Système immunitaire

Un morceau de peau humaine est greffé sur le dos de souris immunodéficientes, au cours d'une chirurgie de 30 minutes suivie de sept jours sous bandage, avant qu'on leur injecte le méningocoque dans la veine de la queue. 1 308 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur décrit une septicémie qui mène à la prostration entre 6 et 16 heures après l'infection et assure que ses procédures "ne dépasseront pas 3h post-infection". Il prévoit pourtant des souris infectées "pendant 3 ou 16 heures" avant leur mise à mort.

Objectifs

Le méningocoque est une bactérie pathogène de l’homme responsable de septicémies (infections généralisées) et de méningites (infections du système nerveux). Ces infections graves sont souvent associées à des séquelles importantes, et restent parfois mortelles (10-20% des cas) malgré les traitements disponibles. Le pouvoir pathogène du méningocoque réside dans sa capacité à « coloniser » les vaisseaux sanguins humains. Après 24 à 48 heures, ce processus aboutit à la destruction du vaisseau colonisé. L’étude in-vivo des infections invasives à méningocoques nécessite un modèle murin basé sur la xénogreffe d’un morceau de peau humaine sur le dos de souris du fait de la spécificité de la bactérie pour les vaisseaux humains. Lors de la prise du greffon, les micro-vaisseaux humains contenus dans la peau humaine vont se connecter au réseau vasculaire murin. Ainsi, lorsque l’on injecte par voie intraveineuse des bactéries aux animaux, celles-ci vont se fixer sur la paroi des vaisseaux humains du greffon, se multiplier et induire des lésions vasculaires importantes comme dans la pathologie humaine. Toutefois, une limite majeure de ce modèle est qu’il utilise des souris immunodéficientes, qui sont donc incapables de reproduire la réponse immunitaire complète qui se met en place chez l’Homme. Dans ce contexte, notre projet vise à analyser, au sein de ce modèle de xénogreffe, le comportement des cellules humaines et murines, en conditions infectées et non infectées. Nous étudierons également leurs interactions avec les cellules immunitaires. À terme, une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires en jeu pourrait contribuer au développement de traitements plus efficaces.

Bénéfices attendus

Notre modèle murin avec xénogreffe de peau humaine est à ce jour le seul et unique modèle murin permettant de reproduire chez la souris les grandes caractéristiques des infections invasives à méningocoque observées chez l’homme, à savoir la fixation et la multiplication des bactéries sur la paroi des vaisseaux sanguins, entrainant le déclenchement d’une septicémie. À court et moyen terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit face à une infection à méningocoque. Il s’intéressera notamment au rôle de plusieurs types de cellules immunitaires qui participent à la défense de l’organisme contre ces agents infectieux. Les résultats obtenus pourraient conduire à des avancées thérapeutiques en identifiant de nouvelles cibles pour moduler la réponse inflammatoire. À long terme, nous espérons que ce projet permettra l’amélioration des traitements des infections invasives à méningocoques chez l’homme en permettant une prise en charge précoce plus efficace. Sur le plan scientifique, cette étude contribuera également à optimiser les protocoles expérimentaux pour les modèles de greffe et d’infection, tout en fournissant des données précieuses pour la recherche translationnelle. Enfin, ce projet renforcera la collaboration interdisciplinaire entre immunologie, biologie vasculaire et modélisation animale, tout en soutenant la formation de jeunes chercheurs dans un domaine à fort impact médical.

Procédures

Tous les animaux utilisés dans cette étude sont greffés avec de la peau humaine. Le greffon est implanté sur le dos de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale d’une durée d’environ 30min réalisée sur des animaux anesthésiés. Les animaux portent un bandage pour protéger le greffon pendant 7 jours. Une fois les bandages enlevés et au minimum 4 semaines après l’implantation du greffon, les animaux seront utilisés dans 3 types d’expériences : 1- Des expériences où les animaux seront infectés par l’injection intraveineuse de bactéries. Les injections se feront via la veine caudale sur des animaux vigiles placés dans un tube de contention pendant 2 min. Les animaux seront infectés pendant 3 ou 16 heures puis seront mis à mort. 2- À la suite de l’infection des animaux par l'injection intraveineuse de bactéries, des observations seront réalisées pendant une période maximale de 3h sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables sont attendus lors des différentes procédures expérimentales présentes dans ce projet : - L’excision d’une petite partie de la peau du dos pour la remplacer par de la peau humaine est une chirurgie qui entrainera une douleur modérée pendant quelques jours. Cette douleur sera contrôlée par l’utilisation d’analgésiques pendant et après la procédure chirurgicale. - La présence de bandages maintenus pendant 7 jours pour protéger le greffon et favoriser sa prise entraineront une gêne et une mobilité réduite. - Lors des expériences d’infection par le méningocoque, les animaux infectés par l’injection intraveineuse de bactéries développent une septicémie entrainant progressivement une baisse de leur activité (0-6h post-infection) allant jusqu’à leur prostration (6h-16h post-infection) et la survenue du décès de l’animal (plus de 24h post-infection). L’introduction de l’aiguille lors de l’injection intraveineuse entraine une douleur légère de courte durée. Nos procédures ne dépasseront pas 3h post-infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront greffés avec de la peau humaine et infectés par le méningocoque.

Remplacement

Du fait de la spécificité du méningocoque pour les cellules humaines, la majorité des études portant sur cette bactérie utilise des cellules en culture (i.e. culture et infection de cellules épithéliales ou endothéliales humaines in vitro, les deux types cellulaires sur lesquels la bactérie peut se fixer) ou des organes sur puce (i.e. développement d’un modèle de « vaisseaux sur puce »). Ces études permettent uniquement d’obtenir des informations sur les mécanismes mis en œuvre dans la pathologie. Il est cependant encore impossible de reproduire in vitro la complexité et dynamique du système vasculaire et son interaction avec le système immunitaire. Notre modèle murin avec xénogreffe de peau humaine est le seul à ce jour à fournir ce niveau de complexité et représente donc un modèle de choix pour l’étude des infections invasives à méningocoque.

Réduction

Le calcul des effectifs des groupes d’animaux de cette étude s’est fait sur la base du retour d’expérience d’une précédente étude. Afin de réduire le nombre de souris nécessaires, notre projet utilisera des mâles et des femelles. La répartition des animaux sera faite grâce à un outil de randomisation afin de créer des groupes expérimentaux homogènes. Le nombre de souris à utiliser a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Les comparaisons entre les groupes expérimentaux seront réalisées grâce à des analyses de variance et l’effectif des groupes expérimentaux a été déterminé avec l’aide de biostatisticiens. Cela permettra d’utiliser le nombre d’animaux minimum et adapté. Le recours à l’imagerie a permis un suivi longitudinal des mêmes animaux au cours du temps, offrant une étude dynamique et transversale de l’évolution de l’infection sans nécessiter le sacrifice d’animaux à chaque point expérimental. Cette approche a ainsi contribué à réduire ainsi le nombre total d’animaux requis tout en améliorant la qualité et la robustesse des données obtenues. De plus, plusieurs organes seront prélevés sur un même animal en fin d’étude afin de recueillir un maximum d’informations biologiques à partir de chaque individu et d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires. Notre expérience sur les procédures mises en œuvre nous a aidé à établir en amont un plan d’étude adapté aux objectifs du projet. Elle nous permet également une optimisation des expériences et une limitation des variabilités inter-individuelles liées au modèle.

Raffinement

Souris immunodéficientes Les animaux immunodéficients étant considérés comme ayant un « phénotype dommageable », ils seront hébergés dans des portoirs ventilés, en cages individuelles autoclavées. Ils disposeront d'eau de boisson autoclavée et d'une alimentation irradiée. Tous les équipements et matériels entrant en contact avec les animaux seront autoclavés ou, lorsque l'autoclave n'est pas possible, décontaminés selon les procédures adaptées. Xénogreffe de peau humaine : 30 minutes avant la chirurgie, les animaux sont prémédiqués par injection sous-cutanée d'un antalgique et d'un anti-inflammatoire non stéroïdien. La chirurgie (~30 min) est réalisée sous anesthésie et sous loupe binoculaire pour une meilleure précision des gestes chirurgicaux, les animaux étant placés sur un tapis chauffant (37°C) pour éviter la baisse de leur température corporelle. Avant d'être placés dans leur cage de réveil, propre et placée sous une lampe chauffante, les animaux greffés sont réhydratés par une injection sous-cutanée de sérum physiologique. Un gel de réhydratation enrichi en sucres est placé dans la cage pour favoriser leur récupération. Un traitement antalgique est fourni aux animaux pendant 5 jours après la chirurgie. Si des signes de souffrance persistent 2 jours après la chirurgie malgré le traitement (poils hérissés, changements d'expressions faciales, abattement, perte d'activité …), les animaux sont mis à mort. Les animaux sont évalués quotidiennement les 5 premiers jours suivant la chirurgie, pendant le port du bandage, afin de détecter d'éventuels signes de souffrance et vérifier l'intégrité des bandages protégeant le greffon. Si l'animal a détérioré son bandage sans léser le greffon, le bandage est refait sous anesthésie ; s'il a lésé le greffon de peau humaine, l'animal est mis à mort. Une fois le bandage enlevé, l'évolution des greffons est suivie hebdomadairement pendant 4 semaines. Infection par le méningocoque : L'infection des animaux est réalisée par injection intraveineuse des bactéries. Les animaux sont ensuite placés dans des cages contenant des gels de réhydratation enrichis en sucres et dont la moitié du sol est chauffée à l'aide de chaufferettes pour aider au maintien de leur température corporelle. Les animaux sont mis à mort à la fin de l'expérience. Hébergement : Les animaux ayant subi une xénogreffe de peau humaine sont hébergés au nombre de 4 maximum par cage, dans des cages contenant du coton et un igloo.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille permettant une manipulation aisée et leur coût est relativement faible. Leur système vasculaire est proche du système vasculaire humain, ce qui permet l’interconnexion des deux réseaux lors de la xénogreffe de peau. De plus, il est possible d’utiliser l’ingénierie génétique pour permettre la génération de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe immunitaire humaine efficace et prolongée. Les greffes de peau humaine sont réalisées chez des souris adultes immunodéficientes âgées de 6 à 12 semaines, période pendant laquelle la prise du greffon est maximisée selon nos observations. Les expérimentions sont ensuite réalisées 4 semaines minimum après la chirurgie, période nécessaire à une bonne prise du greffon.

4 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, et une partie d'entre elles reçoit une injection par semaine pendant douze mois, une prise de sang mensuelle et jusqu'à trois tests comportementaux par semaine, jamais nommés. D'autres développent après injection une maladie inflammatoire du système nerveux : perte de poids, queue sans tonus, pattes arrière affaiblies jusqu'à la paralysie possible. Aucun antidouleur ne leur est donné, pour ne pas fausser la réponse immunitaire étudiée, et le seuil de mise à mort est fixé à la paralysie des pattes avant et arrière, à une perte de poids importante ou à l'incapacité de boire et manger seule. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré à sévère, pour des traitements contre la sclérose en plaques que le porteur renvoie au conditionnel et au "long terme".

Objectifs

La sclérose en plaques touche un grand nombre de personnes et représente un enjeu important de santé publique. Dans cette maladie, le système immunitaire, qui est normalement chargé de défendre l’organisme contre les infections, devient trop actif et attaque certains tissus du corps. Cette inflammation persistante peut entraîner une dégradation progressive des organes ou des tissus concernés et conduire à des douleurs, une perte de fonction et parfois un handicap durable. Dans notre organisme, certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle essentiel pour limiter ces réactions excessives. Parmi elles, les cellules immunitaires régulatrices agissent comme des « freins » du système immunitaire. Elles permettent de contrôler l’inflammation et d’éviter que l’organisme ne s’attaque à lui-même. Des recherches récentes suggèrent que ces cellules peuvent aussi s’adapter aux différents tissus du corps et participer non seulement au contrôle de l’inflammation mais aussi à la réparation des tissus endommagés. Cependant, on comprend encore mal comment ces cellules fonctionnent dans les situations d’inflammation chronique. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent dans les maladies auto-immunes. Nous chercherons notamment à déterminer comment certaines voies de signalisation biologiques influencent leur capacité à contrôler l’inflammation et à favoriser la réparation des tissus. Ce projet repose sur des modèles murins génétiquement modifiés, qui permettent d’étudier précisément le rôle de certains gènes impliqués dans la régulation du système immunitaire. Les souris constituent aujourd’hui un modèle essentiel pour comprendre les interactions complexes entre les cellules immunitaires et les différents organes du corps, ce qui ne peut pas être reproduit uniquement avec des cellules cultivées en laboratoire. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des maladies inflammatoires chroniques et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à restaurer l’équilibre du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre comment le système immunitaire fonctionne dans certaines maladies auto-immunes chroniques, comme la sclérose en plaques. En identifiant plus précisément les mécanismes responsables de l’inflammation et du dérèglement du système immunitaire, ces travaux pourraient aider à développer, à long terme, de nouveaux traitements plus ciblés et plus efficaces pour les patients. Ce projet contribuera également à améliorer les modèles expérimentaux utilisés en recherche. Une meilleure connaissance de ces modèles permettra d’optimiser les expériences, de réduire le nombre d’animaux nécessaires et d’améliorer leurs conditions d’utilisation, tout en obtenant des résultats scientifiques plus fiables. Les premiers résultats seront disponibles à court et moyen terme sous forme de publications scientifiques et permettront d’identifier de nouvelles pistes de recherche. À plus long terme, ces découvertes pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Les connaissances acquises pourront être utilisées par des chercheurs en France et à l’international pour mieux comprendre ces maladies et améliorer les stratégies de traitement.

Procédures

Dans ce projet, les souris seront utilisées pour mieux comprendre certaines maladies inflammatoires et auto-immunes. Les animaux pourront recevoir des injections afin d'induire expérimentalement une forme contrôlée de maladie reproduisant certains aspects de l'inflammation du système nerveux observée chez l'être humain. L'évolution de la maladie est ensuite suivie pendant une durée maximale de 30 jours, par une observation quotidienne et une évaluation de l'état de santé général de chaque animal. Certains animaux recevront des substances destinées à modifier la réponse du système immunitaire, administrées par injection au maximum deux fois par semaine, ou par l'eau de boisson pendant une période de deux semaines. Ces animaux sont surveillés quotidiennement. Un second groupe d'animaux sera suivi sur une durée plus longue, jusqu'à l'âge de dix-huit mois, afin d'étudier l'effet du vieillissement sur le système immunitaire. Ces animaux recevront une injection hebdomadaire à partir de six mois, feront l'objet d'un prélèvement de sang et de selles une fois par mois, et participeront à plusieurs tests comportementaux, réalisés sur animal éveillé après une période d'habituation, à raison de trois tests par semaine au maximum et de quelques minutes chacun. À la fin des expériences, les animaux sont mis à mort selon des méthodes réglementées afin de permettre l'analyse des organes.

Impact sur les animaux

Les souris reçoivent sous la peau du dos une injection d'une substance qui stimule le système immunitaire, ce qui entraîne un stress et une douleur légers de courte durée. Cette injection provoque fréquemment une réaction locale au point de piqûre (rougeur, gonflement, plus rarement une croûte ou une petite plaie) responsable d'un inconfort léger à modéré pouvant persister plusieurs semaines. Injections dans l'abdomen, jusqu'à deux fois par semaine pendant un mois pour certains groupes, ou une fois par semaine pendant douze mois pour les animaux suivis au long cours : stress léger et douleur légère de très courte durée à chaque injection. Les souris développent ensuite une maladie inflammatoire du système nerveux qui ressemble à la sclérose en plaques humaine. Les premiers signes apparaissent une dizaine de jours après l'injection : les animaux perdent du poids, leur queue perd son tonus, puis leurs pattes arrière s'affaiblissent progressivement et peuvent devenir paralysées. Les souris se déplacent alors difficilement et peuvent avoir du mal à atteindre leur nourriture et leur eau, qui sont pour cette raison déposées au sol. Cette phase représente une nuisance modérée d'une durée de quelques jours à deux semaines. Aucun médicament contre la douleur ou contre l'inflammation ne peut être administré à ces animaux : ces traitements agiraient directement sur la réponse immunitaire qui fait l'objet de l'étude et rendraient les résultats ininterprétables. Le bien-être des animaux repose donc sur une surveillance quotidienne et sur des limites strictes, appliquées sans délai : dès qu'une souris présente une paralysie de ses deux pattes avant et arrière, une perte de poids importante ou qu'elle ne peut plus se nourrir ni boire seule, elle est mise à mort. Les souris seront maintenues jusqu'à l'âge de dix-huit mois, ceci peut induire l’apparition possible de troubles liés à l'âge (tumeurs, lésions de la peau, perte de poids, baisse d'activité), sans lien avec les interventions expérimentales. En parallèle, des tests comportementaux sont également réalisés, après une période d'habituation destinée à limiter le stress, qui reste léger et de courte durée. Des prélèvements mensuels d'une petite quantité de sang et recueil de selles induiront un stress léger et une douleur brève.

Devenir

À la fin des expériences, les souris seront mises à mort selon des méthodes réglementaires et réalisées par du personnel formé, afin de garantir une procédure rapide et de limiter toute souffrance. Cette étape nous permettra de prélever différents organes et tissus nécessaires à l’analyse scientifique. Les échantillons seront ensuite étudiés grâce à plusieurs types d’analyses complémentaires : des analyses immunologiques pour mieux comprendre le fonctionnement des cellules du système immunitaire, des analyses histologiques pour observer les tissus au microscope et évaluer les éventuels signes d’inflammation ou de lésions. Ces différentes approches permettront d’obtenir une vision détaillée des mécanismes impliqués dans les maladies étudiées et d’identifier de nouvelles pistes pour améliorer leur compréhension et, à terme, leur traitement.

Remplacement

Aujourd’hui, certaines méthodes réalisées en laboratoire, comme les cultures de cellules ou les organoïdes, permettent d’étudier certains aspects des maladies auto-immunes. Ces approches ont déjà permis d’observer comment certaines cellules réagissent à différentes stimulations et d’identifier des modifications moléculaires importantes. Cependant, ces systèmes restent limités, car ils ne reproduisent pas toute la complexité d’un organisme vivant. Des maladies comme la sclérose en plaques expérimentale impliquent en effet de nombreuses interactions entre différentes cellules du système immunitaire et plusieurs organes du corps, comme le cerveau. Pour comprendre pleinement comment ces maladies apparaissent et évoluent, il est nécessaire d’étudier ces interactions dans un organisme entier où tous les systèmes biologiques fonctionnent ensemble. L’utilisation de modèles chez la souris nous permet d’observer le développement et la progression de ces maladies dans des conditions proches de celles d’un organisme vivant. Cela permet également d’étudier le rôle de certaines cellules du système immunitaire et d’évaluer l’effet de modifications génétiques ou de nouvelles approches thérapeutiques sur l’ensemble de l’organisme. Ces modèles sont donc indispensables pour mieux comprendre les mécanismes des maladies et préparer le développement de futurs traitements.

Réduction

Pour garantir des résultats scientifiques fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible, le nombre de souris utilisées dans chaque groupe est déterminé à l’avance grâce à des méthodes statistiques. Ces calculs permettent d’estimer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour détecter de véritables différences entre les groupes étudiés. Dans ce projet, ces analyses montrent que 11 à 20 souris par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats solides et interprétables. Cette approche permet d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux tout en assurant la qualité scientifique des expériences

Raffinement

Pour faciliter leur alimentation et leur hydratation, des sources d’eau sous forme de gel seront mises à disposition dans les cages, et de la nourriture sera placée directement au sol pour qu’elle reste facilement accessible. Si certains animaux développent des signes de maladie plus marqués, des mesures supplémentaires seront mises en place, comme l’ajout d’une bouteille d’eau supplémentaire et d’aliments adaptés, afin de leur permettre de boire et de se nourrir plus facilement. Ces dispositions visent à améliorer leur confort et leur bien-être tout au long de l’expérience. Une grille de scoring du bien-être animal (BEA) servira de support pour identifier les effets sur le BEA. D’après cette évaluation, des mesures spécifiques seront mises en place afin de minimiser les nuisances observées, notamment : - Augmentation de la fréquence de surveillance clinique ; - Mise à disposition de nourriture et d’eau facilement accessibles (hydrogel, nourriture humidifiée ou déposée au sol) ; - Ajout de matériaux favorisant le maintien de la température corporelle en cas de diminution de la mobilité ; - Limitation des manipulations au strict nécessaire afin de réduire le stress ; - Hébergement adapté avec surveillance renforcée ou séparation temporaire si les interactions sociales compromettent le bien-être de l’animal ; - Consultation de la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et/ou du vétérinaire et mise en œuvre d'une mise à mort anticipée (si perte de poids importante, incapacité à s’alimenter ou à s’abreuver ou signes de souffrance persistante). Un arbre décisionnel définit, pour chaque niveau de score, les mesures à mettre en œuvre : renforcement de la surveillance, adaptation de l'hébergement et de l'accès à l'alimentation, consultation du vétérinaire, puis mise à mort anticipée lorsque les critères d'arrêt sont atteints. Ces critères d'arrêt sont fixés à l'avance, identiques pour tous les animaux, et leur application ne dépend pas de l'avancement de l'expérience.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle animal est particulièrement pertinente pour l’étude des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, car elles permettent de reconstituer de manière fidèle les interactions complexes entre les cellules immunitaires et les tissus cibles dans un organisme complet. Les souris offrent également la possibilité de manipulations génétiques précises, telles que la délétion ou la mutation de gènes spécifiques dans des populations cellulaires définies, ce qui est essentiel pour comprendre le rôle de molécules spécifiques dans la régulation immunitaire. Enfin, ces modèles permettent de suivre la progression de la maladie, la sévérité des symptômes et la réponse aux interventions thérapeutiques dans des conditions physiologiques, ce qui serait impossible à reproduire in vitro ou sur des organoïdes, garantissant ainsi la pertinence des résultats. Les animaux sont utilisés au stade adulte. Pour l'étude de la maladie inflammatoire, il s'agit de jeunes adultes âgés de deux à trois mois, âge auquel la réponse immunitaire est pleinement mature et pour lequel nos données préliminaires ont été obtenues, ce qui garantit la cohérence des comparaisons. Pour l'étude du vieillissement, les animaux sont suivis de six à dix-huit mois, ce qui correspond au passage de l'âge adulte à l'âge avancé chez la souris et permet d'observer les modifications progressives du système immunitaire. Aucun animal n'est utilisé au stade fœtal, néonatal ou juvénile.

Certaines rendues immunodéficientes par traitement, des souris sont vaccinées puis exposées sous anesthésie aux piqûres de plusieurs moustiques porteurs du virus du Nil occidental. 1 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le projet doit soutenir une demande d'essais cliniques pour un vaccin candidat, avant de nouveaux essais sur des "animaux plus grands", selon le porteur. Il résume les effets de l'infection en une ligne, "Troubles liés à l'infection par le virus", sans dire quels symptômes justifient la classe sévère ni à quels seuils les souris sont mises à mort.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de soutenir une demande d’essais cliniques pour un candidat vaccin contre le virus du Nil Occidental. C'est un virus transmis par les moustiques. Il circule surtout chez les oiseaux, qui servent de réservoir naturel. Chez l’être humain, la plupart des infections ne provoquent aucun symptôme (environ 80 % des cas). Cependant, environ 20 % des personnes peuvent avoir de la fièvre et se sentir mal pendant quelques jours. Dans moins de 1 % des cas, le virus peut toucher le système nerveux et provoquer des complications plus graves, comme des inflammations du cerveau ou des méninges, voire une paralysie soudaine ou encore la mort. Ces formes graves sont plus fréquentes chez les personnes âgées ou dont le système immunitaire est affaibli. Il est présent dans de nombreuses régions du monde dont l’Europe. Il n’existe actuellement pas de vaccin contre cette maladie et le vaccin candidat que nous proposons pourra répondre à un besoin en santé publique mondiale. Le projet se déroulera dans 2 EU.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à court terme est la compréhension des mécanismes cellulaires de protection du vaccin candidat. A long terme, les résultats soutiendront le développement d’un vaccin contre ce virus transmis par les moustiques. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique de cette maladie transmise par les moustiques.

Procédures

Dans un premier temps, nous optimiserons les conditions pour explorer les mécanismes de l’immunité responsable de la protection vaccinale. Des prélèvements seront effectués pour permettre l’analyse de la réponse immunitaire et des acteurs impliqués. Nous évaluerons ensuite l’effet des facteurs immunitaires sur la protection conférée par le vaccin. Des souris avec les mêmes types de déficiences immunitaires que précédemment seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par le virus. Dans l’EU2 seront réalisés les protocoles de vaccination, d’injection des traitements et les prélèvements. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur des animaux infectés.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection des traitements altérant l’immunité cellulaire, du candidat vaccin et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendue aux points de piqûres des moustiques. Troubles liés à l’infection par le virus. Les souris seront surveillées quotidiennement pour évaluer leurs éventuels symptômes.

Devenir

Les animaux utilisés pour l'étude de la localisation des cellules immunitaires seront euthanasiés afin de permettre la collecte de leur peau et de leurs ganglions lymphatiques. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. A ce jour, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet d’évaluer la réponse immunitaire à un vaccin et la protection contre une infection par exposition à une piqûre de moustique infecté. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires. Ces travaux antérieurs nous on permit d’identifier notre vaccin candidat.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris, nous avons calculé le nombre limite nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des travaux préliminaires ont été réalisés pour calculer ce nombre au plus juste. De plus, nous effectuerons les expériences suivant un arbre décisionnel qui validera ou non la poursuite des expériences à chaque étape pour limiter le nombre de souris utilisé.

Raffinement

Les souris auront un temps d’acclimatation (7 jours) avec visite quotidienne pour limiter le stress lié à la manipulation. Les souris seront hébergées de 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements variés, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Une grille de score évaluant l'état général des souris sera quotidiennement suivie. Cette grille permet d’observer différents signes de bien-être ou de malaise (comme l’apparence, l’activité, le comportement ou la perte de poids). Nous avons défini des seuils à ne pas dépasser pour garantir la santé et le bien-être des animaux. Si l’un de ces seuils est atteint, l’expérience sera immédiatement arrêtée afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des souris adultes de 6-8 semaines car elles ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection.