Oncologie

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées porteuses d'une tumeur humaine, elles reçoivent une chimiothérapie par gavage pendant quatorze jours puis de l'iode-131 radioactif, pour tester une combinaison anticancéreuse. Le porteur précise que l'étude est menée comme une "prestation de services" pour le compte d'une entreprise biopharmaceutique. Il affirme qu'une étude in vitro "ne peut représenter la complexité du vivant".

Objectifs

Cette étude est menée dans le cadre de prestations de services contractualisées pour le compte d’une entreprise biopharmaceutique spécialisée dans la recherche et le développement de nouveaux outils thérapeutiques et de diagnostic. Elle s’intéresse à l’évaluation in vivo d’une approche thérapeutique multimodale combinant des agents anti-cancéreux (chimiothérapie) avec de la thérapie interne par radio-isotopes dans le traitement du cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de montrer l'intéret de la combinaison de la chimiothérapie avec une radiothérapie interne à l'iode-131 dans le traitement du cancer.

Procédures

Les animaux recevront une administration par gavage de chimiothérapie pendant 14j consécutifs. Ils recevront également une administration par gavage ou par injection intraveineuse d'iode-131 (1 seule fois ou 2 fois à une semaine d'intervalle)

Impact sur les animaux

Des effets indésirables de la chimiothérapie couplée ou non à l'administration d'iode-131 ne sont à pas exclure. La surveillance quotidienne des animaux permettre de réagir rapidement dès l'appartition de signes cliniques avec une prise en charge médicamenteuse ou une mise à mort de l'animal en cas d'atteinte des points limites définis.

Devenir

A l'issue du projet, tous les animaux seront mis à mort par surdosage d'anesthésie gazeuse puis dislocation cervicale en vue d'analyses ex vivo.

Remplacement

La validation de nouvelles thérapeutiques requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience du laboratoire sur l'analyse desparamètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire est réduit au maximum en sélectionnant uniquement les expérimentations essentielles. Le nombre d'animaux a été calculé afin de garantir une valeur statistique à l'étude menée.

Raffinement

Un enrichissement des cages d’hébergement sera assuré par l'ajout de briquettes de bois. Pour legavage des animaux, ceux-ci seront habitués à la contention par l'expérimentateur avant le début des procédures. Par ailleurs, les animaux seront suivis de façon quotidienne à l’aide de feuille de score de façon à détecter tout signe d’inconfort et de permettre une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

La validation de nouvelles cibles thérapeutiques requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés. En effet, la physiologie globale de l’individu entre en jeu et une étude ex vivo ou in vitro ne peut représenter la complexité du vivant. L'implantation d'une tumeur humaine chez l'animal est possible uniquement chez des individus immunodéprimés. Ainsi la souris immunodéprimée est préférée pour cette étude. Les souris utilisées sont des immunodéficientes adultes de 4-6 semaines d’environ 25 grammes qui sont adaptées à la croissance des tumeurs.

318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un état de mal épileptique est induit par injection de kaïnate et un implant crânien est posé pour l'enregistrement EEG, pour étudier le lien entre crises épileptiques et neurodégénérescence. Le porteur indique que les décharges peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou conduire l'animal à se blesser dans 10 % des cas, et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle alternatif" pour observer les crises et le déclin cognitif.

Objectifs

L'association entre crise épileptique et neurodégénérescence a été observée en clinique. Malgré ça, à l’heure actuelle, aucune étude n’a intégré des modèles précliniques pour examiner systématiquement comment des crises épileptiques peuvent accélérer des processus de neurdégénérescences et en cours de vieillissement. Dans ce projet, nous allons tester les hypothèses suivantes : i) les crises épileptiques suffisent à déclencher les voies amyloïdes et l’hyper phosphorylation de tau dans le cerveau ; ii) ces effets sont plus sévères au cours du vieillissement. Cette exploration est importante, au vu de l’incidence croissante des épilepsies et des comorbidités neurologiques chez la personne âgée.

Bénéfices attendus

Pouvoir mettre en évidence une corrélation pathophysiologique entre une crise épileptique qui arriverait pendant le vieillissement et le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

- Entre 2 et 5 injections intra-péritonéales sur une durée de 2 heures - Une procédure chirurgicale d'une durée de 40 minutes.

Impact sur les animaux

L'induction d'un status epilepticus sur la souris engendre des décharges neuronales fortes. Celles-ci peuvent provoquer un arrêt cardiaque ou entrainer l'animal à se blesser dans la cage (morsure de la langues). Ces effets sont observés dans 10 % des cas. L'injection, si nécessaire, de diazépam entraine une somnolence de l'individu avec absence d'hydratation (comblée par une IP de solution saline stérile) et d'alimentation pendant plusieurs heures. La pose d'un implant crânien pour suivi électroencéphalographique peut entrainer un inconfort temporaire, signe de grattage plus intense au niveau de celui-ci.

Devenir

A la suite de la procédure 1, les animaux seront mise à mort par CO2 car leur utilisation est terminée. Les animaux de la procédure 2 seront mise a mort comme décrit dans la procédure pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle alternatif pour observer les crises épileptiques et le déclin cognitif (maladie d'alzheimer) dans leur globalité.

Réduction

Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales sur les animaux d'un an puisque le comportement sera effectué sur les méme animaux que le prélèvement d'organes. De plus, Nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux.

Raffinement

Le raffinement passe par le maintien de l'enrichissement dans les cages notamment en cas d'isolement des souris pour les besoins de l'expérience. La socialisation sera de nouveau rendue possible quand les contraintes expérimentales le permettront. Tous les animaux seront surveillés lors de la procédure 1 et un SE supérieur à 2 H entrainera l'injection IP de diazépam à 0.5mg/kg pour stopper les crises et éviter ainsi une surmortalité. Pour la procédure 2 avec chirurgie, une grille de score (ci-joint) sera établie et permettra par exemple de : -procéder à une désinfection en cas de palie ou de suture problématique sous isoflurane, -surveiller le poids de l'animal avec une mise à mort si perte > 15% et apport de nourriture appétente si perte entre 10 et 15%. Pour les enregistrement EEG, une habituation à la contention sera effectuée chaque jour pour minimiser les stress lors des enregistrements.

Choix des espèces

L'espèce souris a été choisi en fonction des modèles nécessaires à l'étude. Un modèle isomorphe est nécessaires. La mise en place d'un modèle épileptique artificiellement induit . La souris répond aux besoins scientifiques et aux règles des 3R. Le fond génétique C57Bl/6 est utilisé dans le modèle car il a pu montrer la meilleure réponse physiopathologique. Le modèle d'épilepsie utilisé ici, induit par injection de kainate est un modèle connu et robuste. Il permet l'étude de la physiopathologie de l'épilepsie. Les animaux utilisés sont des adultes mâles agés de 2 mois, 6 mois et 9 mois. Les souris seront gardées au long court pour les points de prélèvement à 6 mois, 9 mois et 1 an. Nous allons induire une crise épileptique a des stades différents de la vie pour évaluer les conséquences de celle-ci en fonction de l'âge.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules souches humaines leur sont injectées dans les cuisses sous anesthésie pour y former des tératomes, tumeurs servant à vérifier la pluripotence de lignées cellulaires. Le porteur indique que la croissance de ces tumeurs peut gêner la mobilité de l'animal et retient des souris NSG "très immunodéprimées" pour éviter le rejet des cellules humaines. Il présente cette formation de tératomes comme "indispensable" pour démontrer la pluripotence, sans mentionner d'alternative in vitro validée.

Objectifs

Etude comparée des capacités de différenciations des lignées de cellules souches ES humaines et d’iPSC reprogrammées dans le cadre des pathologies leucémiques. Plusieurs lignées cellulaires seront à tester. Plusieurs facteurs plus ou moins aléatoires entrent en jeu : la capacité à obtenir des cellules différenciables en quantité suffisante, l'obtention d'échantillons des patients afin d’en déterminer les profils génétiques, profils qui peuvent comporter 1 ou plusieurs mutations, notre capacité à reproduire ces profil génétiques entièrement ou partiellement etc… Actuellement, nous pouvons établir cette liste non exhaustive des différentes lignées cellulaires à tester : - cellules hES transduites par les lentivirus vides ou codant pour différents shARN (TET2, RUNX1, EZH2, ANKRD26, RAD21, ASXL1..) ainsi que pour différents transgénèse cDNA (GATA1s, ANKRD26, CALRwt, CALRmut, JAK2mut, MPLmut..), - cellules iPSC donneur sain - cellules d’IPSC à partir des patients avec les néoplasmes myéloprolifératifs (mutations de JAK2, CALR, MPL) - cellules d’IPSC à partir des patients présentant des thrombopénies avec ou sans prédisposition aux leucémies (RUNX1, FLNA, ANKRD26, ETV6, NBEAL2) - cellules d’IPSC à partir des patients avec les leucémies myélomonocytaires (mutations dans des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage). - cellules d’IPSC génétiquement modifiées par la technologie CRISPR/CAS9 pour des molécules de signalisation, des régulateurs épigénétiques, des facteurs d’épissage.

Bénéfices attendus

Les cellules IPS et hES peuvent servir à reproduire les mécanismes impliqués dans une pathologie hématopoïétique notamment lorsqu’il est difficile d’obtenir des prélèvements de patients. Par exemple, cela permettrait d’étudier l’embryogénèse humaine. A terme, ces techniques pourraient permettre d’obtenir des cellules hématopoïétiques (globules rouges ou plaquettes) en nombres suffisants et immunitairement compatibles avec les patients. Ceci limiterait les risques de rejet (système HLA, rhésus, etc..), pallierait au manque de cellules sanguines pour les transfusions et limiterait les risques de transmission pathologique entre donneur et receveur (maladie du greffon contre l'hôte).

Procédures

Injection intra musculaire au niveau supérieur de la cuisse arrière (biceps cruraux gauche et droit) une fois, durée: 2 minutes incluant la préhension. - Les injections de tératomes se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pendant l'induction et 2% pour le maintient sous anesthésie). Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...).

Impact sur les animaux

L'injection des cellules en intramusculaire peut éventuellement au maximum entrainer des problèmes modérés de mobilité pour l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour étude des cellules de tératome.

Remplacement

Les cellules induites in vitro seront caractérisées sur le plan moléculaire afin de vérifier qu’elles n’ont pas d’anomalies génétiques importantes comme duplication ou perte de chromosome, si les mutations qui conduisent aux maladies qu’on étudie sont présentes et si ces cellules ont toujours la capacité à se différencier en tous types cellulaires.Des marqueurs spécifiques qui correspondent à l’état de pluripotence avant toute utilisation chez l'animal seront recherchés par séquençage. La confirmation de l'état pluripotent chez l'animal est indispensable pour pouvoir considérer les cellules comme réellement pluripotentes.

Réduction

Afin de limiter l'utilisation d'animaux l'injection des 5 souris se fera en deux étapes décalées dans le temps : dans un premier temps 3 souris seront injectées. Si il y a obtention de 3 tératomes exploitables dans les 3 mois post-injection impartis, nous n'injecterons pas les 2 autres souris. Dans le cas contraire, nous ajouterons 2 souris au premier lot. Pour ramener un taux d'échec moyen par injection de 40% à 20% par souris (échec ou prise trop lente du greffon), nous injecterons les deux cuisses de chaque souris en même temps.

Raffinement

Les injections se font sous anesthésie gazeuse (isoflurane), dans les 2 biceps cruraux afin d'impacter le moins possible la mobilité de l'animal. Elles sont réalisées avec des seringues à insuline pour éviter tout problème lors de l'injection du matrigel (désolidarisation aiguille/seringue,...), limiter le volume mort dans la seringue et ainsi garantir l'injection de la bonne quantité de cellules. Ces seringues sont pré-montées avec des aiguilles très fines limitant ainsi le traumatisme pour l'animal. Des pooints limite très stricts ont été définis et seront appliqués conernant les éventuels impacts de la croissance des tératomes sur la mobilité.

Choix des espèces

L'induction de tératomes dans les souris immunodéficientes est considérée comme indispensable pour démontrer la pluripotence des lignées cellulaires obtenues in vitro. Ces essais ont été standardisés pour prouver la formation des 3 feuillets germinaux (endoderme, mesoderme et ectoderme) et donc la pluripotence des cellules souches. Chez la souris, cette induction intramusculaire, est pratique, aisée à réaliser, reproductible et quantifiable. Nous avons choisi les souris NSG car elles sont très immunodéprimées et dépourvues de lymphocytes B, T et NK murins, ce qui permet d’éviter le rejet de greffe des cellules humaines à greffer. En raison de leur déficit immunitaire combiné sévère, les souris NSG ont une capacité de rejet des greffes allogéniques ou de tissus xénogéniques réduites, et sont donc d'excellents hôtes pour les cellules et les tissus d’origine humaine. Animaux injectés entre 6 et 10 semaines, pour des raisons de système immunitaire faible.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une mutation de l'oncogène Kras déclenche chez elles des lésions précancéreuses du pancréas, puis elles reçoivent des injections et des gavages répétés de molécules candidates avant un prélèvement terminal de sang et d'organes. Le porteur affirme que ces lésions "ne devraient pas" entraîner de douleur, en s'appuyant sur le diagnostic tardif du cancer chez l'humain. Il sollicite 1 200 souris sur cinq ans tout en indiquant que le projet ne devrait en nécessiter qu'environ 300, et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace l'"organisme intégré".

Objectifs

L’adénocarcinome du pancréas est un cancer en constante augmentation qui devrait d’ici fin 2022 se classer comme le second cancer le plus mortel. Ce cancer est très difficilement pris en charge et son diagnostic souvent tardif ne laisse que peu d’opportunité de traitement thérapeutique, conduisant les patients à moins de 5% de chance de survie 5 ans après leur diagnostic. Grâce aux analyses génétiques à grande échelle, plusieurs mutations impliquées dans cette pathologie ont déjà été identifiées chez l’Homme. L’initiation des cancers du pancréas est majoritairement associée à l’acquisition de mutations de l’oncogène Kras. Face à ces mutations, les cellules affectées deviennent précancéreuses, elles développent une réponse de protection visant à limiter leur expansion. Ce processus appelé « Sénescence oncogénique induite » ou OIS conduit les cellules précancéreuses à induire des mécanismes visant à limiter leur prolifération, mais également à sécréter de nombreux composés complexes (regroupés sous le terme: SASP) dont le rôle bénéfique ou délétère sur la progression tumorale restent encore mal compris. De nombreuses fonctions sont décrites au large spectre de molécules sécrétées qui compose le « SASP ». Ces molécules sont produites en aval de grandes voies canonique de signalisation (mTOR, JAK (Janus Kinase), Notch, Toll Like Receptor (TLR), …). Leurs actions peuvent être inflammatoiree, favoriser la fibrose ou plus bénéfique pour certaines d’entre elles. Parmi les nouvelles stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses, le développement de molécules appelées « sénomorphiques » vise à bloquer spécifiquement les molécules du SASP aux effets délétères tout en conservant l’action des molécules bénéfiques. L’objectif de notre projet vise à évaluer les effets thérapeutiques de 5 candidats molécules capables de bloquer les voies de signalisation qui conduisent à la production de différentes molécules du « SASP » par les cellules précancéreuses pancréatiques. Il consistera à traiter à court terme (2 semaines) ou à long terme (2 mois) de jeunes souris porteuses dans leur pancréas de la mutation KRAS qui est à l’origine des cancers pancréatiques chez l’Homme. Les résultats bénéfiques ou délétères seront ensuite observés sur les lésions développées afin de mieux comprendre le rôle complexe du SASP dans l’initiation des tumeurs pancréatiques.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à mieux comprendre l'intérêt du ciblage thérapeutique des cellules sénescentes et des molécules qu’elles secrètent dans le cadre du développement des cancers pancréatiques. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité d'action du SASP dans les pré-lésions pancréatiques et fournir des pistes importantes pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les cancers du pancréas

Procédures

Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés, sur 2 semaines à 2 mois, pour administrer les molécules candidates thérapeutiques. La fréquence d’administration dépendra des molécules concernées (3 injections intrapéritonéales et de 3 à 5 gavages par une canule adapté par semaine). Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin des procédures de traitements sur des animaux, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.

Impact sur les animaux

L'activation ciblée de la mutation de Kras dans le pancréas des souris entrainera l'apparition de pré-lésions cancéreuses pancréatiques. Ces lésions bégnines ne devraient toutefois pas entrainer de douleurs (chez l'homme le cancer pancréatiques n'est diagnostiqué que très tardivement par des douleurs). Les animaux subiront des injections intrapéritonéales ou des gavages répétés qui pourraient entrainer un inconfort ou des irritations locales sur lesquels nous seront particulièrement vigilant. Les produits testés pourraient entrainer une réponse inflammatoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements réalisés. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages de molécules secrétées par les pré-lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les pancréas collectés post-mortem. Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Remplacement

Aucun autre modèle ne permet de reproduire de manière aussi satisfaisante la progression tumorale du cancer du pancréas puisque les tumeurs se développent au niveau du pancréas lui-même. En raison de la nature complexe de la recherche proposée qui vise à évaluer les effets de molécules thérapeutiques au sein de lésions pancréatiques précancéreuses (où des interactions cellulaires complexes prennent place), nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro. L’effet des molécules que nous proposons de tester ont toutefois été étudié et validé in vitro sur des lignées cellulaires pour confirmer l’intérêt thérapeutique des travaux que nous proposons.

Réduction

Afin de nous conformer à la règle de Réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation des traitements thérapeutiques testés. 6 à 9 souris par sexe et par groupe devraient nous permettre d’obtenir des conclusions statistiques interprétables entre groupe de traitements. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale sauf en cas de problèmes techniques qui compromettraient l’interprétation de nos travaux. Signalons enfin que les traitements à court et long terme seront réalisés séquentiellement et que les traitements à long terme ne seront mis en place qu’en d’absence d’effets des traitements à court terme. Bien que nous sollicitions 1200 souris sur 5 ans, ce projet ne devrait donc nécessiter qu’un quart de ces animaux (300) pour atteindre nos objectifs.

Raffinement

Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, perte de poids, irritations liées aux modes d’administrations des traitements réalisés). L’identification de ces signes entraineraient alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir la variabilité des bénéfices thérapeutiques des traitements que nous testerons, ils seront accompagnés de nombreuses analyses des tissues pré-tumoraux post-mortem par des approches histologiques et moléculaires complémentaires qui permettront d’exploiter au mieux nos résultats et ainsi limiter la nécessité de répéter nos travaux expérimentaux.

Choix des espèces

Le modèle murin que nous avons choisi pour réaliser cette étude reproduit parfaitement la pathologie humaine. Il est basé sur l’expression conditionnelle dans le pancréas d’une mutation de l’oncogène Kras qui est retrouvée dans plus de 90% des patients atteints de cancer du pancréas. Il reproduit les lésions pré-cancéreuse (PANINs) qui sont décrites chez l’Homme. Ces animaux permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale du cancer du pancréas qui prend place chez l’homme en aval des mutations qui affectent ce gène. L’utilisation d’animaux est de plus essentielle pour la réalisation de notre projet car elle requiert l’analyse des effets de molécules thérapeutiques sur un organisme intégré. Les protocoles de traitements mis en place seront réalisés sur des souris âgées de 4 semaines. A cet âge les souris porteuses de mutation Kras ne présentent que de très rares lésions de type PANINs dans lesquelles l'existence de mécanismes de sénescence est déjà bien démontrée.

12 génisses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées en vie pour le renouvellement du troupeau. Chaque animal subit jusqu'à 55 prises de sang, une synchronisation des chaleurs, une production et un transfert d'embryons sous anesthésie épidurale, pour mesurer l'effet de ces techniques de reproduction sur le bien-être des génisses. Le porteur reconnaît que l'étude préliminaire avait mis en évidence le stress lié à l'isolement et à la contention imposés par ces actes. Il affirme qu'aucun système ex vivo ne permet d'évaluer ces effets et invoque une demande sociétale accrue pour le "bien-être animal".

Objectifs

Dans un contexte de demandes sociétales accrues vis-à-vis du bien-être animal (97% des Européens estiment qu’il est important de protéger le bien-être des animaux d’élevage selon l'eurobaromètre 2015 de la comission européenne), donner des éléments de réponse et des pistes d’amélioration est primordial. De ce fait, les entreprises et organismes agricoles cherchent à prendre en compte cette notion au sein de leurs activités. Les entreprises impliquées dans la reproduction et la génétique des ruminants souhaitent pouvoir étudier l’impact des technologies de la reproduction sur le bien-être des animaux en vue éventuellement de les améliorer. Très peu de publications scientifiques sont disponibles sur ce sujet. Ainsi, il a été mis en évidence que la palpation rectale et l’insémination animale entrainaient une augmentation significative de cortisol dans le sang à la suite de ces manipulations. De plus, il a été montré que la ponction folliculaire ovarienne, utilisée dans la cadre des productions d’embryon in vitro, ne semblait pas impacter le bien-être des animaux. Aucune étude n’a étudié l’impact des protocoles de collecte et de transfert d’embryons sur le bien-être des génisses. Or, ces techniques requièrent un ensemble d’actes successifs représentatif des pratiques de reproduction actuelles chez cette espèce, dont l’IA. De plus, l’évaluation du bien-être animal dans les travaux précédemment cités ne prenaient en compte que des données physiologiques ou de production alors qu’il est communément admis aujourd’hui que l’évaluation du bien-être animal doit être multicritères, prenant également en compte des données comportementales. Une expérimentation préliminaire, ayant déjà fait l'objet d'une saisine au comité d'éthique, a été menée l'année dernière sur 6 animaux permettant à la fois de préciser les effets attendus (variabilité indivdiuelle forte) mais soulignant également plusieurs points de vigilance dans les procédures et méthodes utilisées pour éviter les biais expérimentaux (nécessité d'un protocole en carré latin, standardisation de l'approche de l'animal, monitoring de la fréquence cardiaque...). Fort de cette expérience, le projet présenté ici a donc pour objectif de mesurer l’impact des protocoles de production et de transfert d’embryons sur le bien-être de 12 génisses.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de conforter les résultats préliminaires déjà acquis dans l'étude préliminaire et ainsi d’objectiver l’impact de ces technologies de la reproduction sur le BEA des génisses. Sur la base de ces résultats, il conviendra de proposer d'éventuelles voies d'amélioration.

Procédures

Afin d'évaluer l'impact des protocoles de production et de transfert d'embryons sur les génisses, 12 femelles naïves de toutes biotechnologies de la reproduction suivront: - une phase d'acclimatation à leur nouvel environnement, aux moyens de contentions utilisés et aux prises de sang (6 prises de sang) sera effectuée (2 semaines); - une synchronisation des chaleurs pour initier une phase témoin (sans technologies de la reproduction; ~4 semaines) puis une phase expérimentale (avec technologies de la reproduction; ~9 semaines) ou inversement (dispositif en carré latin). Au cours de ces phases, 49 prises de sang seront réalisées sur les animaux pour suivre les paramètres plasmatiques en lien avec l'évaluation du BEA soit au total 55 prises de sang par génisse en incluant la phase d'acclimatation. Lors de la phase expérimentale uniquement, les génisses suivront également un protocole de production d'embryon et un protocole de transfert d'embryons. En dehors du suivi des paramètres plasmatiques, le bien-être de ces génisses sera évalué de façon multicritère par le recueil non invasif de phénotypes physiologiques (monitoring de l’activité et de la rumination par des colliers activimètres, de la température ruminale par des thermobolus, de la fréquence cardiaque par des ceintures Polar) et comportementaux (vidéos individuelles et de groupe) qui ne font pas l'objet d'une procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Les technologies de la reproduction étudiées dans cette étude sont aujourd'hui largement utilisées à travers le monde et ne sont pas connues pour induire des douleurs ou un stress intenses et prolongés aux animaux. De plus, selon les pratiques actuelles, une anesthésie épidurale sera systématiquement pratiquée lors des procédures de collecte et de transfert d'embryons. Enfin, la finalité de cette étude est d'étudier les impacts plus fins sur les animaux dans le but de raffiner les technologies de la reproduction. L'étude préliminaire a mis en évidence le stress causé par l'isolement et/ou la contention des animaux nécessaire à la réalisation des actes mais également quelques tendances qu'il sera nécessaire de de confirmer sur des effectifs plus importants. De plus cette étude a permis de vérifier que les prélèvements répétés de sang ne conduisaient pas à une douleur intense et prolongée des animaux et que ceux-ci n'entrainaient pas de complications particulières. Les animaux seront suivis de façon journalière et placés sous monitoring permanent de la rumination, de l'activité ou de la température ruminale. Cette surveillance continue des animaux nous permettra de réagir rapidement en cas de dégradation de leur état de santé.

Devenir

Toutes les génisses seront gardées en vie à la fin de cette procédure sauf avis contraire du responsable scientifique et du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

Le bien-être animal est une notion complexe dont l'évaluation ne peut être que multicritères. A ce jour, aucun système ex vivo permet de mesurer l’impact de ces technologies sur le bien-être des animaux.

Réduction

Chaque animal étant son propre témoin dans cette étude, ceci permet de diminuer le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation. Sur la base des travaux préliminaires menés et de la grande variabilité individuelle constatée, un nombre de 12 animaux semble suffisant pour mettre en évidence une différence significative (avec un risque alpha de 5% et une puissance de test de 80% minimum) à partir des tendances observées. Compte-tenu des effectifs prévus (12 animaux) et de l’appariement des données (mesures répétées sur les mêmes individus), seuls des tests non paramétriques peuvent être utilisés.

Raffinement

La finalité de cette étude est de raffiner les technologies de la reproduction. Toutefois, selon les pratiques actuelles, une anesthésie épidurale est systématiquement pratiquée lors des procédures de collecte et de transfert d'embryons. De plus, les génisses utilisées dans ce projet seront placées sous surveillance quotidienne (activité, comportement) et hébergées dans une stabulation répondant aux normes de bien-être animal chez cette espèce (10m² par animal avec un accès aisé à l'auge et aux points d'abreuvements, présence de tapis caoutchouc derrière pour le confort des aplombs, accès à des brosses latérales et dorsales...).

Choix des espèces

Compte-tenu de l’objectif même de l’étude, le modèle animal ne peut être substitué par un modèle d’étude ex vivo. De plus, les techniques utilisées dans ce projet sont des pratiques couramment réalisées en élevages. Afin de produire le matériel biologique nécessaire au déroulement du projet, il est nécessaire d'utiliser des génisses, toutes pubères (< 2 ans). Ce stade de développement correspond au stade de développement des animaux sur lesquels les biotechnologies de l’embryon sont pratiquées. De plus, le fait qu’elles n’aient subie aucune biotechnologie de la reproduction avant d’intégrer l’étude permet d’éviter les éventuels biais liés à la répétition des protocoles.