des doses non toxiques telles qu’elles sont définies par les agences réglementaires, dans des conditions d’alimentation équilibrée ou déséquilibrée (riche en graisse). Nous suivrons les marqueurs caractéristiques des pathologies hépatiques non alcooliques, du diabète et de l'obésité tout au long de l’expérience qui durera 26 semaines.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire aux pesticides seuls ou en cocktail dans un contexte d’alimentation équilibrée ou d’alimentation déséquilibrée source de troubles métaboliques. Ce projet apportera des arguments en faveur ou non du lien entre exposition aux pesticides et le risque de développer des pathologies métaboliques rapporté dans des études récentes réalisées dans la cohorte Française Nutrinet santé.
Procédures
Les animaux seront nourris avec un régime contrôle ou un régime riche en graisse contenant les pesticides. Au cours des 26 semaines de régime, nous réaliserons 2 tests pour évaluer la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour ces tests, le glucose et l’insuline seront administrés après 6h de jeûne. Les gestes de contention et de gavage dureront moins de 30 secondes par animal. Pour les mesures de taux de glucose sanguin (glycémie), le prélèvement d’une seule goutte de sang sera réalisé à la queue. Ces tests seront réalisés en alternance et espacés au minimum d'une semaine, et réalisé seulement 2 fois au cours des 26 semaines. Des prélèvements intermédiaires de sang qui prennent environ 15 secondes, pourront aussi être réalisés. Les animaux seront placés individuellement pendant 24h dans des cages adaptées à la récolte des urines. Avant la mise à mort, un prélèvement de sang sera réalisé à la joue.
Impact sur les animaux
Le régime utilisé dans cette expérience est riche en graisse. Il induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées comme un diabète, une accumulation de graisse dans le foie, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement. Le prélèvement sanguin et l’administration de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, à la piqûre, bien que légère, au gavage, bien que très rapide, ainsi qu’une légère douleur (piqûre). L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine peut entraîner un stress de l’animal.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires). En effet, la stéatose hépatique non alcoolique est caractérisée par une accumulation de lipides dans le foie qui viennent majoritairement du tissu adipeux ; de plus le microbiote intestinal joue un rôle prépondérant dans son développement et sa progression.
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur des études similaires précédentes et en respectant la règle des 3R. Le nombre idéal d’animaux par groupe est donc de 16, et avec un total de 256 animaux.
Raffinement
Comme il est convenu réglementairement, les animaux seront hébergés dans des cages de 4 à 5 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. En ce qui concerne les cages à métabolisme, les souris disposeront également d'un abri en inox. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 5 aspects de l'état de l'animal : variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; apparence physique externe ; signes cliniques mesurables (changements du rythme respiratoire) ; changement dans les comportements non provoqués et réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal, une absence totale et pérenne des 5 signes indiqués, ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs à chacune des catégories indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint et l'animal sera retiré de l'expérimentation.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. En effet, il est bien connu que les souris soumises à un régime gras développent une insulino-résistance importante, élément corrélé avec l'apparition de la MASLD. Nous utiliserons uniquement des souris adultes car il est nécessaire que la fonction hépatique ait pleinement atteint sa maturité physiologique (7 semaines minimum). De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme un fort dimorphisme sexuel dans le développement des maladies hépatiques.
Evaluation de l’effet des substances pharmacologiques sur le transit colonique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 3000
Réutilisés pour 2 000 d'entre eux dans d'autres projets, tués pour les autres afin de prélever leurs organes, 3 000 souris et 3 000 rats sont soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des substances jusqu'à trois fois par jour pendant cinq jours, subissent l'insertion d'une bille dans la partie terminale du colon, une privation de nourriture jusqu'à vingt-quatre heures sur grille et un hébergement individuel sur sol grillagé pour que soient comptés et pesés leurs excréments. Une partie reçoit une substance qui provoque artificiellement une diarrhée ou une constipation, afin de tester si un candidat médicament la corrige. Le porteur qualifie ces atteintes de gêne ou d'inconfort, et affirme que les modèles animaux "restent plus adaptés" que les tests in vitro pour évaluer la motilité intestinale humaine.
Objectifs
Les troubles gastrointestinaux constituent un large éventail de pathologies qui affectent l’appareil digestif depuis la cavité buccale jusqu’au rectum affectant plus de 40 % de personnes dans le monde. La diarrhée et la constipation sont les principaux symptômes des troubles de la motilité intestinale. Ils sont associés à un certain nombre de maladies chroniques (tel le syndrome du côlon irritable, les maladies inflammatoires de l’intestin) ou à la médication. La constipation est définie par une diminution de la fréquence des selles associée à une difficulté pour les évacuer et se caractérise par un ralentissement du transit et une déshydratation des selles. A l’inverse, la diarrhée est une émission de selles fréquentes, abondantes et de consistance très molle à liquide. Ces troubles sont associés à une morbidité accrue, à un inconfort, à la perte de productivité au travail et à la consommation de ressources médicales. Le présent projet consiste à évaluer d’une part l’effet des substances sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces) et d’autre part le potentiel effet à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives lors de l’évaluation clinique de nouveaux candidats médicaments. En effet, il est nécessaire d’évaluer avant les phases d’essais cliniques chez l’homme tout risque encouru lors de l’administration d’un candidat médicament.
Bénéfices attendus
Ces études ont pour objectifs d’évaluer l’efficacité de potentiel nouveaux candidats médicaments à reverser la diarrhée ou la constipation induite par des substances réactives et d’autre part évaluer leurs potentiels effets indésirables sur la fonction gastrointestinale (diarrhée ou la constipation, consistance des fèces).
Procédures
Les substances d'essais sont administrées par bolus durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées ( 3 fois par jours au maximum) pendant plusieurs jours (maximum 5 jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont mis à jeun sur grille pour une période n’excédant pas 24h (test compris). L’effet des substances sur le transit du colon est évalué soit après insertion d’une bille dans la partie distale du colon (durée de quelques minutes) ou après évaluation du nombre et de la consistance des fèces récupérées aprés hébergement inviduel des animaux sur sol grillagé (6 h maximum). Dans certains cas, les animaux peuvent recevoir une substance réactive ralentissant artificiellement le transit clonique (administration unique , durant quelques secondes). L’effet reverse des substances sur la diarrhée ou la constipation est évaluée après administration unique ou répétée (2 fois par jours au maximum / durée de quelque seconde) d’une substance réactive induisant la diarrhée ou constipation. Pour les modèles de constipation la prise de poids et la consommation d'eau et de nourriture sont monitorées au cours de l'étude nécessitant un hébergement individuel des animaux pendant au maximum 24h. Enfin, des prélèvements de sang (8 maximum) peuvent être réalisés, chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes.
Impact sur les animaux
Bien qu’un certain nombre de procédures appliquées dans ce projet n’induisent pas de nuisance ou d’effets indésirables sur les animaux, quelques procédures peuvent induire : un stress lié à la privation de nourriture temporaire (pour une durée n’excédant 24 h),à un hébergement individuel (pour une durée n’excédant 24 h), à une gêne ou un inconfort lié à l’induction des modèles symptomatiques de diarrhée ou de constipation, ou à une incommodité lors de l’insertion de la bille dans la partie distale du colon. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, des points limites clairement établis permettraient de sortir l'animal de l'étude.
Devenir
Dans le cas où des prélèvements terminaux d'organes (estomac, intestin...) sont obligatoires, les animaux ne pourront pas être maintenus en vie à la fin de l'étude et seront donc euthanasiés. Dans le cas contraire, (i.e; prélèvements terminaux d'organes non nécessaires pour atteindre les objetifs de l'étude) les animaux seront réutilisés dans un autre projet pour évaluer l'impact de la substance sur le transit intestinal par exemple.
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne représentent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central et le système endocrinien. Ainsi, les modèles animaux, restent plus adaptés pour évaluer l'effet global des médicaments sur la motilité intestinale pour le développement de nouvelle thérapie et pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) présentent une motilité intestinale similaire à celle de l'Homme et réagissent de la même manière aux substances dont les effets prokinetique ou ralentisseur du transit sont connus. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage, car les substances testées dans ce projet sont principalement destinées pour l'Homme adulte).
Etude de l’implication de l’AhR dans l’analgésie morphinique dans un modèle neuropathique de souris sauvages et KO
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une lésion chirurgicale du nerf sciatique qui induit une douleur qu'il qualifie d'irréversible, avec perte de mobilité et perte de poids, suivie d'injections sur animal vigile, de prélèvements sanguins répétés à la queue et, pour certains groupes, d'une chirurgie terminale. Les tests de sensibilité ne sont pas nommés, le résumé mentionnant seulement une mesure du seuil de douleur de dix minutes. Le nombre de prélèvements caudaux varie d'une rubrique à l'autre, neuf dans la description des procédures et dix-neuf sur trois heures dans celle du raffinement, et le porteur justifie le recours aux souris en affirmant que les cultures cellulaires ne modélisent pas la dégradation de la morphine dans un "organisme entier".
Objectifs
La douleur neuropathique (atteinte des nerfs provoquant une douleur persistante) affecte 10% de la population et est traitée par des antidépresseurs qui sont peu ou pas efficaces. Les morphiniques sont alors utilisés pour soulager ces douleurs. Or, en comparaison d’autres types de douleur, il est nécessaire d’injecter plus de morphine car celle-ci est moins efficace sur la douleur neuropathique. Lors d’une neuropathie, une voie de signalisation intracellulaire particulière induit une augmentation des quantités d’enzymes de dégradation de la morphine. Il en résulterait une dégradation accrue de la morphine et donc de son effet analgésique. Nos manipulations in vitro montrent que l’inhibition de cette voie diminue la dégradation de la morphine. Notre but est de montrer que l’inhibition de du Récepteur de l'Aryl hydrocarbone (AhR) impliqué dans la détoxification des molécules exogènes) permettrait d’augmenter l’activité analgésique de la morphine lors d’une neuropathie. Ces résultats permettraient de développer de nouveaux traitement pour soulager les patients neuropathiques
Bénéfices attendus
Nous avons montré sur des cellules et chez la souris que l’inhibition du Récepteur de l'Aryl hydrocarbone (AhR) diminuait l’expression des enzymes de détoxification et donc la dégradation de la morphine. Il en résulte une augmentation de l’analgésie de la morphine. L’inhibition d’une nouvelle voie métabolique impliquée dans la dégradation. Il en résulterait beaucoup moins d’effets secondaires. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre la douleur neuropathique qui est partiellement résistante à l’effet analgésique de la morphine. Les trois premières procédures permettront de prouver l’implication de l’AhR dans la faible analgésie de la morphine lors de neuropathies, permettant de cibler l’AhR lors du développement de traitements. Les deux dernières procédures mettront en évidence d’une enzyme de dégradation de la morphine qui pourrait aussi représenter une nouvelle cible thérapeutique.
Procédures
Un 1er groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), puis une injection sur animal vigile (30sec) et 1 test de mesure du seuil de douleur (10min). Un 2ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10min), puis une injection sur animal vigile (30sec), ainsi que 9 prélèvements de sang à la queue sur animal vigile (30sec). Un 3ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), puis une injection sur animal vigile (30sec) et une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min). Un 4ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), une injection sur animal anesthésié (5min), une injection i.p. sur animal vigile (30sec) et 1 test de mesure du seuil de douleur (10min). Un 5ème groupe de souris subira une intervention chirurgicale sous anesthésie (10 min), une injection sur animal anesthésié (5min), une injection i.p. sur animal vigile (30sec) et une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min).
Impact sur les animaux
La lésion du nerf sciatique induit une douleur irréversible. La chirurgie peut provoquer des œdèmes, une inflammation ou une infection locale. Cette lésion conduit à une perte de mobilité, ainsi qu’à une perte de poids. Concernant les injections, elles peuvent entrainer une douleur aiguë, une inflammation locale et une infection. Concernant les prises de sang à la queue, celles-ci peuvent aboutir à des saignements, une inflammation locale.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus.
Remplacement
La chirurgie permettant la mise en place d’une douleur chronique provoque des problèmes moteurs importants. Nos travaux ont montré qu’un composé est capable d’amplifier l’effet analgésique de la morphine via une inhibition du Récepteur de l’aryl hydrocarbone (AhR). Le but de notre projet est de montrer chez la souris que l’AhR qui induit une enzyme de dégradation diminue les quantités de morphine et donc l’analgésie. Nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur. (2) les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine dans l’organisme entier.
Réduction
520 animaux (260 souris mâles et 260 femelles) sont nécessaires à la réalisation des études statistiques. L’effet attendu étant inconnu, une analyse de puissance n’est pas possible. Toutefois, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe étaient généralement suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement antiallodynique en conditions neuropathiques. Les effectifs de 10 animaux tiennent également compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure (par exemple suite à des blessures consécutives à des bagarres) ou de la possibilité d’un problème technique (décès pendant la chirurgie). Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte avec tous les groupes contrôles devra être ajoutée ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions à tester chaque lot. Les tests statistiques ANOVA à 2 facteurs, suivis de comparaisons multiples, permettront de mettre en évidence des différences statistiques.
Raffinement
d'interactions sociales et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Pour aider à la reprise de poids, des aliments sous forme de gel sont déposés dans la cage. Les blessures superficielles sont désinfectées avec une solution de chlorhexidine. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e. boites du test) est réalisée. Dans les tests comportementaux où on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Par ailleurs des points-limites ont été établies pour pour chacune des procédures réalisées. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et sous analgésie et du gel oculaire est appliqué durant la procédure. Nous réaliserons des injections dans la moelle sous une anesthésie totale. Concernant les prises de sang à la queue des souris, nous réaliserons une anesthésie du bout de la queue 10min avant le 1er prélèvement de sang, puis 19 prélèvement seront réalisés sur 3h. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal. Par ailleurs, lors des tests comportementaux de mesure de seuil de douleur, l’animal peut retirer sa patte librement.
Choix des espèces
Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés sont réalisées chez la souris . Par ailleurs, l’utilisation de cette souche est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur chronique. Par ailleurs, nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voie métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études pré-cliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du système opioïdergique est uniquement mature chez l’adulte (i.e., expression des récepteurs Mu à la morphine).
Etude du rôle d’une cytokine et de sa voie de signalisation dans le vitiligo
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour étudier le rôle d'une cytokine dans le vitiligo, 400 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements. Elles reçoivent sous la peau du flanc des cellules de mélanome qui déclenchent une réaction auto-immune, puis des injections d'anticorps neutralisants, une résection chirurgicale de la greffe au douzième jour, et des séances répétées d'anesthésie gazeuse pour être pesées, mesurées et photographiées pendant plusieurs mois. Le porteur écrit que le protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris, chiffre supérieur aux 400 déclarées dans les gravités attendues. Sur le remplacement, il indique que les cibles ont été identifiées par des travaux in vitro et in silico, et affirme que la complexité de la réponse immunitaire rend "nécessaire" le recours aux expériences in vivo.
Objectifs
Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.
Procédures
400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.
Remplacement
Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.
Réduction
Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.
Choix des espèces
La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.
Production d’anticorps par ascite après injection de pristane puis irradiation chez des souris (projet Multisite_site n°1/3)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
2 300 souris vont être utilisées, tuées par ponction d'un volume de liquide abdominal qui ne permet pas leur survie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce site est le premier de trois pour un même projet de production d'anticorps par ascite, le deuxième site déclarant lui aussi 2 300 souris. Après une injection de pristane et une irradiation, elles reçoivent des hybridomes dans le péritoine, ce qui gonfle leur abdomen et modifie leur comportement, le porteur estimant qu'elles récupèrent "complètement" en 24 heures des deux premières étapes. Il annonce une baisse de plus de 95 % des effectifs depuis 2015 et un objectif d'élimination des méthodes in vivo, tout en maintenant que l'ascite est "rendue nécessaire" en cas d'urgence sanitaire.
Objectifs
La fabrication de test de diagnostics de maladies infectieuse nécessite un approvisionnement en anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux sont le coeur de la qualité des tests, ce sont ces anticorps qui vont accrocher les antigènes et ainsi diagnostiquer la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production de réactifs de diagnostic in vitro. Ces réactifs permettent de dépister des maladies infectieuses telles que, le sida, les hépatites, la toxoplasmose ou les méningites bactériennes. Ces pathologies mondiales touchent pour le sida 38.4 millions de personnes (avec 1.5 million de contaminations par an), pour les hépatites 325 millions de personnes (dont 1.3 million de décès par an et 1.7 million de nouvelles contaminations). Le CNREEA note qu'il n'est pas souhaitable que la production d'anticorps in vivo indispensable à la santé publique soit délocalisée dans des pays tiers où la règlementation en matière de protection animale est peu developpée.
Procédures
Injection intra-péritonéale d'agent activateur de la réponse immunitaire (sous traitement analgésique) dure quelques secondes., délai d’attente et de surveillance 15J Irradiation à une dose modérée dure 6.5min, délai d’attente et de surveillance 7 à 15J. Injection intra-péritonéale d'hybridomes dure quelques secondes
Impact sur les animaux
Après les étapes de pristanisation et d'irradiation, l'animal peut être amorphe associé ou non à du poil hérissé pendant 24h maximum, puis récupère complètement. La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d’ascite qui engendre un gonflement de l’abdomen de l’animal qui induit des modifications du comportement et de l'aspect de l'animal.
Devenir
Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements de fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.
Remplacement
Dans les nouveaux produits et les nouvelles versions de produit, les anticorps utilisés sont fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro ». La mise au point des conditions de production in vitro est longue (plusieurs mois) et les rendements sont souvent inférieurs à ceux in vivo. Les développements nécessaires pour chaque production les rendent moins efficaces en termes de mise au point et ils ne sont guère compatibles avec certaines applications comme les screening de molécules. L'utilisation d'animaux est rendue nécessaire en cas d'urgence sanitaire où la production in vitro ne peut être imposée. L'approche alternative doit être mis en oeuvre en effet dès lors que la production in vitro a d'ores et déjà donné des résultats satisfaisants pour un antigène considéré dans les critères de performances définis dans la formulation du produit final, sachant qu'il peut y avoir des échecs de la production in vitro en termes de quantité ou qualité. Néanmoins, un projet est lancé pour remplacement de 100% des productions d'anticorps monoclonaux "in -vivo" par des productions "In-vitro". Le but avoué est l'élimination des méthodologies In-vivo. Ce travail est suivi régulièrement et est partagé avec le MESRI.
Réduction
Une politique stricte de la gestion des stocks est en vigueur afin d'utiliser le matériel issu de ces animaux le plus judicieusement possible (pas de surstock) et d'éviter tout gaspillage. Une baisse significative du nombre d’animaux peut être notée car nous sommes passé de 25000 animaux/an demandé en 2015 à 7000 animaux/an demandé en 2021 pour être aujourd’hui à 1150 animaux /an soit une baisse de plus de 95% en quasiment 8 années.
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application dans le plus grand respect de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, associé à la mise au point de procédures rigoureuses à chaque étape du projet, à leur réalisation par du personnel formé et habilité à la surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux. A chaque étape les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. Le suivi des points limite est réalisés au travers de la mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet aux techniciens d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal de petite taille et facile à manipuler. Elle possède une durée de vie courte, ce qui permet d'avoir des études de courtes durées et l'élaboration d'hypothèses sur des modèles plus complexes dont l'Homme. Le modèle souris est utilisé du fait de l'origine des hybridomes (murine). La souche de souris Balb/C est appropriée car elle se révèle excellente pour la production ultérieure in vivo d’anticorps à partir de ces hybridomes. La souris est âgée de 8 semaines en début de protocole. La souris doit être adulte mais pas top âgé afin de ne pas « polluer « la production d’Anticorps avec les cellules propres à l’animal.
Développement de la spectroscopie et de l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire chez le rongeur et le primate non humain: Application à l’étude des altérations métaboliques au cours de l’activation cérébrale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 90
Macaques à longue queue : 1
Macaques rhésus : 5
Réutilisés ensuite dans d'autres projets, 90 souris, 90 rats et six macaques subissent des IRM répétées sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut passer jusqu'à 120 examens de deux heures sur cinq ans, avec prises de sang et administrations de molécules le jour de l'examen. Le porteur reconnaît que le stress de la contention et les anesthésies répétées entraînent une perte de poids, et que la stimulation des pattes des rongeurs provoque des douleurs les jours suivants. Quand les rongeurs deviennent trop lourds pour le scanner, il annonce leur transfert vers des projets de formation, ce qui prolonge leur utilisation dans un autre cadre.
Objectifs
Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par résonance magnétique nucléaire (RMN) à travers le développement et la validation d’outils dédiés à la résonance magnétique nucléaire à haut champ, notamment les antennes radiofréquences servant à l’excitation des spins nucléaires et la détection des signaux RMN, et les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux non-proton observables in vivo. Nous mènerons d’une part des expériences chez le rongeur (rat et souris) et le primate non humain sain anesthésié pour développer et valider nos nouveaux outils d’imagerie cérébrale. Nous attendons de ces expériences qu’elles nous permettent d’acquérir des données de référence qui seront comparées aux données de la littérature afin d’apporter la « preuve de concept » que nos outils sont performants et précis. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal sain.
Bénéfices attendus
Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour préfigurer les études de recherche biomédicale et de neurosciences à venir chez le rongeur, le primate non-humain et ultimement chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique.
Procédures
Des prélèvements sanguins (de quelques secondes) seront éventuellement réalisées chez l’animal anesthésié (juste avant, juste après ou pendant l’examen IRM) pour la détermination de certains paramètres physiologiques). Des molécules à dose thérapeutique seront administrés occasionnellement (réalisée typiquement en quelques minutes) le jour de l’examen IRM. Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM sur 5 ans pour les macaques et moins d’une dizaine pour les rongeurs. Un nombre maximal de 5 expériences de stimulations somato-sensorielle (quelques minutes) seront menées par animal durant certains examens IRM.
Impact sur les animaux
Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie répétée peuvent être délétères entrainant typiquement une perte de poids. A noter également que la stimulation somato-sensorielle des pattes chez le rongeur implique le plus souvent des douleurs les jours suivants nécessitant un traitement analgésique.
Devenir
Pour les rongeurs, les dispositifs expérimentaux présupposent un poids maximum au-delà desquels les souris ou les rats (ne peuvent plus être positionnés correctement et de façon stable dans le scanner IRM préclinique. Dans ce cas de figure, nous chercherons à transférer les animaux vers d’autres projets de formation en particulier. Après avis favorable du vétérinaire, les PNH pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.
Remplacement
Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de souris, de rat ou de macaque adulte. Toutefois, la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau ne peut être appréciée à l’aide d’objets-test aussi évolués soient-ils. Le passage par l’expérimentation animale (rongeur ou primate) est donc une nécessité.
Réduction
Nous comptons utiliser le nombre minimum d’animaux nécessaires à la mise au point et à l’affinement de nos méthodes. Aucun test statistique précis n’est envisagé à ce stade mais les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Pour chaque espèce, les effectifs suffisant pour acquérir des données de références ont été évalué sur la base de nos études précédentes. Chaque animal sera réexaminé à plusieurs reprises avec un intervalle minimum de 15 jours (soit un nombre maximum de 120 examens par animal sur une période de 5 ans). Concernant la détection des variations locales de signal liée à l’activation cérébrale, nous considérons empiriquement que les effectifs prévus seront suffisants pour atteindre une significativité statistique. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de primate nécessaires en recherche biomédicale.
Raffinement
Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continus afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveiller de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Un contrôle minutieux des points-limites est également mené tout le long du projet afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux . Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables.
Choix des espèces
Le rat et la souris sont des espèces ubiquitaires en recherche biomédicale. L’organisation, la physiologie et le métabolisme du cerveau des rongeurs sont bien connues dans le monde scientifique. Par ailleurs, de très nombreux modèles de souris transgéniques permettent aujourd’hui de valider la pertinence de nos biomarqueurs vers une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques en jeu chez la maladie humaine. Chacune de ces deux espèces de rongeur propose des challenges techniques spécifiques en terme de dimensionnement des dispositifs expérimentaux mais aussi en terme de quantité ou de stabilité des signaux RMN. Ainsi certaines méthodes ne seront pas réalisables pratiquement chez l’une ou l’autre espèce. Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'homme notamment en termes de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (conceptions des équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour les rats, les individus devront être pesés de 200 à 450g. Pour les souris, leur poids devra être compris entre 20 et 40g. Des groupes homogènes en âge seront constitués. Pour le macaque, dans le souci de réduire, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.
Effets d’une carence gestationnelle en vitamine A sur la transmission dopaminergique mésocorticolimbique dans le contrôle de la prise de décision
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 326 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance léger ou modéré, pour étudier les effets d'une carence en vitamine A pendant la gestation. Parmi les descendants, 660 subissent douze semaines de conditionnement opérant sous restriction alimentaire, avec une perte de poids limitée à 10 %, et parmi eux 240 sont opérés du cerveau en chirurgie stéréotaxique et 60 reçoivent des injections d'amphétamine. 120 autres passent des tests de comportement de type anxieux, que le porteur ne nomme pas et dont il écrit qu'ils entraînent un "stress aigü", et les 306 souris reproductrices sont tuées au sevrage. Le porteur affirme qu'une recherche dans des bases de données démontre l'absence d'alternatives, sans citer ces bases, et présente le recours à des "modèles animaux pertinents" comme une "nécessité expérimentale".
Objectifs
La carence en vitamine A au cours de la période périnatale, causée par un régime appauvri en vitamine A, reste un enjeu majeur de santé publique dans les pays en voie de développement. En effet, l’acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A est indispensable au développement cérébral du foetus et du nouveau-né mais joue également un rôle très important dans les fonctions cérébrales à l’âge adulte. En se fixant sur ses récepteurs nucléaires les RARs (Retinoic Acid Receptors) et les RXRs (Retinoid X Receptors) qui jouent le rôle de facteur de transcription, l’AR régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans les processus de plasticité cérébrale. Ainsi, de faibles apports en vitamine A pendant la période périnatale conduiraient à une hypoactivité de la voie de signalisation de l’AR et des modifications d’expression de certains gènes comme le récepteur dopaminergique D2 (D2R) avec des conséquences néfastes sur les fonctions cérébrales associées (fonctions exécutives, planification motrice). Nous faisons l’hypothèse qu’un déséquilibre d’apports alimentaires en vitamine A durant la période périnatale altère le développement de la transmission dopaminergique et pourrait participer à l’étiologie de pathologies neurodèveloppementales qui impliquent des déficits des fonctions exécutives et motrices.
Bénéfices attendus
cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
306 souris reproductrices seront euthanasiées au sevrage des animaux et 120 souris descendantes seront euthanasiés pour réaliser des enregistrements électrophysiologiques (426 sans réveil). 660 souris descendantes seront soumises à un conditionnement opérant (classe légère). Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Sur les 660 souris descendantes ayant été soumises au conditionnement opérant , 60 seront soumises à des injections intrapéritonéales d'amphétamine (classe modérée) et 240 seront soumises à des chirurgies stéréotaxiques (classe modérée). Afin d’évaluer le comportement de type anxieux, 120 souris descendantes seront soumises à des tests comportementaux qui peuvent engendrer un stress aigü (classe légère). Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. 240 souris descendantes (dont 120 soumises au conditionnement opérant) seront perfusées pour réaliser des analyses immunohistochimiques (classe légère). Cette intervention dure 15 min par souris (480 classe legère).
Impact sur les animaux
De part sa nature et son objectif les tests comportementaux évaluant le comportement de type anxieux que nous allons utiliser entraine un stress aigü chez la souris. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. Les souris seront de toute façon suivies comme suit : les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Pour cela, les animaux seront pesés chaque jour et la quantité de nourriture ajustée en fonction. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération.
Devenir
En fin de procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés pour collecter des tissus fixés afin de réaliser de l'immunomarquage sur les tranches de cerveau. En fin de procédure 3 tous les animaux seront euthanasiés et le cerveau sera prélevé (comme tissu frais) afin de réaliser des enregistrements électrophysiologiques. En fin de procédure 4, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 5 et 6 , tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques d’une carence gestationnelle en vitamine A . Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. L’objectif à long terme du projet étant de tester les effets comportementaux d’une supplémentation nutritionnelle en vitamine A dans le contexte des maladies neurodéveloppementales. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (bâton à ronger, igloo, sizzle nest). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée d'analgésique si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Enfin, les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalable soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études sur l'impact des carences gestationnelles de nutriments sur la prise de décision , de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet.
1/2 – Étude d’une molécule pharmacologique à visée thérapeutique in utero sur un modèle de souris de la Trisomie 21.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
255 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une molécule par gavage chaque jour de la gestation, jusqu'à 21 fois, le porteur reconnaissant que la répétition accentue la douleur liée à la canule. Leur descendance subit trois tests de mémoire, une électrorétinographie sous anesthésie de 30 à 45 minutes, une IRM et un prélèvement de sang, les mères étant tuées au sevrage des petits. Le porteur espère déplacer "de quelques dizaines de points" le quotient intellectuel de personnes trisomiques, promesse adossée à un modèle murin dont le taux de transmission de la trisomie atteint à peine 30 %.
Objectifs
La trisomie 21 (T21), est due à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental qui touche environ 1 nouveau-né pour 2000 naissances. Elle représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. Plusieurs traitements visant à améliorer le retard mental ont déjà été investigués. Parmi ceux-ci, on trouve une molécule qui a montré des effets bénéfiques dans des modèles animaux mais aussi chez l’Homme à l’âge adulte. Pour autant, peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications importantes se mettent en place très tôt au cours du développement dans la T21. Pour palier a ce manque, une molécule sera administré aux souris femelles gestantes. Suite à ce traitement au cours de la gestation, 4 domaines seront évalués. 1) Le domaine de la mémoire à l’origine du retard mental. 2) Le domaine ophtalmologique qui servira à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces défauts chez les patients. 3) Le domaine de du cerveau pour évaluer par Imagerie par Résonance Magnétique son fonctionnement avec ou sans le traitement. 4) Le domaine de fonctionnement du foie qui comporte des défauts chez les porteurs de T21. Ici nous voulons tester l’hypothèse que ces problèmes commence au cours de la gestation. Ce projet sera réalisé sur 2 etablissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Arriver à déplacer, de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée. Cela constituerait un progrès très important pour leur qualité de vie et celle de leur entourage. Peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications structurales de l’hippocampe et du cervelet se mettent en place très tôt au cours du développement embryonnaire dans la T21 et donc au cours de la période gestationnelle. Dans 2 études précédentes, nous avons montré que le traitement in utero chez la souris avec des inhibiteurs ciblant l’activité d'une proteine cible, améliore les déficits observés en lien avec la T21 chez plusieurs modèles murins. Ceci montre que le traitement au cours de la gestation entraîne des modifications qui perdurent sur le long terme. Nous attendons pour cette étude, les mêmes effets bénéfiques mais en utilisant une molécule de dernière génération, soluble, permettant une administration per os, indispensable pour une transposition chez l’Homme. Nous espérons que ce traitement sera suffisant pour permettre de ne plus avoir besoin de traitement chronique chez l’adulte. Une amélioration significative des performances cognitives est attendue, notamment pour la mémoire de travail et la mémoire explicite dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ce test. L’imagerie rétinienne révélera si le traitement a un impact sur les phénotypes rétiniens, ça n’a jamais été investigué. De plus, les potentielles améliorations seront également caractérisées par de l’imagerie fonctionnelle. L’étude des marqueurs sanguins permettra de savoir si le défaut du métabolisme hépatique à une origine développementale. D’une façon plus générale, pour une recherche fondamentale, les résultats obtenus devraient également permettre d’approfondir les connaissances sur le rôle de cette protéine cible au cours du développement et son impact sur les défauts cognitifs des patients.
Procédures
Les femelles gestantes seront traitées avec la molécule par gavage tous les jours pendant la durée de la gestation. Le traitement sera administré 1 fois par jour, tous les jours durant la gestation (21 jours maximum) per os par gavage. Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement qui permettent d'évaluer leur mémoire. Ces tests se déroulerons sur 4 jours, avec 1 session unique par jour. Chaque session dure de 8 à 15min suivant le test. Les souris recevront 3 anesthesies, -1 gazeuse pendant toute la durée de l’imagerie ophtalmique, 15 minutes maximum. -1 anesthésie gaseuse complementée par une analgesie pour l'imagerie par resonnance magnétique (IRM) - 1 anesthesie pour effectuer une fixation du cerveau ou une anesthésie de quelques minutes par inhalation pour un prelevement sanguin. La production des animaux traités in utero ainsi que les tests de comportement et les analyses ophtalmologiques seront fait dans l'EU235. L'IRM, les prelevements de sang et les fixations des cerveaux au PFA seront fait dans l'EU466.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules par voie orale. Cette douleur sera accentuée à cause de la répétition des gavages, au maximum 21 fois, soit 1 gavage par jour de gestation. L’électrorétinographie implique une anesthésie longue (30-45 minutes) obtenue par injection d'anesthesique. L'IRM se fait sous une anesthésie gazeuse avec analgésie, necessitant une injection. Le prélèvement de sang se fait sous anesthésie gazeuse, pouvant induire une angoisse chez l'animal. Les test de comportement nécessite de placer les souris dans des sytèmes quelles ne connaissent pas, ce qui peut engendrer un stress.
Devenir
Tous les animaux sont mis a mort. Des organes seront prelevés pour études.
Remplacement
La compréhension des mécanismes ainsi que les origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines.
Réduction
Le taux de transmission de la trisomie dans ce modèles souris et d’à peine 30%. 1 portée compte en moyenne 6 petits dont 2 trisomiques. Pour assurer la production des animaux, il faut accoupler 40 animaux femelles au total pour le traitement au cours de la gestation. Il faut multiplier ce chiffre par 2 pour avoir des mâles et des femelles, car l’analyse IRM montre des différences significatives en fonction du sexe. En effet, il nous intéresse de connaître la différence d’action que peut avoir la molécule inhibitrice sur des souris de sexes différents. Les effets du genre sur l’action de la molécule pourront ainsi être étudiés. La taille des groupes a été déterminée grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testeront 4 animaux de plus dans chaque groupe.
Raffinement
Dans notre étude précédente, l’administration répétée pendant 19J par gavage chez l’adulte de cette molécule n’a pas montré d’effets délétères chez les animaux traités. Un suivi des femelles sera cependant réalisé sur la totalité de l’expérience, notamment durant la période gestationnelle où aura lieu le traitement. Un arbre décisionnel basé sur le reflet de la douleur chez la souris sera utilisé pour ne pas prolonger des souffrances éventuellement constatées. Les conditions d’élevage seront améliorées pour les femelles gestantes pour leur permettant de faire un nid plus complexe et ainsi de mieux gérer leur exposition à la lumière et aux menaces perçues. De plus, un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience. Les animaux seront ensuite sevrés de leur mère à 4 semaines et hébergés par groupe de 4 ou 5 pour leur assurer une vie sociale. Lors des tests ophtalmiques, du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout dessèchement cornéen. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil. Durant l’examen d’IRM une anesthésie est utilisée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. La température et la respiration des animaux sont en permanence surveillées par un système de monitorage et les animaux sont maintenus à une température optimale grâce au système de chauffe berceau de l’IRM. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l’acquisition en cours est immédiatement interrompue et l’animal est sorti de l’IRM. Il est alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu’à son réveil, sous surveillance. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées et sera pris en charge par un transporteur. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d’utiliser des transgéniques est liée à l’absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Les femelles qui seront traitées durant leur gestation, utilisées pour générer les groupes d’animaux, seront accouplées à partir de 8 semaines, dès la maturation sexuelle atteinte. Les animaux issus de ces croisements, seront utilisés dès le début de la gestation. Le but de l’expérience étant de réduire les deficits qui ont lieu in utero, pendant la gestation chez les souris trisomiques. Après la naissance, les animaux sont sevrés à 4 semaines. Les femelles porteuses seront mises à mort à ce stade. Les nouveaux nés seront gardés jusqu’à 3 mois, âge adulte, auquel ils seront évalués dans différents paradigmes. C’est aussi l’âge où le développement cérébral est complet et où le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présentes.
Production d’anticorps par ascite après injection de pristane puis irradiation chez des souris (projet Multisite_site n°2/3)
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
Pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic, 2 300 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tuées par prélèvement d'un volume de liquide abdominal incompatible avec leur survie. Elles reçoivent une injection de pristane dans le péritoine, une irradiation, puis une injection d'hybridomes dont la multiplication gonfle leur abdomen et modifie leur comportement. Le porteur indique que la production in vitro existe et qu'un programme vise à remplacer 100 % des productions in vivo, tout en la décrivant comme plus lente et de moindre rendement. Il reprend l'avis du comité national d'éthique selon lequel cette production in vivo "indispensable à la santé publique" ne devrait pas partir vers des pays à réglementation moins développée, argument de localisation davantage que de science.
Objectifs
La fabrication de test de diagnostics de maladies infectieuse nécessite un approvisionnement en anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux sont le coeur de la qualité des tests, ce sont ces anticorps qui vont accrocher les antigènes et ainsi diagnostiquer la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production de réactifs de diagnostic in vitro. Ces réactifs permettent de dépister des maladies infectieuses telles que, le sida, les hépatites, la toxoplasmose ou les méningites bactériennes. Ces pathologies mondiales touchent pour le sida 38.4 millions de personnes (avec 1.5 million de contaminations par an), pour les hépatites 325 millions de personnes (dont 1.3 million de décès par an et 1.7 million de nouvelles contaminations). Le CNREEA note qu'il n'est pas souhaitable que la production d'anticorps in vivo indispensable à la santé publique soit délocalisée dans des pays tiers où la règlementation en matière de protection animale est peu développée.
Procédures
Injection intra-péritonéale d'agent activateur de la réponse immunitaire (sous traitement analgésique) dure quelques secondes., délai d’attente et de surveillance 15J Irradiation à une dose modérée dure 6.5min, délai d’attente et de surveillance 7 à 15J. Injection intra-péritonéale d'hybridomes dure quelques secondes
Impact sur les animaux
Après les étapes de pristanisation et d'irradiation, l'animal peut être amorphe associé ou non à du poil hérissé pendant 24h maximum, puis récupère complètement. La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d’ascite qui engendre un gonflement de l’abdomen de l’animal qui induit des modifications du comportement et de l'aspect de l'animal.
Devenir
Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements de fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal
Remplacement
Dans les nouveaux produits et les nouvelles versions de produit, les anticorps utilisés sont fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro ». La mise au point des conditions de production in vitro est longue (plusieurs mois) et les rendements sont souvent inférieurs à ceux in vivo. Les développements nécessaires pour chaque production les rendent moins efficaces en termes de mise au point et ils ne sont guère compatibles avec certaines applications comme les screening de molécules. L'utilisation d'animaux est rendue nécessaire en cas d'urgence sanitaire où la production in vitro ne peut être imposée. L'approche alternative doit être mis en oeuvre en effet dès lors que la production in vitro a d'ores et déjà donné des résultats satisfaisants pour un antigène considéré dans les critères de performances définis dans la formulation du produit final, sachant qu'il peut y avoir des échecs de la production in vitro en termes de quantité ou qualité. Néanmoins, un projet est lancé chez le donneur d'ordre pour remplacement de 100% des productions d'anticorps monoclonaux "in -vivo" par des productions "In-vitro". Le but avoué est l'élimination des méthodologies In-vivo. Ce travail est suivi régulièrement par le donneur d'ordre et est partagé avec le MESRI
Réduction
Une politique stricte de la gestion des stocks est en vigueur afin d'utiliser le matériel issu de ces animaux le plus judicieusement possible (pas de surstock) et d'éviter tout gaspillage. Une baisse significative du nombre d’animaux peut être notée car nous sommes passé de 25000 animaux/an demandé en 2015 à 7000 animaux/an demandé en 2021 pour être aujourd’hui à 1150 animaux /an soit une baisse de plus de 95% en quasiment 8 années
Raffinement
Le raffinement sera obtenu par l'application dans le plus grand respect de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, associé à la mise au point de procédures rigoureuses à chaque étape du projet, à leur réalisation par du personnel formé et habilité à la surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux. A chaque étape les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. Le suivi des points limite est réalisés au travers de la mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet aux techniciens d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal de petite taille et facile à manipuler. Elle possède une durée de vie courte, ce qui permet d'avoir des études de courtes durées et l'élaboration d'hypothèses sur des modèles plus complexes dont l'Homme. Le modèle souris est utilisé du fait de l'origine des hybridomes (murine). La souche de souris BALB/c est appropriée car elle se révèle excellente pour la production ultérieure in vivo d’anticorps à partir de ces hybridomes. Les souris seront toutes utilisées au stade adulte pour que leur système immunitaire soit mature. Les souris utilisées auront au minimum 6 semaines d’âge au démarrage du projet et 8 semaines (au moment de l'induction de l'ascite). A ce stade, les souris sont assez matures et robustes pour supporter l'injection des hybridomes sans mortalité en cours d'expérimentation.