Souris
Etude des conséquences de l’exposition de souris gestantes aux nanoplastiques présents dans l’eau de boisson sur l’axe placenta-intestin-cerveau
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Pour étudier les effets des nanoplastiques avalés pendant la gestation, 1 064 souris sont exploitées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et tissus. Les femelles boivent une eau chargée de nanoparticules de polystyrène une semaine avant l'accouplement puis pendant toute la gestation, et leurs petits sont soumis à des tests d'activité locomotrice, de mémorisation et d'anxiété à un et deux mois. Le porteur indique qu'un défaut de placentation peut entraîner une résorption fœtale, que les petits peuvent naître plus légers, et qu'un prélèvement de sang à la queue sans anesthésie provoque une douleur brève. Il décrit les modèles in vitro et les organoïdes comme "imparfaits" et présente le recours à la souris comme le seul moyen d'observer les conséquences sur la descendance.
Objectifs
L’exposition placentaire humaine aux nanoparticules de plastique est dorénavant documentée ainsi que leur passage transplacentaire. En effet, quatre études ont montré leur présence dans les placentas humains ainsi que dans le méconium des nouveau-nés, suggérant un passage materno-foetal. Des modèles in vitro et ex vivo ont permis d'étudier les conséquences de cette exposition sur les cellules placentaires humaines. Cependant, l’exposition n’est réalisable que sur des courtes durées et sur des cellules placentaires du 3ème trimestre. Or, les stades initiaux de la placentation sont cruciaux pour le bon déroulé de la grossesse, en particulier l’ancrage du placenta dans la muqueuse utérine. Ceci ne peut être étudié in vitro/ex vivo du fait de l'indisponibilité de placentas précoces avant 7 semaines d’aménorrhée. Aussi, les modèles d’organoides restent imparfaits tant dans leur structure cellulaire que dans l’exposition non-physiologique aux particules qui en résulte. Les conséquences sur le développement fœtal ne sont pas évaluables in vitro et ex vivo. Ainsi, les modèles actuels ne permettent pas d'étudier les conséquences sur le développement des nouveau-nés exposés in utero. A travers ce projet, nous nous intéresserons donc aux conséquences sur l’issue de grossesse de l’exposition aux nanoparticules de polystyrène au cours de la gestation et sur le devenir des nouveau-nés jusqu’au stade adulte. L’effet de deux lots de nanoparticules de polystyrène de diamètres différents présentant des caractéristiques d’internalisation différentes, sera étudié. De plus, les mécanismes d’action de ces nanoparticules variant selon leur concentration, l’effet de deux concentrations envionnementales et décrites dans la littérature sera analysé. Les souris (femelles) seront donc exposées une semaine avant l’accouplement puis tout au long de la gestation à ces particules via leur eau de boisson. L’objectif sera d’étudier le développement placentaire et l’issue de gestation de ces souris (poids foetal et maternel, anomalies placentaires, risque de retard de croissance intra-utérin). La descendance (exposée aux particules in utero) sera suivie jusqu’à l’âge adulte avec des analyses portant sur leur tractus digestif et leur dévelopement cérébral. L’ensemble de ce projet permettant ainsi d'étudier les conséquences d'une exposition in utero aux nanoparticules de plastiques sur l'issue de la gestation et le developpement global de la descendance.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera donc des connaissances sur l’absorption et la distribution sanguine des nanoparticules via le dosage de celles-ci. Des informations précieuses seront récoltées concernant les conséquences sur le développement et les fonctions placentaires mais aussi sur le développement des souris exposées in utero, tant sur la maturation intestinale et l’installation de leur microbiote que sur leur développement cérébral et comportemental. Ce projet s’inscrit dans un projet plus global et complètera les résultats obtenus sur les modèles in vitro et ex vivo. Ces résultats apporteront des connaissances essentielles concernant l’impact de l’exposition au cours de la grossesse aux polluants environnementaux avec une évaluation globale de l’axe placenta-intestin-cerveau. A long terme, ce projet participera à la détection des populations particulièrement à risque de grossesses pathologiques lié à une exposition environnementale ou professionnelle importante et au développement de mesures préventives.
Procédures
Les souris gestantes seront exposées 1 semaine avant l'accouplement puis tout au long de la gestation aux nanoparticules de plastique présentes dans leur eau de boisson. Un prélèvement bihebdomadaire, chez les souris gestantes, des fèces après émission spontanée sera réalisé pour un suivi du microbiote. Il est non-invasif, indolore et très court. Un prélèvement hebdomadaire des fèces après émission spontanée sera réalisé pour un suivi du microbiote jusqu’à J28 pour les souriceaux exposés in utero puis 1 fois à 1 et 2 mois. 15 jours après la mise-bas, en même temps que le prélèvement de fèces chez les souriceaux, un prélèvement de sang à la queue de la souris (sans anesthésie) sera pratiqué, provoquant une douleur légère de courte durée. Des tests comportementaux chez les souriceaux à 1 et 2 mois seront réalisés : tests d'activité locomotrice, de mémorisation et d'anxiété. Ils seront réalisés avec un intervalle de 2-3 jours. Les tests de locomotion, de mémorisation et d'anxiété durent respectivement 15 min, 30 min et 4min. Les prélèvements sanguins en fin d'expérimentation sont réalisés sous anesthésie prodonde pour éviter toute souffrance à la souris.
Impact sur les animaux
Les concentrations en nanoparticules choisies n’induisent pas de cytotoxicité aigue d’après les données de la littérature et les résultats in vitro sur cellules placentaires humaines. Aussi, l’exposition sera réalisée uniquement sur les souris femelles, au moment de la gestation à savoir, 1 semaine en amont de l’accouplement et durant l'ensemble de la gestation. Les effets indésirables prévus d’après les données de la littérature sont relativement faibles mais : il est possible qu’un défaut de placentation survienne entrainant alors un risque de résorption fœtale chez les souris gestantes. Un plus petit poids de naissance peut être observé chez les souriceaux exposés in utero aux particules. Aussi, les tests comportementaux pourront entrainer une possible anxiété et le prélèvement sanguin à J15 un risque d’hypovolémie. Les prélèvements de selles seront non-invasifs (isolement bref de 5min d’une souris et récupération de crotte) n’entrainant pas d’effets indésirables. Les mâles reproducteurs seront isolés brièvement entre les périodes d'accouplement; un risque d’ennui et de stress existe qui sera réduit par des cages transparentes leurs permettant de voir leur congénères et par un enrichissement de celle-ci.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de sang et de tissus.
Remplacement
Des études in vitro et ex vivo ont été menées afin de tester la cytotoxicité des nanoparticules sur les cellules placentaires humaines. Les concentrations choisies n’induisent pas de cytotoxicité aigue in vitro. Aussi, ces travaux ont permis d’appréhender certains mécanismes d’action cellulaires qui seront recherchés dans ce modèle in vivo; seul modèle permettant d'étudier les conséquences d'une exposition aux nanoparticules de plastique, in utero, sur la descendance.
Réduction
Grâce aux données de la littérature, un calcul statistique de puissance a été réalisé afin d’évaluer le nombre d’animaux à inclure pour obtenir des résultats significatifs tout en réduisant au maximum ce nombre. Les analyses statistiques seront réalisées avec des tests non-paramétriques pour les petits nombres d’animaux par groupe (
Raffinement
Les souris gestantes seront exposées par l’eau de boisson à des concentrations environnementales en nanopolystyrene pour une durée d’un mois maximum. Pour maintenir l’interaction sociale, les souris seront placées au nombre de 3 à 4 par cage avec un enrichissement sous forme de coton, carton, bâtonnets de bois. Le soin et le suivi des animaux seront évalués par des personnes compétentes et expérimentées (zootechniciens) et de manière bihebdomadaire par l’expérimentateur. Des points limites bien définis à l’aide d’une grille de score seront mis en place avec mise à mort selon les scores atteints. L’anesthésie profonde au moment de la mise à mort sera vérifiée par pincement des doigts avant de procéder aux prélèvements.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car elle possède un placenta hémochorial dont les échanges foetaux-placentaires sont extrapolables à l’espèce humaine. La gestation est de courte durée et la taille de la portée importante ce qui facilite l’étude concernant le devenir de la descendance exposée in utero aux nanoparticules. Les souris femelles gestantes et les males reproducteurs seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines). Les souriceaux mâles et femelles seront utilisés à partir de la naissance. Les nanoparticules seront incluses dans l’eau de boisson des souris gestantes une semaine avant l’accouplement et tout au long de la gestation. Les souriceaux exposés in utero aux particules (males et femelles) sont inclus dans le protocole dès la naissance et jusqu’au stade adulte (2 mois). Des prélèvements de selles (passif, pas de gestes invasifs) sont pratiqués une fois par semaine jusqu’à J28 puis 1 fois par mois à 1 et 2 mois (J7, J15, J21, J28, J42, J56). Des tests comportementaux sont pratiqués à 1 et 2 mois.
Etude de l’activité anti-tumorale de vecteurs viraux ou vésicules extracellulaires de cellules infectées par des virus combinés ou non avec de l’immunothérapie dans des modèles murins de tumeurs syngéniques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
10 656 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 8 880 d'entre elles et modéré pour 1 776. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales sur animal vigile puis jusqu'à trois injections de virus, et 7 776 subissent en plus des injections d'immunothérapie jusqu'à trois fois par semaine pendant 31 jours. Le porteur indique que les tumeurs greffées sous la peau peuvent nécroser, s'ulcérer et saigner, que les nodules pulmonaires peuvent entraîner des difficultés respiratoires, et que 180 souris guéries seront réinjectées de cellules tumorales. Les 1 776 souris comptées comme réutilisées sont destinées à l'entraînement de personnel, et seront tuées si aucune formation n'a lieu.
Objectifs
Le cancer est la deuxième cause de décès dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. Les traitements conventionnels de nombreux cancers tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie ont démontré des limites d’efficacité nécessitant un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les virus ou les vésicules extracellulaires (EV) libérées par des cellules infectées par un virus sont une nouvelle classe d’agent thérapeutique pouvant être une alternative au traitement des cancers. Les virus candidats vont servir de vecteurs pour permettre l’expression d’agents thérapeutiques et bioactifs au sein des tumeurs pour lesquelles il y a un fort besoin médical en clinique humaine. Sachant que le développement clinique de ces virus prévoit de les combiner avec de l’immunothérapie afin de potentialiser l’activité anti-tumorale, le projet se propose d’explorer dans les modèles murins les combinaisons de ces virus (ou EV) avec des traitements d’immunothérapie pour le traitement de cancers de différentes origines. Le but de ce projet sera d’évaluer l’effet thérapeutique des virus candidats-médicaments en association ou non avec de l’immunothérapie. Ce projet vise à déterminer l’activité anti-tumorale de nos vecteurs et de relier l’activation du système immunitaire (obtenue dans des modèles In vitro et In Vivo) à un contrôle de la croissance tumorale et/ou une augmentation de survie. Les données générées nous permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes d’action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d’action et son efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à caractériser l’efficacité anti-tumorale de virus recombinants ou de vésicules extracellulaires de cellules infectées en combinaison ou non avec des produits d’immunothérapie. Il s’agit de mieux comprendre l’impact de l’injection de vecteurs viraux (ou EV) sur la croissance tumorale. Cette connaissance devrait nous permettre de mettre en place de nouvelles thérapies anti-cancéreuses chez l’Homme.
Procédures
Toutes les souris recevront une greffe de cellules qui sera effectuée sur souris vigile, durée environ 1 minute. Toutes les souris recevront au maximum 3 injections de virus. Chaque injection sera réalisée sur souris vigile mais geste rapide de l’ordre de la minute. Les injections seront séparées de 2 jours ou 8 jours maximum selon le virus ou EV candidat. 7776 souris recevront des injections de produits d’immunothérapie qui seront réalisées sur souris vigile, durée des injections environ 1 minute, maximum 3 injections par semaine durant 31 jours maximum. S’il y a guérison, 180 souris (maximum) seront ré-injectées avec des cellules tumorales. Ce geste sera réalisé sur souris vigiles, durée environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Les souris greffées avec des cellules tumorales pourront voir leur état général s’altérer avec des signes cliniques d’affaiblissement (prostration, poils hirsutes, amaigrissement…). L’implantation de cellules tumorales en sous-cutané sur le flanc de la souris pourra entrainer une gêne dans la mobilité de l’animal mais on veillera à bien implanter les cellules au milieu du flanc pour éviter au maximum un développement proche des pattes. La tumeur implantée sur le flanc pourra nécroser voire ulcérer et saigner. L’implantation de cellules tumorales par voie intra-veineuse rendra le développement tumoral non visible pour l’expérimentateur mais des nodules tumoraux pourront apparaître au niveau des poumons notamment et entrainer des difficultés respiratoires avec une perte de poids et dégradation de l’état général. Les injections répétées chez la souris peuvent également être source de stress et d’angoisse mais tout est mis en œuvre pour limiter cette nuisance (gestes rapides inférieurs ou égaux à 1minute par du personnel formé, utilisation tunnel de change, …). Elles peuvent aussi induire une induration ou inflammation au site d’injection mais qui est transitoire et nous essaierons de décaler les sites d’injections pour éviter d’injecter 2 ou 3 fois au même endroit On ne peut pas exclure un effet secondaire des produits d’immunothérapie seuls ou en combinaison avec nos virus ou EVs. Si c’est le cas on peut s’attendre à une perte de poids transitoire ou un effet sur le comportement mais les doses seront choisies en fonction des données pharmacologiques publiées ou obtenues antérieurement.
Devenir
Les animaux surnuméraires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue ou formation des nouveaux arrivants après accord du responsable de la SBEA. Ces animaux seront classés en sévérité modérée. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris incluses dans l’évaluation des virus (ou EV) seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude à J+90 si guérison car souris non réutilisables suite à l’injection de cellules tumorales et virus (ou EV) soit après re-challenge et atteinte de points limites.
Remplacement
Avant d'être testés chez l'animal, les virus (ou EV) ont été testés dans des modèles in vitro. Seuls les virus (ou EV) avec une bonne activité dans ces modèles seront testés chez la souris. Démontrer une activité anti-tumorale avec survie et guérison nécessite un système complet permettant la croissance tumorale, la vascularisation, l'intervention du système immunitaire et toute la pharmacocinétique du médicament. A l'heure actuelle aucun système alternatif ne réunit toutes ces conditions.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus-candidats médicaments auront été évalués in vitro sur des modèles cellulaires de tumeurs humaines et murines établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales) pour sélectionner les virus candidats médicaments ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité. Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation des expériences a été déterminé en se basant sur les résultats obtenus lors de nos expériences antérieures. Nous avons retenu et validé le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et robustes. Les virus (ou EV) qui ne devraient pas avoir une activité suffisante et concluante ne seront pas testés ultérieurement. Leur étude sera stoppée.
Raffinement
Tout au long de leur vie, une attention particulière est portée au bien-être des animaux en particulier par un enrichissement de leur milieu de vie (matériel de nidification : bâtonnet et carré de coton dans chaque cage) qui leur permet d’assouvir les comportements liés à leur espèce et la thermorégulation. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée des expérimentations, dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. A la réception des souris une phase d’acclimatation de 2 semaines minimum est prévue. Durant la première semaine les souris seront laissées dans leur nouvel environnement afin qu’elles se familiarisent avec celui-ci. Puis, l’expérimentateur habituera l’animal à la contention et aux gestes utilisés. L’utilisation d’un tunnel de change permettra également de réduire le stress et l’angoisse chez l’animal. La réalisation des gestes techniques par des techniciens rompus à ces manipulations garantissent la bonne reproductibilité des expériences. Ceci permet de limiter le nombre d’animaux inclus dans les procédures et un suivi optimal du bien-être des animaux. Des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux (mesure du volume tumoral, l’apparence de la tumeur, l’évolution pondérale, l’apparence physique générale, le comportement) sont mis en place afin de limiter autant que possible la souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence en oncologie. Il s’agit de mammifères au système immunitaire assez proche de l’homme pour pouvoir utiliser des données générées dans une approche translationnelle valide. De plus, ll existe de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires chez cette espèce. Animaux adultes de 4 à 5 semaines minimum (à la réception), soit 6 semaines minimum au début de l’étude (avec 2 semaines de stabulation). Six semaines est l’âge où le système immunitaire est considéré comme suffisamment mature pour débuter l’étude
Mise au point de méthodes de délivrance de nanoparticules théranostiques, permettant de réduire le passage hépatique, sur un modèle de souris porteuses de tumeurs cérébrales
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Implantées de cellules tumorales dans le cerveau par chirurgie, puis soumises à des instillations nasales répétées sous contention ou à la pose d'un cathéter dans la carotide, 392 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 337 d'entre elles et sévère pour 55. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut provoquer une perte de poids, une prostration et des difficultés neurologiques au-delà de 3 à 4 mm de diamètre, et qu'une infection peut apparaître au point d'insertion du cathéter. L'hyperthermie magnétique porte la température locale à 44 °C pendant trente minutes, ce qu'il décrit comme sans "désagrément pérenne" pour l'animal. Sur le remplacement, il affirme que les essais in vitro ne prédisent pas le comportement des nanoparticules et conclut que le modèle animal ne peut être substitué à cette étape.
Objectifs
Une des limites actuelles aux stratégies de traitement de certaines tumeurs (notamment cérébrales) est liée au fait que les molécules thérapeutiques utilisées, bien qu’efficaces, ne sont pas délivrées spécifiquement dans le tissu tumoral. Une des voies explorées pour résoudre ce problème est le recours aux nanoparticules (NPs). Non seulement, les NPs peuvent être modifiées pour atteindre de façon spécifique une tumeur (particules dites fonctionnalisées) mais elles combinent potentiellement deux autres avantages : elles pourraient servir directement à une thérapie par chauffage local d’une tumeur (thermothérapie magnétique) et à un suivi par imagerie d’une tumeur. Nous souhaitons cibler des tumeurs cérébrales à l’aide de particules qui contiennent une molécule reconnaissant spécifiquement les cellules tumorales et qui contiennent un cœur de fer et nous souhaitons améliorer leur accumulation dans les tumeurs en limitant leur captation par les cellules macrophages du foie, phénomène décrit comme apparaissant rapidement après l’injection (moins de 10 min) par voie intraveineuse des NPs dans des études précédentes. Les animaux pourront recevoir si nécessaire des ultrasons localisés sur la zone tumorale pour ouvrir localement la barrière hémato-encéphalique, pour optimiser encore l’incorporation dans la tumeur. Nous souhaitons tester différentes méthodes décrites dans la littérature comme limitant la captation de produits actifs par les cellules du foie, dans le cadre de traitement de tumeurs cérébrales. Ces méthodes n’ont pas été décrites pour le type de NPs que nous utilisons. 1) Méthode par administration intra nasale : instillations nasales de faible volume. 2) Méthode par administration sublinguale : les NPs sont concentrées dans un gel appliqué entre la joue et la gencive. 3) Méthode par injections intra carotidiennes répétées en mettant en place un cathéter permanent dans la carotide. 4) Un traitement préalable à l’injection des NPs avec des liposomes qui encapsulent une molécule particulière (clodronate) et qui sont connus pour supprimer transitoirement les cellules macrophages du foie. Si une des méthodes permet d’optimiser de façon satisfaisante l’incorporation des particules dans les tumeurs, un traitement par hyperthermie magnétique sera réalisé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont l’optimisation des procédures de traitements des tumeurs cérébrales par des nanoparticules pour une meilleure incorporation dans les tumeurs et donc un effet thérapeutique potentiellement supérieur.
Procédures
Les animaux seront traités avec les nanoparticules par un mode d’administration différent selon le groupe auxquels ils appartiennent. La durée de chaque traitement et le nombre d’administrations dépendent de la voie administration allant de quelques secondes à plusieurs fois quelques secondes toutes les 5 minutes pendant 45 min à 30 min. Une partie des animaux seront implantés avec des cellules tumorales par injection intracrânienne, la procédure dure 20 minutes/animal. Le devenir des particules sera suivi par Imagerie IRM (1 heure d’acquisition) après administration des particules, ainsi que 24h après la dernière administration. La croissance tumorale sera également suivie par Imagerie IRM. Pour chaque groupe d’animaux correspondant à un mode d’administration, une partie des animaux recevra un traitement visant à diminuer les macrophages du foie, traitement administré une fois par intraveineuse (d’une durée de quelques secondes) et dont l’effet perdure 5 jour. Les animaux pourront recevoir des ultrasons localisés sur la zone tumorale pour ouvrir localement la barrière hémato-encéphalique, cette procédure dure quelques minutes. Une partie des animaux sera traitée par hyperthermie en faisant chauffer la température localement dans la tumeur par hyperthermie magnétique (c’est le cœur de fer des nanoparticules qui chauffe).
Impact sur les animaux
Les animaux ne seront pas tous confrontés aux mêmes effets indésirables, les effets indésirables prévus dépendent du mode d’administration, de l’induction ou non du modèle tumoral, l’utilisation de méthodes complémentaires (Ultra sons focalisés (FUS), suppression macrophage, hyperthermie…) et des examens qu’ils vont avoir. Les effets indésirables sont classés ci-dessous par type de méthode/examen : L’administration par instillation nasale nécessite soit une anesthésie, soit une contention ferme transitoire, réitérée toutes les 5 min environ sur une durée de 45 minutes. Cette contention peut générer du stress. En fonction de la prise en main du geste, l’une ou l’autre solution sera appliquée. Il est possible qu’un mauvais passage entraine des difficultés respiratoires. La thérapie par hyperthermie magnétique nécessite un examen IRM sous anesthésie, cette technologie entraine une augmentation de la température de l’animal, localisée et transitoire (44°C), durant la stimulation (30 minutes maximum), mais n’entraine pas de désagrément pérenne pour l’animal. Le shunt du premier passage au foie, qui permet aux particules de ne pas passer par le foie en première circulation après injection, réalisé par injections répétées nécessite la mise en place d’un cathéter carotidien, chirurgicalement. Une inflammation et une douleur transitoire sont prévisibles. Une manipulation minimale tous les 5 jours est nécessaire pour éviter que le cathéter ne se bouche. Une infection peut apparaitre au niveau de la zone d’insertion du cathéter. L’induction du modèle tumoral cérébral nécessite une chirurgie, entrainant une légère inflammation et une douleur transitoire. La croissance tumorale peut entrainer une perte de poids, une apathie ou une prostration et des difficultés neurologiques lorsque la tumeur atteint une taille supérieure à 3-4 mm de diamètre (mesurée par imagerie).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour recueillir les organes afin de réaliser des études histologiques sur les tissus. L’imagerie IRM permet la quantification in vivo du fer accumulé dans les tumeurs mais il est nécessaire de vérifier les résultats IRM à l’aide d’une analyse histologique. Les images IRM n’ont pas la résolution nécessaire pour identifier les cellules ayant incorporées les nanoparticules, seule l’analyse post-mortem permet d’observer finement la répartition des particules par type cellulaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de valider in vivo l'efficacité diagnostique et/ou thérapeutique de NPs après une accumulation optimisée dans une tumeur et activées par une stimulation externe. Des expériences in vitro ont permis de caractériser l’interaction de NPs isolées avec différents types cellulaires, mais elles ne sont pas prédictives des propriétés in vivo d’affinité, de spécificité et d’effet thérapeutique des NPs pour les cellules cancéreuses ciblées. Avant d’envisager un transfert à l’homme, il est nécessaire d’étudier dans un organisme vivant les relations entre le devenir des NPs (pharmacocinétique), notamment après une accumulation et la modulation de la pathologie (pharmacodynamique), d’évaluer les propriétés thérapeutiques de ces NPs. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in vitro ou in silico.
Réduction
Les études réalisées au laboratoire ont déjà permis de définir des conditions d’implantations des tumeurs, l’apprentissage des actes chirurgicaux se fera en amont, réduisant le nombre d’animaux nécessaire, notamment pour les animaux implantés avec un cathéter carotidien et une tumeur cérébrale. Le suivi longitudinal in vivo avec des dispositifs d’imagerie non invasifs (IRM) permet d’utiliser le même animal à différents temps, et ainsi d’acquérir une grande quantité d’information sur la croissance tumorale et la réponse à un traitement tout en limitant le nombre d’animaux. Le protocole est construit avec différentes étapes (comparaisons des voies d’administrations, ajout d’autres méthodes et pour finir test des paramètres d’hyperthermie avec la méthode la plus intéressante. Si une des voies d’administration testée en première instance ne permet pas de réduire la captation par le foie des particules par rapport à la voie de référence, elle ne sera plus évaluée lors des étapes suivantes, réduisant d’autant le nombre d’animaux. Le nombre de paramètres de traitements pourra être réduit si les premières expérimentations montrent une amélioration significative de la captation tumorale. La quantification du contenu en fer des tumeurs et du foie sera évaluée par IRM puis la présence des particules sera évaluée en post mortem par histologie (semi-quantitatif). Une analyse statistique tenant compte des différents paramètres étudiés (nombre de facteurs, données répétées), a été utilisée pour définir le nombre d’animaux nécessaires à l’atteinte de chaque objectif.
Raffinement
L’imagerie IRM, l’administration par voie sublinguale et /ou intranasale et les intraveineuses seront réalisées sous anesthésie. Les animaux utilisés pour l’implantation de cathéters et/ou de cellules tumorales recevront une antalgie préopératoire 30 minutes avant le début de la chirurgie, puis seront anesthésiés. Durant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pour éviter toute hypothermie, puis pendant la phase de réveil, seront maintenus dans une couveuse thermostatée pour favoriser la récupération. Des soins post opératoires seront réalisés, ainsi qu’un suivi tout au long de la durée de vie de l’animal pour évaluer l’état sanitaire ( mise en place de pointd limites).
Choix des espèces
Les modèles rongeurs représentent les modèles les plus utilisés en oncologie, notamment parce que les études comparatives sont facilitées par l’existence de nombreuses souches qui fournissent des animaux génétiquement similaires. II existe des modèles immunodéficients (Nude) permettant d’étudier des tumeurs issues de lignées cellulaires humaines sans risque élevé de rejet de la greffe tumorale. Nous utiliserons uniquement des mâles adultes pour corréler avec les études déjà réalisées avec les nanoparticules utilisées.
Evaluation des effets de composés dans des modèles cognitifs chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
22050 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal peut subir jusqu'à 28 tests comportementaux non détaillés, 672 administrations de substances et 90 prélèvements sanguins, certains protocoles incluant des chocs électriques provoquant une réaction aversive. Le porteur signale désorientation, convulsions rares, apathie, perte de poids et léthargie selon les substances employées pour induire un trouble cognitif. Il reconnaît tester aussi des molécules déjà sur le marché, pour mesurer la "prédictivité" de ses propres modèles.
Objectifs
Le trouble cognitif est un trouble mental fréquent au cours du vieillissement normal puisqu'il touche jusqu'à 50 % des sujets âgés de plus de 55 ans. Les principaux types de troubles cognitifs marqués sont le délire, la démence, la perte d’attention et l'amnésie. Les cas les plus sévères sont associés aux maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington. A l’heure actuelle, il y a seulement quatre médicaments (donepezil, rivastigmine, galantamine et memantine) reconnus officiellement pour le traitement des symptômes cognitifs. Les effets de ces molécules restent modestes et ne sont pas dénués d’effets secondaires dont les plus courants sont des troubles gastro-intestinaux. Ainsi, la recherche vise à trouver un médicament plus efficace sans effets secondaires majeurs et à disséquer les mécanismes conduisant aux troubles cognitifs. A l’heure actuelle, le criblage des molécules aux effets procognitifs peut se faire sur les modèles basés sur la capacité d’apprentissage et de mémoire chez le rat ou la souris non transgéniques ayant un dysfonctionnement mnésique naturel lié au vieillissement ou induit pharmacologiquement. En effet, en fonction de la situation considérée les troubles cognitifs peuvent résulter de l’altération de différents phénomènes comme l’altération de la voie cholinergique, l’altération de la voie glutamatergique, l’augmentation de l’inflammation cérébrale,… Dans ce projet, nous nous proposons de tester des traitements en développement sur leur efficacité à améliorer la cognition. Chaque procédure de ce projet utilise un moyen diffèrent pour induit un trouble cognitif chez la souris afin de mimer différentes situations pathologiques de l’altération de la fonction cognitive mais utilise le même test d’évaluation de la cognition chez la souris.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter les troubles cognitifs. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles,c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux de ce projet être amenés à réaliser 28 tests comportementaux d’évaluation de leur capacité cognitive et/ou de motricité (10-30 min), recevoir un maximum de 672 administrations et de 1 à 90 prélèvements sanguins sur une période de 168 en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des souffrances au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des comportements liés à la mémoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 à 15 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 360 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi par du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Lors de l’utilisation de souris âgées le nombre d’animaux par cage est réduit et l’enrichissement doublé pour limiter les phénomènes de dominance. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. De plus nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris dans les études des phénomènes mnésiques. De plus tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les atteintes cognitives sont des phénomènes qui peuvent être liés à l’âge mais cela n’est pas systématiquement le cas. Ainsi dans ce projet nous utilisons des souris âgées au minimum 4 à 5 semaines au début du projet.
Evaluation de l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée
- Recherche appliquée
- Cancers
1080 souris vont être utilisées, toutes en souffrance sévère et toutes tuées, dans une évaluation de composés anticancéreux. Une tumeur leur est induite par injection sous-cutanée de 3-méthylcholanthrène, un cancérigène, avant des traitements répétés et de nombreux prélèvements sanguins, y compris par voie rétro-orbitaire. Le porteur prévoit des effets sévères liés à la tumeur, perte de poids, nécrose et ulcération, et des points limites déclenchant la mise à mort. Cette prestation d'évaluation vise une éventuelle utilisation clinique, formulée sans échéance.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les modèles murins jouent un rôle essentiel dans le domaine de l'oncologie, notamment, dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments ainsi que dans la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif de ce projet consiste à évaluer l’efficacité d’un composé à visée thérapeutique seul ou en combinaison chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée. Les doses et les fréquences de traitement seront déterminées grâce aux études de pharmacocinétique, de pharmacodynamie et de toxicité préalablement réalisées et/ou en se basant sur les données de la littérature et notre expérience. Remarque : Le 3-méthylcholantrène est un hydrocarbure aromatique polycyclique cancérigène dont l’administration sous-cutanée chez la souris induit la formation de tumeurs solides et mime ainsi le processus de tumorigenèse physiologique. Dans une souris génétiquement modifiée pour exprimer un antigène tumoral humain, celui-ci permet, notamment, l’induction de tumeurs exprimant cet antigène de manière endogène.
Bénéfices attendus
Le cancer est l’une des principales causes de mortalité dans le monde, avec 10 millions de décès en 2022. Malgré de nombreuses avancées dans les traitements proposés, le besoin médical en thérapies innovantes et efficaces est donc considérable. L’immunothérapie est aujourd’hui une nouvelle approche thérapeutique qui a permis une avancée majeure dans le traitement du cancer. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de composés à visée thérapeutique chez la souris immunodéprimée ou immunocompétente porteuse de tumeur induite par du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée pour une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme.
Procédures
• Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de l’induction ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Injection de 3-méthylcholanthrène en en sous-cutanée (1 injection, 15 s) ; Modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation (1 fois) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 1 fois /jour pendant 12 semaines maximum, 15 s) ; Mesure de tumeur (de 1 à 4 fois/semaine, 20 s) ; Microprélèvement de sang au niveau de la veine caudale (maximum 1 fois /jour dans la limite de 292 µL sur 28 jours pour un animal de 20g, 15 s). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (4 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal par voie rétro-orbitaire (1 fois, 1 min) ou en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois /semaine pendant 12 semaines maximum, 15 s).
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère, liés à l’administration du 3-méthylcholanthrène en sous-cutanée. Stress et douleur légère lors de l’administration du(des) composé(s) thérapeutique(s) en intra-péritonéal, sous-cutané, per os, intraveineux ou intra-tumoral. Inconfort lors de la manipulation de l’animal vigile pour les gestes de tonte du flanc, pesée et mesure de tumeur. Stress lié à la modification de la distribution des animaux dans les cages lors de la randomisation. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse et difficulté de mobilité/engourdissement au réveil. Stress et douleur légère lors des micro-prélèvements sanguins. Possibilité d’effets indésirables sévères liés à l’induction tumorale : Perte de poids, modification du comportement, nécrose, ulcération et/ou inflammation de la tumeur. Possibilité d’effets indésirables sévères liés au(x) composé(s) thérapeutique(s) : Perte de poids transitoire, modification temporaire du comportement.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux (pour chaque procédure) lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur au cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Fin de l’étude.
Remplacement
Evaluer les effets pharmacologiques d’un composé thérapeutique visant à réactiver le système immunitaire implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité dépend de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement (et de la tumeur), ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Pour pouvoir effectuer ces évaluations in vivo, il est indispensable d’utiliser en premier lieu un modèle tumoral maitrisé et bien caractérisé en recréant la pathologie. L’animal porteur de tumeur devient ainsi un bon modèle expérimental pour évaluer les composés anti-cancéreux. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le recours aux animaux, les molécules sont préalablement testées in vitro et sélectionnées sur la base des résultats obtenus dans les modèles cellulaires. Seules celles présentant la meilleure activité sont choisies pour être évaluées chez l’animal. En se basant sur les données de la littérature et notre expérience, 10-15 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats, statistiquement interprétables, en tenant compte de la variabilité inter-individuelle et de celle du succès de l’induction tumorale. Ces études sont menées à l’aide de différents modèles statistiques. Les volumes de prélèvement de sang sont limités pour obtenir la quantité minimale strictement nécessaire pour la réalisation des analyses. Ceci permet de prélever plusieurs fois un même animal, dans la limite des règles d’éthique et limiter ainsi le nombre d’animaux par étude. Un maximum de 10 études sera mené sur 5 ans. Au cours de l’étude, les organes et/ou tumeurs peuvent être prélevés pour mutualiser l’utilisation des animaux dans le but d’étudier différentes questions et paramètres au sein de la même étude et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés en évitant la multiplication des expériences.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la SBEA. Ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local, dans le cas de prélèvements rétro-orbitaires. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Les injections intraveineuses effectués au niveau du sinus rétro-orbital seront réalisées sous anesthésie gazeuse. La taille des aiguilles utilisées lors des injections sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. Des points limites précoces relatifs à l’apparence/comportement de l’animal, à l’aspect et au volume de la tumeur ainsi qu’à la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de l’étude, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. Le poids des animaux sera suivi au minimum 1 fois/semaine. Le(s) composé(s) injecté(s) pourra(ont) induire une perte de poids des animaux plusieurs jours post-injection. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence des pesées sera augmentée et de la nourriture humidifiée ou gélifiée pourra être ajoutée au fond de la cage, afin de faciliter son accessibilité. Cette surveillance renforcée sera maintenue jusqu'à ce que leur poids ne diminue plus sur 2 pesées successives. Le volume des tumeurs sera suivi au minimum 1 fois/semaine. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement, aspect des tumeurs) sera suivi lors des mesures de poids ou du volume tumoral (minimum 1 fois/semaine). Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (3-4 foisminimum 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser l’efficacité de nouvelles thérapies et la réponse immunitaire associée. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 30 semaines lors de leur entrée dans l’étude, âge auquel le système immunitaire de l’animal est décrit comme mature.
Effet d’une molécule sur le poids corporel et la prise alimentaire de souris nourries avec un régime hyperlipidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes tuées pour prélèvement du foie, du coeur et des tissus gras, 84 souris rendues obèses par un régime hyperlipidique sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées tous les deux à cinq jours pendant quatre semaines, puis une imagerie de composition corporelle sous anesthésie. Le projet teste les doses d'une molécule censée réduire la prise alimentaire, en préparation d'un essai clinique. Le porteur note que l'efficacité de cette molécule a "déjà été validée" par ses collaborateurs américains, ce qui interroge la nécessité de cette série supplémentaire.
Objectifs
L'obésité morbide est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations élevées en lipides dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester différentes doses et différentes fréquences d’administration d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules affectant la prise alimentaire nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses.
Procédures
Les souris vigiles recevront une injection sous cutanée tous les 2 ou 5 jours pendant 4 semaines. Les souris seront pesées chaque jour pendant 28 jours. A jour 28, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre.
Impact sur les animaux
Le protocole est modéré, il comporte des injections sous cutanées tous les 2 ou 5 jours, des prises de poids et une analyse non invasive terminale de mesure de composition corporelle. Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs néanmoins une surveillance appuyée des sites d'injections sera réalisé pour s'assurer de la bonne tolérance de la molécule.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l'expérimentation afin de récolter le foie, le coeur et les tissus adipeux gonadaux et sous cutanées.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux. il est à noter que l'efficacité de la molécule a déja été validée par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le calcul d’effectif a été défini à l'aide d'un logiciel dédié.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés 4 par cage dans un environnement sain. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites ont été fixés au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégrée les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Nous utiliserons des souris à l’âge adulte, le début du protocole se fera sur des souris âgées de 8 semaines. Nous maitrisons un modèle de souris sauvages rendues obèses par un régime hyperlipidique.
Rôle de l’épithélium alvéolaire dans le maintien de l’immunité entraînée pulmonaire, chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Pour étudier la cicatrice immunitaire que laisse une pneumonie dans le poumon, 420 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Une partie est irradiée puis reconstituée en moelle osseuse par injection dans le sinus de l'oeil, toutes reçoivent une administration intra-trachéale et certaines des cellules cancéreuses par voie veineuse. Le porteur décrit une perte de poids transitoire après l'infection et annonce un modèle de métastases pulmonaires "sans souffrance" jusqu'au jour de la mise à mort. Les retombées contre les infections et le cancer restent présentées comme potentielles.
Objectifs
Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Rôle des héparanases dans l’inflammation cutanée
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Enduites de crème Aldara provoquant une dermatite proche du psoriasis, 936 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements de tissus. Elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales quotidiennes, une semaine sur deux pendant neuf semaines, et présentent stress et grattage. Le projet cherche le rôle de certaines enzymes dans l'inflammation cutanée, en vue de futures cibles thérapeutiques. Le porteur affirme avoir limité le nombre d'animaux par des travaux in vitro préalables, mais juge l'étape animale "indispensable".
Objectifs
Notre laboratoire étudie le rôle des médiateurs de l’inflammation au cours des pathologies inflammatoires chroniques de la peau telles que le psoriasis. La description de l’activité de ces médiateurs proinflammatoires permet d’identifier celles qui jouent un rôle primordial dans la physiopathologie de la maladie et de les cibler en thérapie. Bien que quelques médiateurs proinflammatoires constituent des cibles thérapeutiques validées en clinique, des mécanismes d’échappement sont toujours observés, nécessitant l’identification de nouvelles cibles originales. Dans le cadre d’une collaboration scientifique nationale, nous étudions le rôle de certaines enzymes du microenvironement inflammatoire. Les rôles respectivement pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de ces molécules sont décrits dans un contexte tumorale et des outils de blocages de ces enzymes sont en cours de validation chez l’animal. Néanmoins, leurs expressions par les cellules résidentes cutanées (kératinocytes, fibroblastes) ou par les cellules immunitaires et leurs activités biologiques sont peu caractérisées dans les maladies inflammatoires chroniques cutanées. Des résultats préliminaires montrent que l’expression de ces enzymes est modifiée dans les lésions psoriasiques humaines et que les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules immunes peuvent produire ces enzymes in vitro dans un contexte inflammatoire. Le but de notre projet est de démontrer les roles régulateurs de ces enzymes dans la dermatite psoriasiforme chez la souris en utilisant des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes et des inhibiteurs originaux spécifiques de ces enzymes.
Bénéfices attendus
Ces résultats nous permettront de mieux comprendre le rôle joué par certaines enzymes dans la régulation de l’inflammation cutanée. A terme, le développement des inhibiteurs testés dans notre projet pourrait améliorer la prise en charge des patients présentant des lésions chroniques en ciblant l'inflammation induite par ces enzymes.
Procédures
-Injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours, sur animal vigile (n=72 souris). -Anesthésie générale par injection intra-péritonéale (n=936 animaux). -Application quotidienne en vigile de crème Aldara ou de vaseline sur l’oreille et sur le dos de l’animal une semaine sur 2 pendant 9 semaines (n=936 animaux). -Injection quotidienne par voie intrapéritonéale une semaine sur 2 pendant 9 semaines (uniquement pour les animaux traités, n=468 animaux). -Administration une fois par semaine des inhibiteurs enzymatiques ou des excipients par application sur l’oreille et le dos, ou par injection intrapéritonéale pendant 9 semaines. (n=468 animaux).
Impact sur les animaux
-injections intrapéritonéales: douleur et stress légère et transitoire -Anesthésie fixe : incomfort léger et transitoire au réveil -Application de crème sur le dos et l’oreille : stress léger et transitoire. Phénomènes de grattage.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques et moléculaires
Remplacement
Nous avons limité le nombre d’animaux utilisés dans notre projet en réalisant en amont des expériences sur des modèles in vitro de kératinocytes, fibroblastes, monocytes et leucocytes. Ces données nous ont permis de cibler ces 4 types cellulaires et d’analyser les expressions et fonctions de ceraines enzymes dans l’inflammation. L’intégration de ces types cellulaires dans le tissu cutané in vivo est maintenant indispensable pour vérifier les profils d’expression et les fonctions identifiées in vitro. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes dans les types cellulaires cités est indispensable pour démontrer le rôle clé de ces molécules dans l’inflammation. De même, le blocage d’activité par des inhibiteurs originaux seront testés en amont sur des cultures in vitro. Seuls les outils validés in vitro et sans toxicité seront testés sur les souris. A ce jour, il n'existe pas de modèle in silico permettant de réaliser ce projet. La modélisation in vitro ou in silico n’est pas envisageable au vu de la complexité de la réponse inflammatoire cutanée étudiée.
Réduction
L’expérience du laboratoire sur ce modèle d’inflammation chronique et la variabilité mesurée des différents paramêtres de l’inflammation nous ont permis d’utiliser un test de puissance et de calculer un effectif pour avoir des données interprétables statistiquement et robustes. Afin de limiter le nombre d'animaux, une analyse intermédiaire sera effectuée. Si aucune différence n’est observée entre les lots, l’expérience sera stoppée. Si une différence est observée nous procéderons à la réalisation des expériences sur le dernier groupe d’animaux. De même, le test des inhibiteurs enzymatiques ne sera effectué que si un phénotype est observé chez les souris génétiquement modifiées.
Raffinement
Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues avec contrôle de la température par tapis chauffant. Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupe de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées leur permettant de se cacher (nid, tunnel, matériel à ronger). Dans certains modèles d’inflammation, une perte de poids temporaire, liée à une déshydratation de l’animal, peut être observée. Afin de compenser cette déshydratation une réhydration sera effectuée de façon préventive, un gel hydraté mis à disposition dans les cages et le poids des animaux mesuré quotidiennement pendant le traitement. Des points limites gradés précis et adaptés sont proposés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocemment en cas de besoin.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris décrit et étudié depuis des décennies, autorise des comparaisons avec le système immunitaire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’inflammation cutanée et évitent d’avoir recours à des espèces animales supérieures. De plus, le projet de recherche inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 à 14 semaines lorsque leur système immunitaire est bien développé.
Evaluation de la biodistribution et de l’efficacité de nanoparticules lipidiques comme vecteur de thérapie génique dans un modèle murin de la Dystrophie Musculaire de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
718 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles de la dystrophie musculaire de Duchenne, elles subissent jusqu'à huit anesthésies générales par animal pour des injections et des séances d'imagerie, ainsi qu'un rasage et la pose d'une boucle à l'oreille. Le porteur teste des nanoparticules censées transporter une thérapie génique vers les muscles à la place des virus. Il présente l'ensemble comme une "preuve de concept" préclinique, sans bénéfice direct pour les patients à ce stade.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie génétique mortelle entrainant un handicap physique qui touche 5 personnes sur 100 000 dans le monde. Malgré une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques de cette pathologie, presque aucun traitement n'est disponible. Les thérapies géniques utilisant des virus inactivés peuvent induire des effets toxiques et ne sont pas applicables à tous les patients. Ce projet vise à améliorer le transport des thérapies géniques en utilisant des nanoparticules à la place des virus vers les zones musculaires cibles pour augmenter leur efficacité et réduire les effets toxiques. Pour cela, nous utiliserons 2 modèles de souris de la myopathie de Duchenne : un modèle léger et un modèle modéré.
Bénéfices attendus
Le présent projet permettra de fournir une preuve de concept pré-clinique de l’efficacité thérapeutique de nos nanosystèmes pour délivrer la thérapie génique dans un modèle de souris de la myopathie de Duchenne, en vue de fournir des traitements innovants potentiellement transférables chez les patients.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale pour des raisons d'imagerie sous anesthésie générale et juste après cela, les animaux seront soumis à une injection intramusculaire ou intraveineuse (temps d'anesthésie total inférieur à 5 minutes). Les animaux seront imagés chaque jour durant les 7 jours suivant l'administration des nanosystèmes sous anesthésie générale (temps d'anesthésie inférieur à 2 minutes). Au total, 8 anesthésies générales par animale seront donc réalisées pour les étapes d'injections et imageries. Les animaux seront identifiés par pose d'une boucle d'identification à l'oreille.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet, du stress peut être induit aux animaux lors des anesthésies et des contentions pour la réalisation des injections. De plus, une légère douleur passagère peut être induite à la suite de l’injection du traitement. Le rasage de la face ventrale de l'animal ainsi que la pose de la boucle d'identification à l'oreille peut occasioner du stress chez l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée des différents organes prélevés qui ne peut pas être réalisée sur animal entier vivant.
Remplacement
Des études préliminaires ont démontré l’efficacité de nos nanoparticules pour délivrer des molécules thérapeutiques dans des cultures de cellules musculaires et chez la souris saine. Pour aller plus loin, l’utilisation d’animaux dans un modèle pathologique de la maladie est nécessaire pour démontrer l’efficacité thérapeutique de nos nanoparticules. Il est donc nécessaire de pouvoir étudier l’effet de ce traitement sur des organismes entiers.
Réduction
L’utilisation des animaux est réduite grâce des outils statistiques au nombre minimal et nécessaire pour l’obtention de données expérimentales statistiquement exploitables. Le projet étant conçu par étapes successives, si aucun effet bénéfique n’est observé sur le modèle léger de la maladie, il ne sera pas poursuivi sur le modèle modéré et également l'obtention de résultats positifs sera nécessaire pour passer d'une étude à la suivante.
Raffinement
Durant toute la durée des protocoles les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie. Les études histologiques et moléculaires permettront d'évaluer l'efficacité du traitement.
Choix des espèces
La structure et le fonctionnement du tissu musculaire de la souris sont très proches de ceux de l'homme. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour les investigations de la physiopathologie des maladies musculaires survenant chez l’homme. Les modèles de souris pertinents utilisés présentent des signes histologiques légers ou modérés de la pathologie des patients DMD dès l’âge de 2 mois. Pour les animaux présentant une expression modérée de la maladie, ceux-ci seront maintenus jusqu'à l'âge de 5 mois avant qu'ils ne développent une expression aggravée de la maladie entravant leur qualité de vie.
Le rôle des plaquettes dans la formation des anévrysmes intracrâniens 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Toutes tuées pour analyse du cerveau, 1179 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour provoquer des anévrysmes intracrâniens. Elles subissent des ligatures d'artères, une injection dans le cerveau et la pose d'un dispositif augmentant la pression artérielle, chirurgies pour lesquelles le porteur anticipe environ 10 % de mortalité chacune. Une rupture d'anévrysme, recherchée par le modèle, entraîne une brusque perte de poids, des symptômes neurologiques et une hémorragie, suivies de la mise à mort. Le porteur présente le projet comme une voie pour remplacer un jour la chirurgie humaine par un médicament.
Objectifs
Ce projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Les anévrysmes intracrâniens (AI) sont des déformations des vaisseaux sanguins présentes dans le cerveau chez environ 4% de la population avec une majorité de femmes atteintes. La rupture d'un anévvrysme entraine des saignements dans le cerveau, ce qui provoque le plus souvent la mort du patient. L’unique traitement des AI, rompus ou non, consiste en une intervention chirurgicale risquée permettant de retirer l'anévrysme du cerveau. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques, moins lourdes, pour améliorer la prise en charge des patients. Il est aujourd’hui admis qu'un flux sanguin anormal et une inflammation de la paroi vasculaire sont à l'origine de l'anévrysme car ils fragilisent la paroi, ce qui permet la déformation du vaisseau. Cette déformation du vaisseau qu'est l'AI évoluera ou non jusqu’à sa rupture. Il apparait que les plaquettes, petites cellules sanguines responsables, entre autre, de la cicatrisation lorsqu'on se coupe et de la coagulation, pourraient être impliquées dans les processus pathologiques de formation d'AI. Ces cellules sont en effet les garantes de la bonne santé de la paroi des vaisseaux. Ce projet a pour but de caractériser la contribution des plaquettes et leur mécanismes de réponses lors des stades précoces de la pathologie anévrysmale. Pour cela, nous allons appliquer un modèle d’induction d’anévrysme bien connu et documenté chez la souris. Ce modèle permet d’obtenir en 23 jours chez la souris la formation d'AI. Pour étudier dans la pathologie anévrysmale le rôle de différentes molécules plaquettaires nous disposons de lignées murines génétiquement modifiées ayant des plaquettes déplétées pour ces différentes molécules plaquettaires que nous voulons tester. Nous utiliserons aussi différents médicaments ciblant tous différentes propriétés plaquettaires.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre dans un premier temps d'identifier des molécules plaquettaires impliquées dans la formation des anévrysmes et leur croissance. Il permettra par la suite de tester des médicaments antiplaquettaires déjà utilisés chez l'Homme (comme par exemple l'Aspirine qui empêche les plaquettes de remplir leur rôle dans la coagulation)ainsi que de nouvelles molécules antiplaquettaires en développement. Si nous validons des médicaments empêchant la formation ou la croissance des anévrysmes, le bénéfice pour les êtres humains pourrait être conséquent. De plus, comme les médicaments que nous allons tester sont pour la plupart déjà administrés à l’Homme il n'y aura pas à attendre pour obtenir toutes les autorisations nécessaires à l'utilisation d'une nouvelle molécule chez l'Homme. Finalement, ce projet pourrait permettre de remplacer un traitement chirurgical compliqué et dangereux par un traitement médicamenteux simple et beaucoup moins dangereux.
Procédures
Tous les gestes techniques à l’exception de la mesure de la pression artérielle sont réalisés sur animaux anesthésiés à l’aide d’une anesthésie gazeuse. Tous les animaux prévus dans ce projet seront soumis à une procédure permettant de créer des anévrysmes intracrâniens. Avant l'intervention chirurgicale : un prélèvement sanguin (1 minute) est prévu ainsi qu'une session de rasage des zones opérées (5 minutes). 4 autres prélèvements sanguins (1minute) sont prévus afin de pouvoir étudier les propriétés du sang des souris tout le long du modèle. la première procédure chirurgicale de 50 min consiste en la ligature de la carotide commune gauche, la ligature de l’artère rénale droite (30 min de procédure pour ces deux ligatures) + 20 min de suture du muscle abdominal et de la peau. Les ligatures consistent à faire un noeud autour des artères avec un fil, ce qui permet de couper la circulation sanguine et la suture permet de remettre les bords de l'incision faite au niveau du ventre de la souris ensemble ce qui permettra la cicatrisation. Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. Une autre procédure chirurgicale de 50 min est prévue durant laquelle l’animal reçoit une injection d'une molécule dans le cerveau (40min) et la pose d'un dispositif en sous cutanée au niveau du dos permettant de diffuser une molécule augmentant la pression artérielle(10min). Cette procédure s’effectue sur animaux analgésiés. La pression artérielle des souris sera mesurée sur souris vigile lors de session de 15 minutes de mesure. Chaque souris aura 4 jours de session constituant des séances d’habituation à la machine et 6 jours de mesure de pression. Les interventions décrites ci dessus seront réalisées dans l'établissement utilisateur EU1. L'évolution de leur pathologie sera surveillée par des méthodes d'imagerie: 3 séances d’échographie doppler (15min par séance) + 2 séances d’IRM (30 min par séance). Ce suivi par imagerie s'effectuera dans l'établissement utilisateur EU2.
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirugie de ligature des artères (obstruction d'artère permettant de modifier le flux sanguin dans le cerveau de l'animal), estimée être de l’ordre de 10%. Il en est de même pour la chirurgie d’injection de molécule dans le cerveau, il existe une mortalité de 10%. Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : douleur post-opératoire (modérée grâce à l'utilisation d'antidouleur, pendant environ 24h) après chaque chirurgie; perte de poids postopératoire. Pendant la mesure de leur pression artérielle, les animaux peuvent ressentir du stress car ils sont maintenus immobiles (de façon non douloureuse pour l'animal). Si les animaux souffrent d'une rupture d’anévrisme : brusque perte de poids ; Apparition de symptomes neurologiques, hémorragie.
Devenir
Dès lors qu'une rupture d'anévrysme est identifiée, les animaux sont euthanasiés. Les animaux arrivant jusqu'à la fin de la procédure sans avoir eu de rupture d'anévrysme sont aussi euthanasiés. Nous effectuons des euthanasies afin de pouvoir analyser le cerveau des souris et les anévrysmes qui s'y sont développés. Nous étudions aussi leur sang pour analyser les caractéristiques de leur plaquettes.
Remplacement
La maladie que nous cherchons à étudier est une maladie complexe qui fait intervenir beaucoup de paramètres (inflammation, remodelage de la paroi des vaisseaux sanguins, flux sanguin, pression artérielle...). Il n'existe pas de dispositif aujourd'hui permettant de mimer tous les paramètres nécessaires à la maladie. Il est nécessaire d'utiliser des animaux vivants pour provoquer une maladie qui se rapproche de celle des Humains
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grace aux données disponibles dans la litératture scientifique du domaine. Des tests statistiques pour connaitre le nombre de souris minimum nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir sur la souffrance des animaux avec euthanasie lorsque des points limites sont atteints. La douleur post-opératoire est évaluée chez nos animaux, et est traitée préventivement grâce à l’administration d'un antidouleur. Après les chirurgies, les souris sont gardées en observation car il peut arriver qu’une hémorragie (due au passage de la micropipette dans un vaisseau par exemple) survienne. Ceci s’exprime par l’apparition de symptome neurologique et la souris est alors euthanasiée. Après cette chirurgie, les souris peuvent aussi être gênées dans leurs mouvements pendant 1 à 2 jours. De la nourriture humide est donc placée au sol dans leur cage, plus facile d’accès. L'apparition de symptôme neurologique, l'apparence général des animaux ainsi que leur poids sont contrôlés tous les jours. Enfin, du coton est placé dans leur cage ce qui permet aux animaux de faire des nids. Le transport entre les deux établissements utilisateurs dure 5 min à pied. Il se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris présente un système vasculaire, c'est à dire une organisation des vaisseaux sanguins proche de l'Homme. De même son système immunitaire impliqué dans les inflammations ressemble aussi à celui de l'Homme, permettant une transition des résultats trouvés chez la souris à l'Hommme plus facile. De plus, il existe un grand nombre de souris ayant différentes protéines de plaquette absentes, nous permettant d'en tester un grand nombre. Sa large utilisation dans le domaine scientifique a conduit au développement de nombreux modèles d’anévrysme intracranien dont celui sur lequel se base le projet, qui permet de mimer certaines caractéristiques de la pathologie humaine. Age adulte (entre 8 et 12 semaines). Notre étude porte sur le rôle des plaquettes dans une pathologie touchant principalement des individus adultes.
Comprendre comment la colonisation de certains tissus (autres que la moelle osseuse) modifie la progression d’un cancer du sang, la leucémie aiguë myéloïde
- Recherche appliquée
- Cancers
Irradiées vigiles puis greffées avec des cellules leucémiques par voie intraveineuse, 3400 souris seront toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures classées en souffrance modérée. Le porteur décrit pourtant une maladie qui s'installe en quelques semaines, avec amaigrissement, paralysie des membres postérieurs empêchant l'animal de se déplacer et de s'alimenter, prostration et hypothermie. Certaines souris subissent en plus une ponction de moelle osseuse au fémur et des prélèvements sanguins répétés à la joue. L'étude porte sur les raisons de la colonisation d'autres organes par la leucémie aiguë myéloïde, avec des applications cliniques présentées comme lointaines.
Objectifs
Depuis ces dernières années, la recherche biomédicale s’est attachée à explorer « à grande échelle » la complexité liée aux gènes et aux différentes sous-populations de cellules cancéreuses, sans pour autant parvenir à saisir précisément les mécanismes à l’œuvre lors de la propagation des cellules cancéreuses dans l’organisme. Pourtant, celles-ci pourraient acquérir des caractères d’autant plus malins lorsqu’elles migrent d’un organe primaire (l’organe où se développe initialement ce cancer) vers des sites secondaires (organes qui sont colonisés dans un second temps). Pour comprendre si l’infiltration d’un site secondaire peut conférer aux cellules cancéreuses de nouvelles capacités malignes, nous avons choisi comme modèle d’étude la leucémie aiguë myéloïde (LAM) : les cellules leucémiques n’accumulent que peu de mutations (changements au niveau des gènes) et sont capables intrinsèquement de se déplacer dans le sang. Le projet que nous proposons ici cherche à comprendre quel est le bénéfice pour les leucémies aiguës de sortir de la moelle osseuse, site où la pathologie prend initialement place, pour aller infiltrer, non pas aléatoirement, mais bien spécifiquement des organes en particulier, comme le foie, la rate, ou le système nerveux central (SNC) et le cerveau. Nous allons tenter de répondre à ces questions en les considérant sous l’angle – encore peu abordé – de la dimension métabolique (soit la manière dont la cellule choisit de produire de l’énergie qu’elle utilise) et épigénétique (modifications affectant un gène sans en changer sa composition) qui pourrait moduler grandement l’aptitude des blastes leucémiques (cellules leucémiques)à infiltrer les organes à distance.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’interroger les fondements biologiques de l’infiltration blastique (la colonisation d’un organe/tissu par des cellules leucémiques) vers des sites secondaires dans les LAM dont la cause est encore méconnue et qui contribue à l’apparition de cette maladie. Cette connaissance précise permettra d’identifier de nouvelles combinaisons thérapeutiques (association de plusieurs traitements permettant d’avoir un meilleur résultat) avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées (médicament qui cible un élément impliqué dans l’apparition ou la progression de la maladie réduisant les effets secondaires) existantes qui pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de LAM.
Procédures
Les animaux vigile (c’est-à-dire non endormis) seront tout d’abord irradiés. L’irradiation, introduction des souris dans une machine à rayon X (semblable à une radiographie),permet d’éliminer les cellules de la moelle osseuse afin de pouvoir injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse dans la veine de la queue (durée de l'injection: 1 min). Des prélèvements de sang au niveau d’une veine de la joue de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) seront réalisés pour évaluer la prise tumorale et récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-détection des cellules leucémiques dans le sang périphérique, nous ferons une ponction de cellules au niveau du fémur (durée du prélèvement: 5 minutes; sous anesthésie et analgésie). Une fois l'invasion des cellules cancéreuses établie, les animaux recevront un traitement quotidien de durée variable selon le type de thérapie (injection sur souris éveillée soit dans la cavité abdominale pendant 5 jours et/ou par gavage). De plus, certaines souris recevront un antibiotique soit dans leur alimentation soit dans l'eau de boisson, qui ici joue le rôle d’interrupteur, permettant d’exprimer de molécules capables d'éteindre les gènes.
Impact sur les animaux
Les animaux traités avec les différentes molécules (gavage, intra-péritonéal, intra veineux), greffés (administration de cellules leucémiques) ou prélevés en vue d’examens biologiques pourraient être confrontés à des effets indésirables (stress et/ou perte de poids). Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. La greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de quelques semaines un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse (introduction d’une aiguille dans la moelle osseuse pour récupérer de la moelle osseuse), les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides (amas de cellules cancéreuses forment une masse), d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête), à distinguer avec les infiltrats de cellules leucémiques (colonisations des cellules leucémiques d’un tissu donné) sur lesquels ce projet repose et qui ne font pas de masse solide.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse, le foie, la rate et le cerveau afin de définir les caractéristiques des cellules cancéreuses.
Remplacement
Pour comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller coloniser des organes à distance, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèles in vitro permettant de reproduire de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme entier. Bien que certains modèles in vitro (expériences pratiquées au laboratoire sans utilisation d'être vivant) permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses qui peut les influencer. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
En vue de réduire le stress subit par les animaux, le confort des cages sera optimisé par des buchettes en bois que les souris aiment ronger, des tunnels en carton où elles trouvent refuge et des nids en papier. Les animaux seront observés quotidiennement en faisant particulièrement attention aux signes cliniques et comportementaux tels que : niveau d’activité, agressivité, attitude/posture, réaction à la manipulation, toilettage/ consommation alimentaire et hydrique mais aussi des signes mesurables non subjectifs : perte de poids (une première pesée sera réalisé aux 9 eme jours après injection des cellules leucémiques, puis chaque 3 jours), rythme respiratoire, déshydratation (plis de la peau). Suivant la grille de suivi des souris et l’arbre décisionnel préalablement établi. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subie par l'animal, en optimisant le mode et le volume d'injection et la durée de traitement. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites (points qui permettent d’éviter une souffrance accrue et ou prolongée de l’animale) et d’établir d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter une intervention de l’expérimentateur afin de soulager l’animal. Une décision rapide et raisonnée sera prise pour éviter toute souffrance animale. En effet, si une douleur est constatée un antalgique sera administré à l’animal chaque fois que cela ne compromet pas les résultats attendus de l’expérience, si un antalgique ne peut être administré et/ou n’est pas suffisant à calmer la souffrance de l’animal, une mise à mort de l’animal sera réalisée.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine (prolifération anormale de cellules sanguines anormales) et aident à comprendre pourquoi les cellules leucémiques sortent de la moelle osseuse pour aller infiltrer des organes à distance. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Enregistrement de neurones nociceptifs périphériques pour le criblage de candidats médicaments antalgiques chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 420
Opérés ou injectés d'une substance inflammatoire sous anesthésie pour provoquer une douleur chronique, ou rendus diabétiques, 840 rongeurs, 420 souris et 420 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Tous passent au moins deux tests comportementaux d'allodynie mécanique et thermique, sans que ces tests soient nommés, avant l'enregistrement de leurs neurones de la douleur sous anesthésie, sans réveil. Le porteur décrit cette douleur chronique comme "modérée à sévère", précise que "c'est leur but", et teste sur ces neurones des candidats antalgiques venus de l'industrie pharmaceutique. Il justifie l'emploi du rat par des "raisons historiques".
Objectifs
Le projet consiste à tester des candidats médicaments de l'industrie pharmaceutique sur l'activité des nocicepteurs chez le rat ou la souris anesthésié. Ces mesures se font chez l'animal sain, ou chez l'animal présentant un état douloureux de type inflammatoire ou neuropathique, induit expérimentalement. Il y a 2 aspects distincts dans ce projet : la procédure de mesure d'activité des nocicepteurs (réalisée chez l'animal anesthésié, dite terminale ou sans réveil) et la génération des modèles physiopathologiques qui seront utilisés dans cette procdure (modèles physiopathologiques réalisés chez l'animal anesthésié avec réveil). Ce projet implique un travail de recherche fondamental car il n'y a pas ou peu de données publiées sur l’activité des nocicepteurs chez la souris, espèces qui forment pourtant via l'utilisation des souris génétiquement modifiés le coeur des avancés dans le domaine de la recherche sur la douleur.
Bénéfices attendus
D’un point de vue fondamental, ce projet améliorera ou apportera une connaissance nouvelle sur l’effet de conditions physiopathologiques connus pour sensibiliser l’activité des nocicepteurs périphériques et supposé comme sous tendant un état de douleur chronique. Il permettra ensuite de déterminer l’efficacité analgésiques de candidats médicaments sur ces nocicepteurs de manière spécifique (par opposition à la mesure globale réalisée en comportement).
Procédures
630 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale ou à une injection de substance inflammatoire sous anesthésie (durée inférieure à 15 min). 210 animaux seront rendus diabétiques et subiront 3 prélèvement sanguins vigiles (durée de 20 s). Tous les animaux seront soumis à au moins 2 tests comportementaux permettant de mesurer l’allodynie mécanique et thermique (durée de 30 min).
Impact sur les animaux
Les modèles physiopathologiques mis en œuvre induisent un état de douleur chronique, modérée à sévère (c’est leur but, ce projet s’inscrit dans le développement de nouveaux traitements antalgiques). La mise au point de traitements analgésiques efficaces et dénués d’effet secondaire contre les douleurs neuropathiques nécessite l’utilisation de modèles de douleur neuropathique préclinique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car les mesures électrophysiologiques sont invasives et n'autorisent pas la survie des animaux.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques). C’est seulement chez l’animal entier (et non in vitro) que l’impact des caractéristiques physico-chimiques des candidats médicaments peut être évalué. D’autre part, l’électrophysiologie in vivo (et non in vitro) permet d’aboutir à une compréhension mécanistique du mode d’action des candidats médicaments analgésiques/antalgiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable pour obtenir un taux de succès élevé dans ces expériences délicates); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie, les nocicepteurs non-myélinisés, qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle lors du test de candidats médicaments (principe des mesures répétées avant/après). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apporte des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments. Pour assurer leur bien-être, les animaux disposent dans leur cage de bois à macher, de petits abris et de matière pour faire des nids. Les animaux sont contrôlés quotidiennement et des points limites sont mise en place pour éviter toutes souffrance excessive que les animaux pourraient subir.
Choix des espèces
L’utilisation du rat est due à des raisons historiques. C’est l’espèce sur laquelle le plus grand nombre de données a été obtenus dans le domaine de l’algologie. L'utilisation de la souris permet de tirer parti d’animaux transgéniques, et certains aspects physiologiques font de la souris une espèce plus appropriée que le rat pour obtenir des prédictions d’efficacité clinique. Par exemple, il a été montré que chez la souris, seules les fibres exprimant le récepteur TRPV1 étaient insensibles aux stimuli mécaniques. Cette situation est similaire chez l’homme, mais différente chez le rat. Il existe aussi parfois une plus grande homologie dans la structure de certaines cibles thérapeutiques entre la souris et l’homme que l’homme et le rat, comme c’est le cas pour le canal au sodium voltage dépendant 1.7. Les animaux sont utilisés au stade adulte, 8-12 semaines pour les souris, 6-8 semaines pour les rats. On utilise des animaux au stade jeune adulte, car ils présentent un système neurophysiologique mature et sont en forme (ce projet ne s'intéresse ni au développement, ni à l'animal âgé).