Souris
Caractérisation des effets de la diminution de DNM2 ou de l’augmentation de BIN1 sur la fonction musculaire dans un modèle murin reproduisant une forme récessive de myopathie centronucléaire causée par des mutations dans le gène Ryr1
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Soumises chaque semaine à des tests d'activité locomotrice, de force et de posture, puis à des mesures de force sous anesthésie, 280 souris sont toutes tuées après prélèvement d'organes, 240 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 40 d'un niveau sévère. Ces 40 souris portent la mutation étudiée, qui provoque une perte de poids dès quinze jours, une scoliose, une cyphose, une atrophie et une faiblesse musculaires, et une survie qui dépasse rarement huit semaines. Toutes reçoivent une biopsie de l'oreille pour identification et sont isolées temporairement, jusqu'à 48 heures pour l'enregistrement de l'activité spontanée. Le porteur qualifie ces tests de "peu invasifs" et affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer la contractilité musculaire sur l'organisme entier.
Objectifs
Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques. A ce jour aucun traitement n’est disponible pour les patients atteints de ces maladies qui impactent grandement leur survie ou qui sont handicapantes au quotidien et qui affectent considérablement leur qualité de vie. Le but de ce projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de la modulation du niveau de protéines impliquées dans la maladie pour le traitement de myopathies congénitales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de fournir des informations relatives aux effets de la modulation du niveau de protéines impliquées dans la maladie pour le traitement de myopathies congénitales. Ce projet permettra de proposer un traitement pour ces maladies graves.
Procédures
Des tests de comportement peu invasifs qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal (activité locomotrice, force, posture) seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines pendant 5 semaines (i.e. jusqu’à l’âge de 8 semaines), puis une fois par mois de deux mois jusqu’à un an. Chaque test sera réalisé 3 fois par jour avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai. Chaque essai durera entre 10 secondes et 5 minutes selon le test comportemental. L’activité locomotrice spontanée et la posture debout de l’animal seront acquises pendant 48h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes chez l’animal anesthésié par inhalation d’un mélange gazeux ou par injection intrapéritonéale d’un anesthésique et d’un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux (40/280) sont porteurs de la mutation qui entraine une perte de poids à partir de 14 jours après la naissance, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles (les animaux ne survivent pas plus de 8 semaines). Pour ces animaux, les mâles et les femelles sont affectés. Tous les animaux seront identifiés et génotypés à partir d’une biopsie auriculaire prélevée à partir de 14 jours suivant la naissance. Tous les animaux seront isolés temporairement. Tous les animaux seront mis sous anesthésie générale profonde en fin de procédure.
Devenir
Les animaux utilisés pour les tests seront euthanasiés après prélèvement des organes nécessaires pour les analyses au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Dans ce projet qui consiste à évaluer les effets de la modulation du niveau de protéines sur la fonction du muscle, le modèle murin est privilégié car l’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer la contractilité du muscle. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo les effets de ce type de modulation. L’évaluation in vivo des effets de potentiels traitements est un prérequis indispensable avant toute application clinique.
Réduction
Pour la production des animaux expérimentaux, le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle et en faisant plusieurs portées par femelle. Pour la partie expérimentale, les tests comportementaux peu invasifs offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. Ce point est essentiel car il permet de réduire de manière drastique le nombre d’animaux.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. Les tests comportementaux seront peu invasifs et permettront un suivi longitudinal. Afin de diminuer le stress lié à ces tests, une session de familiarisation sera effectuée. Pour les tests nécessitant une anesthésie générale de l’animal, la respiration sera contrôlée visuellement, la température de l’animal sera régulée et maintenue à sa valeur basale à l’aide d’une lampe chauffante et un gel ophtalmique sera appliquée sur les yeux de l’animal afin de limiter l´assèchement des cornées. La phase de réveil s’effectuera sous une lampe chauffante dans une cage où l’animal sera seul, puis l’animal sera replacé dans sa cage avec ses congénères.
Choix des espèces
Le modèle murin utilisé reproduit la pathologie humaine. Une partie des animaux générés développe un phénotype dommageable (symptômes de myopathie dès 14 jours après la naissance). La durée de vie maximale de ces animaux étant de 8 semaines avec une majorité des animaux mourant avant l’âge de 8 semaines, ces animaux seront utilisés entre 5 et 7 semaines. Si la modulation génique améliore le phénotype, les autres animaux générés ne développeront pas de phénotype dommageable. Les tests de la fonction musculaire seront réalisés une fois par semaine sur les animaux âgés de 3 semaines (i.e. à partir du sevrage) sur une période de 5 semaines puis une fois par mois à partir de 2 mois jusqu’à un an, chez les animaux sans phénotype dommageable.
Rôle spécifique des composants d’une voie de réponse à l’infection dans l’immunodépression suite à une infection chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour comprendre l'immunodépression qui suit une infection sévère, 7 648 souris sont utilisées, toutes tuées pour prélever des organes vitaux, 6 880 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 768 d'un niveau sévère. Une partie subit une péritonite provoquée par perforation du tube digestif sous anesthésie, une autre reçoit l'injection d'un composant bactérien sur animal vigile, puis des injections d'inhibiteurs chaque jour pendant six jours jusqu'à la mise à mort. Le porteur indique que la péritonite peut provoquer douleurs, perte de poids et réduction de la mobilité, et prévoit une mise à mort anticipée en cas d'inconfort trop important. Il juge l'étude sur "animal entier" indispensable et rappelle que des médicaments inhibant cette voie sont déjà utilisés en clinique dans d'autres indications, ce qui rend selon lui la perspective thérapeutique "très concrète".
Objectifs
Chez les patients de réanimation présentant une infection sévère, des altérations de la réponse immunitaire se développent, responsables de la majorité des décès. Les mécanismes à l’origine de ces dysfonctionnements des cellules du système immunitaire restent mal connus. L’activation d’une voie particulière de l’inflammation pourrait participer à ce phénomène. Les souris présentant une infection sévère ont une activation de cette voie, en association avec des altérations du système immunitaire. Au cours de ce projet, nous allons étudier plus précisément le rôle respectif des différents composants de cette voie en utilisant d’une part des souris génétiquement modifiées capables ou non d’activer cette voie de l’inflammation et d’autre part des inhibiteurs de cette voie. Nous utiliserons un modèle murin d’infection sévère par péritonite ou par injection d’un composant bactérien. Nous étudierons les altérations immunitaires présentées par ces souris dans différents organes (rate, moelle osseuse, sang, péritoine, poumon).
Bénéfices attendus
Les infection sévères sont des pathologies fréquentes qui peuvent causer de nombreuses maladies et décès. Le pronostic des patients développant ces infections sévères est principalement grevé par le développement d’altérations de la réponse immunitaire à l’origine à moyen terme d’infections secondaires contractées à l’hôpital et à long terme du développement de maladies cardiovasculaires et de cancers. Une meilleure compréhension des mécanismes de ces altérations est jugée nécessaire par l’Organisation Mondiale de la Santé pour progresser dans la prise en charge de cette pathologie. En focalisant les efforts sur une voie majeure de réponse à l’infection et en particulier sur ses différents composants, cela permettra de générer des pistes pour de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’améliorer le devenir de ces patients. L’existence de médicaments capables d’inhiber cette voie utilisés en pratique clinique et bien tolérés dans d’autres indications rend cette perspective très concrète. Ces stratégies thérapeutiques innovantes auraient un effet préventif des conséquences à moyen et long terme de ces infections sévères.
Procédures
L’étude des modifications génétiques des souris sera réalisée grâce à une biopsie de l’oreille. Le projet s’appuie sur 2 modèles d’infections chez la souris. Le premier modèle est une infection au niveau abdominal (péritonite) créée par perforation du tube digestif (durée de la procédure : 5 minutes) sous anesthésie générale. Cette intervention est réalisée une seule fois en début de procédure, à J0. Le deuxième modèle consiste en l’injection d’un composant bactérien (injection sur 10 secondes) sur animal vigile. Cette injection est réalisée une seule fois en début de procédure à J0. L’injection des différents inhibiteurs d’une voie de réponse à l’infection sera réalisée au maximum une seule fois par jour pendant 6 jours, jusqu’à mise à mort de l’animal (De J1 à J6 injection sur 10 secondes) sur animal vigile. Les prélèvements sanguins seront réalisés exclusivement sous anesthésie générale le jour de la mise à mort (10 secondes) et les différents autres prélèvements en post-mortem.
Impact sur les animaux
La péritonite peut être à l’origine de douleurs, d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Il existe également une douleur au point d’injection lors de l’injection d’anesthésique. L’injection du composant bactérien est à l’origine d’une perte de poids, d’une douleur au point d’injection lors de l’injection et d’une réduction de l’activité et de la mobilité. L’injection d’inhibiteurs de cette voie de l’inflammation génère une douleur au point d’injection lors de l’injection. L’étude des modifications génétiques des souris sera réalisée grâce à une biopsie de l’oreille. Cette biopsie est à l’origine d’une douleur légère de courte durée.
Devenir
Une mise à mort sera réalisée à l’issue des procédures du fait du prélèvement nécessaire d’organes vitaux (poumon par exemple) ne permettant pas d’envisager une autre issue.
Remplacement
Un modèle utilisant uniquement des cellules isolées ou l’utilisation d’outils informatiques ne pourraient refléter toute la complexité de la réponse du système immunitaire contre les infections sévères et les relations entre les cellules de l’immunité. L’étude sur un animal entier est donc indispensable et nous utiliserons 2 modèles d’infection bien validés dans d’autres études et qui reproduisent la réponse anti-infectieuse décrite chez l’homme.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe a été réalisé afin de pouvoir mettre en évidence des différences significatives entre les groupes. Au cours de chaque expérience, de multiples analyses utilisant des techniques différentes seront réalisées sur les différents prélèvements afin de minimiser le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être, une prise en charge de la douleur (anesthésie générale lors de l'intervention, administration d’antalgiques) et une prise en charge de la déshydratation seront réalisées. A l'issue de la chirurgie, les souris seront replacées dans leurs cages avec un aménagement spécifique pour garantir leur confort. La cage sera placée dans une armoire chauffante. Une surveillance quotidienne avec pesée des souris et grille d’évaluation spécifique sera effectuée jusqu'à mise à mort. En cas de douleur ou d’inconfort trop important, une mise à mort anticipée des souris sera réalisée.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux les plus utilisés en immunologie avec un large choix de solutions techniques dédiées disponibles commercialement et des modèles génétiquement modifiés sont d’ores et déjà disponibles. Il s'agit de jeunes adultes (8-12 semaines) dont le système immunitaire est à maturité.
Etude de la dégénérescence des cellules oligodendrocytaires et étude des effets de la stimulation magnétique répétitive transpinale dans le développement de la SLA chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard à 110 jours pour prélever la moelle épinière, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une biopsie de la queue vers six jours, et 260 d'entre elles portent une mutation qui provoque une paralysie progressive, avec des tests moteurs hebdomadaires que le porteur n'énumère pas. Quatre-vingts souris reçoivent en plus une stimulation magnétique de la moelle sous anesthésie générale pendant quatorze jours. Le porteur fixe le point limite à une paralysie modérée qu'il décrit comme ayant "peu d'impact sur la vie de l'animal", et prévoit croquettes mouillées et biberons à longue tétine pour que les souris n'aient pas à se redresser.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative touchant les neurones moteurs (appelés aussi motoneurones). Elle se déclare à l’âge adulte, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif et l'issue de la maladie est fatale. De plus, les mécanismes conduisant à la dégénérescence des motoneurones restent mal connus à ce jour. En outre, une dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures a été observée, cette dégénérescence étant considérée comme une conséquence de celle des motoneurones. Cependant, des études récentes suggèrent que la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures pourrait précéder, voire contribuer, à celle des neurones moteurs. Le premier objectif de ce projet sera donc d'étudier la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures au cours de l'évolution de la maladie chez des souris transgéniques qui reproduisent la sclérose latérale amyotrophique. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique d’un traitement non-invasif dans le développement de la maladie. En effet, il a été démontré que la stimulation magnétique répétitive permet d'augmenter la survie des neurones et de réduire la démyélinisation après une lésion traumatique de la moelle épinière. Par conséquent, nous étudierons les effets de la stimulation magnétique répétitive sur la dégénérescence des précurseurs d'oligodendrocytes et des oligodendrocytes matures. Pour cela, afin de pouvoir étudier spécifiquement les oligodendrocytes et les oligodendrocytes matures dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique, des souris permettant de suivre spécifiquement ces cellules seront croisées avec des souris développant la sclérose latérale amyotrophique au cours du temps ; ces deux lignées de souris étant présentes au sein de notre animalerie.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse aux mécanismes qui concourent à la dégénérescence des motoneurones et donc au développement de la sclérose latérale amyotrophique dans un modèle de souris qui reproduit la maladie décrite chez l’Homme. Il permettra donc le cas écheant de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte pathologique. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des patients qui développent la sclérose latérale amyotrophique.
Procédures
L'ensemble des animaux, soit 360 souris, subiront une biopsie de queue vers 6 jours afin de réaliser le génotypage de ces animaux. Pour une première série d’expérimentations ; 100 souris controles (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. De la même facon, 100 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (50 males et 50 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences d’histologie. Pour une seconde série d’expérimentations 160 souris exprimant les symptomes de la sclérose latérale amyotrophique (80 males et 80 femelles) seront utilisées afin de réaliser des expériences de comportements et d’histologie. Les tests de comportements seront réalisés à partir de l’âge P50 et seront effectués toutes les semaines. La moitié de ces souris, soit 80 souris, bénéficiera d’un traiment par stimulation magnétique qui durera 14 jours. Ce traitement se fera sous anesthésie générale pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 0.4T). Les animaux seront stimulés soit de J50 à J64 soit de J80 à J94. Enfin l’ensemble des animaux sera euthanasié, à un age de P110 au maximum afin de récupérer la moelle épinière.
Impact sur les animaux
Nous avons bien conscience que dans notre étude certains animaux mimant la maladie humaine vont développer certains signes de paralysie progressive et que l’aggravation de leur état conduira à un arrêt de toute procédure pour ces animaux. Ce projet impose également une douleur de courte durée à la suite du prélévement de queue (biopsie) afin de réaliser le génotypage
Devenir
L’ensemble des animaux (360 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (à P110 maximum) afin de procéder au prélévement de la moelle.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, la sclérose latérale amyotrophique résulte d'interactions pathogènes complexes entre les neurones moteurs et les autres constituants cellulaires de la moelle épinière, en particulier les cellules microgliales, les astrocytes et également les oligodendrocytes. L’étude de l’implication de ces différentes populations cellulaires dans le développpement de la maladie ne peut donc se faire que via l’utilisation d’animaux entiers vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 animaux pour certaines expériences se justifie par la variation pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels.
Raffinement
Les expériences sont concues pour apporter le moins d’inconfort possible aux animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Nous avons défini un point limite ; score de 2 sur une échelle de 4 où la paralysie est modérée et a peu d'impact sur la vie de l'animal. Toutefois, par souci de précaution, afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la sclérose latérale amyotrphique ou SLA. Nous utiliserons ici l'un de ces modèles de souris qui mime la maladie. Ces souris présentent une mort progressive des neurones permettant le controle moteur, reproduisant ainsi les caractéristiques de cette maladie. Cette souris est donc un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles. Afin d’étudier la dégénérescence des cellules qui produisent la myéline, ces souris seront croisées avec un second modèle de souris de manière à pouvoir suivre ces cellules spécifiquement durant le développement de la maladie. Les animaux utilisés seront agées entre 15 et 110 jours. En effet, nous voulons étudier la dégénérescence des cellules myélinisantes et des neurones au cours du développement de la SLA chez la souris. Les premiers temps expérimentaux correspondent aux stade pécoces pré-symptomatiques (P15 et P30) de la maladie, puis à P50, P80 et P110 ; périodes qui correspondent respectivement à l’apparition des premiers signes notamment des symptomes locomoteurs et à l’apparition de la paralysie.
Modèle murin de maltraitance physique infantile : syndrome du bébé secoué
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Secoués sous anesthésie générale à l'âge de sept jours pour reproduire le syndrome du bébé secoué, 909 souriceaux sont tous tués aux stades étudiés pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur liste les atteintes attendues : douleurs cérébrales liées aux lésions, difficulté à s'alimenter, retard du développement psychomoteur, rigidité corporelle, mouvements de convulsion, respiration anormale et anomalies du comportement. Une partie des souriceaux subit en plus une craniotomie d'une heure sous anesthésie, sans réveil. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative parfaite" à un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement, et présente ce modèle comme une préparation d'interventions de prévention chez les enfants.
Objectifs
Les violences faites aux enfants et adolescents sont un fléau sanitaire et sociétal mondial. Un quart des adultes déclarent en avoir été victime mais une minorité d’entre eux est repérée suffisamment précocement pour éviter les conséquences « vie entière » somatiques et neuropsychiatrique de ces violences et leur impact socio-économique majeur. Les violences faites aux enfants et adolescents sont définies par l’OMS comme toutes les formes de mauvais traitements physique et/ou affectifs, de sévices sexuels, de négligences ou d’exploitation, entraînant un préjudice réel ou potentiel pour la santé de l’enfant, sa survie, son développement ou sa dignité, dans le contexte d’une relation de responsabilité, de confiance ou de pouvoir. Dans les pays à économie développée, les estimations de fréquence usuellement acceptées indiquent que 4 à 16% des mineurs seraient victimes de maltraitance physique. Pour les enfants survivants aux violences physiques du syndrome du bébé secoué, les conséquences à long terme sont majeurs sur le plan neurologique et développemental (périmètre crânien diminué, épilepsie, déficiences motrices visuelles intellectuelles, trouble du langages, et anomalies comportementales). Enfin, la pandémie de COVID-19 a augmenté la fréquence et la gravité des violences. Le syndrome du bébé secoué a vu son incidence doubler en 2021 et la mortalité décupler par rapport à la période de prépandémie. Dans ce projet, nous modéliserons chez le souriceau le syndrome du bébé secoué (traumatisme crânien). Plusieurs analyses seront réalisées à des temps spécifiques de la maturation du cerveau : enfance, adolescence et adultes. Nous établirons un profil comportemental individuel sur plusieurs composantes (motrice, sociale, cognitive). Les effets au niveau moléculaires de ces maltraitances seront également étudiés afin de permettre un futur transfert vers la clinique chez l’humain. Les analyses seront ciblées sur les marqueurs moléculaires de deux axes identifiés chez l’humain comme étant tout particulièrement perturbés après exposition à des maltraitance dans l’enfance : la neuroinflammation et la production d’hormones. Les études de la génétique et des protéines sont réalisés sur le sang et le cerveau des animaux juvéniles, adolescents et adultes. Enfin des approches thérapeutiques telles que la thérapie comportementale et des tests de médicaments ciblant les régulateurs clés seront entreprises.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les mécanismes et l'évolution du traumatisme crânien du syndrome du bébé secoué à l’échelle cellulaire comme comportementale pour mieux définir la période la plus propice pour les futures études thérapeutiques chez les enfants et adolescents. Il permettra de préparer des interventions de prévention secondaires adaptées et correctrices.
Procédures
Les souriceaux subiront un traumatisme crânien par secouement sous anesthésie générale. Après le traumatisme, des groupes d’animaux de différents âges seront anesthésiés, et une perfusion intra-cardiaque sera réalisée post- mortem pour éliminer le sang des vaisseaux du cerveau qui sera étudié. La perfusion est réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie. Certains animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale pour réaliser des mesures d’imagerie du cerveau (durée 1 heure). Cette chirurgie consiste en une craniotomie afin de permettre le passage du signal. Cette procédure est sans réveil, les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation. Cette procédure sera réalisée exclusivement par des expérimentateurs aguerris, maîtrisant parfaitement toutes les techniques requises.
Impact sur les animaux
Tout d'abord le jour du traumatisme crânien par secouement : - Séparation d’avec la mère lors de l’anesthésie par inhalation - Une hypothermie causée par l’isolement d’avec la mère - Le secouement horizontale. Ensuite, suite au traumatisme du secouement : - Douleurs cérébrales suite aux lésions occasionnées par le secouement - Difficulté à s’alimenter engendrant un petit poids - Retard dans le développement psychomoteur - Hypertonique, ou rigidité corporel, mouvements anormaux de convulsions, - Respiration anormale - Anomalie du comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral après le traumatisme, ainsi que l’inflammation cérébrale.
Remplacement
Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle sur un organisme vivant pour étudier les conséquences du secouement sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découle. Plusieurs analyses de notre projet ne peuvent être modélisée hors de l’organisme vivant, ni par des méthodes utilisant des modèles informatiques de théories de toxicité. Ce modèle, de bébé secoué, réalisé sur organisme vivant nous permet de s’intéresser à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel.
Réduction
Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Nos analyses sont réalisées régulièrement dans notre laboratoire, ainsi nous savons combien d’animaux sont nécessaires afin d’obtenir un résultat. En conséquence, le nombre d’animaux pour ce projet sera au maximum de 909 animaux afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques. Le cerveau des animaux issus de l’analyse de la connectivité neuronale et ceux issus des analyses du comportement seront prélevés pour les analyses du tissus cérébral ce qui a réduit le nombre d’animaux dans notre projet. Il est prévu de mettre en place le modèle avec 48 animaux, mais si la fréquence d’agitation est déterminée sur moins d’animaux nous en utiliserons moins ce qui réduira le nombre total d’animaux.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid comme cela est fait dans leur milieu naturel. Les animaux seront réchauffés à l’aide d’une lampe au moment de la procédure du secouement. On surveillera l’état général des animaux dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les souriceaux dans la portée sans les déranger à nouveau car les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile, donc il attire l’œil. Pendant les protocoles nécessaires pour la mise en place des appareils d'imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l'animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure sera interrompue et l'animal euthanasié. Les animaux seront euthanasiés après administration d’un analgésique et d’un anesthésique. C’est quand la mort sera vérifiée (plus de réflexes) que nous procéderons alors aux prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. Le modèle de secouement sera fait à 7 jours de vie, ceci correspond à la petite enfance chez l’humain. Nous étudierons les interactions entre les cellules du cerveau en développement sur un modèle de bébé secoué, pour cela il est nécessaire d’utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l’homme. La souris remplit très bien cette condition. Notre objectif étant d’étudier l’effet du secouement sur le cerveau en développement, nous nous intéresserons à 3 temps de vie : 8 à 21 jours (petite et moyenne enfance), 45 jours (adolescence), et 6 mois de vie (adulte), afin d’étudier l‘évolution du traumatisme cérébrale et les effets à long terme.
Identification du rôle de l’additif alimentaire nanoparticulaire phosphate tricalcique dans la survenue de l’allergie à l’œuf chez un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour savoir si un additif alimentaire nanoparticulaire déclenche l'allergie à l'œuf, 360 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. Chacune subit quatre prises de sang et quatre prélèvements de selles, et 240 d'entre elles reçoivent trois injections intrapéritonéales de sensibilisation avant un gavage destiné à déclencher la réaction allergique. Le porteur indique que des symptômes d'anaphylaxie peuvent apparaître dans la demi-heure suivant le gavage et persister une trentaine de minutes, avec chute de la température corporelle mesurée par voie rectale. Il compare la forme en aiguilles des particules de phosphate tricalcique aux fibres d'amiante dans les poumons, tout en rappelant que cet additif entre dans les préparations infantiles.
Objectifs
L’augmentation de la prévalence des allergies alimentaires observée depuis une vingtaine d’année coïncide avec l’augmentation de la consommation d’aliments ultra-transformés. Parmi les aliments ultra-transformés, on trouve ceux contenant des additifs alimentaires, dont le risque de déclencher des réactions allergiques commence à être évoqué pour ceux contenant des nanoparticules. L’un de ces additifs, le phosphate de calcium, contient 100% de nanoparticules et se présente sous la forme d’hydroxyapatite. Il a servi pendant plusieurs années de support à des vaccins comme adjuvant pour amplifier la réponse immune et est actuellement employé dans les préparations infantiles pour augmenter l’apport en calcium. Le projet vise à identifier comment cet additif alimentaire, reconnu comme un nanomatériau et incorporé dans les formulations alimentaires pour équilibrer l’apport en phosphate et calcium, peut conduire à des désordres immunitaires via sa capacité à stimuler le système immunitaire et/ou son affinité pour des protéines identifiées comme allergène (ici le lysozyme).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’apporter des connaissances sur le mécanisme d’action d’un additif alimentaire, le phosphate tricalcique dans l’allergie à l’œuf (via le lysozyme). Par la comparaison des différents paramètres mesurés, le protocole répondra aux hypothèses mécanistiques formulées suivant la bibliographie, à savoir : 1) Le phosphate tricalcique (E341) participe à la sensibilisation et au déclenchement de l’allergie alimentaire en favorisant l’exposition des épitopes et/ou limitant la dégradabilité des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Ce mécanisme est basé sur les grandes capacités d’adsorption du phosphate tricalcique pour les protéines dont les allergènes. 2) Les particules de phosphate tricalcique (E341), de par leur forme en aiguilles pointues, irritent mécaniquement la barrière intestinale (à la manière des fibres d’amiante dans les poumons), la rendant perméable et facilitant le passage d’allergènes dans l’organisme, auquel le système immunitaire réagit en produisant des anticorps.
Procédures
Lors de ce protocole, toutes les souris subiront 4 prélèvements de selles et 4 prises de sang espacées d’une semaine au minimum, une juste après l’acclimatation, une avant la sensibilisation 1 = S1, une avant la sensibilisation 2 =S2 et une avant la sensibilisation 3 =S3. Les groupes sensibilisés soit 120 souris par sexe subiront 3 Injections intrapéritonéales à 1 semaine d’intervalle (S1, S2, S3), puis toutes les souris, soit 360, subiront 1 gavage oral.
Impact sur les animaux
La sensibilisation par voie intrapéritonéale et la phase de déclenchement de l’allergie alimentaire peuvent contribuer à des nuisances. Lors de l’injection intrapéritonéale une légère douleur passagère peut être ressentie au point d'injection. Une baisse de la température corporelle des animaux est également observée quand l’animal déclenche une réaction allergique. Les souris pourraient ressentir des douleurs stomacales liées à l’administration de l’allergène par gavage. La prise de température par voie rectale peut aussi entrainer un inconfort pour les souris. Aussi, des symptômes caractéristiques de l’anaphylaxie peuvent être observés. Généralement, les effets surviennent entre 0 et 30 minutes après le gavage pour déclencher la réaction allergique et peuvent persister pendant une trentaine de minutes. Lors de la prise de sang à la queue une irritation passagère à la queue peut être ressentie.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude immunologique et de la fonction gastro-intestinale.
Remplacement
Dans le cas de l’allergie alimentaire, les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire efficacement les phénomènes intervenant à la fois sur le système immunitaire et la physiologie. Pour étudier le mécanisme de la réponse allergique, le modèle in vivo est donc actuellement le seul adapté.
Réduction
Sur la base d’une étude menée récemment au laboratoire, le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement exploitables sur les immunoglobines IgG conduit à utiliser des groupes de 30 souris chacun.
Raffinement
Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l’expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi des signes généraux et le suivi des points limites sont effectués au quotidien afin de minimiser l’inconfort et la douleur. L’eau et la nourriture seront mises à volonté dans les cages.
Choix des espèces
Au cours de cette étude seront utilisées des souris mâles et femelles. Le modèle murin est reconnu dans le cadre des études du système immunitaire du fait de la caractérisation approfondie de cette espèce. De plus, nos modèles d’allergie ont été établis sur cette espèce. Des analyses phénotypiques des populations lymphocytaires seront réalisées. L’utilisation de ces souris nous donne accès à de nombreux outils immunologiques, notamment les anticorps nécessaires aux marquages. Les souris utilisées auront 3 semaines de vie à réception, 5 semaines de vie au début du protocole d’exposition, puis 7 semaines à la première sensibilisation, 10 semaines au moment du gavage oral et de la mise à mort.
Etude des approches d’inhibition de la GPVI plaquettaire dans un modèle murin immunocompétent de greffe d’adénocarcinome canalaire pancréatique (ACCP)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Toutes tuées pour analyse histologique, 150 souris subissent une greffe de cellules tumorales dans le pancréas par chirurgie ou une injection intraveineuse de ces cellules, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que les tumeurs pancréatiques entraînent une perte de poids et que des métastases apparaissent rapidement dans les poumons, avec des difficultés respiratoires, ainsi que dans le foie, la rate et les ganglions. Le projet teste l'effet de médicaments inhibant une protéine plaquettaire, seuls ou combinés à la chimiothérapie standard. Le porteur décrit ses propres modèles cellulaires en trois dimensions comme capables de remplacer "une partie" des études sur souris, et retient le recours aux animaux non-humains pour les échanges cellulaires que ces modèles ne reproduisent pas.
Objectifs
Les carcinomes canalaires pancréatiques sont classés comme des tumeurs très agressives par l'Organisation mondiale de la santé. Ils se caractérisent par une invasion étendue du pancréas et des organes distants, principalement en raison de mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique de ces tumeurs repose généralement sur une chimiothérapie et/ou radiothérapie. Lorsque cela est possible, l'ablation partielle ou totale de la tumeur améliore la survie des patients. Cependant, malgré ces traitements lourds, la survie des patients est actuellement estimée à environ 6 à 12 mois. L'objectif de ce projet est d'étudier, dans un premier temps, l'effet de médicaments sur le développement de ces tumeurs en combinaison ou pas avec la chimiothérapie standard. Dans un deuxième temps, nous étudierons l'effet de ces inhibiteurs sur la dissémination métastatique des tumeurs.
Bénéfices attendus
A ce jour, les cancers du pancréas représentent des cancers très agressifs et réfractaires à tous types de traitement. Ainsi, la mise en évidence de nouveaux traitements ou de nouvelles combinaisons de traitements représenterait une avancée majeure dans la prise en charge thérapeutique de ces patients et un espoir thérapeutique fort pour d’autres types de tumeurs agressives et réfractaires. Notre étude s’attache à mieux comprendre, modéliser, et cibler la croissance tumorale et la dissémination métastatique afin de contrecarrer la résistance aux traitements et les mécanismes d’échappement.
Procédures
Des souris subiront une chirurgie lors de la greffe intra-pancréatique des cellules tumorales. Celle-ci sera réalisée sous anesthésie adaptée et analgésie (1 fois, durée : 10min). D'autres souris auront une greffe cellulaires en intraveineux sous anesthésie (1 fois, durée 1min). Des animaux subiront des traitements par injections intraveineuses (durée : 1min) (nombre : 3 fois, espacés de 3 jours ou 5 jours).
Impact sur les animaux
La chirurgie pourrait entrainer une hémorragie chirurgicale ou une infection générale sont des complications exceptionnelles de la procédure (jamais rencontrées). Ces animaux développeront des tumeurs pancréatiques, qui peuvent entrainer la perte de poids. L'injection intraveineuse de cellules pourrait entrainer une irritation. Ce projet est bien caractérisé et des tumeurs métastatiques apparaissent rapidement dans les poumons (principalement), ceci pourrait entrainer des difficultés respiratoires. Des tumeurs métastatiques peuvent aussi être retrouvées dans d’autres organes tels que le foie, la rate et les ganglions. Lors des traitements : un stress peut être engendré par des contentions multiples, une irritation au point d'injection pourrait apparaitre.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses histologiques détaillant des effets thérapeutiques observés.
Remplacement
Notre laboratoire développe des modèles cellulaires en 3 dimensions permettant de remplacer une partie des études précliniques chez la souris en testant sur des cellules l’efficacité des drogues. Seules les drogues ayant montré un effet significatif sur l’inhibition de l’agressivité des cellules tumorales seront testées chez la souris. Ces systèmes cellulaires comportent des limites et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe ce qui explique le recours à des animaux pour étudier les échanges cellulaires et moléculaires qui prennent place dans la progression tumorale et la dissémination métastatique.
Réduction
Nous allons diviser les études en deux groupes : une étude de la progression de la tumeur qui durera 30 jours et une étude de la dissémination métastatique des cellules cancéreuses qui durera 15 jours. Un nombre croissant d’études révèlent la présence d’un dimorphisme sexuel pouvant conduire à une mauvaise interprétation des résultats. Des tests statistiques ont été utilisés afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires par groupe qui permettent à la fois de réduire le nombre total d’animaux nécessaires tout en préservant la significativité des résultats et leur robustesse. Cela nous permettra d’obtenir des conclusions pertinentes et d’éviter toutes répétitions expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés ensemble dans un environnement confortable pour éviter qu'ils ne soient stressés. Les personnes en charge des animaux et de l'expérience surveilleront leur comportement tous les jours pour détecter toute douleur ou souffrance. Les expériences et les procédures seront effectuées de manière à minimiser le stress et à garantir le bien-être animal. Les souris seront suivies régulièrement pour détecter tout signe de souffrance, et si nécessaire, elles seront euthanasiées. Avant toute intervention chirurgicale, les souris recevront des anti-douleurs et seront surveillées de près pendant 48 heures après l'opération. Pendant l'anesthésie, les yeux des souris seront protégés pour éviter qu'ils ne se dessèchent, et les souris seront maintenues au chaud sur un tapis chauffant pour les garder à une température corporelle confortable.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris car la souris est génétiquement très proche de l'Homme. Les expériences sur les souris permettent d'avoir des analyses statistiques plus étendues comparées à des animaux de plus grande taille. Le modèle permettra de bien comprendre les mécanismes immunologiques émis par le microenvironnement tumoral pendant la progression tumorale et la dissémination métastatique et lors des réponses aux traitements. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines pour toutes les études. A ces âges, les animaux présentent des caractéristiques adultes et sont réceptifs à la prise des greffes.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse mammaire grâce à des études orthotopiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses mammaires, des traitements répétés jusqu'à une fois par jour pendant deux à quatre semaines, et jusqu'à deux ponctions de sang par semaine dans la veine mandibulaire. Le porteur affirme que des expériences antérieures n'ont montré "aucune souffrance" liée aux tumeurs parce qu'elles sont sous-cutanées, une affirmation difficile à concilier avec la gravité sévère déclarée pour l'ensemble des 1 860 souris. Une partie de ces souris est utilisée pour constituer une biobanque de tumeurs destinée à son laboratoire et à des équipes partenaires.
Objectifs
Le cancer du sein dit triple-négatif (aussi appelé TNBC, pour "Triple-Negative Breast Cancer" en anglais), est un sous-type très agressif de cancer du sein pour lequel très peu de stratégies thérapeutiques sont envisageables à l'heure actuelle par manque de compréhension de cette maladie complexe. Nous pensons que des traitements combinatoires ciblant les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires seront efficaces, contrairement aux traitements individuels qui n'ont que des effets limités. Mais l’évaluation de l'efficacité de ces traitements dans les études précliniques est assez limitée en raison du manque de modèles d'étude appropriés. Nous travaillons avec des souris qui développent des tumeurs dans la glande mammaire et qui modélisent fidèlement les caractéristiques des tumeurs retrouvées chez les patientes atteintes de TNBC. Ce projet de recherche a pour objectif de comprendre comment les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires "dialoguent" entre elles au début de la formation des tumeurs mais aussi lorsque la tumeur régresse suite à un traitement anticancéreux. Nous souhaitons aussi évaluer l'efficacité de traitements combinant des candidats-médicaments ciblant les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires (immunothérapie). Pour cela, nous envisageons de greffer des cellules cancéreuses (provenant du modèle souris TNBC) dans des souris dites receveuses, qui elles-mêmes développeront des tumeurs mammaires; ceci afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques permettant de nombreuses analyses (création d'une biobanque). Ces greffes de cellules cancéreuses serviront également à évaluer l'efficacité d'agents anti-cancéreux (candidats-médicaments) administrés seuls ou en combinaison avec de l'immunothérapie. Enfin, afin de se rapprocher de la clinique, la pertinence des traitements qui s'avèreront efficaces sur les cellules cancéreuses de souris seront ensuite testées sur des cellules humaines. Pour cela, des cellules cancéreuses humaines (cellules provenant de patientes atteintes de TNBC) seront greffées dans la glande mammaire de souris dont le système immunitaire est défaillant, permettant ainsi la prise de la greffe. Les tumeurs résultantes seront alors soumises aux traitements qui se seront avérés être efficaces sur les tumeurs d'origine souris.
Bénéfices attendus
1) Le modèle de souris qui sera utilisé est un modèle unique puisqu'il génère exclusivement des tumeurs mammaires de type TNBC. Ce modèle préclinique est par conséquent très précieux pour la communauté scientifique. La création d'une biobanque de tumeurs de souris de type TNBC est donc importante afin de générer suffisamment de matériel biologique pour des études réalisées soit dans notre laboratoire, soit en collaboration avec d'autres équipes. 2) L'évaluation préclinique de traitements combinatoires ciblant les cellules cancéreuses et/ou les cellules immunitaires est un prérequis pour des études cliniques. Ce projet nous permettra d'apporter des connaissances sur les signaux qui confèrent la sensibilité ou la résistance de certains sous-types de TNBC à des traitements spécifiques. A plus long terme, ces données pourront alors être traduites en clinique afin d'envisager une stratification des patients atteints de TNBC et ainsi prédire une réponse aux traitements.
Procédures
Les souris anesthésiées subiront 1 seule greffe de cellules. La durée de la greffe sera très courte (inférieure à 30 secondes). Certaines de ces souris seront traitées avec des candidats-médicaments anti-cancéreux et/ou de l'immunothérapie qui seront administrés selon les recommandations fournies pour chaque composé. La durée de l'administration sera très courte ((inférieure à 20 secondes). Après administration, les souris seront placées en observation dans une cage. La fréquence des injections dépendra du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine, pour une durée variant de 2 à 4 semaines). Pour certaines cohortes de souris, l'évolution des tumeurs sera évaluée par mesure directe avec un pied à coulisse ou de manière indirecte, par imagerie non-invasive, réalisée 1x/15jours (5mn/séance). Les animaux seront examinés régulièrement de façon à détecter d'éventuels signes pouvant traduire un stress ou une souffrance. Un échantillon de sang sera également prélevé (2x/semaine, au maximum) par ponction dans la veine mandibulaire. Chaque prélèvement durera moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances / effets indésirables potentiels sont : 1) des insuffisances respiratoires ou cardiaques survenant au cours de l'anesthésie et 2) un réveil douloureux suite à l'anesthésie. Mais puisque nous réaliserons une anesthésie volatile, ce risque est minimisé. 3) Une douleur possible lors de l'administration des agents pharmacologiques qui seront administrés selon un mode opératoire, une fréquence et dose tolérés par les souris, sur la base d'études publiées. Les nuisances dues au mode d'administration ne seront que temporaires (au cours de l'administration). Aucun effet indésirable, dû à l'administration, n'est attendu chez les animaux. 4) Une douleur possible lors de l'injection de luciférine, composé nécessaire aux analyses par bioluminescence (imagerie non invasive). 5) Une souffrance éventuelle liée à la formation des tumeurs. Cependant, des expériences précédentes n'ont montré aucune soufrance chez les souris car il s'agit de tumeurs sous-cutanées. 6) Un stress généré par les manipulations fréquentes des animaux (pesées, mesure des tumeurs). Les souris seront régulièrement suivies par les expérimentateurs. Des paramètres définis permettront d'évaluer la souffrance des animaux. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (enrichissement des cages, acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation).
Devenir
En fin d'expérimentation, toutes les souris seront euthanasiées. Les tumeurs seront prélevées pour réaliser les analyses nécessaires au projet. Toutefois, en cas de souffrance avérée (définie selon des critères bien établis) au cours de la procédure, les souris seront euthanasiées.
Remplacement
Nous avons établi des lignées de cellules TNBC (provenant des tumeurs mammaires du modèle de souris) et sommes actuellement en train de générer des cultures d'organoïdes (également dérivés des tumeurs mammaires). Bien que des études supplémentaires soient nécessaires, ces modèles in vitro nous ont déjà permis d'identifier des signaux vulnérables et de tester l'efficacité de certains agents anti-cancéreux. Ces résultats nous permettent de limiter les études in vivo, en se focalisant sur les agents/signaux les plus pertinents, afin d'établir leur pertinence dans un contexte physiologique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé par un test d'effectifs couramment utilisé en recherche. Cet outil nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires pour avoir une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe d'animaux traités, en tenant compte de la variabilité des réponses. En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables.
Raffinement
L'état de santé des souris sera régulièrement surveillé en fonction de l'évolution des expériences, de la formation des tumeurs. L'évaluation sera réalisée en suivant différents critères : poids, apparence du pelage, comportement animal dans la cage qui traduirait une éventuelle souffrance ou angoisse. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de réduire, voire de supprimer, la souffrance chez l’animal (ex : acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation). De plus, les cages seront enrichies avec des objets comme un dôme, un rouleau de carton, des petits rouleaux de papier ou de la paille que les souris désintègrent pour se constituer un nid. La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie de manière longitudinale par mesure directe avec un pied à coulisse et/ou par imagerie non invasive (bioluminescence/fluorescence). Les anesthésies pratiquées seront des anesthésies gazeuses et seront effectuées par du personnel compétent et expérimenté.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes du développement du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches utilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent de mettre en évidence de nouveaux mécanismes de signalisation impliqués dans les cancers ainsi que de potentiel traitements, comme nous l'avons déjà démontré. Les modèles de greffes chez la souris utilisés dans ce projet, permettront de tester dans le cas du TNBC, pour lequel aucune thérapie n'est efficace à l'heure actuelle, de nouveaux candidats-médicaments et d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinants des agents qui visent les cellules cancéreuses et des immunothérapies (qui affectent les cellules immunitaires). Les souris seront utilisées au stade adulte (environ 2 mois). Cet âge permet de minimiser les variations intrinsèques liées au fait que les greffes seront réalisées dans des tissus d'individus jeunes, plus réceptifs, par rapport à des tissus âgés. De plus, l'âge prédéfini des souris immunocompéténtes permettra de minimiser les variations du système immunitaire suite aux greffes. L'ensemble de ces critères permet de minimiser les variations et donc de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre des résultats statistiquement significatifs (règle des 3R).
Activité des formes génétiques naturelles d’un facteur cancéreux dans la dissémination des tumeurs mammaires vers les sites osseux et pulmonaires, dans un modèle métastatique murin de cancer du sein.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si deux variantes génétiques d'un facteur cancéreux favorisent les métastases osseuses, 108 souris femelles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère pour 48 d'entre elles et modéré pour 60, toutes tuées sous anesthésie pour prélever leurs tissus. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses humaines dans l'artère de la queue, puis un suivi par radiographie et bioluminescence sous anesthésie pendant 7 ou 28 jours. Le porteur reconnaît que ces tumeurs induisent chez l'humain de fortes douleurs et une gêne à la mobilité, et affirme qu'arrêter les expériences à 28 jours permettra d'obtenir les données "sans occasionner de complication ni de douleur", ce qui cadre mal avec la gravité sévère déclarée pour près de la moitié des souris. Il revendique des expériences "indispensables" parce qu'elles portent sur un "animal entier".
Objectifs
Le cancer du sein est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé vers des sites secondaires. Les métastases localisées dans l’os sont les complications les plus fréquentes du cancer du sein, responsables d’une destruction massive de l’os. Les métastases osseuses génèrent chez les patientes de grandes douleurs, des fractures pathologiques et peuvent engager le pronostic vital. Il est donc urgent d’identifier les facteurs qui prédisposent et conduisent les cellules cancéreuses du sein à se disséminer dans l’organisme et à coloniser l’os. Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dissémination des cancers du sein à l’os, et ceci afin d’améliorer les thérapeutiques préexistantes et d’entrevoir de nouvelles thérapies ciblées. Nous avons identifié un facteur biologique cancéreux qui favorise le développement des métastases osseuses dans le cancer du sein. Notre projet vise à comprendre si certaines formes génétiques naturelles de ce facteur peuvent également contribuer à la formation des métastases osseuses dans le cancer du sein. Les deux formes génétiques que nous étudions sont les seules connues à ce jour comme ayant un impact sur la séquence de la protéine du facteur cancéreux étudié, c’est-à-dire que ces deux formes génétques peuvent affecter la fonction biologique du facteur cancéreux étudié. Les résultats attendus permettront de savoir si le facteur biologique cancéreux étudié ou si également les formes génétiques naturelles de ce facteur représentent des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement des rechutes métastatiques et en particulier des métastases osseuses dans le cancer du sein.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers du sein et améliorer la survie des patients. A court terme, ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dissémination des cancers du sein à l’os. Ainsi, le projet permettra de comprendre le rôle des formes génétiques naturelles du facteur biologique cancéreux étudié dans la dissémination des cellules de cancer du sein vers la moelle osseuse et dans le développement des métastases dégradant l’os. Trouver une solution thérapeutique afin de prévenir le développement de métastases osseuses dans le cancer du sein est un problème majeur de santé publique. A terme, ce projet permettra également d’envisager des solutions thérapeutiques candidates, car il indiquera s’il est pertinent de cibler uniquement le facteur biologique cancéreux étudié ou si les formes génétiques naturelles de ce facteur représentent également une cible thérapeutique potentielle. A l’avenir, le projet bénéficiera à d’autres cancers propices à développer des métastases osseuses (cancer du poumon et cancer de la prostate), et dans lesquels le facteur biologique cancéreux étudié joue également un rôle.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules cancéreuses dans l’artère de la queue (moins d’une minute) et un suivi quotidien d’observation des animaux sera mis en place pendant 7 jours ou 28 jours. Les animaux suivis jusqu'à 28 jours seront anesthésiés une fois par semaine pour une imagerie non invasive en radiographie (1 minute) et en bioluminescence (5 minutes). En fin d'expérience, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale afin de réaliser des prélèvements de tissus pour analyse.
Impact sur les animaux
Le développement des tumeurs a pour caractéristique chez l’homme d’induire de fortes douleurs et une gêne à la mobilité. Dans le but de réduire la douleur et la gêne à la mobilité des animaux, la procédure sera limitée dans le temps et la quantification de la dégradation osseuses et de la croissance tumorale sera suivie de facon hebdomadaire par radiographie et bioluminescence afin d’anticiper le moment d’apparition d’un des points limites.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale. Les analyses seront réalisées post-mortem.
Remplacement
Nos expériences chez l’animal sont indispensables pour répondre à nos deux questions scientifiques. En effet, elles miment un contexte se rapprochant le plus possible de la situation clinique du cancer du sein métastatique chez la patiente, car utilisant un animal entier. Notre équipe dispose déjà de résultats expérimentaux in vitro justifiant de passer dans le modèle in vivo. En effet, nous avons montré que les formes génétiques naturelles du facteur cancéreux étudié confèrent in vitro un phénotype agressif qui apparait supérieur à celui de la forme sauvage du facteur cancéreux étudié. Toutefois, l’activité biologique et l’influence que peuvent présenter les formes génétiques naturelles étudiées sur des phénomènes tumoraux (tels que la migration in vivo, la colonisation et l’ancrage osseux lors de la formation des métastases osseuses) ne peuvent pas être appréciées par des tests in vitro, et nécessitent exclusivement une approche sur animal entier. L’approche in vivo est donc entièrement justifiée et sera complémentaire des résultats in vitro déjà obtenus. L’utilisation des lignées cellulaires d’origine humaine que nous avons préalablement testées in vitro pour leur capacité à être invasives nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer du sein chez la femme.
Réduction
La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. La taille des groupes correpond au nombre minimal de souris permettant de mettre en évidence une différence statistiquement significative pour l’effet observé. La réduction des effectifs à 12 souris par groupe permet une réduction au nombre de souris strictement nécéssaire pour obtenir la robustesse statistique nécessaire, tout en ayant pris en compte les éventuelles pertes d’animaux, par exemple si retirés de l’étude.
Raffinement
Les souris seront réceptionnées dans un environnement permettant leur acclimatation et cohabiteront dans des conditions d’hébergement adaptées pour garantir leur bien-être. Les animaux seront également sous surveillance journalière et manipulés systématiquement dans des conditions limitant leur stress. La douleur des animaux sera prise en compte et réduite en réalisant les injections des cellules humaines dans des souris sous anesthésie générale, et ce afin d’améliorer le confort de l’animal. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort, et retirés de l’ étude si nécessaire. Les expériences seront arrêtées au plus tard 28 jours après l'injection de cellules cancéreuses ce qui permettra d'obtenir les données escomptées sans occasionner de complication ni de douleur ou incidence sur la qualité de vie des animaux.
Choix des espèces
Les souris prévues pour nos expériences sont couramment utilisées en oncologie. Ces souris présentant une déficience de leur système immunitaire et peuvent donc recevoir des cellules tumorales humaines sans rejet. Nous utiliserons des souris femelles car nous travaillons sur le cancer du sein, principalement diagnostiqué chez la femme. Le cancer du sein chez l’homme est très rare et représente moins de 1% des cancers du sein diagnostiqués. Les expériences seront réalisées avec des souris âgées de 6 semaines (à cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures). Pour les injections intra-artérielles de cellules du cancer du sein, les souris doivent en effet être agées entre 4 et 6 semaines, car la prise métastatique est fortement réduite avec des souris plus agées.
Evaluation de traitements contre les comorbidités associées au syndrome de Dravet dans un modèle murin EU 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Soumises à une biopsie d'oreille puis à des injections ou des gavages quotidiens pouvant aller jusqu'à 42 administrations, 275 souris sont toutes tuées à l'issue, 200 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 75 d'un niveau léger. Ces souris portent une mutation qui déclenche des crises d'épilepsie spontanées, et le porteur indique que 40 à 50 % d'entre elles n'atteindront pas l'âge de 60 jours. Il annonce jusqu'à cinq tests comportementaux par animal sans préciser lesquels, alors que l'objet déclaré du projet porte justement sur l'hyperactivité, la sociabilité et la cognition. Il affirme que l'usage d'animaux transgéniques est "indispensable" pour reproduire un syndrome d'origine génétique, et compte sur ce modèle pour proposer des traitements des comorbidités du syndrome de Dravet.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer l’impact de traitements (pharmacologiques et ou probiotiques) sur les comorbidités liées à l’épilepsie, telles qu’une hyperactivité, une altération de la sociabilité ou des déficits cognitifs. Le syndrome de Dravet est une épilepsie rare de l’enfant qui a pour cause (dans plus de 80% des cas) une mutation hétérozygote (ne touchant qu’un allèle sur les 2) du gène SCN1A, codant pour un canal sodique. Ce syndrome épileptique est très bien caractérisé au niveau des crises épileptiques, mais l’est moins pour les comorbidités psychiatriques qui se développent à plus long terme. Des modèles murins du syndrome de Dravet ont été établis par transgène en délétant ou en mutant le gène Scn1a, ce qui mène au développement de crises épileptiques, provoquant dans certains cas une mort prématurée (phénotype aussi présent chez l’homme), ainsi que certaines comorbidités. Nous proposons d’utiliser un des modèles murins qui récapitule un grand nombre des caractéristiques du syndrome de Dravet : des crises précoces spontanées, une mort prématurée (nommée SUDEP = sudden unexpected death in epilepsy), et des altérations comportementales, comme une hyperactivité, une diminution de la sociabilité ou encore des déficits cognitifs. Ce modèle robuste est toujours utilisé pour le développement de traitements pharmacologiques.
Bénéfices attendus
Le syndrome de Dravet est un syndrome épileptique de l’enfant dont les traitements actuels ne permettent pas de soigner tous les patients. De plus, même si certaines crises sont atténuées par les traitements actuels, les comorbidités psychiatriques associées à ce syndrome ne sont pas traitées et entrainent une diminution de la qualité de vie des patients. Ce projet vise à tester de nouveaux traitements chroniques pour atténuer les comorbidités psychiatriques, ce qui permettra de proposer de nouveaux traitements chez l’homme.
Procédures
Tous les nouveaux-nés (environ 200) seront identifiés et génotypés à l’aide d’un prélèvement (biopsie) à l’oreille qui sera effectuée une seule fois (maximum 5 minutes/animal). Pour l’évaluation du comportement, les animaux (150) seront testés au maximum 5 fois à l’aide de test allant de 8 min à 30 min/jour, le tout sur 5 semaines maximum. Pour les traitements, les animaux (120) seront administrés quotidiennement (une fois par jour, maximum 2 min/animal) par voie intrapéritonéale (injection) ou voie orale (gavage) pendant la durée des tests comportementaux soit au maximum : 42 fois au total.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues (connues de la littérature) sont : 1) Une survenue de crises épileptiques spontanées, qui peuvent entrainer une mort prématurée (environ 40% à 50% des animaux au maximum n’atteignent pas l’âge de 60 jours). 2) Un stress et une douleur associée à la biopsie d’oreille pour l’identification et le génotypage simultané 3) un stress dû au transport entre le site de maintien de la lignée et le site de test. 4) un stress dû aux tests comportementaux (isolement dans un environnement nouveau) 5) un stress et une douleur dus à l’administration chronique des traitements (par gavage ou injection intrapéritonéale) Les traitements seront effectués par une personne expérimentée pour limiter le stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes, pour compléter cette étude.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car le comportement (locomoteur, social, cognitif) ne peut être étudié au niveau cellulaire (in vitro) ou par modélisation (in silico). De plus, afin de mimer un syndrome d’origine génétique, l’utilisation d’animaux transgéniques est indispensable
Réduction
Afin de limiter l’utilisation d’animaux transgéniques à phénotype dommageable, les animaux HE seront générés à partir de fécondation in vitro d'ovules de femelles C57BL/6 à l’aide de sperme issus de male modèle de Dravet. Nous ferons aussi une planification rigoureuse des expériences, en testant d’abord le phénotype comportemental du modèle murin dans nos conditions expérimentales (environnement) avant de tester de possibles traitements. Le calcul du nombre des animaux est fait selon une approche statistique, il nous faut donc au minimum 12 animaux par groupe pour pouvoir évaluer le phénotype des animaux.
Raffinement
Pour la procédure d’élevage, les animaux sont hébergés en isolateur enrichies avec des morceaux de coton et de la frisure de carton servant de matériel de nidification. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 6h/18h. Une manipulation réduisant le stress des animaux sera réalisée (manipulation dans le creux de la main). Le transport entre le site d’élevage (procédure 1) et le site utilisateur (procédures 2 et 3) se fera dans des cages où les animaux seront groupés en conservant les groupes sociaux, avec de la frisure de carton en enrichissement, de l’eau gélifiée et de l’aliment, et dans des conditions environnementales contrôlées. Pour les procédures comportementales, les animaux sont hébergés dans des cages ventilées enrichies avec de la frisure de carton. La température est de 22°C +/-2°. Le cycle jour/nuit est de 12h, changeant à 7h/19h. Une surveillance attentive et quotidienne des animaux est réalisée. Des points limites strictes sont définis pour chacune des procédures. Les administrations (injection intrapéritonéale ou gavage oral à l’aide de sondes souples) seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté.
Choix des espèces
Afin de modéliser au mieux le syndrome de Dravet, qui est à plus de 80% dû à une mutation génétique, l’espèce souris dont la modification génétique du gène Scn1a déjà publié est la plus pertinente. Ce modèle récapitule le phénotype Dravet : crises fébriles, crises spontanées, SUDEP et comorbidités psychiatriques. Pour la procédure 1, les animaux seront élevés de la naissance à leur expédition à partir de 8 semaines d’âge. Pour les autres procédures (2-3), des animaux adultes (à partir de 8 semaines d’âge) seront réceptionnées et utilisés. A cet âge, la survie n’est plus diminuée (stabilisation de la mortalité) et les comorbidités psychiatriques au syndrome de Dravet sont bien retrouvées chez l’adulte.
Utilisation de matériaux poreux comme vecteur de gaz et autres stratégies thérapeutiques pour les tumeurs hypoxiques.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Rats : 504
Pour tester des nanoparticules poreuses censées porter des gaz et des médicaments jusqu'aux tumeurs, 1 692 souris et 504 rats sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous mis à mort pour prélever leurs organes. Une partie reçoit une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis trois séances d'irradiation de 4 Gy et des injections intraveineuses trois jours de suite. Le porteur s'attend à une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux porteurs d'une tumeur cérébrale, ainsi qu'à une dégradation de l'état général jusqu'à une semaine après l'irradiation du crâne, avec pelades sur la tête et sécrétions au museau. Il justifie le projet par le "besoin d'améliorer" des thérapies dont il constate le manque d'efficacité, et présente le nombre annoncé comme un maximum susceptible d'être réduit si les seuils statistiques sont atteints plus tôt.
Objectifs
Ce projet a pour but de caractériser l’intérêt de nanoparticules (NPs) poreuses comme vecteur de thérapies (gazeuses et médicamenteuses) pour les tumeurs hypoxiques, décrites dans la littérature comme résistantes aux traitements actuels. En effet, un meilleur ciblage de la tumeur par ces NPs permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements actuels tels que la radiothérapie (RT), les chimiothérapies (CT) ou encore les immunothérapies (IT). Devant le manque d’efficacité des thérapies standards, ce projet se justifie par le besoin d’améliorer, par des approches innovantes, les thérapies actuelles.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles en utilisant comme vecteur des NPs qui ont montré, par nos études précédentes, leur capacité à s’accumuler dans la tumeur tout en préservant le tissu sain environnant .
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal. - Injection intraveineuse de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de cellules tumorales (animal vigile) : 1 fois à l’injection des cellules ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des NPs (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Injection intraveineuse des CT ou IT (animal vigile) : 3 fois sur 3 jours consécutifs ; 5 minutes maximum par animal. - Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal. - Injection sous-cutanée de buprénorphine (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux et 3 fois pour les animaux avec des tumeurs cérébrales qui auront deux injections supplémentaires en péri-opératoire ; 2 minutes maximum par animal.
Impact sur les animaux
Parmi les procédures expérimentales, les injections intraveineuses (cellules tumorales, NP, CT ou IT) ou les injections sous-cutanées effectuées sur un animal vigile peuvent causer un stress à l'animal lors de l'intervention, ce qui peut être considéré comme une nuisance légère. De plus, au regard de l’expérience du laboratoire concernant les différentes procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir des effets indésirable modérés avec une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de tumeur cérébrale. Également, sur ces modèles de tumeur cérébrale, nous nous attendons à une fatigue et une dégradation de l’état général (porphyrine autour des yeux et de la bouche, sécrétions au niveau du museau, pelades sur la tête) induit par l'irradiation cérébrale jusqu’à une semaine après l’irradiation.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la cellule tumorale. L’utilisation de modèles in vivo complets permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et à la réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir les meilleures NPs (taille, aspect de toxicité, oxygénation) mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive et des modèles de tumeur sous-cutanés se conforment à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Toutefois, dans tous les protocoles d’imagerie, d’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, non sans risque pour l’animal. Afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques puissants, et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculés est un nombre maximal. En effet, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.
Raffinement
A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage et 3 à 2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation de 7 jours minimum avant toutes expérimentations et bénéficierons également d’enrichissement (roue d’activité, tunnel en carton, stimulation sensorielle par différents objets). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés et par le choix de points limites cohérents. Pour les animaux immunodéprimé, la procédure est identique à l’exception de l’hébergement. En effet, les animaux sont placés dans des cages ventilées individuellement par des portoirs spécifiques, ces deniers étant eux-mêmes dans une zone spécifique et dédiée à la manipulation des animaux immunodéprimés pour la recherche en cancérologie.
Choix des espèces
La souris et le rat immunodéprimés sont des espèces de choix pour évaluer l’évolution du volume tumoral dans le temps dès lors que les cellules tumorales utilisées sont d’origine humaine. Notre expertise des différents modèles de tumeurs cérébrales, nous a permis d’établir que suivant le type cellulaire, nous obtenons des tumeurs plus ou moins hypoxiques et plus ou moins vascularisés (Corroyer-Dulmont et al., Biol Chem. 2013). Ces deux composantes, influençant la croissance tumorale et l’efficacité des traitements actuels, il est nécessaire de travailler avec ces différents modèles in vivo, afin de se rapprocher de la situation clinique. Lorsque les cellules tumorales (cérébrales et pulmonaires) sont d’origine murine (issues de souris C57Bl/6) alors nous pouvons utiliser des animaux immuno-compétents de même souche (souris C57Bl/6) dans ce projet afin de prendre en compte l’ensemble du système immunitaire et le contexte inflammatoire du micro-environnement étudié et connus pour participer à la réponse aux traitements. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, mâles et femelles, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.
Hébergement, reproduction et génotypage de souris génétiquement modifiées pour des études immunohistochimiques et électrophysiologiques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 111 souris vont être utilisées dans un projet d'élevage et de génotypage de lignées génétiquement modifiées, 1 543 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 568 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Le seul geste pratiqué sur l'animal vivant est le prélèvement d'un millimètre de queue pour le génotypage, dont le porteur reconnaît qu'il génère stress, douleur ponctuelle et saignement. Les souris dont le génotype ne convient pas à la gestion de l'élevage sont mises à mort, les reproducteurs sélectionnés étant maintenus en vie pour produire les portées suivantes. Le porteur indique qu'une des lignées manifeste des symptômes nuisant à sa santé et prévoit un génotypage avant la troisième semaine pour repérer les mutants avant l'apparition de la maladie.
Objectifs
L'équipe étudie le système nerveux moteur situé dans la moelle épinière impliqué dans la locomotion. Ce réseau de neurones, pour qu'il fonctionne correctement, doit être régulé finement. L'un des projets de l'équipe est d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau de ces neurones qui seraient responsables de l'activation de ce réseau innervant les muscles locomoteurs. Des protéines particulières présentes en grande quantité à la surface des neurones, sont principalement ciblées. Ainsi, l'élevage de ces lignées de souris chez qui certaines protéines sont altérées ou spécifiques d'un neurone identifié, est primordial pour caractériser et spécifier leur activité générée dans les neurones du système nerveux.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des animaux de ces lignées faite de façon précoce nous permet d'optimiser la gestion de l'élevage mais aussi de contrôler et maîtriser la non apparition du phénotype dommageable chez les souris susceptibles de le développer. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour mieux comprendre la contribution de protéines d'intérêt dans l'activité du réseau locomoteur spécifiquement dans des neurones identifiés. De plus, une inactivation de la protéine ciblée chez ces animaux particuliers, nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie ou d'autres maladies neurodégénératives. La recherche qui découle de ces lignées de souris profitera à l'ensemble de la communauté scientifique en lien avec ce domaine de recherche.
Procédures
La plupart des interventions sur ces animaux se fera post-mortem. La seule intervention que ces animaux subissent de leur vivant, est le prélèment de tissu à l'extrémité de la queue (segment de 1mm) pour le génotypage grâce à une paire de ciseaux adaptée, notamment chez le jeune qui n'a pas de poils. Il n'est prévu qu'une seule intervention par animal d'une durée de 1 minute. Une fois que le génotypage sera mis au point sur le follicule pileux, un génotypage plus tardif pourra être effectué si celui ci est compatible avec la technique expérimentale utilisée.
Impact sur les animaux
Biopsie de l'extrémité de la queue qui peut engendrer un stress, une douleur ponctuelle et un saignement. Les femelles reproductrices seront soumises à un stress accru lors de la dernière semaine de gestation du fait de leur isolement comme pour les mâles reproducteurs séparés de la femelle.
Devenir
Mise à mort des animaux de génotype non utile pour la gestion de l'élevage en gardant en vie les animaux reproducteurs sélectionnés en fonction de leur génotype. Utilisation des animaux sélectionnés pour les expérimentations pour l'objectif scientifique.
Remplacement
Nos évaluations et caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des neurones connectés les uns aux autres formant ainsi un réseau complexe. Pour cela, nous utilisons des tissus prélevés sur souris d'élevage. En effet, il n'est pas possible de reproduire sur un modèle bioinformatique ou en culture cellulaire la complexité de ces connexions ou la particularité d'un neurone spécialisé, même si de nombreuses études préliminaires in vitro ont permis de diminuer le nombre d'animaux nécessaires et/ou à retarder leur utilisation.
Réduction
Les techniques de prédilection employées dans cette étude sont de l'ordre de 4. Elles nous permettent d'utiliser un même animal pour plusieurs mesures et différentes conditions d'exposition. Le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre une significativité dans nos résultats est ainsi limité à son strict minimum. En effet, grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques, à chaque question scientifique posée, nous estimons un nombre d'individu minimal suffisant pour atteindre une significativité. Ainsi par exemple, pour tester l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur l'activité du neurone, nous choisissons deux techniques spécifiques qui nécessitent chacune, 8 animaux par condition. En revanche, pour toutes les questions relatives à l'efficacité d'une molécule médicamenteuse sur la quantité de protéine présente à la surface de neurones ou sur sa manière dont elle est exprimée à l'intérieur d'un tissu en fonction des traitements employés, cela nécessite l'emploi de 2 autres techniques qui demandent entre 4 et 12 animaux par condition. Sur l'ensemble de la saisine, il y aura 2111 souris qui seront génotypées. Plus de la moitié sera utilisée pour leur génotype d'intérêt en lien avec les questionnements scientifiques du projet de recherche, tandis que l'autre partie sera utile pour le maintien de la lignée. Dans un moyen long terme, nous estimons que la mise au point du génotypage sur follicule pileux nous permettra le maintien de la lignée sans geste invasif et sans phénotype dommageable, puisque l'on privilégiera les accouplements sans risque. Seul le prélèvement d'un peu de tissu de l'extrémité de la queue sera toujours effectué sur les souriceaux provenant d'un accouplement à risque dédié à une série expérimentale spécifique.
Raffinement
Après sevrage, les animaux seront hébergés entre 3 et 5 par cage en fonction de leur âge, de leur sexe et de leur poids. Les cages seront enrichies régulièrement de rondin de bois, de tunnel, de matériel de nidification. Concernant les accouplements à risque, une observation renforcée sera mise en place par l'expérimentateur et les zootechniciens pour cette lignée qui manifeste des symptômes nuisant à la bonne santé de l'animal uniquement chez les souris dont la mutation touche les gènes impliqués. Un génotypage systématique des animaux sera fait avant la 3eme semaine post-natale afin d'identifier les mutants le plus tôt possible avant l'apparition de symptômes de la pathologie. Un point d'arrêt sera de toute façon établi en cas d'apparition précoce des symptômes. La biopsie sera effectuée par un personnel qualifié qui maitrise le geste avec agilité et rapidité permettant ainsi de limiter le stress, l'inconfort et la douleur chez l'animal.
Choix des espèces
Les lignées de souris seront utilisées essentiellement jusqu'à la 2eme semaine post-natale en expérimentation pour l'enregistrement de l'activité des neurones ou la quantification de protéines d'intérêt à la surface des neurones et leur localisation dans le tissu nerveux. Ce stade précoce est essentiel pour la compréhension de la contribution des protéines ciblées dans la mise en place de l'activité neuronale. Une inactivation provoquée d'une de ces protéines chez des animaux génétiquement modifiés nous permet d'explorer des mécanismes qui lui sont spécifiques et ainsi mettre en lumière des concepts pouvant être communs à certaines pathologies comme la lésion de la moelle épinière, l'épilepsie, ou d'autres maladies neurodégénératives.
Hydrogel de régénération de la pulpe dentaire : relargage local et systémique d’une molécule modèle chez la souris ; étude pilote
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue pour prélever les tissus autour de l'implant, 190 souris subissent une chirurgie sous la peau du dos puis neuf séances d'imagerie sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objet du projet reste étroit : mesurer la diffusion d'une molécule fluorescente hors d'un hydrogel implanté, dans une étude que le porteur qualifie lui-même de pilote. Il indique que l'incision dorsale et l'implantation peuvent provoquer douleurs et démangeaisons, et que les expositions répétées aux rayons X pourraient induire une légère perte de poids. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" ne peut remplacer le recours aux souris, tout en présentant cette étape comme un préalable à des modèles "plus compliqués" avant toute application dentaire humaine.
Objectifs
A l’intérieur d’une dent se trouve un tissu nommé pulpe dentaire. A la base de la dent se trouve un orifice. C’est à travers cet orifice que les vaisseaux sanguins et les nerfs de la pulpe dentaire passent pour rejoindre les systèmes nerveux et sanguins dits systémiques. Lors d’une infection carieuse non traitée, la pulpe dentaire est attaquée, puis nécrose. On observe l’apparition d’un abcès à la base de la dent suite au passage de l’infection à travers l’apex pouvant conduire à des infections systémiques graves. Le traitement actuel consiste à remplacer la pulpe par un dérivé inerte de caoutchouc, et présente des limites en augmentant le risque de fracture de la dent ou de réinfection. Au risque de réinfection s’ajoute un risque de sélection de souches bactériennes résistantes ou multirésistantes. Des stratégies visant à régénérer la pulpe dentaire à partir d’hydrogels sont donc actuellement envisagées. Pour ce faire, il est nécessaire de concevoir des hydrogels bioactifs, associés à des molécules aux propriétés antibactériennes, capables de désinfecter à la fois l’intérieur de la dent et l'orifice. L’efficacité des hydrogels repose donc sur l’évaluation et le contrôle du relargage de l’agent antibactérien à travers l'orifice. L’objectif de ce projet est d’évaluer les variations de relargage à l'orifice et de maintien dans l’hydrogel d’une molécule fluorescente lorsque des éléments anatomiques et physicochimiques sont modifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux connaître les cinétiques de relargage à partir d’hydrogels. Ces cinétiques sont très peu documentées, et plus particlièrement dans le cadre d’hydrogels pour la dent. L’objectif est de mieux comprendre et appréhender le comportement des hydrogels “in vivo”, afin de développer notre maitrise des cinétiques de relargage avant de proposer des études plus complexes sur la dent de souris à partir d’hydrogels formulés en conséquence. A long terme, ces travaux permettront la conception d’hydrogels antibactériens pour l'intérieur de la dent humaine. Il sera possible d’anticiper la libération des molécules antibiotiques, et donc de fournir aux patients un produit connu, maitrisé et par conséquent sécurisé. Ces produits permettront la désinfection à la fois de l'orifice et de l'interieur de la dent, et par conséquent la réduction du risque de d'infection du corps entier associé aux infections non traitées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une opération de chirurgie sous cutanée sous anesthésie, puis à 9 procédures d'imagerie sous anesthésie également (imagerie en fluorescence ou en rayons X).
Impact sur les animaux
De précédentes études d’implantation d’hydrogel et de nanoparticules en sous-cutanée ne montrent pas signe de souffrance significative de l’animal. Toutefois, une attention particulière sera apportée concernant l’implantation des nanoparticules d’or. Il existe un risque de douleurs liées à l’incision dans le dos et à l’implantation d’un objet de grade chirurgical en sous cutanée. Les animaux pourraient souffrir de démangeaisons et douleurs dans le dos au niveau du lieu d’implantation. Par ailleurs, les animaux pourraient également souffrir de stress en raison de leur manipulation notamment pour l’imagerie quotidienne . Enfin, l’analyse au rayons X provoque une exposition à de faibles doses de rayons ionisants. Il n'y a pas d’effets secondaires dans la littérature. Cependant, ces expositions répétées pourraient induire une perte légère de poids et des démangeaisons pour lesquelles nous serons vigilants.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort, afin de rendre possible le prélevement de tissus sur environ 5mm autour de l'apex du modèle endodontique, et l'analyse des signes d'inflammation liés aux hydrogels.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l'utilisation des animaux. Des tests “in vitro” ont au préalable été réalisés afin de limiter le nombre de conditions expérimentales (concentration en hydrogel, diamètres des apex…). Ce projet est une étape indispensable pour mimer un environnement associé à un système physiologique avant d’envisager des modèles plus compliqués à mettre en oeuvre et un passage vers la clinique. La souris, par sa petite taille, est un modèle adapté à l’imagerie corps entier, nécessaire ici pour suivre et quantifier la libération des molécules à partir des hydrogels.
Réduction
Le nombre d’animaux maximum nécessaire au total sur toutes procédures ,est de 190 sur 5 ans. Ce nombre, validé par une statisticienne , a été déterminé dans le but d’utiliser un nombre minimum d'animaux sans compromettre l’analyse statistique des résultats. L’utilisation de la tomographie par fluorescence permet de suivre la biodistribution sans mise à mort des animaux, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à cette étude.
Raffinement
Toutes les analyses d’imagerie ont lieu sous anesthésie afin de limiter l’angoisse des animaux, tout en conservant un temps de réveil court après endormissement. Lors de la chirurgie sous cutanée, les animaux seront anesthésiés et un traitement analgésique sera mis en place. L'apparence physique, le comportement (socialisation, nettoyage) seront observés 7/7 jours. et leur poids sera mesuré 2/7 jours.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris permet, par sa petite taille, l’imagerie en corps entier. Par ailleurs, de précédent travaux mené sur la souris donne un meilleur recul et de plus grande chances de répétabilité. Les souris seront âgés de 8 semaines à leur réception. Le début des manipulations aura lieu lorsqu’elles auront 9 semaines (après une semaine d’acclimatation) et la mise à mort aura lieu à 10 semaines. A ce stade (jeune adulte, entre et 8 et 10 semaines) , la croissance est terminée, les souris sont pleinement formées, et le vieillissement n’a pas commencé. Cela permet de travailler avec un minimum d’interférences liées à la croissance physiologique de la souris, et donc de réduire la variabilité statistique. Plus cette variabilité est basse, moins le nombre d’animaux nécessaires est grand.