Système musculosquelettique

Deux examens d'IRM de trois heures chacun sous anesthésie encadrent le protocole de chaque souris : 298 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après le second examen pour prélever les muscles des pattes arrière. Entre les deux, chacune subit une seule de ces procédures : section totale ou partielle du nerf sciatique, patte immobilisée une ou deux semaines, huit à douze semaines d'entraînement intensif sur tapis roulant, ou injections répétées d'une molécule de croissance musculaire. Le porteur présente l'IRM comme une contribution au remplacement, tout en indiquant que la validation par histologie implique un "plus grand nombre" de souris dans un premier temps. Il réserve l'étude aux mâles, chez qui certaines réponses seraient "plus marquées", au nom de la réduction.

Objectifs

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est à l’origine des techniques d’imagerie médicale comme l’IRM, utilisées depuis de nombreuses années pour observer l’intérieur du corps sans intervention chirurgicale. Ces techniques sont aujourd’hui très utiles pour étudier les maladies des muscles et du cœur. Elles permettent notamment de suivre l’apparition de graisse dans les muscles, l’inflammation, les œdèmes ou encore certaines anomalies du fonctionnement musculaire. Au sein du laboratoire, de nouvelles méthodes d’imagerie sont développées afin d’améliorer l’étude des muscles chez les animaux de laboratoire, avec l’objectif de pouvoir ensuite appliquer ces méthodes chez les patients. Pour vérifier la fiabilité des images obtenues, les chercheurs les comparent à l’histologie, une technique qui consiste à analyser les tissus musculaires au microscope. Cette méthode est très précise, mais elle nécessite un prélèvement de muscle et ne peut donc pas être utilisée facilement chez l’être humain, en particulier lorsque les muscles sont déjà très fragilisés. Le projet a pour objectif de créer une base de données reliant les résultats obtenus par imagerie RMN et par histologie pour différents types d’atteintes musculaires. Cette comparaison permettra de mieux interpréter les images obtenues par IRM et de développer de nouveaux indicateurs fiables, appelés biomarqueurs. Dans un premier temps, les chercheurs étudieront des modèles provoquant une augmentation (hypertrophie) ou une diminution (atrophie) de la taille des muscles. Ces modèles ont été choisis car ils modifient principalement la taille des fibres musculaires, sans entraîner beaucoup d’autres changements, ce qui facilite la comparaison entre les images RMN et les observations au microscope. L’objectif est d’identifier des biomarqueurs capables de détecter précisément l’atrophie ou l’hypertrophie musculaire grâce à l’IRM. À terme, ces outils pourront être utilisés dans des maladies neuromusculaires plus complexes afin de distinguer différents types d’atteintes musculaires sans avoir recours à des prélèvements invasifs. Enfin, lors d’une future utilisation en clinique, les médecins pourront comparer les résultats obtenus chez les patients avec cette base de données de référence associant imagerie et histologie, afin d’améliorer le diagnostic et le suivi des maladies musculaires.

Bénéfices attendus

Sur le plan des connaissances scientifiques, ce projet permettra de mieux caractériser les phénomènes d’hypertrophie (augmentation de la taille des muscles) et d’atrophie musculaire (diminution de la masse musculaire) grâce à deux approches complémentaires : l’histologie, qui permet d’observer les tissus au microscope, et la RMN (résonance magnétique nucléaire), utilisée en imagerie médicale. Sur le plan de la recherche préclinique, ce travail contribuera au développement de nouveaux biomarqueurs obtenus par RMN et validés par l’histologie. Ces biomarqueurs pourront ensuite être utilisés dans de futurs travaux de recherche sur les maladies neuromusculaires, avant une application potentielle chez les patients afin d’améliorer le diagnostic et le suivi des atteintes musculaires.

Procédures

Le présent projet comprend quatre procédures expérimentales distinctes et chaque animal participera à une seule de ces séries d'actes. Avant le début des expériences, les animaux bénéficieront d’un examen d'imagerie réalisé sous anesthésie générale. Cet examen permettra d’obtenir des images de référence des muscles avant traitement. Sa durée maximale sera de 3 heures. Chaque animal sera soumis à une seule des quatre séries d'actes suivantes : 1 - Dénervation de la patte. Cette intervention consiste à interrompre totalement ou partiellement l’activité d’un nerf contrôlant les muscles de la patte. Elle sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 10 minutes. Des traitements antidouleur seront administrés avant et après l’intervention. 2 - Immobilisation de la jambe. Une seule patte sera immobilisée pendant 1 ou 2 semaines afin d’étudier les effets du manque d’utilisation du muscle. La mise en place de l’immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 5 minutes. Malgré cette immobilisation, les animaux pourront continuer à se déplacer librement dans leur cage puisque seule une patte sera concernée. 3 - Des animaux suivront un programme d’entraînement physique de type HIIT (High Intensity Interval Training), 8 ou 12 semaines ,à raison de 3 à 4 fois par semaine pendant 20 minutes par séance. 4 - Injections répétées (2 à 4 fois par semaine pendant 4 semaines) d’une molécule stimulant la croissance musculaire. Les injections sont réalisées par voie sous-cutanée sur animal anesthésié. À la fin des procédures expérimentales, un second examen d'imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin d’évaluer les modifications musculaires provoquées par les traitements. Cet examen durera au maximum 3 heures. À l’issue du dernier examen d'imagerie, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre l’analyse des tissus musculaires.

Impact sur les animaux

L’immobilisation d’une jambe n’empêchera pas les animaux de se déplacer normalement et d’interagir entre eux de manière normale. Les doigts resteront visibles dans le but de voir d'éventuelles lésions, dans ce cas le dispositif sera immédiatement retiré. La dénervation partielle ou définitive du nerf sciatique entrainera un inconfort plus important, les animaux pourront toujours se déplacer car la dénervation sera effectuée de manière unilatérale. D’autre part les animaux subissant une dénervation seront soumis à des actes chirurgicaux aseptiques, et à la pose de sutures chirugicales pour éviter tout risque d'infection. Le geste chirurgical peut induire une inflammation et éventuellement une infection locale. Le geste chirurgical est associé à une douleur locale. L’hypertrophie musculaire sera obtenue par des protocoles d’entrainement des animaux sur tapis roulant, ce qui entrainera seulement un léger inconfort. L’hypertrophie obtenue par l’entrainement devrait être modérée. Dans le but d’obtenir une hypertrophie musculaire plus importante, l’hypertrophie sera induite pharmacologiquement. Les injections sous cutanées répétées pourront également provoquer un léger inconfort. Une des nuisances attendues du projet sont liés aux anesthésies pouvant induire une détresse respiratoire et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés après l’examen RMN en fin de procédure, l’euthanasie permettra le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

La résonance magnétique nucléaire (RMN) contribue au principe de Remplacement des 3R en permettant d’étudier de nombreux paramètres du tissu musculaire directement chez l’animal vivant. Cette approche réduit le recours à des méthodes plus invasives, comme l’histologie ou les analyses biochimiques, qui nécessitent généralement un prélèvement de tissu et donc l’euthanasie de l’animal. Dans le cadre de ce projet, des analyses histologiques restent toutefois nécessaires afin de valider les biomarqueurs obtenus par RMN. Cette étape implique l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux dans un premier temps. Cependant, les résultats attendus permettront ensuite de développer des biomarqueurs fiables capables de limiter, voire d’éviter, le recours à l’histologie dans les études futures. À ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire fidèlement la complexité du muscle, notamment son organisation, son fonctionnement mécanique et son métabolisme énergétique. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour étudier les muscles squelettiques et cardiaques dans des conditions proches de la réalité physiologique. Plusieurs modèles animaux de maladies neuromusculaires existent, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement utilisés en recherche fondamentale et préclinique car ils sont faciles à manipuler, nécessitent moins de ressources et permettent de reproduire de nombreuses caractéristiques observées dans les maladies humaines.

Réduction

La mise en place des modèles expérimentaux nécessitera également l’utilisation d’animaux. Dans cette première étape, le nombre d’animaux sera volontairement limité à 4 par groupe expérimental. Cette phase permettra de vérifier que les procédures sont fiables, reproductibles et adaptées, tout en testant les nouvelles techniques de RMN développées dans le cadre du projet. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, les groupes de la phase comparative comprendront entre 10 et 12 animaux selon les procédures étudiées. Ce nombre a été choisi pour être suffisamment élevé afin de garantir la fiabilité des analyses statistiques, tout en restant aussi réduit que possible conformément aux principes de réduction du nombre d’animaux utilisés en recherche. Au total, 298 animaux seront inclus dans le projet.

Raffinement

La RMN contribue également au troisième principe de la règle des 3R, appelé Raffinement, qui vise à améliorer les conditions expérimentales afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les progrès technologiques constants en imagerie RMN permettent aujourd’hui d’obtenir, en recherche préclinique, des images extrêmement précises, avec une résolution bien supérieure à celle utilisée en pratique clinique chez l’être humain. Ces avancées permettent d’obtenir davantage d’informations tout en limitant le recours à des méthodes invasives. Le raffinement concerne également les conditions d’hébergement des animaux. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages adaptées et ventilées, avec un environnement enrichi comprenant notamment des tubes en carton et des matériaux permettant la fabrication de nids, afin de favoriser leur bien-être. Tous les examens RMN seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements pendant l’acquisition des images et de limiter le stress des animaux durant les examens. Les procédures de dénervation seront réalisées uniquement par du personnel qualifié et formé aux techniques chirurgicales. Des traitements antidouleur seront administrés avant et après l’intervention afin de réduire la douleur liée à la chirurgie. Si des signes de douleur apparaissent au cours de l’étude, des traitements complémentaires seront immédiatement mis en place. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, conformément à la réglementation en vigueur. Les animaux seront également pesés régulièrement afin de détecter rapidement toute perte de poids anormale ou tout signe de souffrance. Enfin, des critères d’arrêt précis seront appliqués tout au long du projet. Ceux-ci prendront en compte l’état général des animaux, leur âge ainsi que le nombre d’examens réalisés, afin de garantir leur bien-être pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle expérimental de référence en recherche biomédicale, en raison de leur petite taille, de la maîtrise de leurs conditions d’hébergement et de la disponibilité de nombreux outils expérimentaux validés. Le présent projet sera conduit exclusivement sur des animaux sans pathologie préexistante. Les modèles murins sont largement utilisés pour l’étude de nombreuses pathologies humaines, notamment dans le domaine des maladies neuromusculaires, pour lesquelles ils présentent une forte pertinence translationnelle. Le laboratoire dispose d’une expertise établie dans le développement et l’utilisation de techniques d’imagerie et de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire appliquées à l’étude du muscle squelettique chez la souris. Afin d’assurer la robustesse, la comparabilité et la reproductibilité des données, ce modèle animal sera maintenu. À terme, ces approches ont vocation à être transposées à des modèles de pathologies musculaires plus complexes, reposant fréquemment sur l’utilisation de lignées transgéniques majoritairement développées chez la souris. Le développement et la validation de ces méthodes dans ce modèle sont donc nécessaires en amont. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sur des animaux ayant atteint l’âge adulte, défini comme un âge minimal de deux mois. Les souris incluses dans l’étude seront âgées de 8 à 14 semaines, afin de garantir une homogénéité des groupes expérimentaux. Cette stratégie vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’altérer la répétabilité et la reproductibilité des mesures. Les modèles murins d’atrophie et d’hypertrophie du muscle squelettique, ainsi que les procédures de validation de nouveaux biomarqueurs par imagerie par résonance magnétique nucléaire et analyses histologiques associées, peuvent être réalisés indifféremment chez des animaux mâles ou femelles. Toutefois, certaines réponses physiologiques, en particulier dans les modèles d’hypertrophie musculaire, sont rapportées comme étant plus marquées chez les mâles. Dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R, il a été décidé de limiter cette étude à l’utilisation exclusive de souris mâles.

Rendues obèses par un régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, 80 souris reçoivent aussi, sous anesthésie, un tatouage d'identification et une injection de vecteurs viraux AAV dans le muscle. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transportées vers un second établissement pour un test terminal avec injection d'insuline, glucose radiomarqué et trois prises de sang pour la moitié d'entre elles. La description des procédures affirme qu'après l'injection les souris "ne subiront ensuite qu'une expérimentation terminale", sans mentionner le régime que le porteur dit susceptible d'"engendrer un inconfort significatif". Toutes sont tuées et nécropsiées à l'issue pour prélever tissus et organes, et le porteur fixe leur nombre d'après ses "habitudes expérimentales".

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

Tatouées sous anesthésie à leur arrivée, mises au régime hyperlipidique pendant quatorze à seize semaines à partir de trois mois, puis injectées dans le muscle, 80 souris traversent à pied deux établissements dans des valises de transport avant l'expérimentation terminale. Celle-ci comprend un test de transport de glucose, une injection d'insuline et, pour la moitié d'entre elles, trois prélèvements sanguins pendant le test, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit l'obésité induite comme une source d'inconfort significatif, et les prélèvements répétés comme pouvant provoquer stress, douleurs légères, œdèmes et gonflements. Toutes sont nécropsiées à l'issue, leurs tissus prélevés pour analyses histologiques et génétiques, une partie étant proposée aux autres équipes du centre.

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

Le plafond annoncé est d'une anesthésie gazeuse par jour pendant deux semaines. 744 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Elles reçoivent jusqu'à douze injections intrapéritonéales ou sous-cutanées, et selon les groupes douze séances d'exercice musculaire en trois semaines, une lésion musculaire provoquée, ou douze microlésions intramusculaires par jour pendant deux semaines, l'objectif étant de supprimer les macrophages du muscle et d'observer ce qui suit. Sur l'effectif, le porteur écrit que "l'analyse statistique permet de définir le nombre d'animaux nécessaires minimum pour chaque expérience", sans donner ni ce calcul ni ce nombre, et résume les atteintes en une ligne sur le stress de la contention.

Objectifs

Les tissus renferment des cellules immunitaires résidentes dont les macrophages. Leur rôle n'est pas connu dans le muscle strié squelettique. Pour identifier ce ou ces rôles, l'approche utilisée dans le projet est d'éliminer ces cellules dans le tissu musculaire à l'aide d'un modèle de souris transgénique adapté, et d'évaluer les conséquences sur la stabilité physiologique et la fonction musculaires. Trois types de conditions seront étudiées : l'état basal, une condition physiologique d'exercice, une condition de lésion musculaire et une condition pathologique de maladie musculaire.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de définir le rôle des macrophages résidents du muscle strié squelettique dans toutes les conditions physiologiques et pathologiques. Cela pourra permettre ultérieurement d'identifier de potentielles voies d'action pour améliorer l'état du muscle, normal ou malade.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées (12 injections maximum). Certains seront soumis soit à un protocole d'exercice musculaire pendant 5 min, maximum 12 séances en 3 semaines, soit à un protocole de dommage musculaire (5 min en une fois), soit à des microlésions intramusculaires pendant 2 semaines (12 microlésions par jour). Tous protocoles utilisent l'anesthésie générale. Les nuisances attendues de ce projet incluent : un stress lors de la contention pour les injections vigiles et un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie. Le maximum d'anesthésies est une anesthésie gazeuse quotidienne pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont un stress lors de la contention lors des injections ou le déplacement dans la boite d'anesthésie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue des prélèvements tissulaires pour les analyses biologiques.

Remplacement

Les cellules étudiées (macrophages) sont incrustées au sein du muscle. Si on veut étudier leur rôle sur l'équilibre du tissu (homéostasie), on doit rester au niveau de l'organe et de l'organisme entier. Le projet apportera la preuve de concept de l'utilité des macrophages dans la régulation de l'équilibre du muscle dans les différentes conditions physiologiques et pathologiques, qu'il est impossible de mimer in vitro.

Réduction

La réduction est réalisée selon plusieurs principes : 1) l'analyse statistique permet de définir le nombre d'animaux nécessaires minimum pour chaque expérience; 2) nous utilisons un système de banque de tissu permettant leur réutilisation évitant le recours à de nouveaux animaux; 3) trois Go/Nogo sont établis dans le protocole.

Raffinement

Le raffinement se fait sur le site d'injection, et l'appareil pour mesurer la force musculaire, induire la lésion musculaire et l'exercice est complètement non-invasif. Les souris sont anesthésiées lors de procédures durant plus de 20 secondes. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure.

Choix des espèces

La souris présente un système musculaire proche de celui de l'homme. Les animaux sont des animaux adultes, dont le développement est terminé, des deux sexes.

Testées en comportement et en cognition, puis en motricité, en force et en coordination, 1 288 souris courent jusqu'à soixante minutes sur tapis roulant, subissent six heures puis quatre heures de jeûne, une injection et une incision de la queue pour cinq prises de sang étalées sur deux heures. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et concernent des souris de 3 mois et des souris de 18, 21 et 24 mois, ce dernier âge étant associé selon le porteur à une survie d'environ 60 %. Aucun des tests comportementaux et cognitifs employés n'est nommé, et le résumé annonce parmi les effets du test de tolérance à l'insuline une hypoglycémie avec léthargie, tremblements et perte de réactivité, ainsi qu'une fatigue liée à l'exercice forcé. Toutes sont tuées et leurs organes collectés pour identifier les mécanismes cellulaires en cause.

Objectifs

Le vieillissement s’accompagne d’une diminution progressive des capacités physiques et cognitives, ainsi que d’une augmentation du risque de maladies liées à l’âge. Un des mécanismes biologiques impliqués dans ce processus est un système naturel de nettoyage et recyclage cellulaire qui permet aux cellules d’éliminer et de renouveler leurs composants endommagés. Ce mécanisme joue un rôle essentiel dans le maintien de l’équilibre cellulaire et la protection des tissus face au stress. Cependant, l’efficacité du recyclage cellulaire diminue avec l’âge, ce qui contribue au déclin des fonctions physiologiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact du recyclage cellulaire sur les capacités cognitives, motrices et physiques au cours du vieillissement. Pour cela, des souris génétiquement modifiées seront utilisées afin de mieux comprende les effets bénéfiques du recyclage cellulaire. Les études seront réalisées chez des souris jeunes adultes ainsi que chez des souris âgées à différents stades du vieillissement. Cette approche permettra d’analyser l’évolution des effets du recyclage cellulaire au fil du temps et d’identifier les périodes du vieillissement au cours desquelles son augmentation est la plus bénéfique. À terme, ces travaux contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes biologiques du vieillissement et pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour prévenir le déclin fonctionnel lié à l’âge.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à mieux comprendre le rôle d’un mécanisme naturel de recyclage des cellules, dans le vieillissement de l’organisme. Ce processus permet aux cellules d’éliminer leurs composants endommagés et de maintenir le fonctionnement des tissus. Avec l’âge, cette capacité de recyclage diminue, ce qui est associé à l’apparition progressive de limitations physiques, cognitives et métaboliques. Les résultats de ce projet permettront d’identifier des mécanismes biologiques impliqués dans le déclin des fonctions observé au cours du vieillissement. En étudiant ces mécanismes à différentes étapes de la vie, ce travail apportera des éléments concrets sur les liens entre l’activité de ce processus cellulaire et l’évolution des capacités fonctionnelles avec l’âge. Ce projet permettra également de caractériser des modifications observées à l’échelle de l’organisme lorsque le recyclage cellulaire est modulé, en lien avec les interactions entre différents tissus. Ces données permettront d’identifier comment les échanges biologiques entre organes évoluent au cours du vieillissement et impactent l’état fonctionnel global. Les connaissances générées par ce projet pourront aussi servir de base scientifique pour orienter le développement de stratégies visant à préserver les fonctions physiologiques au cours du vieillissement. Elles pourront soutenir l’identification de cibles biologiques pertinentes dans l’objectif de retarder l’apparition de déficits fonctionnels liés à l’âge et de favoriser un vieillissement en bonne santé.

Procédures

Au cours de cette étude, le comportement et l’état de santé des souris seront évalués sur animaux vigiles, organisées au sein d’une procédure expérimentale unique et progressive, du moins au plus contraignant. Les interventions sur animaux vigiles comprennent des tests comportementaux et cognitifs réalisés une seule fois par animal. Chaque test a une durée comprise entre 1 et 15 minutes. Un temps de repos d’au moins 24 heures est respecté entre chaque test afin de limiter le stress et la fatigue. L’activité motrice des animaux sera ensuite évaluée par des tests de motricité, de force et de coordination, également réalisés sur animaux vigiles d’une durée de 1 à 10 minutes et un test d’endurance sur tapis roulant d’une durée maximale d’environ 60 minutes, avec arrêt immédiat en cas de signes de fatigue excessive et pour lequel une phase d’acclimatation sur 2 jours est réalisé. Un temps de repos d’au moins 24 heures est respecté entre chaque test afin de limiter le stress et la fatigue. Des interventions métaboliques sont également réalisées sur animaux vigiles, comprenant un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline réalisé à un intervalle de 8 jours. Ces tests impliquent une mise à jeun préalable de respectivement 6 et 4 heures, une injection unique et l’analyse d’une goutte de sang à 5 temps donné depuis une unique incision de la queue sur une durée totale d’environ 2 heures par test.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus seront transitoires pour les tests comportementaux et moteurs. Un stress modéré peut être induit par les mesures métabolique au niveau du site d’injection. Possible fatigue cumulée en fin de protocole comportemental (minimisée par des jours de repos entre divers tests) ainsi qu’une fatigue liée à l’exercice forcée sont attendus. Le test métabolique de tolérance à l’insuline peut potentiellement entrainer une hypoglycémie (léthargie, tremblements, perte de réactivité). Les nuisances liées au vieillissement peuvent être une altération de l’état général et une détérioration de leur santé.

Devenir

Mise à mort et collecte des organes pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.

Remplacement

Le projet visant à étudier comment le recyclage cellulaire impacte le vieillissement de l’organisme entier, il n’est pas possible de remplacer les animaux par des lignées cellulaires ou des organoïdes. L’utilisation d’animaux est un pré-requis indispensable à l’établissement du projet.

Réduction

Nous utiliserons des animaux des deux sexes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maximisant l’information recueillie, l’ensemble des évaluations fonctionnelles est réalisé chez les mêmes animaux. Pour les calculs du nombre d’animal nécessaire, nous nous sommes basés sur un logiciel statistique. Nous réaliserons ces expériences sur 31 souris/sexe/génotypes pour les animaux jeunes.

Raffinement

Les mesures de raffinement mises en place comprennent : • hébergement en groupes sociaux stables • enrichissement du milieu : matériel de nidification et abris supplémentaire si besoin • période d’acclimatation avant expérimentation ; • habituation préalable aux tests comportementaux et moteurs ; • réalisation des manipulations et injections par du personnel expérimenté ; • respect de temps de repos entre les différents tests ; • surveillance renforcée après les injections et les tests métaboliques ; • recours à des points limites; L’objectif est de limiter au maximum le stress, la fatigue et l’inconfort associés aux procédures expérimentales en particulier sur nos animaux âgés.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées permettent d’étudier in vivo chez un mammifère les conséquences de la mutation ponctuelle d’un gène dans un type cellulaire spécifique et d’explorer l’impact du gène étudié dans un contexte physiologique similaire à l’homme. Les animaux seront utilisés à différents stades de vies : animaux jeunes adultes à 3 mois et animaux vieux à trois âges différents : 18, 21 et 24 mois. L’âge de 18 mois correspond à un stade de vieillissement avec apparition progressive de déficits fonctionnels mais avec des capacités d’adaptation encore préservées. L’âge de 21 mois représente une phase de transition avec un déclin fonctionnel et une diminution des réserves physiologiques ; enfin, l’âge de 24 mois est associé à une fragilité accrue, à des altérations fonctionnelles plus prononcées et à une survie d’environ 60%. Cette approche nous permettra d’analyser la dynamique temporelle des effets du recyclage cellulaire et d’identifier quand ses effets sont les plus marqués ou, au contraire, s’atténuent.

Vingt-quatre injections sur huit semaines, six tests d'agrippement et une chirurgie de trente minutes pour mesurer la force musculaire : 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime alimentaire particulier, suivi de huit à vingt-quatre semaines, provoque chez les souris génétiquement modifiées une myotonie et une faiblesse musculaire qui peuvent réduire leur activité motrice. Le porteur signale aussi des interventions chirurgicales menées sans réveil, des diarrhées, des pertes de poids et de rares complications cardio-respiratoires, alors que la totalité de l'effectif est déclarée en gravité modérée. Le choix de la souris tient, selon lui, à la conservation de la structure et de la fonction du muscle squelettique entre cette espèce et l'humain, et à des lignées produites au laboratoire qui expriment la mutation humaine.

Objectifs

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la maladie neuromusculaire génétique la plus fréquente chez l’adulte. Elle affecte principalement les muscles squelettiques et se caractérise notamment par une myotonie, c’est-à-dire une difficulté à relâcher les muscles après contraction, ainsi que par une faiblesse musculaire progressive. Le muscle squelettique est un tissu dynamique capable de s’adapter aux contraintes fonctionnelles grâce à des processus de remodelage et à l’ajout de nouveaux noyaux au sein des fibres musculaires, un phénomène appelé accrétion nucléaire. Dans la DM1, ces mécanismes sont perturbés, conduisant à une modification de la composition musculaire, types de fibres musculaires et une augmentation du nombre de noyaux centraux et périphériques. L’objectif principal de ce projet est d’étudier les mécanismes physiologiques responsables du remodelage musculaire et de l’accrétion des noyaux dans les fibres musculaires, afin de mieux comprendre la physiopathologie de la DM1. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin reproduisant les symptômes musculaires fonctionnels observés chez les patients. Ce modèle, généré au laboratoire, expriment la mutation humaine responsable de la DM1 et reproduit fidèlement les altérations musculaires caractéristiques de la maladie. Ce projet servira à long terme à identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le remodelage musculaire et l’accrétion nucléaire, et définir de potentielles stratégies thérapeutiques visant à préserver la fonction musculaire chez les patients atteints de DM1.

Bénéfices attendus

La dystrophie myotonique de type 1 est la dystrophie musculaire la plus fréquente chez l’adulte avec une prévalence estimée à environ 1 personne sur 2 000 dans la population européenne. Les symptômes impactent au quotidien les patients et menacent leur autonomie. A ce jour, aucune thérapie n’est disponible pour soigner cette maladie génétique. Ce projet vise à mieux comprendre mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie en disséquant les processus physiopathologiques musculaires des patients DM1. Ces études sont prérequises pour le développement de thérapies ciblées.

Procédures

Certains lots d'animaux seront soumis à un régime alimentaire spécial pendant 8 à 24 semaines (animal vigil, prise alimentaire spontanée et à volonté), d'autres subiront une injection à raison de 3 fois par semaines pendant 8 semaines (animal vigil, 24 injections maximum, 30 secondes). Certains animaux auront deux injections (animal sous anesthésie générale, 1 injection par patte, 3 minutes). Certains animaux seront soumis au test d'agrippement pendant 8 à 24 semaines à raison d'un test par mois afin d’évaluation leur force musculaire (animal vigil, 6 tests maximum, 3 minutes). Certains lots d'animaux subiront une administration orale à l'aide d'une micropipette par jour pendant 8 jours (animal vigil sans contrainte physique, 8 administration max, 30 secondes à 1 minute). Si l’administration orale à l’aide d’une micropipette et non réalisable, certains lots d’animaux subiront une injection à raison d’1 injection pendant 5 jours (animal vigil, 5 injections max, 30 secondes). Enfin, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale pour la mesure de la force musculaire (animal sous anesthésie générale et analgésie, 1 fois, 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire spécifique administré aux souris génétiquement modifiées est susceptible d’induire un phénotype comprenant une myotonie (défaut transitoire de relaxation musculaire après contraction) ainsi qu’une faiblesse musculaire pouvant entraîner une diminution de l’activité motrice. Les procédures expérimentales prévues peuvent générer des nuisances et effets indésirables, principalement liés aux manipulations et aux actes réalisés dans le cadre du projet. Les injections répétées peuvent provoquer une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi qu’un stress ponctuel lié à la contention nécessaire aux manipulations. Les mesures de force musculaire peuvent également induire un stress léger et temporaire. Les traitements administrés sont globalement bien caractérisés, mais peuvent, dans de rares cas, entraîner des effets indésirables tels que des troubles digestifs (diarrhées) ou une perte de poids. Les procédures sous anesthésie peuvent entraîner une altération transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, des complications cardio-respiratoires. Enfin, les interventions chirurgicales réalisées sans réveil peuvent induire une douleur et un stress pré-opératoires ainsi que des effets délétères transitoires associés à l’acte chirurgical.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire, car des analyses poussées doivent être réalisées sur différents muscles. Ces analyses permettent d’étudier les effets de la maladie sur le muscle.

Remplacement

Les modèles utilisant des cellules musculaires cultivées en laboratoire permettent d’étudier certains mécanismes de la dystrophie myotonique de type 1 (DM1). Ils ont notamment permis de mieux comprendre les anomalies présentes dans les cellules musculaires des patients et les perturbations de leur développement et de leur fonctionnement. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire toute la complexité de la maladie, car ils ne prennent pas en compte l’ensemble du muscle, son environnement et les interactions entre les différents organes. Il est donc nécessaire d’utiliser également des modèles animaux pour mieux comprendre comment la maladie se développe dans un organisme entier. Les modèles de souris actuellement disponibles reproduisent seulement une partie des caractéristiques de la DM1 observées chez les patients. Le développement de nouveaux modèles murins reproduisant plus fidèlement la maladie humaine est ainsi essentiel pour mieux comprendre ses mécanismes et, à terme, contribuer au développement de nouveaux traitements.

Réduction

Afin de réduire et d’optimiser le nombre d’animaux, tous les animaux présentant le génotype d’intérêt pathologique (patrimoine genetique) seront utilisés, sans distinction de sexe. Les souris ne présentant pas ce génotype pathologique seront utilisées comme contrôles dans les différentes expériences. Chaque animal permettra de recueillir le maximum d’informations possible, notamment à partir de plusieurs tissus et par différentes analyses (physiologie, biologie moléculaire et histologie). Les tissus prélevés pourront également être conservés pour d’éventuelles analyses ultérieures, afin d’éviter de réutiliser de nouveaux animaux. Pour les expériences impliquant des injections dans le muscle, la patte opposée de chaque animal servira de contrôle, ce qui permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, le nombre d’animaux a été défini à partir de nos études précédentes et d’analyses statistiques afin d’utiliser le nombre minimal nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Pour ce projet, un maximum de 960 animaux sera utilisé.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum), en portoirs ventilés, avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le milieu est enrichi avec deux d’enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal.Des mesures spécifiques sont mises en place pour limiter le stress et la douleur liés aux procédures expérimentales. Une période d'acclimatation sera respectée après leur arrivée au sein de l’établissement utilisateur. Une habituation préalable des animaux aux manipulations et aux gestes de contention est réalisée avant le début des procédures, afin de réduire les réactions de stress lors des interventions répétées. Une attention particulière est portée à la manipulation douce des animaux et des cages tout au long de l’étude. Les injections et autres procédures invasives sont réalisées dans des conditions limitant l’inconfort, avec recours à une anesthésie lorsque cela est requis. Lors des procédures sous anesthésie, les animaux sont maintenus à température contrôlée à l’aide d’un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie. Un suivi quotidien du bien-être animal est assuré, incluant l’évaluation de points limites précoces et prédictifs. En cas d’effets indésirables tels que des troubles digestifs (diarrhées) ou une diminution de l’état général, des mesures de soutien adaptées sont mises en place, incluant notamment un enrichissement alimentaire directement dans la cage si nécessaire. L’ensemble de ces mesures vise à limiter la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du protocole expérimental.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utilisons des modèles murins développés par notre laboratoire. Le choix de cette espèce est pertinent car la structure et la fonction du muscle squelettique sont fortement conservées entre la souris et l’humain, ce qui permet de reproduire de manière pertinente les mécanismes physiopathologiques observés dans la dystrophie myotonique de type 1. Ces modèles présentent une proximité biologique avec la pathologie humaine, en particulier au niveau des altérations moléculaires et des dysfonctionnements musculaires, ce qui en fait des outils adaptés pour l’étude des mécanismes de la maladie et l’évaluation de stratégies thérapeutiques. Le projet vise à étudier les défauts liés à la dystrophie myotonique de type 1, pathologie qui se développe chez l’adulte. Chez la souris, la maturation du muscle continue jusqu'à 8 semaines après la naissance. Les souris portant le génotype d'intérêt et leur contrôle seront donc utilisées sevrées et adultes âgées de 8 semaines au minimum au début des procédures.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent sous anesthésie une injection de chlorure de baryum dans les muscles pour en détruire le tissu et déclencher sa régénération, 380 d'entre elles sont gavées deux fois au tamoxifène et 120 sept fois avec des modulateurs de la voie WNT avant leur mise à mort. Le porteur écrit qu'aucune complication majeure n'a été observée dans son expérience, tout en n'excluant pas "une diminution importante de l'utilisation de la patte, pouvant aller jusqu'à une paralysie" et une nécrose des tissus. Le bénéfice qu'il annonce tient en une phrase, comprendre si la cascade régulatrice étudiée est propre aux cellules satellites, et il affirme que l'étude de ces processus "au sein d'un organisme dans son ensemble, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, est nécessaire et ne peut être substituée qu'en partie par des approches in vitro".

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables : il présente un développement et une croissance prodigieux et possède de grandes capacités régénératrices. Ces capacités de croissance et de régénération font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Ces cellules sont mises en place au cours du développement. Le développement et le maintien de ces cellules par cet environnement sont cruciaux à l’équilibre et à la régénération musculaire et déterminés par les gènes Hira et Daxx. Il a été récemment montré que l’absence de la protéine Hira ou Daxx dans les cellules souches musculaires adultes (cellules progénitrices, caractérisées par l’expression du gène Pax7 et, dans certains muscles, Pax3) a pour conséquence une inhibition de la régénération musculaire. De plus, il a été démontré que Hira et Daxx sont des facteurs clés pour garder l’identité myogénique des cellules satellites pendant la régénération du muscle. Nous souhaitons étudier la fonction spécifique de chacun de ces gènes dans les cellules satellites pendant la régénération musculaire. Dans un but de suivre le principe des 3R et de réduire et remplacer l’utilisation excessive d’animaux impliqués dans les expériences in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires dérivées de muscles pour les expériences préliminaires. Nous avons caractérisé et étudié ces lignées in vitro pour cibler les expériences les plus pertinentes à développer chez la souris pour la validation in vivo. Les deux procédures principales visent à analyser et caractériser les fonctions d’Hira et Daxx au cours de la régénération musculaire. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induits aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après la procédure d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux qui peuvent présenter une mobilité réduite pendant cette période. Notre étude fera appel à un maximum de 600 souris au total, réparties sur 4 procédures expérimentales.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre si cette cascade régulatrice est spécifique des cellules satellites ou si elle joue un rôle plus général dans le maintien de l’identité cellulaire d’autres types de cellules composant le muscle squelettique.

Procédures

380 de la totalité des animaux (600) seront soumis au gavage de tamoxifène 2 fois avec un intervalle d’une semaine. Les gavages sont faits sur l’animal en vigile et ce geste ne prend que quelques secondes. La totalité des animaux (600) seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Finalement, 120 de la totalité des animaux (600) seront soumis au gavage de modulateurs de la voie WNT 7 fois de suite avant mis à mort. Les gavages sont faits sur l’animal en vigile et ce geste ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Dans notre expérience, aucune complication majeure liée à la régénération musculaire n’a été observée. Cependant, une diminution importante de l’utilisation de la patte, pouvant aller jusqu’à une paralysie, ainsi qu’une dégradation des tissus (nécrose) ne peuvent être totalement exclues. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe anormal et d’intervenir si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par des approches in vitro. Pour réduire le nombre d’animaux nécessaires lors cette phase in vivo, des études préliminaires ont néanmoins été faites sur des lignées cellulaires musculaires.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles publiés utilisant 10 animaux par lot, ce qui est le minimum pour avoir une pertinence statistique et obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies conformément aux recommandations en vigueur. Les enrichissements comprendront du matériel de nidification, des abris permettant aux animaux de se cacher ainsi que des éléments manipulables et/ou à ronger favorisant l’expression des comportements naturels. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables lorsque cela est compatible avec les objectifs scientifiques et leur bien-être. Ces mesures visent à réduire le stress et à améliorer les conditions de vie des animaux tout au long de l’étude. Des points limites ont été définis et seront appliqués dans les cas nécessaires.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de temps pour avoir des animaux adultes (8 semaines) est aussi compatible avec la durée du projet demandé. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé.

292 souris porteuses d'une mutation provoquant une dystrophie musculaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Onze gavages quotidiens sous anesthésie légère, jusqu'à 21 tests d'accrochage à une grille, des isolements de trois heures pour collecter l'urine, 48 heures d'isolement pour mesurer les déplacements, trois heures en pléthysmographe, et pour finir une mesure des propriétés contractiles des muscles du mollet de trois à quatre heures sous anesthésie terminale, avant prélèvement du sang total et mise à mort. L'objet est de comparer l'endoxifène au tamoxifène et à la prednisolone à deux âges de la maladie, un essai clinique étant annoncé comme possible dans les trois à cinq ans. Le porteur affirme qu'il s'agit, à sa connaissance, de "la seule approche scientifiquement valide", et écrit par ailleurs que ces souris ont "une maladie très légère pendant l'essentiel de leur vie" du point de vue clinique.

Objectifs

Les myopathies sont des maladies génétiques rares qui touchent les muscles. Les patients sont progressivement paralysés et décèdent prématurément. Aucun traitement efficace n’est disponible à ce jour. Pour développer des traitements avant des essais cliniques, on utilise des souris modèles. Lors d’essais cliniques, le tamoxifène, un médicament connu depuis 40 ans, s’est montré peu efficace. En effet, son efficacité dépend de sa transformation en plusieurs produits dans le foie. Cette étape est variable d’un malade à l’autre. L’endoxifène est le produit final normalement fabriqué dans le foie. Il serait le véritable médicament actif et aurait moins d’effets secondaires que le tamoxifène. On va tester si ce produit final, endoxifène, est efficace contre la myopathie, et est bien toléré. Nous allons évaluer l’endoxifène dans des souris modèles de myopathie et le comparer à deux traitements de référence : le tamoxifène et la prednisolone, le médicament le plus prescrit aux patients myopathes. Nous allons décrire les effets des traitements, seuls ou en combinaison sur les mouvements des animaux, la force musculaire et la composition des muscles.

Bénéfices attendus

Récemment, il a été établi que le tamoxifène est efficace chez des souris, ce qui a donné lieu à un essai clinique chez des garçons atteints de myopathie. Le tamoxifène est bien toléré, les paramètres cliniques se sont améliorés, mais sans atteindre un niveau statistique. Le faible nombre de patients, les fonds limités et des différences dans la capacité de chaque patient à transformer le tamoxifène (peu efficace) en endoxifène (le médicament actif) dans leur foie expliquent probablement les résultats mitigés de l’essai clinique. Nous allons étudier l’endoxifène comme traitement de la myopathie, dans un projet préclinique qui utilisera le moins d’animaux possible. Nous allons déterminer la dose optimale d’endoxifène à 2 âges clés de la maladie chez les souris modèles de myopathie : lorsque la maladie commence, et lorsque la maladie se stabilise et devient chronique. Les effets de l’endoxifène seront comparés à ceux du placébo et de 2 traitements de référence : le tamoxifène et la prednisolone, un médicament couramment prescrit aux myopathes. On étudiera aussi si une combinaison endoxifène + prednisolone est plus efficace que chaque médicament seul. L’étude pourrait conduire à un essai clinique dans les 3-5 prochaines années.

Procédures

Pour la PROCEDURE 1, sur 133 animaux : 11 traitements par gavages quotidiens sous anesthésie légère isoflurane (tranquillisation ; 1 min max) / traitements avec des nourritures supplémentées (pendant 11 jours) / 1 analyse de composition corporelle, non invasive et sans stress (3 min environ) / isolements pour collecte d’urine, 1 à 3 fois si nécessaire (3h max par séance) / 1 injection d’anesthésique réalisée sous anesthésie légère isoflurane (environ 1 min) / collecte de 2 gouttes sang sous 3 des anesthésies mentionnées (environ 1 min) / chirurgie pour prélèvement de sang total (3 min max.) suivi de mise à mort. Pour la PROCEDURE 2A, sur 123 animaux : 21 tests d’accrochage à une grille : 8 entrainements 2 fois par semaines pendant 4 semaines, + 13 mesures expérimentales hebdomadaires (20 min max par séance) / traitements par des nourritures supplémentées (13 semaines) / 2 analyses de composition corporelle, non invasive et sans stress (3 min environ par séance) / 3 isolements pour mesure de la récupération après tests d’accrochage à la grille (20 min environ par séance) / isolements pour collecte d’urine, 2 à 4 fois si nécessaire (3h max par séance) / 1 isolement dans une cage contenant seulement de la litière (peu de stress) pour la mesure des déplacements de la souris (48h) / 1 isolement dans un pléthysmographe pour mesurer les propriétés respiratoires (3h max) / 1 injection d’anesthésique réalisée sous anesthésie légère isoflurane (environ 1 min) / collecte de 2 gouttes sang sous 3 des anesthésies mentionnées (environ 1 min) / sous anesthésie-analgésie terminale : mesure de la perfusion musculaire, mesure des propriétés contractiles des muscles du mollet (procédure de 3-4h), chirurgie pour prélèvement de sang total (3 min max.) suivi de mise à mort. La PROCEDURE 2B, sur 36 animaux, est semblable à la PROCEDURE 2A, sauf : les 13 tests d’accrochage à la grille qui sont remplacés par 1 injection de colorant 24h avant mise à mort.

Impact sur les animaux

La classe de sévérité des animaux passe lentement de normal à la naissance à léger à 6 mois environ, l’âge maximum pour ce projet. Chez les souris myopathes, les contentions fermes pour les prises de sang à la queue et les injections peuvent causer une augmentation des marqueurs de lésions musculaires dans le sang. Malgré l’acclimatation et les mesures prises, certains tests réalisés et les isolements pendant 3-48h pour les collectes d’urine et pour mesurer les déplacements peuvent causer un stress léger aux animaux. Les médicaments testés peuvent ralentir la progression de la maladie, en partie via une adaptation de la composition en fibres musculaires, qui peut se traduire par une légère perte de poids (muscles plus oxydatifs, comme chez les cyclistes ou les marathoniens).

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux sont mis à mort pour récupérer des organes et faire des analyses post-mortem.

Remplacement

Les cultures de cellules musculaires ne peuvent pas répondre aux questions que nous nous posons sur les maladies qui touchent le maintien du muscle mature. En effet, les cultures de cellules musculaires permettent de reproduire le développement initial du muscle (par exemple lors du développement embryonnaire), mais elles restent trop immatures pour servir de modèles aux maladies qui touchent le muscle des patients après la naissance. En l’absence de méthodes alternatives non-animales, nous sommes contraints d’utiliser des animaux vivants pour atteindre les objectifs du projet. A notre connaissance, il s’agit de la seule approche scientifiquement valide pour augmenter nos connaissances et pour obtenir des données précliniques pertinentes susceptibles de permettre une transition vers des essais cliniques chez l’Homme pour traiter des maladies neuromusculaires à ce jour toujours fatales.

Réduction

Nous nous sommes basés sur notre expérience et sur les données publiées dans la littérature scientifique. Nous avons réalisé des calculs de puissance statistique afin de déterminer le nombre minimal d’animaux qu’il est nécessaire d’utiliser pour collecter des données scientifiquement pertinentes et suffisamment robustes. Les groupes contrôle contiennent moins d’animaux sains parce qu’ils ont moins de variabilité que les groupes d’animaux myopathes. Il n’est pas possible de réutiliser les tissus d’études antérieures car les muscles utilisés pour les analyses post-mortem sont de très petite taille et les nombreuses analyses à effectuer consomment le matériel biologique. Par ailleurs les différences dans les conditions d’hébergement d’une institution à une autre, le type de nourriture utilisée, interdisent d’utiliser des données précédentes pour épargner un groupe d’animaux dans ce projet.

Raffinement

Des points limites prédictifs et précoces sont mis en place pour mettre en évidence tout problème ou anomalie chez nos animaux et prendre les mesures pour limiter leur douleur, souffrance ou angoisse. Les agents pharmacologiques sélectionnés sont sans danger pour les animaux : le tamoxifène et la prednisolone sont utilisées depuis des décennies chez l’homme et ont été évalués précédemment chez les souris dystrophiques. Des études réalisées avec l’endoxifène montrent qu’il est bien toléré à des doses élevées chez les souris saines. Il est en cours d’évaluation clinique contre le cancer du sein et est bien toléré chez les patientes (moins d’effets secondaires chez les femmes que le tamoxifène). Il n’y a aucune alerte concernant un risque chez les souris. Nous avons sélectionné les procédures expérimentales de sorte à minimiser les risques d’interférence avec la fonction et la structure du muscle tout en optimisant le bien-être des animaux. Les interventions et tests fonctionnels sur l’animal vigile (pour mesurer la résistance à la fatigue musculaire, l’activité locomotrice, la fonction respiratoire, la composition corporelle) sont peu ou pas invasifs ou traumatisants. Les prises de sang, les gavages, les injections et les mesures de contraction musculaire isométrique se pratiquent sur l’animal tranquillisé ou profondément anesthésié selon ce qui convient le mieux. La plupart des procédures employées respectent des Standard Operating Procedures élaborées par le consortium TREAT-NMD, afin que les données collectées puissent être comparées aux données obtenues précédemment ou dans d’autres laboratoires.

Choix des espèces

Les souris dystrophiques utilisées ici sont une référence pour étudier les mécanismes de la myopathie et évaluer les approches thérapeutiques pour cette maladie fatale. Certains aspects (par exemple les défauts de structure des muscles) représentent bien la maladie humaine. Cependant, d’un point de vue clinique (perte de fonction musculaire), ces souris ont une maladie très légère pendant l’essentiel de leur vie. La connaissance du génome de la souris et la multitude de mutants disponibles rend cette espèce particulièrement adaptée pour combiner des facteurs génétiques impliqués dans les maladies rares. Le projet porte sur des souris à 2 âges clés de la dystrophie musculaire : Pour certains animaux, les traitements commencent 10 jours avant le sevrage et s’achèvent 10 jours après le sevrage, vers l’âge de 5 semaines (35 jours). Cela permet de déterminer si les traitements retardent l’apparition de la maladie chez les individus immatures, équivalent des jeunes enfants au début de la maladie. Pour d’autres animaux, le projet porte sur des jeunes adultes entre 3 et 6 mois. Cette période de 3 mois correspond au début de la phase chronique de la maladie, pendant laquelle la myopathie progresse lentement, comme chez l’Homme. C’est la période appropriée pour étudier la mise en place de mécanismes d’adaptation du muscle à la maladie et la réponse des traitements sur le moyen-terme.