Souris

Toutes tuées à l'issue pour analyse du cerveau et des méninges, 764 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Les deux veines jugulaires leur sont bouchées par chirurgie, un tube est posé dans le crâne pour des injections quotidiennes pendant six jours, et certaines sont maintenues seules en cage douze à quatorze jours avec ce tube en place. Le porteur ajoute un régime gras de quatre à dix semaines pour les rendre obèses, des IRM, des mesures de pression intracrânienne et des tests comportementaux dont il ne précise pas la nature, et reconnaît que l'isolement avec cathéter peut provoquer souffrance et troubles du comportement. Sur le remplacement, il se borne à quelques phrases générales concluant que le recours aux animaux est "inévitable", sans examiner les modèles disponibles.

Objectifs

Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les enveloppes entourant le cerveau semblent impliqués dans beaucoup de maladies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques ne sont pas présents dans cerveau mais autour, dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des grosses veines du cerveau appelés sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité entre les veines et les lymphatiques jouait un rôle clé dans les défenses immunitaires du cerveau. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération des veines cérébrales influera sur la fonction des vaisseaux lymphatiques, et inversement, 2) La mauvaise circulation de ces vaisseaux chez l’Homme pourrait être impliquée dans une maladie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette maladie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une accumulation d’eau dans le cerveau à des rétrécissements (sténoses) des veines. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette maladie, et d’explorer également pourquoi ces malades ont des problèmes de mémoire qui pourraient être liées à une inflammation du cerveau. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par radiologie du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Créer un modèle animal d’HTIC-I chez la souris 2) Étudier comment une atteinte du flux veineux peut affecter le réseau lymphatique 3) Étudier si en augmentant ou diminuant les fonctions lymphatiques, on modifie les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la mémoire de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de *764* souris incluant 25 souris transgéniques.

Bénéfices attendus

D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure de la vision pouvant rendre les patients aveugles. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont agressifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires importants. De nouveaux traitements, plus efficaces et moins invasifs, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, une étape nécessaire de ce développement est de comprendre les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer les symptômes de ces patients. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale qui semble parfaitement illustrer une dysfonction initiale des systèmes veineux et lymphatique cérébraux. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.

Procédures

Après avoir administré des médicaments pour soulager la douleur et s'être assuré que les souris sont bien hydratées, les procédures suivantes sont effectuées dans des conditions stériles de chirurgie. Un protocole de gestion de la douleur est mis en place après chaque opération. Voici ce qui est réalisé : Chirurgie pour boucher les veines jugulaires des deux côtés du cou (environ 1 heure, avec une préparation de 30 minutes). Mesure de la pression à l'intérieur du crâne (environ 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Injection de produits biologiques dans le liquide cérébral (environ 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Installation d'un petit tuyau à l'intérieur du crâne pour injecter des médicaments (environ 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Installation et injection de substances fluorescentes à travers ce tube (environ 1 heure et 30 minutes, avec une préparation de 30 minutes) IRM du cerveau (environ 40 minutes, avec une préparation de 30 minutes). Mesure du flux sanguin dans le cerveau à l'aide de Doppler (environ 1 heure, avec une préparation de 30 minutes). Les autres procédures ne nécessitent pas de médicaments pour la douleur ou d'anesthésie et incluent : Des tests comportementaux étalés sur deux jours et demi. Un régime alimentaire riche en graisses pour rendre l'animal obèse pendant 4 à 10 semaines. L'isolement de l'animal pendant 12 à 14 jours avec un petit tube restant à l'intérieur du crâne. Une injection quotidienne à travers ce tube pendant 6 jours. Observation de l'activité dans des cages spéciales pendant 31 jours. Observation de l'activité dans des cages équipées de roues d'exercice, avec l'isolement de l'animal pendant 4 périodes de 3 jours. Une injection dans une veine pour introduire des traceurs dans le sang (environ 10 minutes).

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous devons considérer les éventuelles conséquences négatives qui peuvent être regroupées en deux catégories : celles liées aux interventions chirurgicales effectuées sous anesthésie générale et celles sans anesthésie. Les effets indésirables des chirurgies sous anesthésie générale incluent les risques associés à l'anesthésie tels que les accidents pendant l'administration de l'anesthésie (comme des erreurs chirurgicales, des saignements ou une mauvaise réaction à l'anesthésie pouvant entraîner la mort de l'animal ou l'arrêt de la chirurgie), ainsi que les effets indésirables post-opératoires tels que la douleur, les infections au niveau de la cicatrice ou du site opératoire, le stress, une réduction de l'activité et des comportements anormaux. Les procédures effectuées sans anesthésie sont moins graves mais peuvent causer de l'inconfort ou du stress chez l'animal, ce qui doit être surveillé et pris en compte. Par exemple, les souris obèses peuvent avoir des difficultés à se déplacer. De plus, l'isolement des animaux portant un cathéter intracrânien peut provoquer de la souffrance et des perturbations comportementales, qui doivent être détectées et traitées précocement et préventivement en enrichissant leur environnement. L'injection intraveineuse peut entraîner des douleurs au site d'injection, des ecchymoses ou des saignements. Pour atténuer ces douleurs, des médicaments antalgiques seront systématiquement administrés avant l'intervention.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.

Remplacement

Pour notre projet, il n'y a pas d'autre choix que d'utiliser des animaux pour atteindre nos objectifs. Lorsque nous étudions comment les maladies affectent le corps ou comment fonctionnent certains processus biologiques, il est souvent nécessaire d'utiliser des modèles animaux. Ces modèles nous aident à comprendre comment le corps réagit dans différentes situations, ce qui est essentiel pour faire progresser la recherche médicale et scientifique. Bien sûr, nous cherchons toujours des alternatives quand c'est possible, mais dans certains cas, l'utilisation d'animaux est inévitable pour obtenir des informations précieuses sur notre santé et sur le fonctionnement de notre corps.

Réduction

Pour mener à bien notre étude, nous aurons besoin d'un certain nombre de souris pour différentes analyses. Tout d'abord, pour les analyses après le décès des souris, où nous injecterons préalablement des substances pour examiner certains aspects, nous aurons besoin de 710 souris. Ensuite, pour des analyses cliniques par imagerie ou tests comportementaux, nous aurons besoin de 54 souris supplémentaires. Pour minimiser les inconvénients pour les souris, nous allons combiner les études post-mortem avec les études cliniques. Nous avons calculé le nombre optimal de souris par groupe pour chaque type d'analyse, en tenant compte des risques de perte pendant les procédures. Par exemple, pour les analyses cellulaires, nous aurons besoin d'au moins 18 souris par groupe en raison du faible nombre de cellules dans certaines parties du corps. De plus, pour valider nos résultats, nous devrons utiliser des souris génétiquement modifiées. Nous aurons besoin d'environ 25 de ces souris. Enfin, en considérant toutes les analyses prévues, y compris une nouvelle procédure pour évaluer le flux sanguin, nous aurons besoin d'un total de 764 souris pour atteindre nos objectifs de recherche. Toutes ces étapes sont essentielles pour obtenir des données précises et fiables afin de mieux comprendre certains processus biologiques et médicaux.

Raffinement

Lorsque les animaux arrivent, on leur laisse une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement. Pendant toute l'étude, les souris seront logées par groupes de trois dans des cages ventilées pour qu'elles puissent avoir une vie sociale enrichissante. Elles auront de la nourriture et de l'eau à disposition en permanence, ainsi que des matériaux pour se construire un nid douillet. Si une souris a des difficultés à se déplacer, par exemple juste après une opération, on adaptera son alimentation en rendant les croquettes plus faciles à manger et en lui fournissant une sorte de gelée hydratante. Chaque jour, on vérifiera les conditions de vie des souris et on surveillera leur santé de près. On pèsera leur poids deux fois par semaine après une opération. Après chaque intervention, on notera le temps passé en chirurgie et on observera de près les effets immédiats et à court terme. Pour s'assurer que les souris ne souffrent pas, on utilisera une grille de surveillance simple qui évalue différents aspects de leur bien-être. Si une souris montre des signes de douleur ou de détresse, on lui donnera des médicaments adaptés pour soulager sa souffrance. Avant toute opération, les souris recevront des médicaments pour éviter qu'elles ne souffrent trop. Si une procédure pourrait causer de la douleur, les souris seront endormies pour qu'elles ne ressentent rien. Enfin, les souris qui vivent seules auront une attention particulière et auront accès à des jouets et à d'autres éléments qui les divertiront. Tout est mis en place pour que les souris se sentent aussi bien que possible tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Notre objectif est de comprendre comment le système veineux et lymphatique se modifie et quelles sont les molécules impliquées dans ce processus. Pour cela, nous devons utiliser des modèles animaux, et la souris est le choix le plus adapté pour notre recherche. Des méthodes chirurgicales et de manipulation du système lymphatique ont déjà été mises au point avec succès sur des souris, ce qui nous permet de nous baser sur une solide expérience préexistante. Toutes nos expériences seront menées sur des souris adultes, une fois que leur système lymphatique aura atteint sa pleine maturité, environ huit semaines après leur naissance. Les injections dans le crâne et la mesure de la pression intracrânienne seront effectuées sur des souris jeunes adultes âgées de 2 mois à un an. À cet âge, le crâne est complètement développé et stable, ce qui garantit une précision chirurgicale lors des procédures stéréotaxiques.

Injectées de pristane puis irradiées, 2 300 souris reçoivent des hybridomes dans l'abdomen pour produire un liquide d'ascite, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit un gonflement de l'abdomen qui modifie le comportement et l'aspect de l'animal, et une mise à mort motivée par un prélèvement de fluides corporels d'un volume incompatible avec la survie. Il indique que les nouveaux produits utilisent des anticorps obtenus in vitro et qu'un projet vise le remplacement de 100 % des productions in vivo, tout en jugeant la production animale "indispensable à la santé publique". Les effectifs demandés sont passés de 25 000 par an en 2015 à 1 150 aujourd'hui.

Objectifs

La fabrication de test de diagnostics de maladies infectieuse nécessite un approvisionnement en anticorps monoclonaux. Ces anticorps monoclonaux sont le cœur de la qualité des tests, ce sont ces anticorps qui vont accrocher les antigènes et ainsi diagnostiquer la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la production de réactifs de diagnostic in vitro. Ces réactifs permettent de dépister des maladies infectieuses telles que, le sida, les hépatites, la toxoplasmose ou les méningites bactériennes. Ces pathologies mondiales touchent pour le sida 38.4 millions de personnes (avec 1.5 million de contaminations par an), pour les hépatites 325 millions de personnes (dont 1.3 million de décès par an et 1.7 million de nouvelles contaminations). Le CNREEA note qu'il n'est pas souhaitable que la production d'anticorps in vivo indispensable à la santé publique soit délocalisée dans des pays tiers où la règlementation en matière de protection animale est peu développée.

Procédures

Injection intra-péritonéale d'agent activateur de la réponse immunitaire (sous traitement analgésique) dure quelques secondes., délai d’attente et de surveillance 15J Irradiation à une dose modérée dure 6.5min, délai d’attente et de surveillance 7 à 15J. Injection intra-péritonéale d'hybridomes dure quelques secondes

Impact sur les animaux

Après les étapes de pristanisation et d'irradiation, l'animal peut être amorphe associé ou non à du poil hérissé pendant 24h maximum, puis récupère complètement. La multiplication des hybridomes dans le péritoine de la souris induit une production d’ascite qui engendre un gonflement de l’abdomen de l’animal qui induit des modifications du comportement et de l'aspect de l'animal.

Devenir

Sacrifice des animaux pour réaliser des prélèvements de fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal

Remplacement

Dans les nouveaux produits et les nouvelles versions de produit, les anticorps utilisés sont fabriqués avec des anticorps produits uniquement avec un process « in-vitro ». La mise au point des conditions de production in vitro est longue (plusieurs mois) et les rendements sont souvent inférieurs à ceux in vivo. Les développements nécessaires pour chaque production les rendent moins efficaces en termes de mise au point et ils ne sont guère compatibles avec certaines applications comme les screening de molécules. L'utilisation d'animaux est rendue nécessaire en cas d'urgence sanitaire où la production in vitro ne peut être imposée. L'approche alternative doit être mis en œuvre en effet dès lors que la production in vitro a d'ores et déjà donné des résultats satisfaisants pour un antigène considéré dans les critères de performances définis dans la formulation du produit final, sachant qu'il peut y avoir des échecs de la production in vitro en termes de quantité ou qualité. Néanmoins, un projet est lancé pour un remplacement de 100% des productions d'anticorps monoclonaux "in -vivo" par des productions "In-vitro". Le but avoué est l'élimination des méthodologies In-vivo. Ce travail est suivi régulièrement et est partagé avec le ministère.

Réduction

Une politique stricte de la gestion des stocks est en vigueur afin d'utiliser le matériel issu de ces animaux le plus judicieusement possible (pas de surstock) et d'éviter tout gaspillage. Une baisse significative du nombre d’animaux peut être notée car nous sommes passé de 25000 animaux/an demandé en 2015 à 7000 animaux/an demandé en 2021 pour être aujourd’hui à 1150 animaux /an soit une baisse de plus de 95% en quasiment 8 années

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application dans le plus grand respect de la recommandation de CNREEA (parue le 28 juin 2017) sur la production d’anticorps par liquide d’ascite chez la souris, associé à la mise au point de procédures rigoureuses à chaque étape du projet, à leur réalisation par du personnel formé et habilité à la surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux. A chaque étape les animaux sont manipulés par du personnel habilité et sensibilisé au bien-être de l'animal. Le suivi des points limite est réalisés au travers de la mise en place de grilles d'évaluations de la douleur à chaque étape du protocole permet aux techniciens d'être le plus objectif possible sur l'attitude à adopter face à différents symptômes que l'animal pourrait développer.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal de petite taille et facile à manipuler. Elle possède une durée de vie courte, ce qui permet d'avoir des études de courtes durées et l'élaboration d'hypothèses sur des modèles plus complexes dont l'Homme. Le modèle souris est utilisé du fait de l'origine des hybridomes (murine). La souche de souris Balb/C est appropriée car elle se révèle excellente pour la production ultérieure in vivo d’anticorps à partir de ces hybridomes. La souris est âgée de 8 semaines en début de protocole. La souris doit être adulte mais pas top âgé afin de ne pas « polluer « la production d’Anticorps avec les cellules propres à l’animal.

Rendues septiques par l'injection dans l'abdomen d'un mélange de selles, 2 464 souris subissent cinq jours de réanimation puis des tests d'activité physique, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique que les souris septiques présentent des signes de douleur modérée à sévère, et utilise un score clinique validé comme "substitut de mortalité", ce qui revient à fixer des points limites en deçà de la mort. L'objectif déclaré est de démontrer l'implication d'un récepteur dans la faiblesse musculaire qui persiste après un sepsis, en suivant les animaux jusqu'à trois mois. Le porteur mentionne des organoïdes musculaires issus de biopsies de patients, qu'il juge insuffisants à ce jour pour reproduire le vieillissement post-septique.

Objectifs

Les objectifs scientifiques du projet sont de démontrer l'implication du récepteur aux Advanced Glycation End Product (RAGE) dans le vieillissement du muscle après une infection bactérienne grave (sepsis), en utilisant des souris n'ayant pas ce récepteur ou en utilisant des médicaments bloquant ce récepteur. A terme, l'objectif est de prévenir le vieillissement musculaire provoqué par une infection bactérienne.

Bénéfices attendus

Les patients ayant séjourné en réanimation pour une infection bactérienne grave, appelée sepsis, présentent des séquelles persistantes dans le temps, parmi lesquelles une faiblesse de la force musculaire comme observée au cours du vieillissement. Les mécanismes sous-jacents sont mal compris et il n’existe aucun médicament permettant d’améliorer ces atteintes musculaires. Notre modèle animal va reproduire l'infection bactérienne et sa prise en sa prise en charge clinique afin de se rapprocher le plus possible de la maladie humaine. Nos premières données ont pu valider le modèle utilisé puisqu’il reproduit la faiblesse musculaire et une incapacité des muscles à produire de l'énergie jusqu’à 10 jours après le début de la maladie. Cette nouvelle étude va nous permettre de déterminer si ces altérations perdurent dans le temps (jusque 3 mois après l'infection chez la souris), et d’en comprendre les mécanismes sous-jacents. Les données chez l’Homme indiquent l’importance du RAGE, un récepteur des cellules connu pour jouer un rôle dans le vieillissement, et des voies associées dans cette atteinte induite par l'infection bactérienne (sepsis). Nous allons explorer plus en détail comment ce récepteur participe au développement de la maladie en utilisant des souris n’exprimant pas ce récepteur ou des souris sauvages qui seront injectées par des inhibiteurs pharmacologiques de RAGE. A terme, nous espérons montrer que l'inhibition du RAGE empêche la perte de force musculaire provoquée par l'infection bactérienne chez la souris, pour ensuite initier une étude chez l’Homme.

Procédures

Les animaux subiront des injections d’un mélange de selles pour induire le sepsis sous forme d’une injection intrapéritonéale puis une période de réanimation pendant 5 jours. Pour certaines interventions, une anesthésie sera nécessaire pour l’analyse en IRM. Les animaux seront également soumis à des tests d’activité physique. Le niveau d’activité spontanée des animaux et leur respiration seront aussi analysés. Les animaux qui seront injectés pour des molécules pharmacologiques subiront un prélèvement sanguin pour analyse.

Impact sur les animaux

Les souris sont soumises à différentes injections et peuvent développer des douleurs légères liées à ces piqures. Les souris septiques présentent des signes de douleur modérée à sévère. Une injection d’analgésie sera mise en place pour palier à ces douleurs. Des pertes de poids et d'activité modérées sont attendues.

Devenir

L’ensemble des animaux prévus sera utilisé pour le projet. Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du projet afin de collecter les tissus sans avoir à réserver un lot de souris à cette fin. Cela permet de réduire le nombre d'animaux et de les réutiliser.

Remplacement

Nous utilisons des approches complémentaires à l’expérimentation animale de type organoïdes musculaires obtenus par des biopsies musculaires de patients contrôle et admis en réanimation pour un sepsis à l’hôpital. Néanmoins, cette nouvelle approche ne suffit pas à reproduire la complexité du vivant à l’heure actuelle, notamment à reproduire pleinement les caractéristiques du vieillissement accéléré post-septique. En effet, le sepsis est définie par une dysfonction d'organes menaçant le pronostic vital en raison d’une réponse immunitaire inappropriée de l’hôte. La pathogénie des dysfonctions d’organes implique des interactions complexes entre les organes du corps entier. Ainsi, à ce jour, il n’existe pas de modèles cellulaires satisfaisants pour étudier les mécanismes de vieillissement post-septique. Seuls les mammifères ont été validés comme des modèles expérimentaux de sepsis.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été effectués pour déterminer le nombre approprié d'animaux pour ce projet. Le nombre d’animaux est cohérent avec la littérature. Ce nombre d'animaux permettra de générer des données scientifiquement solides permettant de les analyser statistiquement. Chaque animal sera soumis à plusieurs tests plutôt que d'utiliser des animaux différents pour chaque test, afin d'obtenir un maximum de données de chaque animal. Cela permet de réduire le nombre total d'animaux nécessaires. En outre, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus (muscles squelettiques, cœur, foie, reins, poumons, vaisseaux, tissus adipeux) de tous les animaux afin de garantir la collecte d'un maximum d'informations sur chaque animal. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont également été revus et approuvés par un biostatisticien expérimenté.

Raffinement

Les souris seront manipulées de manière appropriée et les interactions avec elles seront fréquentes, ce qui réduira le niveau de stress pendant les procédures. Lorsque nécessaire, les animaux recevront une analgésie et/ou une sédation afin de minimiser la douleur et la souffrance. Afin de garantir le bien-être des animaux, ceux-ci seront surveillés et notés fréquemment à l'aide de score de gravité et de bien-être animal, afin de s'assurer qu'aucun animal ne dépasse un niveau de détresse strictement prédéterminé, et des mesures finales sans cruauté seront mises en œuvre immédiatement si un animal présente des effets indésirables inattendus. -Surveillance : poids, température, score de gravité de l’état général (Murine Sepsis Score, MMS) validé dans la littérature comme substitut de mortalité, bien-être biquotidienne initialement puis selon le niveau de gravité. -Analgésie : toutes les 12 heures tant que le score de gravité murin (MSS) est supérieur à 3/28. -Sédation par inhalation de gaz pour tout examen stressant de classe de gravité légère avec réveil (IRM musculaire). -Sédation et analgésie pour tout examen stressant et invasif de classe sans réveil : sédation par inhalation de gaz et analgésie par injection intrapéritonéale. Des doses supplémentaires d’analgésie seront injectées si nécessaire selon la durée de l’expérience. Les possibilités d’améliorer les procédures seront continuellement explorées (veille de la littérature) et mises en œuvre autant que possible. Le groupe de recherche maintiendra une interaction forte avec les animaliers et le bureau du bien-être animal, afin de permettre une surveillance optimale des animaux et rechercher un enrichissement de leur environnement.

Choix des espèces

L’injection dans le ventre d’un mélange de selles est validée chez les souris, les rats, les brebis et les cochons comme modèle d'infection bactérienne (sepsis) et reproduit en grande partie ce qui est retrouvé chez l'Homme. Ce modèle est publié dans la littérature. L’utilisation de la souris permet la réalisation de tests sur leur motricité et leur respiration en parallèle sur notre site. Cette espèce permet également d'avoir des animaux qui n'expriment plus le récepteur RAGE que l'on pense être impliqué dans la faiblesse musculaire provoquée par l'infection bactérienne. Enfin, il existe des scores cliniques pour évaluer la gravité et la douleur, ainsi que des protocoles d’analgésie bien validés dans ce modèle de souris. Enfin, des points limites ont été proposés dans ce modèle comme substituts de la mortalité. Le but de ce projet est d’étudier les mécanismes impliqués la faiblesse musculaire, qui ressemble à celle observée dans le vieillissement, provoquée par une infection bactérienne. Nous utiliserons des souris âgées de 17 à 30 semaines mâles et femelles. Cet âge correspond chez l'Homme à des individus âgés de 25 à 35 ans.

Pour entraîner des expérimentateurs aux gestes chirurgicaux d'un modèle d'AVC, 240 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Chacune subit trois chirurgies, dont l'induction de l'ischémie cérébrale de quarante minutes sans anesthésie générale, sous simple anesthésie locale et analgésie, précédée de quatre jours d'habituation à la chirurgie éveillée. Le porteur attend un stress lié à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des douleurs post-opératoires, des pertes de poids et des déficits fonctionnels, et signale des arrachements de prothèse crânienne. Il affirme que les techniques de substitution ne permettent pas d'acquérir ces gestes, et annonce que les données produites pendant l'apprentissage pourront servir de résultats préliminaires au projet suivant.

Objectifs

L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Chaque année environ 17 millions de personnes dans le monde connaitront un épisode d’AVC pouvant entrainer des séquelles plus ou moins sévères voir la mort de l’individu. Actuellement, la prise en charge des patients repose sur l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) recombinant (dégradation du caillot sanguin) associée ou non à la thrombectomie (intervention mécanique). Toutefois, seule une faible proportion des patients (moins de 10%) y sont éligibles. L’AVC est donc un problème de santé publique et nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin d’élargir la prise en charge des patients. Pour cela, un travail doit être réalisé afin de se placer dans les conditions les plus proches de la clinique humaine et permettre ainsi la transposition des résultats obtenus en laboratoire aux phases cliniques. Dans cette volonté d’adopter une démarche translationnelle dans les projets de recherche, un modèle davantage en adéquation avec la clinique doit être mis en place. C’est ce qui a été fait précédemment au laboratoire via la mise en place d’un modèle murin d’AVC ischémique chez l’animal vigile permettant d’exclure tout impact de l’anesthésie sur les évènements associés à cette pathologie. En effet, les agents anesthésiants peuvent modifier le fonctionnement cérébral et notamment au niveau de la dynamique du réseau vasculaire ce qui peut interférer avec le décours de l’AVC mais également biaiser les résultats obtenus quant à l’efficacité de certaines molécules. C’est pourquoi cette formation a pour but le bon apprentissage des gestes techniques et chirurgicaux permettant la mise en place du modèle AVC chez l’animal éveillé. Cette formation pratique aura pour résultat d’enrichir les projets via l’utilisation d’un modèle animal d’AVC sans biais liés à l’anesthésie, de réduire le nombre d'animaux des groupes expérimentaux associés aux projets futurs grâce à une meilleure maitrise et reproductibilité des gestes chirurgicaux des expérimentateurs ainsi qu'une meilleure prise en charge et suivi du bien-être animal .

Bénéfices attendus

Le bénéfice de l’apprentissage de ce modèle d’ischémie cérébrale chez l’animal vigile permettra de compléter les projets et/ou modifier progressivement les pratiques expérimentales par l’utilisation d’animaux non anesthésiés permettant d’être au plus proche des situations rencontrées en clinique humaine. Ceci a pour but de veiller à la reproductibilité du modèle et à la fiabilité des résultats qui pourront être obtenus dans les différentes études précliniques. Lors de l’utilisation de ce modèle, la bonne acquisition des gestes techniques et chirurgicaux permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisé dans les projets scientifiques futurs et d’améliorer la prise en charge et le bien-être des animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis a 3 chirurgies : Une chirurgie de pose de prothèse crânienne sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 20 minutes. Une chirurgie permettant une pose de cathéter et une préparation à l'induction de l'ischémie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 45 minutes. Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous couverture analgésique et sous anesthésie locale d’une durée de 40 minutes. A 3 protocoles comportementaux : Un protocole d'habituation à la chirurgie éveillée pendant 4 jours consécutifs, avec des cessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h15 au total. Un protocole de récupération fonctionnelle 24 heures post-AVC avec des sessions durant moins de 5 minutes par souris au total. A 3 protocoles d'imagerie vigile : 4 acquisitions par échographie ultrasonore, où chaque acquisition dure 5 minutes (avant AVC, post-AVC, 1 heure post-AVC et 24 heures post-AVC). Une acquisition à l'IRM de 15 minutes 24 heures après l’AVC.

Impact sur les animaux

Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entrainement. Le stress de l'expérimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance stricte pallient également les nuisances attendues sur les animaux . Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux lors de la procédure seraient : - un stress lors des premières sessions d'habituation, - des douleurs postopératoires après la pose de prothèse, - une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC, - des douleurs post-opératoires après la préparation à l'induction de l'ischémie, un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC. Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement dans le cas où une personne compétente atteste de l’état de bien-être de l’animal suite à chaque étape de la procédure.

Devenir

Tous les animaux utilisés (240) pour les procédures suivantes : un type de modèle selon l'approche pour induire l'ischémie (procédure 1 ou 2), l’évaluation comportementale et les procédures d'imagerie (IRM et échographie à ultrasons) puis seront mis à mort. L'ensemble des animaux suivent une procédure sévère. Il n'est donc pas possible de les réutiliser ou les replacer suite à la procédure.

Remplacement

Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal pour les procédures expérimentales enseignées. En effet, des méthodes expérimentales excluant l’emploi d’animaux vivants ne peuvent être utilisées dans ce cas en remplacement car les techniques de substitution d’apprentissage de chirurgies actuelles ne permettent pas d’acquérir les gestes techniques. Cet apprentissage concerne les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre d’étude sur l’AVC et les connaissances acquises notamment dans la réalisation de procédure chez l’animal éveillé rendent l’emploi de la souris particulièrement intéressantes pour les études portant sur l’AVC.

Réduction

Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur l’expertise d’acquisition des gestes techniques et les données d'études antérieures basées sur l’emploi du modèle d’AVC ischémique chez l’animal éveillé et ayant montré des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Un nombre minimal d’animaux sera utilisé dans le respect du principe de réduction tout en permettant la bonne acquisition des gestes techniques et chirurgicaux et la reproductibilité du modèle. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions durant les nombreuses étapes de la procédure (arrachements de prothèse, perte de poids, stress trop intense lors des premières habituations ...). En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience en prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 30 animaux par modèle et par souche pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM, échographie) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. De plus, sur la fin de la période d’apprentissage dans le cas où le modèle est réussi et reproductible, les données obtenues à partir des différents paramètres étudiés (taille de lésion, comportement, données sur le flux sanguins…) pourront être valorisées en étant inclues comme données préliminaires dans le projet ultérieur de l’expérimentateur apprenant.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Les cages seront enrichies (coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que des paillettes). Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux seront gardés en acclimatation avant expérimentation pendant 1 semaine. Puis ils seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Le protocole d'habituation progressif permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie éveillée. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie et sous anesthésie locale. Des bouchons d'oreilles sont prévus pour l'IRM éveillée, réduisant le bruit ambiant de 27 dB (selon les informations du fabricant). Après la chirurgie d'induction de l'AVC, une période de récupération de 3 jours est prévue : les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle placée au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les évènements précoces au cours de l’AVC ischémique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. De plus, un travail préliminaire de développement du modèle d’AVC ischémique chez l’animal éveillé au laboratoire a été mené chez le souris et permet d’avoir une expertise pour l’application de ce protocole chez la souris. La formation se déroulera sur la souches de souris classiquement utilisé en recherche et à partir de lquelle le modèle a été mis en place. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines (5 semaines lors du début du protocole, et 9 semaines arrivées à la fin du protocole). Le projet est réalisé avec des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.