Système endocrinien

24 gobies à tache noire, des poissons de rivière, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue par surdose de MS-222. Pêchés à l'hameçon ou à la nasse dans la Saône, ils restent environ 24 heures à jeun en bourriche, puis jusqu'à 24 heures seuls dans une chambre de respirométrie immergée dans la rivière, pour mesurer leur consommation d'oxygène. Le projet cherche à comprendre la tolérance de cette espèce invasive aux variations de température et d'oxygène, avec des retombées pour la gestion des milieux renvoyées "à plus long terme". Le porteur les fait tuer plutôt que relâcher parce que l'espèce est invasive, en invoquant la réglementation.

Objectifs

Les cours d’eau sont des environnements fortement variables dans le temps, en particulier à l’échelle du cycle journalier, avec des fluctuations importantes de température et de disponibilité en oxygène. Ces variations représentent une contrainte majeure pour les organismes aquatiques, car une augmentation de la température accroît les besoins énergétiques tandis qu’une diminution de l’oxygène peut limiter la capacité à satisfaire ces besoins. Dans ce contexte, certaines espèces de poissons semblent particulièrement capables de tolérer ces conditions, notamment le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), une espèce invasive aujourd’hui largement répandue dans les cours d’eau français. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent cette capacité de tolérance constitue un enjeu important pour mieux appréhender les dynamiques d’invasion biologique en milieu aquatique. L’objectif général du projet est de quantifier, en conditions naturelles, les performances métaboliques de cette espèce, en mesurant sa consommation d’oxygène directement en rivière, sur un cycle complet de 24 heures. Ces mesures permettront d’estimer le métabolisme minimal et maximal des individus, ainsi que leur capacité à ajuster leur dépense énergétique en fonction des variations naturelles de température et d’oxygène dissous. Plus spécifiquement, le projet vise à : (i) caractériser la variabilité du métabolisme individuel en conditions naturelles fluctuantes ; (ii) analyser la relation entre consommation d’oxygène et conditions environnementales (température, oxygène dissous) ; (iii) identifier dans quelle mesure ces capacités physiologiques peuvent contribuer à la tolérance de cette espèce aux conditions environnementales variables. Ce projet repose sur des mesures réalisées directement en milieu naturel, au plus proche des conditions écologiques rencontrées par les individus, afin de mieux comprendre le fonctionnement physiologique des poissons dans leur environnement réel.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances nouvelles sur la manière dont une espèce de poisson invasive, le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), ajuste son métabolisme face aux variations naturelles de son environnement. En mesurant directement la consommation d’oxygène des individus en rivière, sur un cycle complet de 24 heures, il permettra de mieux comprendre comment ce poisson répond à des fluctuations rapides de température et d’oxygène dissous, deux facteurs majeurs pour le fonctionnement des organismes aquatiques. Le projet contribuera ainsi à améliorer les connaissances sur les mécanismes physiologiques susceptibles de favoriser la tolérance de cette espèce à des conditions environnementales variables, voire contraignantes. Cette meilleure compréhension est particulièrement pertinente dans le contexte actuel de réchauffement des eaux continentales et d’augmentation de la fréquence des épisodes extrêmes, qui peuvent modifier les équilibres écologiques et favoriser certaines espèces opportunistes ou invasives. Au-delà du seul cas du gobie à tache noire, ce projet présente également un intérêt méthodologique et conceptuel plus large. Il permettra d’évaluer la faisabilité et l’intérêt d’une approche de respirométrie réalisée directement en milieu naturel, au plus près des conditions réellement rencontrées par les poissons. Cette démarche pourra alimenter de futurs travaux en écophysiologie de terrain en fournissant un cadre expérimental utile pour étudier les réponses physiologiques des animaux dans des environnements fluctuants. Enfin, les résultats obtenus pourront contribuer, à plus long terme, aux réflexions menées sur la gestion des milieux aquatiques et des espèces invasives, en identifiant certains contextes environnementaux potentiellement favorables au maintien ou à l’expansion de cette espèce.

Procédures

Les poissons seront capturés dans la Saône, soit par pêche au coup avec appât, soit à l’aide de nasses appâtées relevées dans un délai maximal de 12 heures. Après capture, ils seront maintenus temporairement dans l’eau de la rivière, dans de grandes bourriches, afin de limiter le changement de conditions environnementales. Ils resteront à jeun pendant environ 24 heures avant les mesures, afin de limiter l’influence de la digestion sur la consommation d’oxygène. Chaque poisson sera ensuite placé individuellement dans une chambre de respirométrie installée dans la rivière pendant 24 heures, afin d’enregistrer sa consommation d’oxygène dans des conditions naturelles. Le dispositif fonctionne en flux intermittent, avec une alternance de phases de mesure et de renouvellement de l’eau. Chaque animal est utilisé une seule fois dans la procédure. Il n’y a ni chirurgie, ni prélèvement invasif sur animal vivant, ni administration expérimentale de substance. À l’issue de la mesure, les poissons sont euthanasiés conformément à la réglementation applicable à cette espèce invasive.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés au stress physiologique induit par : (i) la capture en milieu naturel (pêche au coup, nasses), (ii) le maintien temporaire en bourriche (mise à jeun), et (iii) le confinement en chambre de respirométrie en milieu naturel, ainsi qu’aux manipulations associées (transferts, installation dans les chambres). Ces contraintes peuvent entraîner des réponses comportementales (agitation, prostration transitoire), une augmentation de la ventilation, et potentiellement favoriser des troubles immunitaires chez des individus fragilisés. Effets indésirables spécifiques attendus : • Lésions légères possibles au niveau buccal lors de la pêche au coup (hameçon), et stress/confinement dans les nasses (limité par un relevé ≤ 12 h). • Jeûne pré-mesure (24 h en bourriche) : potentiellement inconfortable mais nécessaire pour éviter les biais liés à la digestion. • Isolement temporaire lors de la respirométrie (< 24 h) pouvant induire un stress social/comportemental ; il sera limité au strict nécessaire. • En respirométrie en milieu naturel, l’oxygène dissous et la température varient naturellement au cours du nycthémère ; ces fluctuations peuvent induire une contrainte physiologique (hyperventilation, baisse d’activité). Elles seront encadrées par des points limites et des critères d’arrêt. Tous les signes cliniques et comportementaux (respiration, posture, activité, lésions) seront surveillés. Les individus présentant des altérations persistantes seront retirés du protocole. En cas d’atteinte des points limites ou à l’issue de la procédure expérimentale, une euthanasie sera pratiquée par surdose de MS-222 tamponné, conformément à la réglementation applicable à cette espèce invasive.

Devenir

À l’issue des mesures, les poissons ne sont pas relâchés dans le milieu naturel, le gobie à tache noire étant une espèce invasive dans les rivières françaises. Conformément à la réglementation en vigueur, tous les individus sont euthanasiés à l’issue des mesures, par surdose d’anesthésique, afin d’éviter toute dispersion de l’espèce. Ce choix permet à la fois de répondre aux contraintes réglementaires liées à la gestion des espèces invasives et de garantir une fin de procédure rapide, limitant la souffrance des animaux. Si un individu doit être retiré du protocole avant la fin de la mesure (par exemple en cas de blessure ou de signes de détresse), il est immédiatement euthanasié selon la procédure décrite, afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas d’alternative permettant de répondre à l’objectif du projet sans recourir à des poissons vivants. Le projet vise à mesurer, en conditions naturelles, la consommation d’oxygène du gobie à tache noire en lien avec les variations de température et d’oxygène dissous rencontrées en rivière au cours d’un cycle de 24 heures. Ces réponses dépendent du fonctionnement intégré de l’organisme entier, incluant la respiration, la circulation, l’activité spontanée et les interactions avec l’environnement. Des approches alternatives, telles que les mesures physico-chimiques du milieu, la modélisation, l’exploitation de données bibliographiques ou des approches sur tissus et cellules isolés, peuvent contribuer à interpréter les résultats, mais elles ne permettent pas d’estimer directement la consommation d’oxygène d’individus vivants dans leur environnement naturel, ni d’appréhender leurs réponses physiologiques en situation réelle. Le recours à des animaux vivants est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Le protocole a toutefois été conçu de manière à limiter au maximum l’utilisation des animaux à ce qui est strictement nécessaire, avec une approche peu invasive reposant sur une mesure réalisée directement en milieu naturel, sans chirurgie, sans administration de substance et sans maintien prolongé en captivité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été limité au strict nécessaire afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse des analyses. La stratégie de réduction repose sur un plan d’échantillonnage contraint par le dispositif expérimental de terrain. Les mesures de consommation d’oxygène étant réalisées sur une durée de 24 heures par individu, et le dispositif comprenant deux respiromètres fonctionnant simultanément, le nombre maximal d’individus pouvant être étudiés est de deux par jour. Sur une période de 12 jours, l’effectif total est ainsi limité à environ 24 individus. Ce nombre correspond au compromis entre (i) la nécessité de couvrir une variabilité environnementale réaliste (cycle jour/nuit et fluctuations naturelles de température et d’oxygène dissous) et (ii) la contrainte de durée des mesures individuelles. Il permet d’obtenir un nombre suffisant de réplicats indépendants pour analyser la variabilité interindividuelle et les relations entre métabolisme et conditions environnementales. L’approche retenue ne repose pas sur des procédures répétées sur un même individu, ce qui permet de limiter la contrainte cumulée et d’éviter une augmentation du nombre total d’animaux liée à des pertes ou des effets d’habituation. Enfin, aucun animal n’est soumis à des procédures invasives ou à des manipulations supplémentaires (chirurgie, prélèvements, traitements expérimentaux), ce qui permet de maximiser l’information obtenue par individu tout en maintenant un effectif global réduit.

Raffinement

Le protocole a été conçu afin de réduire au minimum la douleur, le stress et la durée des manipulations imposées aux animaux. La capture est réalisée à l’aide de méthodes peu traumatiques et sélectives (pêche à la ligne avec appât et nasses appâtées), avec un relevé des nasses dans un délai maximal de 12 heures afin de limiter le confinement prolongé. Les manipulations sont brèves, réalisées avec du matériel humidifié et en limitant au maximum l’exposition à l’air. Après capture, les poissons sont maintenus en bourriches immergées directement dans l’eau du site, ce qui permet de conserver des conditions physico-chimiques proches de leur environnement naturel (température, oxygène dissous), et de limiter le stress lié à un changement de milieu. Cette phase inclut une période de mise à jeun d’environ 24 heures, nécessaire pour la mesure du métabolisme, tout en permettant une récupération partielle du stress de capture. La respirométrie in situ constitue une approche peu invasive, reposant uniquement sur un confinement temporaire dans une chambre immergée, sans chirurgie, sans prélèvement sur animal vigile et sans administration de substance. Le dispositif fonctionne en flux intermittent, assurant un renouvellement régulier de l’eau à partir du milieu naturel. Afin de limiter les contraintes physiologiques liées aux variations naturelles de l’environnement (température, oxygène dissous), des points limites et des critères d’arrêt sont définis. Toute altération marquée et prolongée du comportement ou de la respiration (perte d’équilibre, ventilation excessive, absence de récupération) entraîne l’arrêt de la mesure et le retrait de l’individu. Une surveillance régulière des animaux est assurée tout au long du protocole, en particulier lors des premières mises en place, afin de vérifier le bon fonctionnement du dispositif et l’absence de détresse. Les manipulations répétées sont évitées afin de ne pas perturber les mesures et de limiter le stress. À l’issue de la procédure, les animaux sont euthanasiés par surdose d’anesthésique (MS-222 tamponné), permettant une perte rapide de conscience et limitant la souffrance, conformément à la réglementation applicable aux espèces invasives.

Choix des espèces

Le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) a été choisi comme modèle en raison de son impact écologique et de son succès invasif dans plusieurs cours d’eau français (notamment Saône, Doubs, Moselle). Espèce benthique exotique envahissante, il colonise rapidement des habitats variés et peut entrer en compétition avec des espèces autochtones, notamment en occupant des zones à faible oxygénation parfois moins accessibles à d’autres poissons. Son comportement locomoteur (déplacements par bursts, maintien au substrat) et sa tolérance apparente aux contraintes de rivière (variations de température et d’oxygène dissous) en font un modèle pertinent pour tester l’hypothèse selon laquelle des aptitudes métaboliques (SMR, MMR, AS, plasticité) favorisent l’établissement et la dispersion en milieu variable. L’espèce est classée LC (préoccupation mineure) ; la capture d’un effectif limité, sous autorisation préfectorale, n’est pas susceptible d’impacter les populations locales. Les animaux utilisés seront des gobies subadultes à adultes, mesurant environ 8 à 15 cm. Ce choix est justifié par deux raisons principales : - (1) Compatibilité technique – cette gamme de tailles est la plus adaptée aux chambres de respirométrie de terrain (volume de chambre et rapport masse/volume permettant une mesure précise de la consommation d’oxygène sur 24 h, tout en laissant au poisson un espace suffisant pour se retourner) ; - (2) Pertinence écologique – ces tailles correspondent aux classes d’âge les plus fréquemment rencontrées dans les populations envahissantes de rivière et impliquées dans l’occupation des habitats et la compétition avec les espèces autochtones. Elles sont donc pertinentes pour tester l’hypothèse d’une tolérance/plasticité métabolique contribuant au succès invasif dans un environnement fluvial variable (température et oxygène dissous).

Pour étudier le rôle du récepteur AhR dans l'appétit et la vulnérabilité à l'obésité, 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet emploie des lignées AhR +/- et AhR -/-, et un régime riche en graisses de 15 semaines qui peut provoquer obésité, résistance à l'insuline, diabète et difficultés à se déplacer. Les souris passent des tests comportementaux sur l'émotion, la cognition et la sociabilité, avec, selon le porteur, une restriction alimentaire temporaire ou un isolement ponctuel. Comme procédure, il ne déclare pourtant qu'une prise de sang terminale, et ne nomme aucun des tests.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) à des substances étrangères et propres à l’organisme, participe dans la régulation du métabolisme énergétique et des réponses immuno-inflammatoires, mais reste plutôt méconnu d’un point de vue comportemental. L’activité d’AhR au niveau oral a été liée à des modifications de la prise alimentaire, et semblerait influencer l’appréciation des aliments et en particulier des lipides. Ce projet vise à étudier la contribution de ce récepteur à la perception des récompenses alimentaires et à l’appétit afin de mieux comprendre son rôle dans la vulnérabilité à l'obésité. L’AhR est ainsi porposé comme une cible prometteuse dans la lutte de cette maladie, dans la perspective d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet devraient permettre (1) d’établir les rôles d’AhR au niveau cérébral et intestinal pour mieux comprendre son implication dans des troubles comme l’anxiété ou la dépression, provoqués par une alimentation trop riche en graisses ; et (2) de déterminer comment des polluants environnementaux influençant l’activité d’AhR participent à la vulnérabilité à l’obésité.

Procédures

Un prélèvement sanguin en terminal sera effectué sous analgésie et anesthésie, et durera moins d’une minute, sur 420 animaux.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux permettent d’étudier les aspects émotionnels, cognitifs et sociaux des animaux. Bien qu’ils puissent causer un stress léger (lié à une restriction alimentaire temporaire ou à un isolement ponctuel pendant les tests), toutes les précautions sont prises pour limiter cet impact : habituation progressive des animaux aux manipulations, environnement contrôlé (température, luminosité, bruit réduit). La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité et potentiellement de provoquer une insulino-résistance et un diabète chez les animaux (temporalité variable et variabilité individuelle importante). Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Une surveillance continue permettra détecter tout signe de détresse. De plus, les animaux sous régime riche en graisses bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour limiter les inconforts, et l’ajout d’enrichissement dans les cages permettra d’améliorer leur qualité de vie. En fin de l’étude, les animaux seront mis à mort de manière indolore (en moins d’une minute), sous anesthésie et analgésie, conformément aux normes éthiques européennes.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort sous analgésie et anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce projet est couplé à une approche en culture cellulaire (méthode in vitro sans recours aux animaux) pour étudier finement le mécanisme d’action d’AhR, ainsi qu’une approche sur modèle souris, indispensable pour analyser des processus physiologiques complexes impliquant plusieurs organes (cerveau, langue, intestin, tissu adipeux, foie, rate et pancréas). Bien que la culture cellulaire permette de réduire l’utilisation d’animaux, le modèle souris reste nécessaire pour une approche intégrée, notamment pour évaluer les interactions entre ces organes et déterminer l’implication d’AhR dans la vulnérabilité à l’obésité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été réduit au strict nécessaire, tout en permettant d’obtenir des résultats fiables et scientifiquement valables. Pour définir cet effectif, un outil en ligne gratuit a été utilisé afin d’aider à concevoir l’étude de manière rigoureuse. Par ailleurs, des travaux antérieurs ont montré qu’un groupe de 15 animaux permettait d’obtenir des résultats statistiquement pertinents. Les données seront analysées au fur et à mesure de l’étude, afin de pouvoir arrêter les expérimentations dès que le nombre d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables sera atteint, limitant ainsi l’utilisation d’animaux au minimum indispensable.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes afin de préserver les interactions sociales naturelles, dans des cages transparentes adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Leur état général sera contrôlé quotidiennement. Dans le respect de la règle des 3R et des principes éthiques de l’expérimentation animale, des méthodes non invasives et des tests comportementaux sont privilégiés. Les animaux seront habitués progressivement à une manipulation douce afin de limiter le stress. En cas de signes de détresse ou de dégradation de l’état général, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude, replacés dans leur cage de vie avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et surveillés quotidiennement. Si leur état venait à se détériorer de manière irréversible et à atteindre un seuil limite prédéfini, ils seraient retirés définitivement des expérimentations et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile. Toutes les interventions seront réalisées par un personnel formé et qualifié, en nombre limité, garantissant un suivi attentif et individualisé des animaux.

Choix des espèces

De nombreuses études portant sur la thématique du projet ont déjà été réalisées chez la souris, qui constitue un modèle de référence largement utilisé pour l’étude de l’obésité et des organes associés. Le modèle AhR +/- et AhR -/- permet de comparer les résultats obtenus avec ceux déjà disponibles dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, car les systèmes biologiques étudiés doivent être pleinement développés. Cet âge permet d’éviter à la fois la période de puberté et les altérations physiologiques liées au vieillissement.

Deux mois d'hébergement à 30 °C pour douze d'entre elles, afin de dérégler leur graisse brune : 60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, leurs organes et leur plasma. Toutes subissent deux prises de sang à la queue et un régime liquide chargé de glucose marqué, et vingt-quatre une échographie de trente minutes sous anesthésie. Le projet met au point une méthode de traçage par l'alimentation qui éviterait la pose chirurgicale d'un cathéter, et le porteur en attend moins de souris tuées "dans de futurs projets". Les plus jeunes entrent dans l'étude à cinq semaines, pour avoir environ trois mois à la sortie de la chaleur, âge où leur graisse brune est assez développée pour, selon le porteur, y "induire un dysfonctionnement".

Objectifs

Avec le fait que les gens vivent de plus en plus longtemps, il devient très important de garder les personnes âgées en bonne santé, autonomes et avec une bonne qualité de vie. En vieillissant, le corps devient moins efficace pour faire face aux stress et pour maintenir un bon équilibre énergétique. Cet équilibre correspond au fait que ce que l’on mange (apports) et ce que le corps dépense restent en balance. Normalement, plusieurs organes travaillent ensemble pour maintenir cet équilibre et s’adapter aux changements. Mais avec l’âge, cette coopération fonctionne moins bien, ce qui peut favoriser des problèmes métaboliques (comme le diabète ou l’obésité). Parmi les organes importants, il y a les tissus adipeux (les graisses du corps) avec la graisse blanche (stockage d’énergie) et la graisse brune et beige (qui brûle l’énergie sous forme de chaleur). Avec le vieillissement, ces tissus (surtout les graisses brunes et beiges) fonctionnent moins bien. Cela peut perturber la manière dont le corps utilise et distribue l’énergie, ce qui impacte le fonctionnement global de l’organisme. Pour étudier comment l’énergie circule dans le corps, les chercheurs utilisent des approches spéciales : ils donnent à des souris des molécules “marquées” (repérables) pour suivre leur transformation dans le corps. Ces approches nécessitent souvent une chirurgie pour réaliser une perfusion intraveineuse via un cathéter. De plus, elles sont très compliquées et ne sont pas toujours adaptées pour étudier certains types de molécules comme les lipides (graisses). Ce projet a donc pour objectif de développer une méthode plus simple et plus efficace (avec l’utilisation d’un régime liquide spécial au lieu d’une chirurgie) pour suivre ces molécules dans le corps et de valider une technique d’analyse qui va permettre d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques auparavant). Une fois ces méthodes validées, elles permettront de mieux comprendre comment le métabolisme change quand certaines graisses (brunes et beiges) ne fonctionnent plus correctement au cours de l’âge. Ce projet sera réalisé sur deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de continuer d'étudier comment certaines graisses du corps (les tissus adipeux) en particulier brunes et beiges influencent le métabolisme, en particulier la gestion des lipides (les graisses), lorsqu'elles ne fonctionnent plus correctement. Si cette perte d’activité observée au cours de l'âge joue un rôle dans les problèmes du métabolisme, alors ces tissus pourraient devenir des cibles importantes pour maintenir un bon équilibre énergétique, favoriser un vieillissement en meilleure santé et diminuer la dépendance des personnes âgées. Par ailleurs, ce projet permettra grâce à l'utilisation d'un régime liquide de diminuer la souffrance des animaux en évitant une chirurgie. De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Procédures

Pour la totalité des souris, une prise de sang à la queue sera réalisée juste avant le changement de régime puis juste avant la mise à mort. Vingt-quatre animaux subiront une seule échographie, qui durera 30 minutes environ, sous anesthésie gazeuse pour mesurer leur debit sanguin. Douze animaux seront hébergés pendant deux mois à une température de 30°C (température dite de thermoneutralité). Toutes ces interventions seront réalisées dans un service de zootechnie.

Impact sur les animaux

Certaines nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - le stress des animaux au moment de leur réception, - le stress lié à l’individualisation des animaux en cas d’agressivité, - le stress lié aux prélèvements sanguins en raison de la contention nécessaire à la prise de sang, - le stress possible lié à la température d’hébergement de 30°C (30°C étant la température de thermoneutralité pour la souris c'est à dire température à laquelle la souris ne met pas en jeu le frisson et/ou l'augmentation du métabolisme énergétique pour réguler sa température corporelle)(par expérience cette température de 30°C n'engendre généralement pas de stress particulier), - le stress possible liè au changement de régime (toutefois ce régime liquide à été décrit comme sans stress).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever leurs tissus et organes ainsi que du plasma pour réaliser l'analyse des molécules du corps et étudier le devenir de ces molécules.

Remplacement

Notre projet consiste à mettre au point une méthode d'administration de molécules marqués et d'extraction de ces molécules afin d'étudier la distribution et le devenir de ces molécules dans l'organisme en entier dans un contexte d'inactivation des tissus adipeux. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme impliquant des échanges de molécules entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche. Les approches in vitro ne peuvant pas être envisagées car elles ne permettent pas d'avoir cet aspect intégré d'échanges de molécules. De même les approches in silico ne peuvent pas être utilisées car elles ne sont pas en capacité de modéliser la complexité du métabolisme de chacun des organes d'un idividu et les échanges de molécules qui ont lieu entre ces différents organes. Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les tissus adipeux bruns et beiges, a été bien étudiée.

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle observée concernant le métabolisme, pour chacune des conditions, 8 souris seront utlisées (4 souris supplémentaires seront utilisées comme contrôles non marquées). Ce nombre d'animaux est necessaire pour avoir 90% de chance de voir une différence significative sur la quantité de molécules marquées. Pour déterminer ce nombre de souris le logiciel EDA a été utilisé (outil d'analyse permettant de déterminer le nombre d'animaux en se basant sur le plan expérimental et les statistiques). De plus grâce à la validation de cette technique d'analyse qui permettra d'étudier tous les types de molécules en même temps (au lieu de l'utilisation de deux techniques) nous pourrons réaliser l'analyse sur une seule et même souris au lieu de deux. Ceci pourra optimiser et réduire le nombre d’animaux utilisé dans de futurs projets.

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour diminuer la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, en respectant les points limites préalablement définis. Les animaux seront placés en zone d’acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils seront pris en charge par le personnel compétent de la zootechnie qui vérifie leur état et place de l’enrichissement dans les cages pour diminuer le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux mâles issus de différents cartons de transport ne seront jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d’hébergement. Le caractère grégaire des souris sera respecté puisqu’elles ne seront jamais seules en cage (sauf si un isolement est nécessaire pour cause d’agressivité et de bagarres). Pour le transport entre les deux bâtiments, les animaux seront tranportés, à pieds, dans leur cages d'origines (pour diminuer le stress) placées dans un système de transport de type sac isotherme opaque fermé. Dix minutes plus tard à l'arrivée au second bâtiment, les animaux seront directement placés soit sur un portoir ventilé identique au premier bâtiment pour les souris hébergées à 21°C, soit dans une armoire à thermoneutralité similaire au premier bâtiment pour les souris hébérgées à 30°C afin de diminuer le stress. Les souris seront surveillées quotidiennement par le personnel de la zootechnie pour repérer des problèmes éventuels (comportement anormal, blessure, maigreur, problème de dentition, …). Elles seront également surveillées et pesées (par une personne impliquée dans le projet) tous les 15 jours pendant les deux mois d'hébergement à 30°C, en début et fin d'acclimatation au régime liquide puis toutes les 24h pendant l'exposition au régime liquide supplémenté avec le glucose marqué. La vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté seront contactés pour avis lorsque une souris présentera une perte de poids supérieure à 10% par rapport au poids initial et/ou sera prostrée, aura le poil hirsute, le dos rond, des signes de diarrhée (postérieur sale, souillé). Toute souris sera mis à mort quand elle présentera une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids initial et/ou après avis de la vétérinaire référente et/ou le zootechnicien expérimenté.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris puisque cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse du métabolisme et dans lequel la biologie des tissus adipeux, en particulier les graisses brunes et beiges, a été bien étudiée. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 4 mois et des souris âgées de 5 semaines afin que ces dernières aient environ 3 mois après les deux mois d'hébergement à 30°C. A cet âge les souris sont de jeunes adultes avec une graisse brune bien développée sur lequel nous pouvons induire un dysfonctionnement suite à l'hébergement à thermoneutralité (30°C).

Rendues obèses par un régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, 80 souris reçoivent aussi, sous anesthésie, un tatouage d'identification et une injection de vecteurs viraux AAV dans le muscle. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transportées vers un second établissement pour un test terminal avec injection d'insuline, glucose radiomarqué et trois prises de sang pour la moitié d'entre elles. La description des procédures affirme qu'après l'injection les souris "ne subiront ensuite qu'une expérimentation terminale", sans mentionner le régime que le porteur dit susceptible d'"engendrer un inconfort significatif". Toutes sont tuées et nécropsiées à l'issue pour prélever tissus et organes, et le porteur fixe leur nombre d'après ses "habitudes expérimentales".

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

Les souris gestantes ou allaitantes reçoivent des molécules actives ou un régime gras, puis leurs souriceaux sont identifiés par un prélèvement à l'oreille ou à la queue et, pour certains, injectés de molécules ou de vecteurs viraux. Viennent ensuite, selon les groupes, jusqu'à douze mois de régime gras, dix jours de restriction alimentaire, des jeûnes de 24 heures, des isolements de 24 heures à deux semaines, quatre expositions de 24 heures à 4 °C, et des chirurgies de deux à quatre heures pour enregistrer l'activité cérébrale. 12 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les tests de comportement prévus vers huit semaines ne sont pas nommés. La narration annonce la mise à mort des souris à l'issue des procédures, alors que le champ structuré en compte 500 réutilisées.

Objectifs

Les premiers mois de vie constituent une période essentielle pour le développement du cerveau et de l’organisme. Durant cette phase, des facteurs tels qu’une naissance prématurée, une alimentation maternelle déséquilibrée, des variations hormonales ou certaines maladies génétiques peuvent influencer durablement la santé. Ces perturbations précoces peuvent augmenter, à long terme, le risque de développer des troubles métaboliques (comme l’obésité ou le diabète), des problèmes de fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques), ainsi que des difficultés cognitives. Ce projet a pour objectif de mieux comprendre comment l’environnement précoce influence le développement du cerveau, en particulier les circuits neuronaux qui contrôlent des fonctions essentielles comme l’alimentation, l’équilibre énergétique et la reproduction. Plus précisément, ce projet vise à : - explorer l’impact des perturbations précoces sur le développement du cerveau et sur certaines fonctions essentielles tout au long de la vie, de la naissance à l’âge adulte ; - comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans ces processus ; - identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour prévenir ou corriger certaines maladies, comme l’obésité, le diabète ou les troubles de la fertilité (par exemple le syndrome des ovaires polykystiques). Ce projet se déroulera sur deux établissements utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2 et le transfert des animaux entre les établissements sera limité au maximum.

Bénéfices attendus

Les premiers mois de vie sont une période cruciale pour le développement du cerveau. Des perturbations durant cette phase, comme une naissance prématurée, des déséquilibres hormonaux ou une alimentation maternelle inadaptée, peuvent avoir des conséquences durables sur la santé de la descendance. Elles augmentent notamment le risque de troubles métaboliques (comme l’obésité, le diabète ou certaines maladies cardiovasculaires), de difficultés reproductives, ainsi que de troubles du développement cognitif à l’âge adulte. Les résultats de ce projet présentent un double intérêt. D’une part, ils permettront d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes cellulaires et neuronaux impliqués dans le développement postnatal des circuits cérébraux qui régulent ces fonctions essentielles. D’autre part, ils pourraient contribuer à la santé publique en ouvrant la voie à de nouvelles stratégies de prévention ou de prise en charge des maladies métaboliques et reproductives. Enfin, ces travaux participeront au développement de modèles expérimentaux plus fiables et mieux adaptés pour la recherche en endocrinologie, en neurodéveloppement et en reproduction.

Procédures

Les interventions décrites ici pourront avoir lieu dans les 2 établissements utilisateurs. Les interventions d’une même procédure auront lieu soit intégralement dans l’EU1/2 soit intégralement dans l’EU2/2. Aucun transport d’animaux n’aura lieu en cours de procédure. Les animaux dont le modèle aura été créé dans l’EU2/2 seront transportés vers l’EU1/2 pour l’évaluation métabolique et comportementale. Chez les mères: Des femelles gestantes et/ou allaitantes recevront des molécules actives (par voie orale ou par injection) ou feront l’objet d’interventions nutritionnelles (régime enrichi en graisses). Les effets de ces traitements seront évalués chez les souriceaux dès la naissance, au cours d’un suivi longitudinal à moyen et long terme. Ce suivi comprendra différentes procédures d’évaluation de la reproduction (à partir de 8 semaines), du métabolisme (entre 4 et 20 sem.), du comportement (vers 8 sem.) et de l’activité cérébrale (jusqu’à 8 sem.). Chez la descendance: Tous les animaux issus des mères gestantes seront identifiés et prélevés au niveau de l’oreille ou de la queue. Des souriceaux (mâles et femelles) recevront, à des âges définis, des injections de molécules ou de vecteurs viraux. Ils feront ensuite l’objet d’un suivi longitudinal similaire, incluant des analyses de la reproduction, du métabolisme, du comportement et de l’activité cérébrale. Types d’interventions et durée : Les animaux pourront recevoir différents types de traitements par voie orale, par injections ou implantation de dispositifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés (veines mandibulaire, caudale ou latérale), en respectant les volumes et fréquences maximaux autorisés. La durée de ces interventions est généralement comprise entre 5 et 20 minutes. Certains groupes seront soumis à des interventions chirurgicales dans le but d’évaluer la reproduction (anesthésie: 1h; intervention: 15 à 20 minutes) ou de réaliser un enregistrement de l’activité cérébrale (anesthésie et intervention: 2 à 4 h). Au cours de ces procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés chaque fois que nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par inhalation et l’analgésie sera administrée par injection ou par application locale. Les animaux impliqués dans l’étude du métabolisme pourront recevoir des régimes spéciaux (régime enrichi en graisses pendant 3 à 12 mois), une restriction alimentaire (jusqu’à 10 jours) ou des périodes de jeûne (durée maximale de 24 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner du stress, de la fatigue et un certain inconfort. Certaines procédures, telles que les interventions chirurgicales, les injections ou les prélèvements sanguins, peuvent provoquer des douleurs légères de courte durée pouvant être répétées. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les animaux seront soumis à des conditions d’hébergement dérogeant aux standards réglementés. En effet les animaux pourront être privés de leur congénères (sans isolement visuel et olfactif) pendant des durées allant de 24h à 2 semaines et pouvant être répétées. Les animaux pourront être restreints en quantité de nourriture (maximum 10 jours) et/ou être exposés à des jeûnes allant jusqu’à maximum 24h. Enfin, pour évaluer la réponse aux changements de température, les conditions standards de température d’hébergement pourront également modifiées (maximum 24h d’exposition à 4°C, 4 expositions au maximum espacées d’au minimum 72h OU 24-72h à 30°C).

Devenir

À l’issue des procédures, les animaux sont mis à mort selon des méthodes réglementaires et encadrées, afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Ces prélèvements sont indispensables pour comprendre en détail les mécanismes étudiés et ne peuvent pas être réalisés autrement.

Remplacement

Pour évaluer l’impact de l’environnement périnatal sur le développement des systèmes neuroendocriniens, il n’existe actuellement pas d’alternative à l’expérimentation animale. La complexité des phénomènes étudiés, notamment l’influence de l’environnement maternel sur le développement de l’organisme, implique des interactions étroites entre plusieurs organes (cerveau, tissus périphériques, systèmes hormonaux) qui ne peuvent pas être reproduites de manière fiable par des modèles informatiques. Les animaux invertébrés ne peuvent pas être utilisés dans ce contexte, car leur organisation biologique est très différente de celle des mammifères. Ils ne possèdent pas les mêmes structures cérébrales ni les mêmes systèmes hormonaux, ce qui ne permet pas d’étudier les mécanismes neuroendocriniens pertinents pour la santé humaine. Par ailleurs, les modèles in vitro, tels que les organoïdes ou les cellules souches, bien qu’utiles pour certaines questions spécifiques, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions entre les organes ni les réponses physiologiques intégrées de l’organisme entier. Or, ces interactions sont essentielles pour répondre aux objectifs de nos recherches en physiologie intégrée.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé à l’aide de calculs de puissance statistique, afin de garantir l’obtention de données fiables tout en limitant leur utilisation au strict minimum. La taille de chaque groupe expérimental a été définie à l’aide d’outils de planification adaptés, permettant d’éviter l’utilisation d’animaux en excès tout en assurant la robustesse des résultats. Par ailleurs, certaines expériences ne seront entreprises que si les résultats des étapes précédentes le justifient, ce qui permet d’éviter des expérimentations inutiles. Enfin, les protocoles expérimentaux ont été conçus pour optimiser l’utilisation de chaque animal. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’analyses seront réalisés sur un même individu (par exemple, des évaluations physiologiques et des analyses moléculaires sur différents organes), réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions strictement contrôlées, garantissant leur bien-être et un bon état de santé. Ils ont accès en permanence à l’eau et à la nourriture, et leur environnement est enrichi (par exemple avec des matériaux pour construire un nid), afin de leur permettre d’exprimer des comportements naturels et de réduire le stress. Les manipulations sont réalisées par du personnel formé et les animaux sont progressivement habitués à être manipulés afin de diminuer leur stress. Une attention particulière est portée à la réduction de toute douleur, peur ou inconfort. Lorsque des interventions sont nécessaires, elles sont réalisées sous anesthésie adaptée et des traitements contre la douleur sont administrés si besoin, avant et après les procédures. Après chaque intervention, les animaux sont surveillés attentivement jusqu’à leur réveil complet, puis leur état de santé est suivi quotidiennement (activité, alimentation, poids, comportement) avec le moins de perturbations possibles. Une attention particulière sera apportée afin de prévenir tout transfert d‘odeurs étrangères à la cage qui pourraient compromettre le lien entre la mère et ses petits. Des critères précis sont définis pour intervenir rapidement en cas de problème. Si un animal montre des signes de souffrance ou de détresse, il est immédiatement pris en charge et, si nécessaire, retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance prolongée. Dans le cadre des études métaboliques ou comportementales, les différentes contraintes sont appliquées de manière séquentielle avec des périodes de récupération permettant la stabilisation physiologique entre étapes et les animaux disposent d’un enrichissement compatible avec les mesures (litière et matériel de nidification). Lors du déplacement des animaux de l’EU2/2 vers l’EU1/2, les animaux seront transportés dans un véhicule climatisé dans des cages de transport agréées sous condition d’autorisation pour le statut sanitaire (distance 11,1 km ; statuts sanitaires équivalents) entre les EU. Les animaux seront acclimatés pour une période de 7 jours sur le site d’accueil avant toute manipulation. Des points limites ont été définis et seront appliqués. Tout animal présentant des signes s’approchant ou atteignant l’un d’entre eux seront retirés de l’étude et si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre les interactions entre le corps et le cerveau afin d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. Nous étudierons des souris de la naissance à l’âge adulte afin de couvrir l’ensemble des étapes clés du développement et de la maturation des systèmes biologiques. La période néonatale correspond à une phase critique de mise en place et d’organisation des structures, notamment au niveau neuroanatomique et neuroendocrinien, tandis que l’âge adulte reflète un état fonctionnel stabilisé de ces systèmes. Cette approche permet d’appréhender la dynamique des mécanismes physiologiques au cours du temps et d’identifier d’éventuelles origines développementales aux altérations observées à l’âge adulte. Le recours aux animaux est strictement limité aux situations dans lesquelles aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un niveau d’information équivalent. L’espèce utilisée a été choisie de manière à maximiser la pertinence scientifique tout en minimisant la douleur, la souffrance et le nombre d’animaux utilisés. La souris est privilégiée car des données essentielles à l’interprétation des résultats ne sont disponibles que dans cette espèce, ce qui contribue également à réduire la variabilité expérimentale et, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les études physiologiques en neuroendocrinologie ainsi que les recherches sur l’obésité et l’infertilité ont historiquement été menées chez la souris, facilitant la comparaison avec les données existantes. Enfin, certaines expériences proposées nécessitent l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour lesquels la souris constitue de loin le modèle expérimental le plus pertinent et le mieux caractérisé.

180 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, chacun passant environ cinq heures par séance dans un dispositif qui mesure sa consommation d'oxygène puis le fait nager contre un courant dont la vitesse augmente progressivement. Chaque poisson reçoit d'abord un marquage sous la peau sous anesthésie, de dix à quinze minutes, puis vit à 20, 25 ou 30 degrés pendant une semaine ou environ deux mois selon le groupe. À chaque étape, deux poissons par aquarium sont anesthésiés profondément, saignés et mis à mort sans réveil, les autres subissant le même sort à la fin du protocole, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur justifie le choix du médaka par sa tolérance de 0 à 40 degrés, sa reproduction rapide, et par la plateforme d'élevage dont l'INRAE d'Aix-en-Provence dispose déjà.

Objectifs

Le réchauffement climatique entraîne une augmentation de la température des rivières, des lacs et des autres milieux aquatiques. Cette hausse peut avoir des conséquences importantes pour les poissons d’eau douce, car leur température corporelle dépend directement de celle de l’eau. Lorsque l’eau se réchauffe, leurs besoins en énergie et en oxygène augmentent. On ne comprend cependant pas encore complètement comment les poissons parviennent à s’adapter lorsqu'ils sont exposés à des températures élevées pendant une longue période. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux poissons de s’adapter à ces changements de température. Les chercheurs étudieront notamment la manière dont leur organisme utilise l’oxygène et produit l’énergie nécessaire à leur fonctionnement, afin de déterminer pourquoi certains poissons supportent mieux la chaleur que d’autres. Pour cela, l’étude sera réalisée sur une espèce de petit poisson appelée médaka (Oryzias latipes). Les poissons seront maintenus dans des aquariums à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Une partie des animaux sera étudiée après une semaine d’exposition, et une autre après environ deux mois, afin de comparer les effets à court et à long terme. Les chercheurs mesureront leur consommation d’oxygène, leurs capacités physiques ainsi que certains paramètres de leur sang et du fonctionnement de leurs cellules. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre la capacité des poissons à s’adapter au réchauffement des eaux. Ils contribueront à mieux prévoir les effets du changement climatique sur les espèces aquatiques et pourront aider à orienter les actions de protection de ces milieux.

Bénéfices attendus

L’étude des effets du changement climatique sur les poissons d’eau douce est essentielle pour mieux comprendre et protéger les milieux aquatiques. Lorsque la température de l’eau augmente, le fonctionnement de leur organisme peut être perturbé. Cette augmentation de température entraîne également une diminution de la solubilité de l’oxygène dans l’eau, réduisant ainsi sa disponibilité pour les organismes aquatiques. Les poissons sont donc confrontés à une double contrainte physiologique : une augmentation de leurs besoins en oxygène liée à l’accélération de leur métabolisme, alors même que la quantité d’oxygène disponible dans leur environnement diminue. Toutefois, la réponse des poissons au réchauffement ne dépend pas uniquement de la disponibilité en oxygène du milieu, mais également de leur capacité à transporter, diffuser et utiliser cet oxygène au niveau des tissus.. Le projet EPO a pour objectif de mieux comprendre comment les poissons réagissent lorsque l’eau se réchauffe. Les chercheurs étudieront la manière dont leur organisme transporte et utilise l’oxygène, depuis la respiration de l’animal jusqu’au fonctionnement de ses cellules. En mesurant leur consommation d’oxygène, en analysant certaines caractéristiques de leur sang et le fonctionnement de leurs cellules, ils chercheront à déterminer si les difficultés rencontrées à haute température sont dues à un transport insuffisant de l’oxygène, à une mauvaise utilisation de celui-ci par les cellules, ou à une combinaison de ces deux phénomènes. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre pourquoi certaines espèces supportent mieux le réchauffement que d’autres. Ils aideront à mieux prévoir les conséquences du changement climatique sur les populations de poissons et apporteront des connaissances utiles pour la protection et la gestion des écosystèmes aquatiques.

Procédures

Après leur arrivée et une période d’adaptation dans l’animalerie, les médakas seront répartis dans des aquariums maintenus à trois températures différentes : 20, 25 ou 30 °C. Chaque poisson recevra un petit marquage sous la peau, réalisé sous anesthésie, afin de pouvoir le reconnaître et suivre son évolution tout au long de l’étude. Cette intervention durera environ 10 à 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite étudiés dans un dispositif permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ils seront placés dans ce dispositif environ une à deux heures avant les mesures afin de réduire le stress lié aux manipulations. Les chercheurs mesureront d'abord leur consommation d’oxygène au repos, puis leur demanderont de nager face à un courant dont la vitesse augmentera progressivement afin d'évaluer leurs capacités physiques. Chaque séance de mesure durera environ cinq heures par poisson. Au début de l'étude, puis après une semaine et après environ deux mois d'exposition aux différentes températures, les poissons seront pesés, mesurés et soumis à ces mesures de consommation d’oxygène. À chacun de ces moments, deux poissons par aquarium seront anesthésiés profondément afin de réaliser un prélèvement de sang. Ils seront ensuite mis à mort pour permettre l'analyse de certains organes et cellules, indispensable pour comprendre comment leur organisme produit et utilise l'énergie.

Impact sur les animaux

Les principales contraintes pour les poissons sont liées aux différentes manipulations nécessaires au suivi de l’étude. Ils recevront un petit marquage individuel sous anesthésie, seront régulièrement manipulés pour être pesés et mesurés, et participeront à des tests permettant de mesurer leur consommation d’oxygène et leurs capacités de nage. Ces manipulations peuvent provoquer un stress temporaire, une respiration plus rapide pendant un court moment, ainsi qu'une fatigue passagère après les tests de nage. Le marquage peut également entraîner une légère irritation au niveau de la zone d’injection. Après chaque anesthésie, les poissons seront surveillés jusqu’à leur récupération complète avant d’être replacés dans leur aquarium. Les poissons seront maintenus à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Ces températures sont adaptées à cette espèce et correspondent à des conditions qu'elle peut rencontrer dans son environnement. Les changements de température seront réalisés progressivement afin de limiter le stress. La qualité de l’eau, notamment sa température, son oxygénation et ses autres paramètres, sera contrôlée régulièrement tout au long de l’étude pour garantir de bonnes conditions de vie. Les poissons seront observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Les chercheurs surveilleront notamment leur comportement, leur alimentation, leur respiration et leur façon de nager. Si un poisson présente des signes de souffrance ou un problème de santé persistant, il sera retiré de l’étude et pris en charge selon les procédures prévues. Les prélèvements de sang et de tissus seront réalisés uniquement sur des poissons profondément anesthésiés. Ils seront ensuite mis à mort sans être réveillés. L'ensemble du projet a été conçu pour limiter autant que possible le nombre de manipulations, le stress et les effets sur les animaux, tout en permettant de répondre aux objectifs scientifiques de l'étude.

Devenir

À l’issue des différentes étapes expérimentales, certains poissons seront mis à mort afin de réaliser les prélèvements sanguins et tissulaires indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Ces prélèvements doivent être effectués immédiatement après la mise à mort afin de préserver l’intégrité fonctionnelle des tissus et des cellules utilisés pour les analyses, notamment celles portant sur la respiration mitochondriale. Les autres poissons seront maintenus dans leurs conditions expérimentales jusqu’à la fin du protocole. Ils seront ensuite également mis à mort afin de permettre la réalisation des analyses terminales prévues dans le projet. Le nombre d’animaux utilisés et mis à mort a été limité au strict minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la robustesse des analyses, conformément au principe de Réduction.

Remplacement

À ce jour, il n’existe pas de méthode permettant de remplacer l’utilisation de poissons vivants pour cette étude. Les chercheurs doivent observer le fonctionnement de l’animal dans son ensemble afin de comprendre comment il réagit lorsque la température de l’eau augmente. Les expériences réalisées sur des cellules ou les modèles informatiques ne permettent pas de reproduire fidèlement le fonctionnement d’un organisme vivant. L’utilisation de poissons est donc indispensable pour comprendre comment ils s’adaptent au réchauffement de leur environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs du projet tout en obtenant des résultats fiables. Les poissons seront répartis dans plusieurs aquariums et exposés à trois températures différentes (20, 25 et 30 °C). Les mêmes poissons seront suivis tout au long de l’étude afin de réaliser plusieurs mesures sur les mêmes individus, ce qui permet de recueillir davantage d’informations sans utiliser plus d’animaux. Seul un petit nombre de poissons sera mis à mort à chaque étape de l’étude pour réaliser les analyses qui nécessitent des prélèvements de sang et de tissus. Enfin, le marquage individuel des poissons permettra de suivre chaque animal au cours de l’étude et de limiter le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les poissons sont maintenus dans des conditions adaptées à leurs besoins afin de préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Ils sont élevés en groupes dans des aquariums aménagés avec des refuges et des plantes pour limiter le stress et favoriser leurs comportements naturels. Ils sont nourris quotidiennement et la qualité de l’eau est contrôlée régulièrement. Les animaux sont observés chaque jour et, en cas de problème, des mesures sont prises immédiatement. Si nécessaire, le vétérinaire est consulté et un poisson peut être isolé en aquarium de quarantaine. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé. Les procédures susceptibles d’être stressantes sont effectuées sous anesthésie afin de limiter la douleur et le stress. Les poissons sont manipulés avec précaution, dans un environnement calme, puis replacés dans leur aquarium après une période de récupération. Leur état est surveillé tout au long de l’étude et tout animal présentant des signes persistants de souffrance est retiré de l’expérimentation conformément aux points limites définis dans le projet.

Choix des espèces

Le médaka est un petit poisson particulièrement adapté à cette étude, car il peut vivre dans une large gamme de températures (de 0 à 40 °C). Il permet ainsi de mieux comprendre comment les poissons s’adaptent au réchauffement de leur environnement. Cette espèce se reproduit rapidement, est facile à élever et supporte bien les manipulations nécessaires à l’étude. L’INRAE d’Aix-en-Provence dispose déjà d’une plateforme d’élevage dédiée à cette espèce, avec des installations adaptées et du personnel expérimenté, garantissant de bonnes conditions d’hébergement et le bien-être des animaux.

Cinquante-deux semaines de régime enrichi en graisses, en sucres et en cholestérol, l'ablation des deux ovaires, quarante-quatre heures en cage individuelle : 4 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par dislocation cervicale pour prélèvement des tissus. S'y ajoutent six prises de sang à la joue après six heures de jeûne, quatre échographies cardiaques sous anesthésie, des gavages ou injections suivis d'une incision de la queue et d'un prélèvement toutes les quinze minutes pendant deux heures. L'objet déclaré est de comprendre pourquoi les œstrogènes protègent les femmes des maladies chroniques du foie, en supprimant ces hormones chez des souris femelles pour observer ce qui se passe ensuite. Le porteur écrit que la souris est le "meilleur modèle expérimental" parce que des lignées transgéniques dépourvues des deux protéines étudiées existent déjà dans le foie.

Objectifs

Le syndrome métabolique touche actuellement 38% de la population mondiale. Au niveau du foie, les complications de ce syndrome se caractérisent par une accumulation de graisses dans cet organe. Ce stade précoce et bénin peut évoluer vers des stades plus graves, caractérisés par une inflammation et une fibrose conduisant à une dysfonction de l’organe. L’ensemble de ces atteintes hépatiques chroniques, nommées hépatopathies métaboliques (HM), représentent la première cause de transplantation de foie et sont associées à des complications cardiaques. Comprendre les mécanismes contrôlant la progression des HM est crucial pour identifier les patient(e)s à risque et développer des traitements préventifs et/ou curatifs actuellement inexistants. Les données cliniques et scientifiques montrent que les femmes sont protégées de la survenue et de la progression de ces HM et de leurs complications grâce aux hormones sexuelles féminines, les œstrogènes. Dans ce projet nous souhaitons déterminer le rôle de 2 protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie dans la progression des HM. Ce projet permettra de comprendre la fonction des hormones sexuelles à l’origine des différences liées au sexe dans la susceptibilité aux HM. Il nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire, car, à l'heure actuelle, les modèles et lignées cellulaires disponibles ne permettent pas de reproduire la complexité du système hormonal et ne conservent pas leurs caractéristiques sexuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera donc des connaissances essentielles permettant de comprendre les mécanismes protégeant les femmes du développement de ces maladies. Il permettra l’élaboration de stratégies thérapeutiques préventives et /ou curatives adaptées au sexe contre ces atteintes hépatiques qui représentent aujourd'hui la première cause de transplantation de foie dans le monde.

Procédures

Les animaux anesthésiés subiront une opération chirurgicale de 15 minutes avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire – La moitié des animaux auront une alimentation riche en graisse et en sucre pendant 52 semaines et seront hébergés à thermoneutralité - les animaux vigiles seront placés en isolement pendant 90 à 120 secondes, à trois reprises - A 6 reprises nous serons amenés à effectuer des prises de sang à la joue des souris vigiles après 6 heures de jeûne (1 minute par animal) – A 4 reprises, les animaux anesthésiés auront une échographie cardiaque d’environ 10 minutes pour chaque animal - Les animaux vigiles recevront soit un gavage soit une injection d’une durée de 20 secondes par animal suivi par une incision au niveau de la queue et le prélèvement d’une goute de sang toutes les 15 minutes sur une durée totale de 2h - A 2 reprises les animaux seront transportés dans leurs cages d’origine dans un autre établissement (durée inférieure à 10 minutes) - Les animaux seront mis dans des cages individuelles pour une durée totale de 44 heures. « A la fin de l'expérimentation une prise de sang sur chaque animal vigile sera effectuée et, directement après, il sera mis à mort.

Impact sur les animaux

Pour l’ovariectomie, c'est-à-dire l'ablation des 2 ovaires, comme pour tout autre acte de chirurgie, les risques attendus sont majoritairement des complications post-opératoires comme des infections, hémorragies, des adhérences internes et des problèmes de cicatrisation (fils cassés). De plus, même si la prise en charge de la douleur est totale lors de cette procédure, l’animal peut ressentir une gêne temporaire lors du réveil dont les signes sont le poil hérissé, l’isolement des congénères et/ou une perte de poids supérieure à 10%. Enfin, des fils de suture peuvent être arrachés les jours suivant l’opération. De plus, les animaux pourraient subir plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourrait survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min) lors des 52 semaines de régime western diet (régime enrichi en graisse, sucres et cholestérol) ou encore lors de la détermination de leur composition corporelle et des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 10 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors des prises de sang ou lors des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline ou encore lors des injections intrapéritonéales. Également, un stress pourrait être subit par les animaux liés à l’isolation de leurs congénères lors des mesures de la composition corporelle ou des mises en cage à métabolisme.

Devenir

A l'issu de la procédure tous les animaux seront euthanasiés par dislocation des cervicales.

Remplacement

Les effets sur tout l'organisme des hormones sexuelles dont les œstrogènes, synthétisés majoritairement par les ovaires, font intervenir des dialogues inter-organes, notamment centraux, et inter-cellulaires à l’échelle de l’organisme qui restent encore non modélisables par des approches cellulaires. Des modèles alternatifs ont été décrits pour l’étude des HM, notamment des modèles de lignées cellulaires d'hépatocytes incubés avec des cocktails de graisses et de sucres permettant de mimer le stockage de graisses dans les cellules qui est caractéristique des HM. Cependant ces modèles ne permettent pas encore d’étudier l’effet des hormones sexuelles et leur rôle dans le développement de l'inflammation et de la fibrose hépatique, qui sont des éléments majeurs dans le développement des complications liées aux HM. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre l'impact physiologique des hormones sexuelles à l'échelle de l'organisme.

Réduction

Nous avons soigneusement conçu les expériences pour, à la fois, répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs, c'est-à-dire 10 animaux par groupe expérimental. Ainsi, le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur les résultats antérieurs d'études similaires.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées conformes à la directive européenne. Du papier et du carton sont fournis pour permettre aux souris de fabriquer des nids et exprimer des comportements naturels. Des tunnels en carton favorisent leur activité physique et leurs interactions sociales. La préhension des animaux se fera grâce à un tube en plastique pour soulever les animaux. Une grille de scoring, en collaboration avec les zootechniciens, permet de surveiller en temps réel l'état de santé et de confort des animaux et d'adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Lors de l'ablation des ovaires, la diminution de la température corporelle sera limitée par un tapis chauffant. Un gel occuloprotecteur préviendra le dessèchement des yeux. La douleur et la sédation seront contrôlées par des injections d'analgésiques et l'inhalation d'anesthésiants. Les complications post-opératoires potentielles incluent le développement d’infections, d’hémorragies, d’adhérences internes et des problèmes de cicatrisation. Une injection supplémentaire d'analgésique sera réalisée 6h après l'opération pour éviter toute gêne au réveil. Une surveillance quotidienne sera assurée pendant 7 jours. En cas de signes de douleur (poils hérissés, isolement, perte de poids >10%), une intervention analgésique sera initiée en concertation avec le vétérinaire. Si les symptômes persistent, l’animal sera mis à mort par dislocation des cervicales. En cas de déchirure des fils de suture le lendemain, une réintervention sous anesthésiants et analgésiants sera effectuée sous surveillance stricte. Pour les prélèvements de sang sur animal vigile, les animaux seront laissés au maximum libres de leurs mouvements. Les animaux sont transportés suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont gardés dans leur cage d’origine pour le transport d’une durée de moins de 10 minutes avant l'euthanasie. Pour les mâles aussi bien que pour les femelles, la répartition des animaux dans les cages n’est pas modifiée par rapport à leur arrivée en zootechnie d’expérimentation.

Choix des espèces

Dans ce projet nous souhaitons étudier le rôle de deux protéines importantes pour le métabolisme des graisses dans le foie et impliquées dans la progression des HM. Donc la souris est le meilleur modèle expérimental car il existe des modèles transgéniques dans lesquels ces protéines ont été supprimées dans le foie spécifiquement. Aussi, dans les études publiées par différentes équipes, les mécanismes métaboliques sont pour beaucoup bien décrits chez la souris, avec une transposabilité à l'Homme élevée. En conséquence, la souris demeure une espèce de choix pour ce projet de recherche basé sur les effets des hormones sexuelles sur la progression des HM et leurs conséquences cardiaques. Les animaux seront utilisés entre 8 et 12 semaines d’âge, correspondant à la phase de fin de croissance et de maturité sexuelle et hépatique.

Quatre lignées de souris à phénotype dommageable développent des lymphomes spontanés à partir de cinq mois, et des tumeurs intestinales à partir de six mois en condition d'obésité. 720 souris de ces lignées vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une alimentation qui les rend obèses, un traitement injecté dans le péritoine, des palpations abdominales deux fois par semaine, et pour les tests métaboliques une mise à jeun la veille puis des prélèvements de sang répétés à la veine de la queue après incision. Le porteur décrit des masses tumorales pouvant entraîner diarrhées, prolapsus, signes d'anémie, et annonce la mise à mort en fin d'expérimentation "afin de réaliser des prélèvements terminaux".

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de cancers digestifs.

Procédures

Les souris seront soumises ou non à un régime alimentaire les rendant obèse, puis un traitement leur sera administré intra-péritonéalement (temps estimé : 15 secondes). Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesés 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, les souris seront, à l'occasion de la pesée, palpées au niveau abdominal (temps estimé : 15 secondes). Pour les tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun la veille. Ensuite, les souris recevront une injection intrapéritonéale de glucose ou d'insuline (temps estimé : 15 secondes). A l’issue de l'injection, des prélèvements sanguins seront effectués (temps estimé : 30 secondes) à la veine caudale après incision transversale légère au niveau de la queue à intervalles de temps réguliers pour mesurer la glycémie ou une éventuelle intolérance à l’insuline.

Impact sur les animaux

Le phénotype attendu des animaux est le développement le développement spontané de lymphomes à partir de 5 mois de vie et en condition d’obésité, des tumeurs intestinales, à partir de 6 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes : développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles digestifs (diarrhées, prolapsus notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. À ces effets liés au modèle s’ajoutent les nuisances expérimentales : les manipulations et contentions répétées peuvent être sources de stress pour les animaux. L’administration de tamoxifène est également susceptible d’induire des effets indésirables transitoires, tels qu’une gêne locale. Enfin, les prélèvements sanguins répétés peuvent engendrer une douleur légère à modérée au point de prélèvement, ainsi qu’un stress associé à la manipulation, et, en cas de répétition rapprochée, un risque d’affaiblissement ou d’anémie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux

Remplacement

Les questions posées dans ce projet portent sur la manière dont les tumeurs apparaissent et évoluent au fil du temps. Pour y répondre, il est nécessaire d’utiliser des souris, car elles permettent d’étudier le fonctionnement du corps dans son ensemble. En effet, le comportement des cellules cancéreuses, notamment leur métabolisme, peut être très différent entre des expériences en laboratoire (sur cellules isolées) et un organisme vivant. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier ces phénomènes de façon aussi complète. L’utilisation de souris reste donc indispensable, en particulier pour comprendre les premières étapes de formation des tumeurs. Enfin, ce projet vise aussi à étudier les interactions entre différents organes et la tumeur, ainsi qu’à identifier des marqueurs détectables dans le sang. Ces objectifs nécessitent obligatoirement une étude sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant de devoir refaire les expériences. Seuls les régimes alimentaires ayant montré les effets les plus marqués seront testés. Chaque groupe comprendra 20 souris (10 par type d’alimentation), ce qui permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour tirer des conclusions solides. Pour analyser les résultats, nous comparerons la croissance des tumeurs entre les différents groupes au fil du temps, ainsi que les caractéristiques biologiques des tumeurs prélevées. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour comparer les données entre groupes. Au total, sur les 5 ans du projet, jusqu’à 720 souris pourront être utilisées, réparties en plusieurs groupes expérimentaux. Ce nombre repose sur des calculs statistiques ainsi que sur l’expérience du laboratoire avec des modèles similaires

Raffinement

Ces 4 lignées à phénotype dommageable présentent des caractéristiques phénotypiques spécifiques liées à l’émergence de lymphomes spontanés dont il faudra tenir compte. Un examen journalier des animaux inclus dans les groupes expérimentaux sera effectué pour renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux associés à une douleur liée à l’émergence de tumeurs (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté…). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation jointe en annexe qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton)). Les groupes expérimentaux seront réalisés de telle sorte à limiter la présence d’animaux isolés.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel, traitées à partir de 7 semaines, âge correspondant à leur maturité sexuelle.

Greffées avec des adipocytes bruns, puis exposées jusqu'à quatre fois à une température de 4 degrés pendant vingt-quatre heures, 1 238 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent des prélèvements sanguins répétés, des chirurgies sous anesthésie et un isolement pouvant durer deux semaines en cage métabolique. L'objet est de tester si une greffe de tissu adipeux brun corrige les troubles métaboliques et reproductifs du syndrome des ovaires polykystiques, que le porteur dit toucher 13 % des femmes en âge de procréer. Cent soixante femelles et cinquante-quatre mâles passent d'une procédure à l'autre et sont réutilisés pour les tests de fertilité avant d'être mis à mort, le porteur indiquant que le prélèvement des organes interdit de les garder en vie.

Objectifs

Le présent projet vise à évaluer les effets de la transplantation d’adipocytes bruns, obtenus à partir de tissu adipeux murin ou d'adipocytes bruns humains obtenus in vitro en 3 dimensions (BAToïdes), sur les altérations métaboliques, hormonales et reproductives associées au syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Le SOPK est une pathologie fréquente, touchant environ 13 % des femmes en âge de procréer. Elle se caractérise par des troubles métaboliques, hormonaux et reproductifs, souvent associés à une altération de la qualité de vie. À ce jour, il n’existe pas de traitement curatif, et la prise en charge repose principalement sur des approches symptomatiques. L’objectif est de déterminer si cette approche de thérapie cellulaire permet de moduler les déséquilibres physiopathologiques observés dans cette pathologie, en particulier au niveau des interactions entre les systèmes métaboliques, endocrinien et reproducteur. Le recours à un modèle animal est indispensable à ce stade afin d’évaluer, dans un organisme entier, la faisabilité, la tolérance et les effets de cette approche. En effet, la complexité des interactions systémiques impliquées dans le SOPK ne peut pas être reproduite de manière fiable par des approches in vitro ou in silico. Cette étape préclinique constitue un préalable nécessaire à l’évaluation de la pertinence de cette stratégie dans une perspective translationnelle. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif d’explorer une stratégie innovante visant à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués et à identifier de nouvelles pistes d’intervention thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les troubles métaboliques et endocriniens, tels que ceux observés dans le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK), représentent un enjeu majeur de santé publique en raison de leur prévalence, de leur impact sur la qualité de vie et des coûts socio-économiques associés. Le SOPK est notamment caractérisé par des altérations métaboliques (dont la résistance à l’insuline) et des dysfonctionnements de la reproduction, pour lesquels les options thérapeutiques actuelles restent limitées et essentiellement symptomatiques. Dans ce contexte, ce projet vise à améliorer la compréhension des interactions entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur, en particulier le rôle du tissu adipeux brun dans la régulation de ces fonctions. En explorant les effets de la transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin pertinent de SOPK, ce travail permettra d’identifier de nouveaux mécanismes physiopathologiques impliqués dans cette pathologie. Les connaissances générées pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles d’intervention et ouvrir des perspectives pour le développement de stratégies innovantes dans la prise en charge des troubles métaboliques et de la fertilité. Plus largement, ce projet s’inscrit dans les priorités actuelles de recherche en santé, notamment en lien avec la santé des femmes, et pourrait participer à l’amélioration de la prise en charge de pathologies chroniques ayant un impact important sur la qualité de vie et le bien-être à long terme.

Procédures

Pour l’ensemble des gestes décris dans les 3 procédures, nous aurons recours à l’utilisation d’anesthésiques (uniquement dans une procédure) et d’analgésiques aussi souvent que cela sera nécessaire. Les anesthésies seront réalisées par injection ou par voie gazeuse. Une injection d’analgésique adapté sera réalisée avant la chirurgie et/ou après si nécessaire. Les injections n’excèderont jamais 20 μl/g de poids corporel. Les animaux feront l'objet d'administration de traitements et de prélèvements selon les volumes et fréquences recommandées par la littérature et dans le respect de la réglementation en vigueur. Des prélèvements sanguins par différentes voies réalisés au cours des procédures de phénotypage seront effectués avec des fréquences et volumes inférieurs aux recommandations bibliographiques et à la réglementation en vigueur. Un isolement de maximum 2 semaines (sans rupture du lien olfactif ou visuel) sera nécessaire pour une partie des animaux afin de pouvoir mesurer des caractéristiques de manière individuelle.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations expérimentales sont susceptibles d’induire un stress, une fatigue ou un inconfort transitoire chez les animaux. Afin de limiter ces effets, l’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel formé et compétent, et les animaux seront préalablement habitués aux manipulations. Certaines interventions, telles que les injections, les prélèvements sanguins ou les procédures chirurgicales, peuvent entraîner des douleurs de courte durée. Celles-ci seront systématiquement limitées par l’utilisation de protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés, ainsi que par une surveillance attentive des animaux pendant et après les interventions. Dans le cadre de certaines analyses, notamment en cages métaboliques, les animaux pourront être hébergés individuellement pendant une durée limitée. Cet isolement sera restreint au strict nécessaire et réalisé dans des conditions permettant le maintien d’interactions sensorielles (contacts visuels, olfactifs et auditifs) avec les congénères, afin de réduire le stress associé. Plus généralement, une surveillance régulière de l’état général, du comportement et du poids des animaux sera mise en place tout au long du protocole, permettant d’identifier précocement tout signe de mal-être et d’adapter les conditions expérimentales si nécessaire. Afin d’étudier l’influence de la température sur la réponse métabolique, les animaux seront exposés à une température de 4°C (atteinte progressivement) pour une durée maximale de 24h et sous surveillance constante. Cette exposition sera effectuée au maximum 4 fois.

Devenir

Les animaux décrits en procédure 1 seront transférés en procédure 2 ou 3 et seront mis à mort à la fin de ces dernières. Les 160 femelles et 54 mâles du projet seront réutilisés pour les tests de fertilité en procédure 3 puis seront mis à mort à l’issue de celle-ci. La nécessité de prélever les organes pour analyses ne nous permet pas de les garder en vie.

Remplacement

Dans la mesure du possible, des approches alternatives seront utilisées afin de réduire le recours à l’expérimentation animale. Celles-ci incluent notamment des cultures cellulaires, des modèles dérivés de cellules souches ainsi que des modèles tridimensionnels de type organoïdes ou adipocytes bruns différenciés in vitro. Dans le cadre de ce projet, des adipocytes bruns humains générés in vitro seront également utilisés afin de limiter le recours à des tissus animaux. Par ailleurs, certains tissus et cellules issus des animaux utilisés dans les procédures expérimentales pourront être exploités ex vivo pour la réalisation de cultures primaires et d’analyses fonctionnelles, permettant ainsi de réduire le nombre de composés et d’expérimentations complémentaires à réaliser in vivo. Cependant, l’étude des interactions complexes entre les systèmes métabolique, endocrinien et reproducteur dans le contexte du syndrome des ovaires polykystiques nécessite une approche intégrée à l’échelle de l’organisme entier. Les effets attendus de la transplantation d’adipocytes bruns sur le métabolisme, la fonction hormonale et la fertilité impliquent des communications multi-organes (tissu adipeux, cerveau, gonades, foie) qui ne peuvent actuellement pas être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro ou in silico. Bien que des modèles cellulaires et computationnels soient en cours de développement et puissent contribuer à certaines étapes exploratoires, ils ne permettent pas à ce jour de reproduire la complexité des régulations systémiques étudiées dans ce projet. Ainsi, le recours au modèle animal demeure indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les connaissances générées pourront néanmoins contribuer au développement futur de modèles alternatifs et à la réduction progressive du recours à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’effectif de chaque groupe par procédure a été calculé à l’aide d’outils statistiques spécifiquesen tenant compte de (i) la définition de la taille minimale des groupes expérimentaux à utiliser pour obtenir des résultats probants, qui seront ajustés en fonction des différentes variables, elles-mêmes évaluées dans chaque expérience et (ii) la coordination des études à leur conception afin de permettre la collecte de plusieurs échantillons / tissus chez les mêmes individus ou d'entreprendre des analyses multiples chez des animaux individuels chaque fois que possible.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans le respect strict des conditions standard d’hébergement définis par la réglementation. L’eau et la nourriture sont fournies ad libitum. Un enrichissement est ajouté dans la cage (à minima des cylindres de coton pour stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation). Les périodes d’isolement sont limitées, justifiées et un enrichissement adapté est apporté. Les manipulations sont effectuées par du personnel formé, et les animaux sont habitués aux manipulations afin de limiter le stress. Une attention particulière est accordée au principe de raffinement, en portant l’attention aux différentes procédures expérimentales appliquées aux animaux afin de minimiser la peur, l'angoisse (ex: regroupement et enrichissement de l'environnement) ou la souffrance (ex : soins péri-opératoires, asepsie, anesthésie et analgésie) qu'ils pourraient endurer. Toutes les procédures potentiellement invasives sont réalisées sous anesthésie adaptée, associée à une analgésie préventive et postopératoire lorsque nécessaire, afin de prévenir toute douleur. Une observation continue des animaux est assurée jusqu’au réveil complet après toute intervention nécessitant une anesthésie. Par la suite, une surveillance quotidienne de l’état général et du comportement est réalisée tout au long des procédures expérimentales, incluant l’évaluation de l’activité, de la posture, de l’aspect du pelage, de la prise alimentaire et hydrique ainsi que du poids corporel. Des critères d’arrêt sont définis et appliqués. Tout animal présentant des signes de souffrance, de détresse persistante, de perte de poids excessive ou d’altération de l’état général sera immédiatement retiré de l’étude et, si nécessaire, mis à mort.

Choix des espèces

Nos projets de recherche en physiologie intégrée visent à comprendre le lien entre les différents organes afin d’identifier de nouvelles thérapies pour des pathologies telles que le diabète, l’obésité et l’infertilité. La souris, modèle d’étude largement validé en physiologie intégrée, nous permet de nous appuyer sur un socle de connaissances scientifiques solide. De plus, le modèle que nous utilisons dans ce projet est un modèle établi dans le laboratoire (présentant l’avantage d’une durée de gestation courte dans le cadre de notre étude) et validé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux. Des souris mâles et femelles seront utilisées à deux stades de développement correspondant aux greffes : P21 (post sevrage) et 6 semaines (jeunes adultes), afin d’évaluer l’impact du timing de transplantation d’adipocytes bruns dans un modèle murin de SOPK.