Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 2024-01-18 00:00:00
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-996414)
1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l’œil et, pour 606 d’entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l’injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d’une semaine. Il conclut qu’aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux « grandes fonctions physiologiques des mammifères », et prévoit d’arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d’efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l’homme sont multiples par rapport à l’utilisation d’anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l’origine de la surproduction pathologique de VEGF. D’autre part, il est connu que l’utilisation de siARN permet de rallonger significativement l’efficacité d’un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d’espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu’ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu’à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d’animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La procédure d’administration IVT est considérée comme légère chez l’homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L’autre aspect susceptible d’affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu’un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d’avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d’avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d’utilisation, facile à reproduire et disposant d’une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d’éviter d’avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d’utilisation, facile à reproduire et disposant d’une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d’éviter d’avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.
2. Réduction
Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d’avantage le nombre d’animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d’injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d’animaux dans cette procédure fait l’hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.
3. Raffinement
Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n’entraine pas d’augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l’IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d’éviter toute souffrance pendant l’expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu’à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu’une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d’évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d’où le choix d’une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l’homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.